JP5814684B2 - 位相物体の可視化方法及び可視化装置 - Google Patents

位相物体の可視化方法及び可視化装置 Download PDF

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Description

本発明は、培養細胞、生体組織、及び、表面に微小な段差を有する金属などの位相物体の可視化方法、及び、位相物体の可視化装置に関する。
培養細胞や生体組織（以降、生体標本と記す。）は、生体標本とその周囲の媒質との屈折率差、生体標本自体の屈折率分布や形状などによって、光に位相差を生じさせる位相物体である。
従来から、生体標本などの位相物体は、位相物体の位相分布を可視化する位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡などの特殊な顕微鏡を用いて観察されてきた。位相差顕微鏡については、例えば、特許文献１で開示されている。また、微分干渉顕微鏡については、例えば、特許文献２で開示されている。
近年では、蛍光顕微鏡の普及に伴い、位相差観察または微分干渉観察と蛍光観察とを併用した位相物体の観察が広く行われるに至っている。具体的には、位相差観察または微分干渉観察で得られる画像（以降、位相分布画像と記す。）を用いて、位相物体の解析対象となる部位が特定され、蛍光観察で得られる蛍光画像を用いて、当該部位の詳細な解析が行われる。
ところで、一般に、蛍光観察で得られる蛍光は微弱であることから、顕微鏡の結像光学系には高い透過率が求められる。
しかしながら、位相差観察と蛍光観察とが併用される場合には、位相差観察のために、コンデンサ内の瞳位置にリングスリットが設けられ、対物レンズ内のリングスリットと共役な位置に位相膜が設けられる。従って、位相膜での蛍光の吸収により、結像光学系を構成する対物レンズの透過率が低下することになる。
また、微分干渉観察と蛍光観察とが併用される場合には、微分干渉観察のために、照明光学系内に偏光子とノマルスキープリズムが配置され、結像光学系内に偏光子とノマルスキープリズムが配置され、さらに、上記２つの偏光子がクロスニコル状態に設定される。従って、結像光学系内の偏光子とノマルスキープリズムの影響により、結像光学系の透過率が低下することになる。
蛍光観察では必要とされない光学素子による結像光学系の透過率の低下を避けるために、位相差観察または微分干渉観察の観察光路と蛍光観察の観察光路とを分離する構成を採用することも考えられる。
しかしながら、その場合、観察光路を分離（または合成）するための光学素子やリレー光学系が別途追加で必要になる。その結果、追加された光学素子による結像光学系の透過率の低下や結像光学系の構成の複雑化といった新たな課題が生じることになる。
以上のように、位相差観察または微分干渉観察と蛍光観察とを併用する顕微鏡では、蛍光に対する結像光学系の透過率の低下を防止することは非常に困難である。
このような技術的な課題に対して有効な技術が、非特許文献１、特許文献３、及び、特許文献４に開示されている。
非特許文献１では、位相物体を合焦位置からずらして、デフォーカス状態で観察することで、位相物体の位相分布に対応した像強度分布が発生することが開示されている。非特許文献１で開示される技術によれば、結像光学系内に位相差観察や微分干渉観察で必要とされる光学素子を配置することなく、位相物体の位相分布に対応した像強度分布を、ひいては、位相分布画像を得ることができる。このため、結像光学系の透過率の低下は生じず、蛍光観察との併用に好適である。
また、特許文献３及び特許文献４では、位相物体を合焦位置から前後にずらして、各デフォーカス状態で取得した２枚の画像を差演算することで、コントラストが強調された位相分布画像が生成できることが開示されている。特許文献３及び特許文献４で開示される技術によれば、非特許文献１で開示される技術によって得られる画像に比べてコントラストが強調された位相分布画像を得ることができる。また、特許文献３及び特許文献４で開示される技術においても、非特許文献１で開示される技術と同様に、結像光学系内に位相差観察や微分干渉観察で必要とされる光学素子は不要である。このため、結像光学系の透過率の低下が生じず、蛍光観察との併用に好適である。
特開平７−２２５３４１号公報 特開平８−１２２６４８号公報 特開２００４−３５４６５０号公報 特開２００５−１７３２８８号公報
C.J.R.Sheppard, T.Wilson，Fourier imaging of phase information in scanning and conventional optical microscopes，PHILOSOPHICAL TRANSACTIONS OF THE ROYAL SOCIETY OF LONDON，英国，ROYAL SOCIETY，１９８０年２月７日，Vol.295,No.1415，pp.513-536
位相分布画像は、上述したように、主に、位相物体の解析対象となる部位の特定、いわゆる、スクリーニング（Screening）と呼ばれる作業などに用いられる。このため、位相分布画像には、解析対象部位を特定するに足りる十分なコントラストとともに、観察視野の移動に追随した高いリアルタイム性が要求される。
