KR20180102118A - 위상차 현미경 및 촬상 방법 - Google Patents

위상차 현미경 및 촬상 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20180102118A
KR20180102118A KR1020187022710A KR20187022710A KR20180102118A KR 20180102118 A KR20180102118 A KR 20180102118A KR 1020187022710 A KR1020187022710 A KR 1020187022710A KR 20187022710 A KR20187022710 A KR 20187022710A KR 20180102118 A KR20180102118 A KR 20180102118A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
surface shape
liquid
liquid surface
phase difference
difference image
Prior art date
Application number
KR1020187022710A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102054095B1 (ko
Inventor
야스시 시라이시
Original Assignee
후지필름 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 후지필름 가부시키가이샤 filed Critical 후지필름 가부시키가이샤
Publication of KR20180102118A publication Critical patent/KR20180102118A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102054095B1 publication Critical patent/KR102054095B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G02B21/08—Condensers
    • G02B21/14—Condensers affording illumination for phase-contrast observation
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G02B21/08—Condensers
    • G02B21/086—Condensers for transillumination only
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B26/00—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements
    • G02B26/06—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements for controlling the phase of light
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B26/00—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements
    • G02B26/08—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements for controlling the direction of light
    • G02B26/0875—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements for controlling the direction of light by means of one or more refracting elements
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
    • G02B27/0025—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00 for optical correction, e.g. distorsion, aberration
    • G02B27/0068—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00 for optical correction, e.g. distorsion, aberration having means for controlling the degree of correction, e.g. using phase modulators, movable elements
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B3/00—Simple or compound lenses
    • G02B3/12—Fluid-filled or evacuated lenses
    • G02B3/14—Fluid-filled or evacuated lenses of variable focal length
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis
    • G06T7/50—Depth or shape recovery
    • G06T7/55—Depth or shape recovery from multiple images
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04N—PICTORIAL COMMUNICATION, e.g. TELEVISION
    • H04N23/00—Cameras or camera modules comprising electronic image sensors; Control thereof
    • H04N23/70—Circuitry for compensating brightness variation in the scene
    • H04N23/71—Circuitry for evaluating the brightness variation
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/10—Image acquisition modality
    • G06T2207/10056—Microscopic image
    • G06T5/70—

Abstract

액면 형상을 구하기 위한 새로운 측정계를 마련하지 않고, 용기 내의 액체의 액면 형상을 추정할 수 있는 위상차 현미경 및 촬상 방법을 제공한다. 액체 및 관찰 대상이 수용된 용기에 대하여 위상차 계측용 조명광을 조사하는 조명광 조사부(10)와, 조명광을 조사한 관찰 대상을 촬상하는 촬상부(40)와, 용기 내의 액체의 액면 형상에 기인하는 조명광의 굴절을 조정하는 조정 광학계(20)와, 촬상부(40)에 의하여 촬상된 관찰 대상의 위상차 화상의 휘도 분포에 근거하여, 용기 내의 액체의 액면 형상을 추정하는 액면 형상 추정부(54)와, 액면 형상 추정부(54)에 의하여 추정된 액면 형상에 근거하여, 조정 광학계(20)의 광학 특성을 조정하기 위한 조정 정보를 취득하는 조정 정보 취득부(55)를 구비한다.