非特許文献１で開示される技術は、位相差観察や微分干渉観察のように瞳面に配置された光学素子により強制的に光に位相差を生じさせるのではなく、合焦位置からのずれ（デフォーカス）によって生じる瞳面での波面収差を利用して光に位相差を生じさせる技術である。従って、非特許文献１で開示される技術では、位相差の制御が難しく、十分なコントラストを有する位相分布画像を得ることが困難である。
一方、特許文献３及び特許文献４で開示される技術によれば、上述したようにコントラストが改善された位相分布画像を生成することができる。しかしながら、コントラストが改善された位相分布画像を生成するためには、位相物体を合焦位置から前側にずらした画像と後側にずらした画像を取得する必要がある。このような光軸方向への位相物体または焦点位置の移動には、通常ステージや対物レンズなどの機械的な駆動が伴う。このため、画像取得の高速化には限界があり、高速に画像を生成することが難しい。従って、特許文献３及び特許文献４で開示される技術では、位相分布画像の十分なリアルタイム性を実現することは困難である。
以上のような実情を踏まえ、本発明では、高いコントラストを有する位相分布画像を高速に生成する技術を提供することを課題とする。
本発明の第１の態様は、被観察物体を偏射照明で照明して、異なる照明方向から照明された前記被観察物体の複数の第１の電子画像を取得する工程と、前記複数の第１の電子画像を演算して、第２の電子画像を生成する工程と、を含み、前記複数の第１の電子画像を取得する工程は、ｄを結像光学系の瞳中心と前記結像光学系の瞳中心に最も近い位置に入射する光が前記結像光学系の瞳を通過する位置との距離とし、ｒを前記結像光学系の瞳半径とするとき、以下の条件式０．４≦ｄ／ｒを満たすように前記被観察物体を偏射照明で照明する工程を含む可視化方法を提供する。
本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の可視化方法において、前記複数の第１の電子画像を取得する工程は、偏射照明で第１の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、偏射照明で第２の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、を含み、前記第１の照明方向と前記第２の照明方向は、前記被観察物体を照明する照明光学系の光軸に対して略対称である
可視化方法を提供する。
本発明の第３の態様は、第１の態様または第２の態様に記載の可視化方法において、さらに、前記複数の第１の電子画像を取得する工程の前に、前記被観察物体を、当該被観察物体の光学像を形成する結像光学系の焦点位置から、前記結像光学系の光軸方向にずらした位置に配置する工程を含む可視化方法を提供する。
本発明の第４の態様は、第１の態様乃至第３の態様のいずれか１つに記載の可視化方法において、前記第２の電子画像を生成する工程は、前記複数の第１の電子画像を差演算する工程を含む可視化方法を提供する。
本発明の第５の態様は、第１の態様乃至第４の態様のいずれか１つに記載の可視化方法において、前記複数の第１の電子画像を取得する工程は、偏射照明で第１の照明方向から前記被観察物体を照明する工程と、偏射照明で第２の照明方向から前記被観察物体を照明する工程と、偏射照明で前記第１の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、偏射照明で前記第２の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、を含み、前記第１の照明方向と前記第２の照明方向は、前記被観察物体を照明する照明光学系の光軸に対して略対称である可視化方法を提供する。
本発明の第６の態様は、第１の態様乃至第４の態様のいずれか１つに記載の可視化方法において、前記複数の第１の電子画像を取得する工程は、偏射照明で第１の照明方向と第２の照明方向から同時に前記被観察物体を照明する工程と、偏射照明で前記第１の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、偏射照明で前記第２の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、を含み、前記第１の照明方向と前記第２の照明方向は、前記被観察物体を照明する照明光学系の光軸に対して略対称である可視化方法を提供する。
本発明の第７の態様は、第１の態様または第２の態様に記載の可視化方法において、前記複数の第１の電子画像を取得する工程は、偏射照明で第１の照明方向と第２の照明方向から同時に前記被観察物体を照明する工程と、偏射照明で前記第１の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、偏射照明で前記第２の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、を含み、前記第１の照明方向と前記第２の照明方向は、前記被観察物体を照明する照明光学系の光軸に対して略対称であり、前記被観察物体を照明する工程は、前記照明光学系の瞳位置近傍に配置された偏射照明手段の開口上に配置された第１の偏光子であって、第１の偏光方向の光を透過する第１の偏光子により、前記第１の照明方向から照明し、前記開口上で且つ前記照明光学系の光軸に対して前記第１の偏光子と略対称な位置に配置された第２の偏光子であって、前記第１の偏光方向と直交する第２の偏光方向の光を透過する第２の偏光子により、前記第２の照明方向から照明する可視化方法を提供する。