Description

위상차 현미경 및 촬상 방법
본 발명은, 액체 중의 관찰 대상을 위상차 계측하는 위상차 현미경 및 그 촬상 방법에 관한 것이다.
최근, 간세포 등의 배양된 투명한 세포를 비염색으로 관찰하는 방법으로서 위상차 계측이 널리 사용되기 시작했다. 그리고, 이와 같은 위상차 계측을 행하는 것으로서 위상차 현미경이 사용되고 있다.
일반적인 위상차 현미경에 있어서는, 링 형상의 조명광이 관찰 대상에 조사되고, 관찰 대상을 통과한 직접광과 회절광이 위상판에 입사된다. 그리고, 직접광은 위상판의 링 부분에 의하여 감광되고, 회절광은 위상판의 투명한 부분을 통과하여, 이 직접광과 회절광이 결상됨으로써 명암의 콘트라스트를 가진 상(像)을 촬상할 수 있다.
여기에서, 위상차 현미경에 의하여 배양액 중의 세포 등을 관찰하는 경우, 배양액의 표면 장력의 영향에 의하여 배양액의 액면에 메니스커스가 형성된다. 그리고, 이 메니스커스의 렌즈 작용에 의하여 링 형상의 조명광의 광로가 어긋나게 되어, 위상판에 입사되는 직접광과 회절광에 영향을 미쳐 명료한 위상차 화상이 얻어지지 않는 문제가 있다.
이 메니스커스에 의한 광로 어긋남을 보상하기 위해서는, 메니스커스가 형성하는 액면 형상의 정보가 필요하다. 액면 형상을 알고 있으면 보상하는 것은 가능하지만, 메니스커스가 형성하는 액면은, 웰 플레이트 등의 용기의 표면의 소재와 용기 내에 수용되는 액체의 관계로부터 형성되므로, 현실적으로 있을 수 있는 모든 조합을 고려하여 보상하는 것은 어렵다. 또, 동일한 웰 내이더라도, 웰 내에 수용되는 액체의 종류 및 양과 웰 내의 표면 상태에 따라 국소적으로 액면 형상이 다르므로, 액면 형상을 한번 계측하면 되는 것이 아니라, 관찰할 때마다 액면 형상을 계측할 필요가 있다. 또, 타임 랩스 촬영을 행하는 경우, 용액의 증발에 의하여, 용기 내의 수위가 변화하고, 이것에 의해서도 액면 형상이 변화한다.
따라서, 예를 들면 특허문헌 1에 있어서는, 배양액의 액면의 복수 위치에 계측광을 조사하고, 그 계측광의 어긋남량을 검출하며, 그 어긋남량에 근거하여, 배양액의 액면의 형상을 산출하는 것이 개시되어 있다.
일본 공개특허공보 2015-152650호
그러나, 특허문헌 1에 기재된 장치에서는, 계측광을 조사하기 위한 구성이 필요하며, 장치가 대형화되어 코스트 업이 되는 문제가 있다.
본 발명은, 상기의 문제를 감안하여, 액면의 형상을 구하기 위한 새로운 측정계를 마련하지 않고, 용기 내의 액체의 액면 형상을 추정할 수 있는 위상차 현미경 및 촬상 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 위상차 현미경은, 액체 및 관찰 대상이 수용된 용기에 대하여 위상차 계측용 조명광을 조사하는 조명광 조사부와, 조명광을 조사한 관찰 대상을 촬상하는 촬상부와, 용기 내의 액체의 액면 형상에 기인하는 조명광의 굴절을 조정하는 조정 광학계와, 촬상부에 의하여 촬상된 관찰 대상의 위상차 화상의 휘도 분포에 근거하여, 용기 내의 액체의 액면 형상을 추정하는 액면 형상 추정부와, 액면 형상 추정부에 의하여 추정된 액면 형상에 근거하여, 조정 광학계의 광학 특성을 조정하기 위한 조정 정보를 취득하는 조정 정보 취득부를 구비한다.
또, 상기 본 발명의 위상차 현미경에 있어서는, 조정 정보 취득부에 의하여 취득된 조정 정보에 근거하여, 조정 광학계의 광학 특성을 조정하는 조정 광학계 제어부를 구비하는 것이 바람직하다.
또, 상기 본 발명의 위상차 현미경에 있어서, 액면 형상 추정부는, 미리 설정된 액면 형상을 이용하여 기하 광학 시뮬레이션을 행하여 취득된 위상차 화상의 휘도 분포에 근거하여, 용기 내의 액체의 액면 형상을 추정하는 것이 바람직하다.
또, 상기 본 발명의 위상차 현미경에 있어서, 액면 형상 추정부는, 서로 다른 곡률을 갖는, 미리 설정된 복수의 액면 형상을 이용하여 각각 기하 광학 시뮬레이션을 행하여 취득된 복수의 위상차 화상의 휘도 분포에 근거하여, 용기 내의 액체의 액면 형상을 추정하는 것이 바람직하다.
또, 상기 본 발명의 위상차 현미경에 있어서, 액면 형상 추정부는, 기하 광학 시뮬레이션을 이용하여 취득된 위상차 화상의 휘도 분포와 촬상부에 의하여 촬상된 위상차 화상의 휘도 분포의 상관 관계를 구함으로써, 용기 내의 액체의 액면 형상을 추정하는 것이 바람직하다.
또, 상기 본 발명의 위상차 현미경에 있어서, 액면 형상 추정부는, 상관 함수를 이용하여 상기 상관 관계를 구하는 것이 바람직하다.
또, 상기 본 발명의 위상차 현미경에 있어서, 액면 형상 추정부는, 기하 광학 시뮬레이션을 이용하여 취득된 위상차 화상의 휘도 분포에 있어서의 변곡점의 휘도값과 촬상부에 의하여 촬상된 위상차 화상의 휘도 분포에 있어서의 변곡점의 휘도값에 근거하여, 상관 관계를 구하는 것이 바람직하다.
또, 상기 본 발명의 위상차 현미경에 있어서, 액면 형상 추정부는, 촬상부에 의하여 촬상된 위상차 화상 상에 있어서, 용기 내에 형성되는 메니스커스의 중심 부분으로부터 용기의 외주를 향하여 뻗는 적어도 하나의 직선을 설정하고, 그 설정한 직선 상의 위상차 화상의 휘도 분포에 근거하여, 용기 내의 액체의 액면 형상을 추정하는 것이 바람직하다.
또, 상기 본 발명의 위상차 현미경에 있어서, 액면 형상 추정부는, 서로 다른 복수의 방향으로 뻗는 상기 직선을 설정하고, 그 복수의 직선 상의 위상차 화상의 휘도 분포에 근거하여, 용기 내의 액체의 액면 형상을 추정하는 것이 바람직하다.
또, 상기 본 발명의 위상차 현미경에 있어서, 액면 형상 추정부는, 촬상부에 의하여 촬상된 위상차 화상에 대하여 평활화 처리를 실시하고, 그 평활화 처리가 실시된 위상차 화상의 휘도 분포에 근거하여, 용기 내의 액체의 액면 형상을 추정하는 것이 바람직하다.
본 발명의 촬상 방법은, 액체 및 관찰 대상이 수용된 용기에 대하여 위상차 계측용 조명광을 조사하여, 관찰 대상의 위상차 화상을 촬상하고, 그 촬상한 위상차 화상의 휘도 분포에 근거하여, 액체의 액면 형상을 추정하며, 그 추정한 액면 형상에 근거하여, 용기 내의 액체의 액면 형상에 기인하는 광의 굴절을 조정하는 조정 광학계의 광학 특성을 조정하기 위한 조정 정보를 취득하고, 그 조정 정보에 근거하여, 조정 광학계의 광학 특성이 조정된 후, 용기에 대하여 조명광을 조사하며, 조명광을 조사한 관찰 대상을 촬상한다.
본 발명의 위상차 현미경 및 촬상 방법에 의하면, 관찰용 위상차 화상을 촬상하는 촬상부에 의하여 촬상된 위상차 화상의 휘도 분포에 근거하여, 용기 내의 액체의 액면 형상을 추정하도록 했으므로, 액면 형상을 추정하기 위한 새로운 측정계를 마련하지 않고, 용기 내의 액체의 액면 형상을 추정할 수 있다.
도 1은 본 발명의 위상차 현미경의 일 실시형태를 이용한 현미경 시스템의 개략 구성을 나타내는 도이다.
도 2는 조정용 광학 소자의 위치, 광축의 회전 및 굴절력의 조정을 모식적으로 나타내는 도이다.
도 3은 위상차 화상에 나타나는 명암 패턴의 일례를 나타내는 도이다.
도 4는 메니스커스 모델(M)에 대하여 링 형상 조명광(N)이 입사한 경우의 광로 어긋남의 산출 방법의 일례를 설명하기 위한 도이다.
도 5는 대물 렌즈 모델에 링 형상 조명광(N)이 입사하는 범위(dna)와 평면(A)에 있어서의 광로 어긋남(Δx)의 관계를 나타내는 도이다.
도 6은 기하 광학 시뮬레이션에 의하여 취득된 위상차 화상의 휘도 분포의 일례를 나타내는 도이다.
도 7은 조정 광학계에 의한 조정 전에 촬상부에 의하여 촬상된 위상차 화상의 일례를 나타내는 도이다.
도 8은 기하 광학 시뮬레이션에 의하여 취득된 위상차 화상의 휘도 분포(G1)와, 촬상부에 의하여 촬상된 위상차 화상의 휘도 분포(G2)의 일례를 나타내는 도이다.
도 9는 본 발명의 위상차 현미경의 일 실시형태를 이용한 현미경 시스템의 작용을 설명하기 위한 플로차트이다.
도 10은 메니스커스의 중심 부분으로부터 외주를 향하여 8개의 직선(L1~L8)을 설정한 예를 설명하기 위한 도이다.
도 11은 위상차 화상의 휘도값(P(x))과, 액면의 경사각(θ)을 대응지은 프로파일의 일례를 나타내는 도이다.
도 12는 도 11에 나타내는 프로파일을 이용하여 액면의 경사각을 산출하는 방법을 설명하기 위한 도이다.
도 13은 액면의 경사각의 후보가 복수 존재하는 경우의 경사각의 결정 방법을 설명하기 위한 도이다.
이하, 본 발명의 위상차 현미경 및 촬상 방법의 일 실시형태를 이용한 현미경 시스템에 대하여, 도면을 참조하면서 상세하게 설명한다. 도 1은 본 실시형태의 현미경 시스템의 개략 구성을 나타내는 도이다.
본 실시형태의 현미경 시스템은, 도 1에 나타내는 바와 같이, 조명광 조사부(10)와, 조정 광학계(20)와, 결상 광학계(30)와, 촬상부(40)와, 현미경 제어 장치(50)와, 표시 장치(70)와, 입력 장치(80)를 구비하고 있다.
본 실시형태의 현미경 시스템에 있어서는, 조정 광학계(20)와 결상 광학계(30)의 사이에, 스테이지(61)가 마련되어 있으며, 이 스테이지(61) 상에, 액체인 배양액(C) 및 관찰 대상(S)이 수용된 배양 용기(60)가 설치된다. 그리고, 본 실시형태의 현미경 시스템은, X 방향, Y 방향 및 Z 방향으로 스테이지(61)를 이동시키는 스테이지 구동부(62)를 구비하고 있다. X 방향 및 Y 방향은, 관찰 대상 설치면(P)에 평행한 면상에 있어서 서로 직교하는 방향이며, Z 방향은, X 방향 및 Y 방향에 직교하는 방향이다.
본 실시형태의 현미경 시스템에 있어서는, 상술한 조명광 조사부(10), 조정 광학계(20), 결상 광학계(30), 촬상부(40), 스테이지(61), 스테이지 구동부(62) 및 결상 광학계 구동부(34)로 위상차 현미경 본체가 구성되고, 현미경 제어 장치(50)는, 이 위상차 현미경 본체를 제어하는 것이다. 이하, 위상차 현미경 본체의 구체적인 구성을 설명한다.
조명광 조사부(10)는, 배양 용기(60) 내에 수용된 관찰 대상(S)에 대하여, 이른바 위상차 계측을 위한 조명광을 조사하는 것이며, 본 실시형태에서는, 그 위상차 계측용 조명광으로서 링 형상 조명광을 조사한다. 구체적으로는, 본 실시형태의 조명광 조사부(10)는, 백색광을 출사하는 백색 광원(11)과, 링 형상의 슬릿을 갖고, 백색 광원(11)으로부터 출사된 백색광이 입사되어 링 형상 조명광을 출사하는 슬릿판(12)과, 슬릿판(12)으로부터 사출된 링 형상 조명광이 입사되며, 그 입사된 링 형상 조명광을 관찰 대상(S)에 대하여 조사하는 콘덴서 렌즈(13)를 구비하고 있다.
슬릿판(12)은, 백색 광원(11)으로부터 출사된 백색광을 차광하는 차광판에 대하여 백색광을 투과시키는 링 형상의 슬릿이 마련된 것이며, 백색광이 슬릿을 통과함으로써 링 형상 조명광이 형성된다.
또한, 본 실시형태에 있어서는, 상술한 바와 같이 슬릿판(12)을 이용하여 링 형상 조명광을 형성하도록 했지만, 링 형상 조명광을 형성하는 방법으로서는, 이에 한정하지 않고, 예를 들면 공간 광변조 소자 등을 이용하여 링 형상 조명광을 형성하도록 해도 된다.
또, 본 실시형태에 있어서는, 위상차 계측용 조명광으로서 링 형상 조명광을 이용하도록 했지만, 링 형상 이외의 형상을 갖는 조명광이어도 되고, 후술하는 위상판과 공액의 형상으로 되어 있으면 삼각 형상이나 사각 형상 등 그 외의 형상이어도 된다.
스테이지(61) 상에 설치된 배양 용기(60)는, 그 바닥면이 관찰 대상 설치면(P)이며, 관찰 대상 설치면(P)에는 관찰 대상(S)으로서 세포군 등이 배치된다. 배양 용기(60) 내에는 배양액(C)이 채워져 있고, 이 배양액(C)의 액면에는, 오목 형상의 메니스커스가 형성된다. 배양 용기(60)로서는, 샬레 및 복수의 웰이 배열된 웰 플레이트 등이 있다. 웰 플레이트의 경우, 각 웰에 관찰 대상(S) 및 배양액(C)이 수용되고, 웰별로 메니스커스가 형성된다.
또, 본 실시형태에 있어서는, 배양액 중에서 배양되는 세포군을 관찰 대상(S)으로 했지만, 관찰 대상(S)으로서는 이와 같은 배양액 중의 것에 한정하지 않으며, 물, 포말린, 에탄올, 및 메탄올 등의 액체 중에 있어서 고정된 세포를 관찰 대상(S)으로 해도 된다. 이 경우도, 용기 내의 이들 액체의 액면에 메니스커스가 형성된다.
조정 광학계(20)는, 상술한 메니스커스의 액면 형상에 기인하는 위상차 계측용 조명광의 굴절을 조정하는 것이다. 본 실시형태의 조정 광학계(20)는, 조정용 광학 소자(21)와, 조정 광학계 구동부(22)를 구비하고 있다.
조정용 광학 소자(21)는, 굴절력을 갖는 광학 소자이며, 구체적으로는, 입사면 또는 출사면에 곡률을 갖는 평볼록면 렌즈, 입사면 및 출사면의 양쪽 모두에 곡률을 갖는 양 볼록면 렌즈, 전압 인가에 의하여 굴절력이 변화하는 액정 렌즈, 렌즈의 곡률 반경을 변경 가능한 액체 렌즈, 및 초점 거리를 변경 가능한 공간 광변조기 등을 이용할 수 있다.
조정 광학계 구동부(22)는, 후술하는 조정 광학계 제어부(51)로부터 출력된 제어 신호에 근거하여, 조정용 광학 소자(21)의 굴절력을 변경하여 초점 거리를 조정하는 것이다. 구체적으로는, 조정 광학계 구동부(22)는, 조정용 광학 소자(21)의 위치 및 광축 방향을 변경하는 기구를 구비한 것이다. 또, 조정용 광학 소자(21)로서 액정 렌즈 또는 공간 광변조기를 이용하는 경우에는, 조정 광학계 구동부(22)는, 액정 렌즈 또는 공간 광변조기에 대하여 원하는 초점 거리에 따른 전압을 인가하는 것이다. 또, 조정용 광학 소자(21)로서 액체 렌즈를 이용하는 경우에는, 조정 광학계 구동부(22)는, 원하는 초점 거리에 따라 액체 렌즈 내의 액체의 양을 조정하고, 이로써 액체 렌즈의 곡률 반경을 조정하는 것이다.
도 2의 I은, X 방향, Y 방향 및 Z 방향으로의 조정용 광학 소자(21)의 위치의 변경을 모식적으로 나타내는 도이다. 또, 도 2의 II는, 조정용 광학 소자(21)의 광축 방향의 변경을 모식적으로 나타내는 도이며, 구체적으로는, 조정용 광학 소자(21)의 광축의 X축 둘레(θ)의 회전 조정, Y축 둘레(φ)의 회전 조정 및 Z축 둘레ρ)의 회전 조정을 모식적으로 나타내는 도이다. 또, 도 2의 III은, 조정용 광학 소자(21)의 굴절력의 조정을 모식적으로 나타내는 것이다. 또한, 도 2의 III에서는, 조정용 광학 소자(21)의 곡률 반경을 조정함으로써 굴절력을 조정하는 예를 나타내고 있지만, 굴절력을 조정하는 방법으로서는, 이에 한정하지 않고, 예를 들면 조정용 광학 소자(21)로서 액정 렌즈나 공간 광변조기를 이용하는 경우에는, 인가 전압을 조정함으로써, 굴절력을 조정할 수 있다.
또, 본 실시형태에 있어서는, 조정용 광학 소자(21)를 X 방향, Y 방향 및 Z 방향으로 이동시키도록 했지만, 이 조정용 광학 소자(21)의 이동에 의한 광학적인 작용과 동등한 작용을 얻을 수 있다면, 반드시 조정용 광학 소자(21)를 이동시키지 않아도 된다. 예를 들면, 조정용 광학 소자(21)로서 액정 렌즈나 공간 광변조기를 이용하는 경우에는, 인가 전압을 조정함으로써, 조정용 광학 소자(21)의 이동에 의한 광축의 시프트와 동일한 작용 효과를 얻도록 해도 된다. 또, 조정용 광학 소자(21)의 광축 방향에 대해서도 마찬가지로, 반드시 조정용 광학 소자(21) 자체를 회전시킬 필요는 없으며, 인가 전압을 조정함으로써, 조정용 광학 소자(21) 자체의 회전에 의한 광축의 회전과 동일한 작용 효과를 얻도록 해도 된다.
또, 본 실시형태에 있어서는, 조정용 광학 소자(21)를 X 방향 및 Y 방향으로 이동하도록 했지만, 이에 한정하지 않고, 스테이지(61)를 X 방향 및 Y 방향으로 이동시킴으로써, 조정용 광학 소자(21)와 배양 용기(60) 내에 형성된 메니스커스의 X 방향 및 Y 방향에 대한 상대적인 위치 관계를 변경해도 된다.
또, 본 실시형태에 있어서는, 하나의 조정용 광학 소자(21)를 이용하도록 했지만, 초점 거리가 다른 복수의 조정용 광학 소자(21)를 전환함으로써 굴절력을 조정해도 된다. 그 경우, 조정용 광학 소자(21)의 교환은, 자동으로 행해도 되고, 수동으로 행해도 된다. 복수의 조정용 광학 소자(21)를 수동으로 교환하는 경우에는, 예를 들면 후술하는 액면 형상 추정부(54)에 의하여 추정된 액면 형상에 근거하여, 적절한 조정용 광학 소자(21)의 종류 정보를 표시 장치(70)에 표시시키고, 그 표시에 근거하여, 유저가 수동으로 조정용 광학 소자(21)를 교환해도 된다.
결상 광학계(30)는, 대물 렌즈(31)와, 위상판(32)과, 결상 렌즈(33)와, 결상 광학계 구동부(34)를 구비한 것이다. 위상판(32)은, 링 형상 조명광의 파장에 대하여 투명한 투명판에 대하여 위상 링을 형성한 것이다. 또한, 상술한 슬릿판(12)의 슬릿의 크기는, 이 위상 링과 공액의 관계에 있다.
위상 링은, 입사된 광의 위상을 1/4 파장 어긋나게 하는 위상막과, 입사된 광을 감광하는 감광 필터가 링 형상으로 형성된 것이다. 위상판(32)에 입사된 직접광은 위상 링을 통과함으로써 위상이 1/4 파장 어긋남과 함께, 그 명도가 약해진다. 한편, 관찰 대상(S)에 의하여 회절된 회절광은 대부분이 위상판(32)의 투명판을 통과하고, 그 위상 및 명도는 변화하지 않는다.
대물 렌즈(31)는, 결상 광학계 구동부(34)에 의하여 Z 방향으로 이동하는 것이다. 관찰 대상(S)의 위상차 화상을 촬상하는 경우에는, 결상 광학계 구동부(34)에 의하여 대물 렌즈(31)를 Z 방향으로 이동시킴으로써 오토 포커스 제어가 행해져, 촬상부(40)에 의하여 촬상되는 화상의 콘트라스트가 조정된다.
결상 렌즈(33)는, 위상판(32)을 통과한 직접광 및 회절광이 입사되고, 이들 광을 촬상부(40)에 결상하는 것이다.
결상 광학계 구동부(34)는, 상술한 바와 같이 대물 렌즈(31)를 Z 방향으로 이동시키는 기구를 구비한 것이다.
촬상부(40)는, 결상 렌즈(33)에 의하여 결상된 관찰 대상(S)의 위상차 화상을 촬상하는 촬상 소자를 구비한 것이다. 촬상 소자로서는, CCD(charge-coupled device) 이미지 센서나 CMOS(Complementary Metal-Oxide Semiconductor) 이미지 센서 등을 이용할 수 있다.
여기에서, 상술한 바와 같은 구성의 위상차 현미경 본체에 의한 위상차 화상의 촬상에 대하여 설명한다. 또한, 여기에서는 배양액(C)의 액면에 형성된 메니스커스의 영향은 없는 것으로서 설명한다.