本発明の第８の態様は、第１の態様または第２の態様に記載の可視化方法において、前記複数の第１の電子画像を取得する工程は、偏射照明で第１の照明方向と第２の照明方向から同時に前記被観察物体を照明する工程と、第１の波長域の光を検出する複数の第１の画素を含む撮像素子により偏射照明で前記第１の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、前記第１の波長域と異なる第２の波長域の光を検出する複数の第２の画素を含む前記撮像素子により偏射照明で前記第２の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、を含み、前記第１の照明方向と前記第２の照明方向は、前記被観察物体を照明する照明光学系の光軸に対して略対称であり、前記被観察物体を照明する工程は、前記照明光学系の瞳位置近傍に配置された偏射照明手段の開口上に配置された前記第１の波長域の光を透過する第１の光学フィルタにより、前記第１の照明方向から照明し、前記開口上で且つに前記照明光学系の光軸に対して前記第１の光学フィルタと略対称な位置に配置された第２の光学フィルタであって、前記第２の波長域の光を透過する第２の光学フィルタにより、前記第２の照明方向から照明する可視化方法を提供する。
本発明の第９の態様は、光源と、前記光源からの光を被観察物体に導く照明光学系と、前記被観察物体の光学像を像面上に形成する結像光学系と、前記像面に配置された撮像素子と、前記撮像素子から得られる前記被観察物体の複数の第１の電子画像を演算して、第２の電子画像を生成する演算装置と、前記照明光学系による偏射照明の照明方向を制御する偏射照明制御手段と、を含み、前記複数の第１の電子画像は、前記偏射照明制御手段により異なる照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を含み、前記偏射照明制御手段は、前記照明光学系の瞳位置近傍に配置された、偏斜照明の照明角度を規定する複数の開口を有する偏射照明手段と、前記複数の開口の少なくとも１つの開口上に配置された、第１の偏光方向の光を透過する第１の偏光子と、前記複数の開口の少なくとも１つの開口上に配置された、前記第１の偏光方向と直交する第２の偏光方向の光を透過する第２の偏光子と、前記光源と前記第１の偏光子及び前記第２の偏光子との間に、光の偏光方向を制御する偏光方向制御手段と、を含み、前記第１の偏光子と前記第２の偏光子は、前記照明光学系の光軸に対して略対称な位置に配置され、ｄを前記結像光学系の瞳中心と前記複数の開口が前記結像光学系の瞳位置に投影された複数の開口像の各々の瞳中心に最も近い開口端との距離とし、ｒを前記結像光学系の瞳半径とするとき、以下の条件式０．４≦ｄ／ｒを満たす可視化装置を提供する。
本発明の第１０の態様は、光源と、前記光源からの光を被観察物体に導く照明光学系と、前記被観察物体の光学像を像面上に形成する結像光学系と、前記像面に配置された撮像素子と、前記撮像素子から得られる前記被観察物体の複数の第１の電子画像を演算して、第２の電子画像を生成する演算装置と、前記照明光学系による偏射照明の照明方向を制御する偏射照明制御手段と、を含み、前記複数の第１の電子画像は、前記偏射照明制御手段により異なる照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を含み、前記偏射照明制御手段は、前記照明光学系の瞳位置近傍に配置された、偏斜照明の照明角度を規定する複数の開口を有する偏射照明手段と、前記複数の開口の少なくとも１つの開口上に配置された、第１の波長域の光を透過する第１の光学フィルタと、前記複数の開口の少なくとも１つの開口上に配置された、前記第１の波長域と異なる第２の波長域の光を透過する第２の光学フィルタと、を含み、前記第１の光学フィルタと前記第２の光学フィルタは、前記照明光学系の光軸に対して略対称な位置に配置され、前記撮像素子は、前記第１の波長域の光を検出する複数の第１の画素と、前記第２の波長域の光を検出する複数の第２の画素と、を含み、ｄを前記結像光学系の瞳中心と前記複数の開口が前記結像光学系の瞳位置に投影された複数の開口像の各々の瞳中心に最も近い開口端との距離とし、ｒを前記結像光学系の瞳半径とするとき、以下の条件式０．４≦ｄ／ｒを満たす可視化装置を提供する。
本発明の第１１の態様は、光源と、前記光源からの光を被観察物体に導く照明光学系と、前記被観察物体の光学像を像面上に形成する結像光学系と、前記像面に配置された撮像素子と、前記撮像素子から得られる前記被観察物体の複数の第１の電子画像を演算して、第２の電子画