먼저, 조명광 조사부(10)로부터 출사된 링 형상 조명광이, 관찰 대상(S)에 조사된다. 관찰 대상(S)에 조사된 조명광은, 관찰 대상(S) 내를 직진한 직접광과 관찰 대상(S)에 의하여 회절된 회절광으로 나뉜다. 그리고, 관찰 대상(S)을 투과한 직접광과 회절광은, 대물 렌즈(31)를 투과하여 위상판(32)에 입사된다. 관찰 대상(S)을 투과한 직접광은, 위상판(32)의 위상 링에 입사되고, 그 위상이 1/4 파장 어긋남과 함께, 그 명도가 약해진다. 한편, 관찰 대상(S)을 투과한 회절광은 대부분이 위상판(32)의 투명한 부분을 통과한다.
위상판(32)을 투과한 직접광과 회절광은, 결상 렌즈(33)에 의하여 촬상 소자의 촬상면에 결상되고, 직접광과 회절광의 간섭에 의하여 에지 부분 등의 콘트라스트가 강조된 위상차 화상이 촬상된다.
또한, 본 실시형태에 있어서는, 스테이지(61)가 X 방향 및 Y 방향으로 이동함으로써, 배양 용기(60) 내가 조명광에 의하여 주사되고, 배양 용기(60) 내의 조명광이 조사된 영역별로 위상차 화상이 촬상된다.
다음으로, 도 1에 나타내는 현미경 제어 장치(50)는, CPU(Central Processing Unit), 메모리 및 하드 디스크 등을 구비한 컴퓨터로 구성되는 것이다.
현미경 제어 장치(50)는, 구체적으로는, 도 1에 나타내는 바와 같이, 조정 광학계 구동부(22)를 제어하는 조정 광학계 제어부(51)와, 결상 광학계 구동부(34)를 제어하는 결상 광학계 제어부(52)와, 스테이지 구동부(62)를 제어하는 스테이지 제어부(53)와, 촬상부(40)에 의하여 촬상된 위상차 화상의 휘도 분포에 근거하여, 배양 용기(60) 내의 배양액(C)의 액면 형상을 추정하는 액면 형상 추정부(54)와, 액면 형상 추정부(54)에 의하여 추정된 액면 형상에 근거하여, 조정 광학계(20)의 광학 특성을 조정하기 위한 조정 정보를 취득하는 조정 정보 취득부(55)를 구비하고 있다.
여기에서, 본 실시형태의 액면 형상 추정부(54)에 의한 액면 형상의 추정에 대하여, 상세하게 설명한다. 액면 형상 추정부(54)는, 상술한 바와 같이 촬상부(40)에 의하여 촬상된 위상차 화상의 휘도 분포에 근거하여, 배양 용기(60) 내의 배양액(C)의 액면 형상을 추정한다. 먼저, 이와 같이 위상차 화상의 휘도 분포에 근거하여, 배양액(C)의 액면 형상을 추정하는 원리에 대하여 설명한다.
도 3의 I은, 위상차 화상의 일례를 나타내는 것이며, 도 3의 II는, 도 3의 I에 나타내는 위상차 화상의 일부(사각으로 둘러싸이는 범위)의 확대도이다. 위상차 화상에 있어서는, 도 3에 나타내는 바와 같이, 동심원 형상으로 명암의 패턴(휘도 분포)이 형성된다. 이하, 이와 같은 명암 패턴이 형성되는 이유를 설명한다.
배양 용기(60) 내의 배양액(C)의 액면에 형성된 메니스커스의 중심 부분을 투과한 조명광은, 메니스커스에 의한 굴절의 영향을 거의 받지 않으므로, 그 직접광은 위상판(32)의 위상 링에 입사되어 감광되고, 그 결과, 메니스커스의 중심 부분의 위상차 화상은 주위보다 어두운 화상이 된다(도 3의 II의 화살표 A로 나타내는 범위). 또한, 메니스커스의 중심 부분이란, 배양 용기(60) 내의 액면 전체에 걸쳐 형성되는 곡면을 메니스커스라고 한 경우에, 배양 용기(60)의 바닥면에 가장 가까운 위치를 포함하는 메니스커스의 바닥면의 부분을 말한다.
그리고, 메니스커스의 중심 부분에 인접하는 곡면 부분을 투과한 조명광은, 메니스커스의 곡면에 의한 굴절의 영향을 받으므로, 그 직접광은 위상판(32)의 위상 링에 입사되지 않고 투명 부분을 투과한다. 그 결과, 곡면 부분의 위상차 화상은, 중심 부분의 위상차 화상보다 밝아진다(도 3의 II의 화살표 B로 나타내는 범위). 단, 메니스커스의 중심 부분보다 외측의 곡면 부분이더라도, 그 중심 부분으로부터의 거리가 어느 정도 떨어진 부분을 투과한 조명광에 대해서는, 메니스커스의 곡면에 의하여 크게 굴절되므로, 그 직접광은 대물 렌즈(31)의 외측을 통과하여 입사되지 않게 되며, 그 결과, 어두운 위상차 화상이 형성된다(도 3의 II의 화살표 C로 나타내는 범위). 따라서, 상술한 바와 같은 작용에 의하여, 위상차 화상에 있어서는, 도 3에 나타내는 바와 같은 동심원 형상의 명암 패턴이 형성된다.
위상차 화상에 나타나는 명암 패턴은, 메니스커스의 형상에 따라 변화하는 점에서, 본 실시형태에 있어서는, 그 명암 패턴을 이용하여, 메니스커스의 형상, 즉 액면 형상을 추정한다.
구체적으로는, 본 실시형태에 있어서는, 기존의 광학계의 파라미터를 이용한 기하 광학 시뮬레이션을 행하여 위상차 화상 상에 나타나는 명암 패턴(휘도 분포)을 취득하고, 그 기하 광학 시뮬레이션에 의하여 미리 취득된 명암 패턴에 근거하여, 배양액(C)의 액면 형상을 추정한다.
기하 광학 시뮬레이션에 대해서는, 예를 들면 서로 다른 곡률을 갖는 복수의 액면 형상(메니스커스)의 모델을 설정하고, 그 각 액면 형상의 모델에 대하여, 각각 입사광의 광로 어긋남을 산출하며, 그 광로 어긋남에 근거하여, 위상차 화상 상에 나타나는 명암 패턴을 산출한다.
도 4는 메니스커스 모델(M)에 대하여 링 형상 조명광(N)이 입사한 경우의 광로 어긋남의 산출 방법의 일례를 설명하기 위한 도이다. 또한, 도 4에 나타내는 60a는 배양 용기의 모델이고, 31a는 대물 렌즈의 모델이며, 32a는 위상판의 모델이고, A는 위상차판 모델(32a)의 위치에 있어서의 평면을 나타내고 있다. 도 4에 있어서 공기의 굴절률을 1로 하고, 배양액의 모델(Ca)의 굴절률을 물과 동일한 1.33으로 하면, 스넬의 법칙으로부터, 하기 식에 의하여 θ2가 산출된다.
[수학식 1]
Figure pct00001
마찬가지로, 스넬의 법칙으로부터, 하기 식에 의하여 θ3이 산출된다.
[수학식 2]
Figure pct00002
그리고, 광축으로부터의 광로 어긋남(Δx)은, 하기 식에 의하여 산출할 수 있다. 또한, f는, 대물 렌즈 모델(31a)의 초점 거리이며, 대물 렌즈 모델(31a)의 초점 위치는, 배양 용기 모델(60a)의 바닥면에 합초(合焦)하고 있는 것으로 한다.
[수학식 3]
Figure pct00003
또, 대물 렌즈 모델(31a)에 링 형상 조명광(N)이 입사하는 범위(dna)는, 하기 식에 의하여 산출할 수 있고, 도 5는 이 범위(dna)와 평면(A)에 있어서의 광로 어긋남(Δx)의 관계를 나타내는 도이다. 또한, 하기 식에 있어서의 NA는 대물 렌즈 모델(31a)의 개구수이다. 또, 도 5에 나타내는 φ1 및 φ2는, 광로 어긋남이 없는 경우에 있어서의 위상판 모델(32a)의 상의 내경 및 외경을 나타내고 있다. 또, 도 5에 나타내는 t1 및 t2는, 광로 어긋남이 Δx인 경우에 있어서의 링 형상 조명광(N)의 상의 내경 및 외경을 나타내고 있다.
[수학식 4]
Figure pct00004
그리고, 위상차판 모델(32a)의 감광률을 ND(정수)로 하면, 평면(A)에 있어서의 (x, y)의 위치별 투과율 T(x, y)는, 하기 식으로 나타낼 수 있다.
[수학식 5]
Figure pct00005
또, 평면(A)에 있어서의 (x, y)의 위치별 입사광 강도 P(x, y)는, 하기 식으로 나타낼 수 있다.
[수학식 6]
Figure pct00006
또한, 이때, 입사광 강도 P(x, y)를 가우스 분포로 표현해도 되고, 그 경우는, 하기 식으로 나타낼 수 있다.
[수학식 7]
Figure pct00007
이상으로부터, 메니스커스 모델(M)의 액면의 경사가 θ1일 때의 평면(A)을 통과하는 광의 강도의 총합 O(θ1)는, 하기 식으로 나타낼 수 있다.
[수학식 8]
Figure pct00008
상술한 바와 같은 연산에 근거하는 기하 광학 시뮬레이션을 행함으로써, 메니스커스 모델(M)의 액면 상의 각 위치를 통과한 광의 강도의 분포, 즉 위상차 화상의 휘도 분포를 취득할 수 있다.
또한, 도 4로부터 명확한 바와 같이, 위상차 화상의 위치와 액면 경사(θ1)의 위치는, 약간 Δxd만큼 어긋나 있다. 따라서, 하기 식을 이용하여 추정 위치를 보정함으로써, 고정밀도로 액면 형상의 추정을 행할 수 있다.
[수학식 9]
Figure pct00009
그리고, 서로 다른 곡률을 갖는 복수의 액면 형상의 각각의 위상차 화상의 휘도 분포가 취득되고, 액면 형상 추정부(54)에 이들 휘도 분포가 미리 기억된다. 도 6은 기하 광학 시뮬레이션에 의하여 취득된 위상차 화상의 휘도 분포의 일례를 나타내는 도이다. 도 6에 나타내는 휘도 분포는, 메니스커스 모델(M)의 중심으로부터 배양 용기 모델(60a)의 외주를 향하여 뻗는 직선 상의 휘도 분포를 나타낸 것이며, 도 6의 가로축은, 메니스커스 모델(M)의 중심으로부터의 거리이다. 또한, 메니스커스 모델(M)의 중심이란, 상술한 메니스커스의 중심 부분 중의 중앙 위치를 말하며, 기하 광학 시뮬레이션의 경우에는, 배양 용기 모델(60a)의 중심 위치와 동일한 위치가 된다. 또, 도 6에 나타내는 세로축의 OD값은, 상술한 직선 상의 휘도값을, 메니스커스 모델(M)의 중심의 휘도값에 의하여 규격화한 값이다. 도 6에 나타내는 바와 같이, 기하 광학 시뮬레이션에 의한 결과에 있어서도, 메니스커스의 중앙 부분으로부터 외측을 향하여 명암 패턴이 형성된다.
액면 형상 추정부(54)는, 서로 다른 곡률을 갖는 복수의 액면 형상의 각각에 대하여, 도 6에 나타내는 바와 같은 휘도 분포를 기억하고 있다. 구체적으로는, 예를 들면 곡률 R=3, R=4, R=5 및 R=6에 대응하는 휘도 분포를 기억하고 있다.
한편, 액면 형상 추정부(54)는, 상술한 조정 광학계(20)에 의한 조정 전에 촬상부(40)에 의하여 촬상된 위상차 화상을 취득하고, 그 위상차 화상의 휘도 분포를 취득한다. 또한, 조정 광학계(20)에 의한 조정 전의 위상차 화상의 촬상 방법으로서는, 조정 광학계(20)의 광학 특성을 초기 상태로 하여 위상차 화상을 촬상하도록 해도 되고, 조정 광학계(20)를 조명광의 광로로부터 퇴피시킨 상태에서 위상차 화상을 촬상하도록 해도 된다. 조정 광학계(20)의 광학 특성을 초기 상태로 하여 위상차 화상을 촬상하는 경우에는, 상술한 기하 광학 시뮬레이션에 있어서도 그 초기 상태의 조정 광학계(20)의 광학 파라미터가 고려되는 것으로 한다.
도 7은 조정 광학계(20)에 의한 조정 전에 촬상부(40)에 의하여 촬상된 위상차 화상의 일례를 나타내는 도이다. 액면 형상 추정부(54)는, 도 7에 나타내는 바와 같이, 촬상부(40)에 의하여 촬상된 위상차 화상 상에 있어서, 메니스커스의 중심 부분으로부터 배양 용기(60)의 외주를 향하여 뻗는 직선(L)을 설정하고, 그 설정한 직선(L) 상의 위상차 화상의 휘도 분포를 취득한다. 또한, 여기에서 설정하는 직선(L)의 연신 방향과, 기하 광학 시뮬레이션에 있어서 휘도 분포를 취득할 때에 위상차 화상 상에 있어서 설정한 직선의 연신 방향은 동일한 방향이다.
또, 상술한 바와 같이 위상차 화상의 휘도 분포를 취득하기 전에, 위상차 화상에 대하여 로 패스 필터 처리 등의 평활화 처리를 실시하고, 그 평활화 처리가 실시된 위상차 화상의 휘도 분포를 취득해도 된다. 이로써, 세포 유래의 휘도 변화를 제거할 수 있어, 보다 고정밀도로 액면 형상의 추정을 행할 수 있다.
또, 촬상부(40)에 의하여 촬상된 위상차 화상 상에 있어서 상술한 직선(L)을 설정하는 경우, 기하 광학 시뮬레이션의 경우와 달리 메니스커스가 어떠한 형상으로 형성되어 있는지 불명확하므로, 메니스커스의 중심 부분을 특정할 필요가 있다. 또한, 실제로 배양 용기(60) 내의 액면에 형성되는 메니스커스의 형상은, 배양 용기(60)의 종류, 배양액(C)의 양 및 배양 기간 등에 따라 다르며, 메니스커스의 중심 부분은 반드시 배양 용기(60)의 중심 부분과 일치하는 것은 아니다.
따라서, 액면 형상 추정부(54)는, 위상차 화상의 휘도에 근거하여, 메니스커스의 중심 부분을 특정한다. 구체적으로는, 예를 들면 미리 설정된 임계값 이하의 휘도의 영역을 위상차 화상으로부터 추출하고, 그 추출된 영역 중 위상차 화상의 중앙 부분에 가까운 원형의 영역을 특정함으로써 메니스커스의 중심 부분을 특정한다. 그리고, 특정된 메니스커스의 중심 부분 중의 중앙 위치로부터 외측을 향하여 뻗는 직선을 설정함으로써, 도 7에 나타내는 직선(L)을 설정한다.
다음으로, 액면 형상 추정부(54)는, 기하 광학 시뮬레이션에 의하여 취득된 위상차 화상의 휘도 분포와, 촬상부(40)에 의하여 촬상된 위상차 화상의 휘도 분포의 상관 관계를 구한다. 구체적으로는, 액면 형상 추정부(54)는, 미리 기억한 곡률 R=3, R=4, R=5 및 R=6의 액면 형상의 휘도 분포와, 촬상부(40)에 의하여 촬상된 위상차 화상의 휘도 분포의 상관 관계를 각각 구하여, 가장 상관 관계가 높은 액면 형상의 휘도 분포를 특정한다. 도 8은 곡률 R=4의 액면 형상의 휘도 분포(G1)와, 촬상부(40)에 의하여 촬상된 위상차 화상의 휘도 분포(G2)의 일례를 나타내는 도이다.
미리 기억한 액면 형상의 휘도 분포와, 촬상부(40)에 의하여 촬상된 위상차 화상의 휘도 분포의 상관 관계를 구하는 방법으로서는, 예를 들면 상관 함수를 이용하여, 이들 휘도 분포의 상관 관계를 구하도록 하면 된다. 또, 상관 함수를 이용한 방법에 한정하지 않으며, 예를 들면 도 8에 화살표로 나타내는 바와 같이, 미리 기억한 액면 형상의 휘도 분포와 촬상부(40)에 의하여 촬상된 위상차 화상의 휘도 분포에 있어서의 변곡점을 구하고, 이들 휘도 분포의 대응하는 변곡점의 휘도값(OD값)의 차의 합곗값을 구한다. 그리고, 미리 기억한 복수의 액면 형상의 휘도 분포의 각각에 대하여 상술한 합곗값을 구하여, 그 합곗값이 가장 작은 휘도 분포를 가장 상관 관계가 높은 휘도 분포로서 특정하도록 해도 된다.
그리고, 액면 형상 추정부(54)는, 촬상부(40)에 의하여 촬상된 위상차 화상의 휘도 분포와의 상관 관계가 가장 높은 곡률의 액면 형상을 특정하고, 그 특정한 곡률의 액면 형상을 배양 용기(60) 내의 배양액(C)의 액면 형상으로서 추정한다.
이상이, 본 실시형태의 액면 형상 추정부(54)에 의한 액면 형상의 추정에 대한 설명이다.
도 1로 되돌아가, 조정 정보 취득부(55)는, 상술한 바와 같이 액면 형상 추정부(54)에 의하여 추정된 액면 형상에 근거하여, 조정 광학계(20)의 광학 특성을 조정하기 위한 조정 정보를 취득하는 것이다. 구체적으로는, 본 실시형태의 조정 정보 취득부(55)는, 액면 형상 추정부(54)에 의하여 추정된 액면 형상에 근거하여, 위상차 화상의 촬상 영역 내에 있어서의 액면의 경사각을 취득하고, 그 경사각과 배양액(C)의 굴절률에 근거하여, 촬상 영역 내에 있어서의 조명광의 굴절각을 산출한다. 또한, 본 실시형태에 있어서는, 상술한 바와 같이 배양 용기(60) 내가 조명광에 의하여 주사되며, 배양 용기(60) 내를 분할한 복수의 촬상 영역별로 위상차 화상의 촬상이 행해지기 때문에, 그 촬상 영역에 대하여, 조명광의 굴절각이 산출된다.
조정 정보 취득부(55)는, 각 촬상 영역 내의 조명광의 굴절각의 정보를 조정 정보로서 조정 광학계 제어부(51)에 출력한다.
조정 광학계 제어부(51)는, 조정 정보 취득부(55)에 의하여 산출된 조명광의 굴절각의 정보에 근거하여, 조정 광학계(20)의 광학 특성을 조정하는 것이다. 구체적으로는, 조정 광학계 제어부(51)에는, 촬상 영역 내의 조명광의 굴절각과, 조정 광학계(20)의 조정용 광학 소자(21)의 조정량을 대응지은 룩업 테이블이 미리 설정되어 있다. 그리고, 조정 광학계 제어부(51)는, 조명광의 굴절각의 정보에 근거하여, 상기 룩업 테이블을 참조하여 조정 광학계(20)의 조정용 광학 소자(21)의 조정량을 취득하고, 그 조정량에 따른 제어 신호를 조정 광학계 구동부(22)에 출력하는 것이다. 또한, 조정 광학계(20)의 조정용 광학 소자(21)의 조정량으로서는, 상술한 바와 같이 조정용 광학 소자(21)의 X 방향, Y 방향 및 Z 방향의 위치, 굴절력과 광축 방향 등이 있다.
조정 광학계 제어부(51)로부터 출력된 제어 신호는, 조정 광학계 구동부(22)에 입력되고, 조정 광학계 구동부(22)는, 입력된 제어 신호에 근거하여, 조정용 광학 소자(21)의 굴절력, X 방향, Y 방향 및 Z 방향의 위치와, 광축 방향을 조정함으로써 광학 특성을 조정한다.
또한, 복수의 조정용 광학 소자(21)를 교환함으로써 메니스커스에 기인하는 굴절을 조정하는 경우에는, 조정 정보 취득부(55)는, 액면 형상 추정부(54)에 의하여 추정된 액면 형상에 따른 광학 특성을 갖는 조정용 광학 소자(21)의 종류를 특정하는 정보를 조정 정보로서 취득한다. 조정 정보 취득부(55)에는, 액면 형상과 그 액면 형상에 대응하는 조정용 광학 소자(21)의 종류를 특정하는 정보가 대응지어진 테이블이 미리 설정되어 있는 것으로 한다.
그리고, 조정 정보 취득부(55)에 있어서 취득된 조정용 광학 소자(21)의 종류를 특정하는 정보는, 조정 광학계 제어부(51)에 출력되고, 조정 광학계 제어부(51)는, 입력된 정보에 근거하여, 액면 형상에 따른 조정용 광학 소자(21)로 자동적으로 전환한다. 또한, 조정용 광학 소자(21)의 종류를 특정하는 정보를 표시 장치(70)에 표시시켜 유저에게 통지시킴으로써, 유저가 수동으로 조정용 광학 소자(21)를 교환하도록 해도 된다.
결상 광학계 제어부(52)는, 결상 광학계 구동부(34)를 구동 제어함으로써 대물 렌즈(31)를 Z 방향으로 이동시키는 것이다. 구체적으로는, 본 실시형태의 결상 광학계 제어부(52)는, 위상차 화상을 촬상할 때, 결상 광학계 구동부(34)에 의하여 대물 렌즈(31)를 Z 방향으로 이동시킴으로써 오토 포커스 제어하는 것이다.
스테이지 제어부(53)는, 스테이지 구동부(62)를 구동 제어함으로써 스테이지(61)를 X 방향, Y 방향 및 Z 방향으로 이동시키는 것이다. 스테이지 제어부(53)는, 상술한 바와 같이 스테이지(61)를 X 방향 및 Y 방향으로 이동시킴으로써, 배양 용기(60) 내를 조명광으로 주사하고, 배양 용기(60) 내(예를 들면, 하나의 웰 내)에서 분할된 복수의 촬상 영역별로 위상차 화상을 촬상하는 것이다.
또, 현미경 제어 장치(50)에는, 입력 장치(80)와 표시 장치(70)가 접속되어 있다. 입력 장치(80)는, 키보드나 마우스 등의 입력 디바이스를 구비한 것이며, 유저에 의한 설정 입력을 접수하는 것이다.
표시 장치(70)는, 액정 디스플레이 등의 표시 디바이스로 구성되는 것이며, 촬상부(40)에 있어서 촬상된 위상차 화상 등을 표시하는 것이다. 또한, 표시 장치(70)를 터치 패널로 구성하고, 표시 장치(70)가 입력 장치를 겸해도 된다.
다음으로, 본 실시형태의 현미경 시스템의 작용에 대하여, 도 9에 나타내는 플로차트를 참조하면서 설명한다.
먼저, 관찰 대상(S) 및 배양액(C)이 수용된 배양 용기(60)가 스테이지(61) 상에 설치된다. 그리고, 먼저, 조정 광학계(20)에 의한 조정 전의 관찰 대상(S)의 위상차 화상이 촬상되고, 액면 형상 추정부(54)에 의하여 취득된다(S10).
액면 형상 추정부(54)는, 상술한 바와 같이 조정 전의 위상차 화상 상에 있어서, 메니스커스의 중심 부분으로부터 배양 용기(60)의 외주를 향하여 뻗는 직선(L)을 설정하고, 그 설정한 직선(L) 상의 위상차 화상의 휘도 분포를 취득한다(S12).
그리고, 액면 형상 추정부(54)는, 그 조정 전의 위상차 화상의 휘도 분포와, 미리 기억된 곡률 R=3, R=4, R=5 및 R=6의 액면 형상의 휘도 분포의 상관 관계를 각각 구하여, 조정 전의 위상차 화상의 휘도 분포와 가장 상관 관계가 높은 액면 형상의 휘도 분포를 특정하고, 그 특정한 액면 형상을 배양 용기(60) 내의 배양액(C)의 액면 형상으로서 추정한다(S14).
액면 형상의 추정 결과는 조정 정보 취득부(55)에 출력되고, 조정 정보 취득부(55)는, 추정된 액면 형상에 근거하여, 조정 광학계(20)의 광학 특성을 조정하기 위한 조정 정보를 취득한다(S16).
그리고, 조정 정보 취득부(55)에 의하여 취득된 조정 정보는 조정 광학계 제어부(51)에 출력되고, 조정 광학계 제어부(51)는, 입력된 조정 정보에 근거하여, 조정 광학계(20)의 광학 특성을 조정한다(S18).
그리고, 상기와 같이 하여 조정 광학계(20)의 광학 특성이 조정되어, 이로써 배양액(C)의 액면에 형성된 메니스커스에 의한 굴절의 영향이 제거된 후, 다시 관찰 대상(S)의 위상차 화상이 촬상부(40)에 의하여 촬상된다(S20).
촬상부(40)에 의하여 촬상된 위상차 화상은 표시 장치(70)에 출력되고, 표시 장치(70)에 의하여 표시된다.
상기 실시형태의 현미경 시스템에 의하면, 관찰용 위상차 화상을 촬상하는 촬상부(40)에 의하여 촬상된 위상차 화상의 휘도 분포에 근거하여, 배양 용기(60) 내의 배양액(C)의 액면 형상을 추정하도록 했으므로, 액면 형상을 추정하기 위한 새로운 측정계를 마련하지 않고, 배양 용기(60) 내의 배양액(C)의 액면 형상을 추정할 수 있다. 그리고, 그 추정한 액면 형상에 근거하여, 조정 광학계(20)의 광학 특성을 조정하고, 그 후, 관찰 대상의 위상차 화상의 촬상을 행하도록 했으므로, 메니스커스의 영향을 억제한 위상차 화상을 촬상할 수 있다.
또한, 상기 실시형태에 있어서는, 액면 형상의 추정을 행할 때, 촬상부(40)에 의하여 촬상된 위상차 화상 상에 있어서, 메니스커스의 중심 부분으로부터 배양 용기(60)의 외주를 향하여 뻗는 1개의 직선(L)을 설정하고, 그 직선(L) 상의 휘도 분포를 위상차 화상 전체의 휘도 분포를 대표하는 것으로서 이용하도록 했지만, 메니스커스의 중심 부분으로부터 외주를 향하여 뻗는 직선을 복수 개 설정하도록 해도 된다. 즉, 배양 용기(60) 내에 형성되는 메니스커스는, 반드시 그 중심으로부터 배양 용기(60) 내의 외주를 향하는 각 방향에 대하여, 모두 동일한 곡률로 형성되어 있다고는 할 수 없다.
따라서, 예를 들면 도 10에 나타내는 바와 같이, 메니스커스의 중심 부분으로부터 외주를 향하여 뻗는 8개의 직선(L1~L8)을 설정하고, 그 직선별 휘도 분포를 취득하도록 해도 된다. 그리고, 직선별 휘도 분포에 대응하는 액면 형상의 곡률을 구함으로써, 8방향에 대하여 각각 액면 형상의 곡률을 구하도록 해도 된다. 이로써, 액면 형상을 보다 고정밀도로 추정할 수 있다.
이와 같이 복수의 방향에 대하여 액면 형상의 곡률을 구하도록 한 경우에는, 이들 곡률의 평균값 또는 최대 빈수 등을 대푯값으로서 구하고, 그 대푯값의 곡률에 근거하여, 조정 광학계(20)의 조정 정보를 취득해도 된다. 또는, 각 방향에 대하여 구해진 곡률을 이용하여, 그 방향별로 분할된 각 영역에 대하여 조정 광학계(20)의 조정 정보를 취득해도 된다. 방향별 영역의 분할 방법으로서는, 예를 들면 각 방향으로 뻗는 직선을 각각 원호의 중심에 포함하는 선형의 영역으로 분할하도록 하면 된다.
또, 상기 실시형태에 있어서는, 액면 형상을 추정할 때, 액면 형상이 구형에 가까운 것을 전제로, 액면 형상의 곡률 R을 구하도록 했지만, 예를 들면 배양 용기(60)의 크기에 따라 메니스커스가 평탄한 바닥면 부분이 커지므로, 액면 형상은 구형이 되지 않아, 액면 형상의 추정 정밀도가 낮아질 가능성이 있다. 따라서, 이하와 같이 하여, 액면 형상을 추정해도 된다.
먼저, 기하 광학 시뮬레이션을 이용하여, 도 11에 나타내는 바와 같은, 위상차 화상의 휘도값(P(x))과, 액면의 경사각(θ)을 대응지은 프로파일을 취득한다. 휘도값(P(x))은, 메니스커스 모델(M)의 중심 부분부터 배양 용기(60a)의 외주까지의 사이의 각 위치 x에 있어서의 휘도값을 나타내고 있다. 또, 액면의 경사각(θ)이란, 도 4에 나타내는 경사각(θ1)이다. 또한, 도 11에 나타내는 프로파일은, 상기 실시형태에 있어서의 연산 결과를 이용하여 취득할 수 있다.
다음으로, 상기 실시형태와 마찬가지로, 촬상부(40)에 의하여 촬상된 위상차 화상을 취득하고, 메니스커스의 중심 부분의 휘도값이 1이 되도록 위상차 화상을 규격화하며, 그 규격화된 위상차 화상에 대하여 평활화 처리를 실시하여 세포 유래의 고주파 노이즈를 제거한다.
그리고, 그 평활화 처리가 실시된 위상차 화상 상에 있어서, 도 12에 나타내는 바와 같이 메니스커스의 중심 부분으로부터 외주를 향하여 뻗는 직선을 설정하고, 그 직선 상을 메니스커스의 중심으로부터 주사하여 각 위치 x1, x2, ···, xn에 있어서의 휘도값을 취득한다. 그리고, 도 11에 나타낸 프로파일을 이용하여, 각 위치 x의 휘도값(P(x))에 대응하는 액면의 경사각(θ)을 구한다. 이로써, 도 12에 나타내는 직선 상의 각 위치에 있어서의 액면의 경사각(θ)을 구할 수 있고, 상기 직선 상의 액면의 형상을 추정할 수 있다.
또한, 도 11에 나타내는 프로파일을 이용하여 액면의 경사각(θ)을 구할 때, 도 13에 나타내는 바와 같이 동일한 휘도값(P(x))(도 13에 나타내는 예에서는 1.5)에 대하여 2개의 경사각(θ)이 구해지는 경우가 있다. 따라서, 상술한 바와 같이 메니스커스의 중심으로부터 순서대로 휘도값을 취득하여, 그 휘도값에 대응하는 경사각(θ)을 순차 구하는 경우에는, 메니스커스의 중심으로부터 떨어질수록 액면의 경사각은 커지는 것으로 하고, 경사각(θ)의 후보가 복수 존재하는 경우에는, 가장 작은 경사각(θ)을 먼저 선택하도록 하면 된다.
또, 상기 실시형태의 현미경 시스템에 있어서는, 액면 상에 형성된 메니스커스에 기인하는 조명광의 굴절의 영향을 제거하기 위하여 조정용 광학 소자(21)를 마련하도록 했지만, 반드시 이와 같은 조정용 광학 소자(21)를 마련하지 않아도 되고, 예를 들면 조정 정보에 근거하여, 슬릿판(12)을 X 방향 및 Y 방향으로 이동시키거나, 위상판(32)을 X 방향 및 Y 방향으로 이동시키거나 하여, 메니스커스에 기인하는 조명광의 굴절의 영향을 제거하도록 해도 된다. 즉, 본 발명에 있어서의 조정 광학계로서, 슬릿판(12)이나 위상판(32)을 이용하도록 해도 된다.
또, 상기 실시형태의 현미경 시스템에 있어서는, 조정용 광학 소자(21)를 콘덴서 렌즈(13)와 배양 용기(60)의 사이에 마련하도록 했지만, 조정용 광학 소자(21)의 위치는 이 위치에 한정하지 않고, 예를 들면 백색 광원(11)과 슬릿판(12)의 사이, 위상판(32)과 콘덴서 렌즈(13)의 사이, 및 배양 용기(60)와 대물 렌즈(31)의 사이 등 그 외의 위치에 마련하도록 해도 된다.
10 조명광 조사부
11 백색 광원
12 슬릿판
12a 슬릿판 모델
13 콘덴서 렌즈
13a 콘덴서 렌즈 모델
20 조정 광학계
21 조정용 광학 소자
22 조정 광학계 구동부
30 결상 광학계
31 대물 렌즈
31a 대물 렌즈 모델
32 위상판
32a 위상판 모델
33 결상 렌즈
34 결상 광학계 구동부
40 촬상부
50 현미경 제어 장치
51 조정 광학계 제어부
52 결상 광학계 제어부
53 스테이지 제어부
54 액면 형상 추정부
55 조정 정보 취득부
60 배양 용기
60a 배양 용기 모델
61 스테이지
62 스테이지 구동부
70 표시 장치
80 입력 장치
C 배양액
Ca 배양액 모델
G1 휘도 분포
G2 휘도 분포
L 직선
L1-L8 직선
M 메니스커스 모델
N 링 형상 조명광
P 관찰 대상 설치면

Claims (11)

  1. 액체 및 관찰 대상이 수용된 용기에 대하여 위상차 계측용 조명광을 조사하는 조명광 조사부와,
    상기 조명광을 조사한 상기 관찰 대상을 촬상하는 촬상부와,
    상기 용기 내의 액체의 액면 형상에 기인하는 상기 조명광의 굴절을 조정하는 조정 광학계와,
    상기 촬상부에 의하여 촬상된 상기 관찰 대상의 위상차 화상의 휘도 분포에 근거하여, 상기 용기 내의 액체의 액면 형상을 추정하는 액면 형상 추정부와,
    상기 액면 형상 추정부에 의하여 추정된 액면 형상에 근거하여, 상기 조정 광학계의 광학 특성을 조정하기 위한 조정 정보를 취득하는 조정 정보 취득부를 구비한 것을 특징으로 하는 위상차 현미경.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 조정 정보 취득부에 의하여 취득된 조정 정보에 근거하여, 상기 조정 광학계의 광학 특성을 조정하는 조정 광학계 제어부를 구비한 위상차 현미경.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 액면 형상 추정부가, 미리 설정된 액면 형상을 이용하여 기하 광학 시뮬레이션을 행하여 취득된 위상차 화상의 휘도 분포에 근거하여, 상기 용기 내의 액체의 액면 형상을 추정하는 위상차 현미경.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 액면 형상 추정부가, 서로 다른 곡률을 갖는, 미리 설정된 복수의 액면 형상을 이용하여 각각 기하 광학 시뮬레이션을 행하여 취득된 복수의 위상차 화상의 휘도 분포에 근거하여, 상기 용기 내의 액체의 액면 형상을 추정하는 위상차 현미경.
  5. 청구항 3 또는 청구항 4에 있어서,
    상기 액면 형상 추정부가, 상기 기하 광학 시뮬레이션을 이용하여 취득된 위상차 화상의 휘도 분포와 상기 촬상부에 의하여 촬상된 위상차 화상의 휘도 분포의 상관 관계를 구함으로써, 상기 용기 내의 액체의 액면 형상을 추정하는 위상차 현미경.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 액면 형상 추정부가, 상관 함수를 이용하여 상기 상관 관계를 구하는 위상차 현미경.
  7. 청구항 5에 있어서,
    상기 액면 형상 추정부가, 상기 기하 광학 시뮬레이션을 이용하여 취득된 위상차 화상의 휘도 분포에 있어서의 변곡점의 휘도값과 상기 촬상부에 의하여 촬상된 위상차 화상의 휘도 분포에 있어서의 변곡점의 휘도값에 근거하여, 상기 상관 관계를 구하는 위상차 현미경.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액면 형상 추정부가, 상기 촬상부에 의하여 촬상된 위상차 화상 상에 있어서, 상기 용기 내에 형성되는 메니스커스의 중심 부분으로부터 상기 용기의 외주를 향하여 뻗는 적어도 하나의 직선을 설정하고, 상기 설정한 직선 상의 위상차 화상의 휘도 분포에 근거하여, 상기 용기 내의 액체의 액면 형상을 추정하는 위상차 현미경.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 액면 형상 추정부가, 서로 다른 복수의 방향으로 뻗는 상기 직선을 설정하고, 상기 복수의 직선 상의 위상차 화상의 휘도 분포에 근거하여, 상기 용기 내의 액체의 액면 형상을 추정하는 위상차 현미경.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액면 형상 추정부가, 상기 촬상부에 의하여 촬상된 위상차 화상에 대하여 평활화 처리를 실시하고, 상기 평활화 처리가 실시된 위상차 화상의 휘도 분포에 근거하여, 상기 용기 내의 액체의 액면 형상을 추정하는 위상차 현미경.
  11. 액체 및 관찰 대상이 수용된 용기에 대하여 위상차 계측용 조명광을 조사하여, 상기 관찰 대상의 위상차 화상을 촬상하고,
    상기 촬상한 위상차 화상의 휘도 분포에 근거하여, 상기 액체의 액면 형상을 추정하며,
    상기 추정한 액면 형상에 근거하여, 상기 용기 내의 액체의 액면 형상에 기인하는 광의 굴절을 조정하는 조정 광학계의 광학 특성을 조정하기 위한 조정 정보를 취득하고,
    상기 조정 정보에 근거하여, 상기 조정 광학계의 광학 특성이 조정된 후, 상기 용기에 대하여 상기 조명광을 조사하여,
    상기 조명광을 조사한 상기 관찰 대상을 촬상하는 것을 특징으로 하는 촬상 방법.
KR1020187022710A 2016-02-22 2017-02-13 위상차 현미경 및 촬상 방법 KR102054095B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2016-030705 2016-02-22
JP2016030705A JP6594223B2 (ja) 2016-02-22 2016-02-22 位相差顕微鏡および撮像方法
PCT/JP2017/005128 WO2017145839A1 (ja) 2016-02-22 2017-02-13 位相差顕微鏡および撮像方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180102118A true KR20180102118A (ko) 2018-09-14
KR102054095B1 KR102054095B1 (ko) 2019-12-09

Family

ID=59685125

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187022710A KR102054095B1 (ko) 2016-02-22 2017-02-13 위상차 현미경 및 촬상 방법

Country Status (5)

Country Link
US (1) US10831009B2 (ko)
EP (1) EP3422073B1 (ko)
JP (1) JP6594223B2 (ko)
KR (1) KR102054095B1 (ko)
WO (1) WO2017145839A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022154348A1 (ko) * 2021-01-12 2022-07-21 정홍준 투명 디스플레이 패널을 이용한 현미경의 투과광 형성장치

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6411294B2 (ja) * 2015-06-30 2018-10-24 富士フイルム株式会社 位相差顕微鏡および撮像方法
WO2019039035A1 (ja) * 2017-08-25 2019-02-28 富士フイルム株式会社 判別器の学習装置、方法およびプログラム、並びに判別器
CN113532800A (zh) * 2021-05-21 2021-10-22 杭州涂鸦信息技术有限公司 透光区域的分析方法以及相关设备、装置

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012013888A (ja) * 2010-06-30 2012-01-19 Nikon Corp 顕微鏡、培養観察装置
KR20120061740A (ko) * 2010-12-03 2012-06-13 캐논 가부시끼가이샤 굴절률 분포 계측방법, 굴절률 분포 계측장치 및 광학소자의 제조 방법
KR20150058462A (ko) * 2012-11-08 2015-05-28 가부시키가이샤 히다치 하이테크놀로지즈 결함 검출 방법 및 그 장치 및 결함 관찰 방법 및 그 장치
JP2015152650A (ja) 2014-02-12 2015-08-24 株式会社ニコン 位相差顕微鏡

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101652660B (zh) * 2007-02-26 2017-09-01 干细胞技术公司 减小液体培养基的弯月面曲率的方法
JP5814684B2 (ja) * 2010-09-03 2015-11-17 オリンパス株式会社 位相物体の可視化方法及び可視化装置
US9069175B2 (en) * 2011-04-08 2015-06-30 Kairos Instruments, Llc Adaptive phase contrast microscope
JP2015152649A (ja) * 2014-02-12 2015-08-24 株式会社ニコン 位相差顕微鏡
JP6380983B2 (ja) * 2014-11-26 2018-08-29 富士フイルム株式会社 位相差顕微鏡
JP6513507B2 (ja) * 2015-06-30 2019-05-15 富士フイルム株式会社 位相差顕微鏡および撮像方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012013888A (ja) * 2010-06-30 2012-01-19 Nikon Corp 顕微鏡、培養観察装置
KR20120061740A (ko) * 2010-12-03 2012-06-13 캐논 가부시끼가이샤 굴절률 분포 계측방법, 굴절률 분포 계측장치 및 광학소자의 제조 방법
KR20150058462A (ko) * 2012-11-08 2015-05-28 가부시키가이샤 히다치 하이테크놀로지즈 결함 검출 방법 및 그 장치 및 결함 관찰 방법 및 그 장치
JP2015152650A (ja) 2014-02-12 2015-08-24 株式会社ニコン 位相差顕微鏡

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022154348A1 (ko) * 2021-01-12 2022-07-21 정홍준 투명 디스플레이 패널을 이용한 현미경의 투과광 형성장치

Also Published As

Publication number Publication date
EP3422073A4 (en) 2019-03-06
US10831009B2 (en) 2020-11-10
KR102054095B1 (ko) 2019-12-09
WO2017145839A1 (ja) 2017-08-31
JP2017151132A (ja) 2017-08-31
EP3422073A1 (en) 2019-01-02
JP6594223B2 (ja) 2019-10-23
US20190033569A1 (en) 2019-01-31
EP3422073B1 (en) 2020-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10466462B2 (en) Phase-contrast microscope and imagine method
JP6380983B2 (ja) 位相差顕微鏡
JP6513507B2 (ja) 位相差顕微鏡および撮像方法
US10831009B2 (en) Phase contrast microscope and imaging method
WO2015182382A1 (ja) 細胞評価装置および方法並びにプログラム
JP6219214B2 (ja) 細胞撮像制御装置および方法並びにプログラム
WO2015182396A1 (ja) 細胞評価装置および方法並びにプログラム
JP6173950B2 (ja) 細胞撮像制御装置および方法並びにプログラム
JP5177138B2 (ja) 観察装置
KR20180104040A (ko) 현미경 및 관찰 방법
JP5508734B2 (ja) パターン描画装置およびパターン描画方法
JP6131204B2 (ja) 観察装置
JP6312410B2 (ja) アライメント装置、顕微鏡システム、アライメント方法、及びアライメントプログラム
JP6522535B2 (ja) 細胞観察装置および方法
JP2015210396A (ja) アライメント装置、顕微鏡システム、アライメント方法、及びアライメントプログラム
EP3835721A1 (en) A method for measuring a height map of a test surface
JP2014066648A (ja) 基板検査方法及び装置
WO2019069823A1 (ja) 撮像装置、撮像装置の作動方法及び撮像制御プログラム

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant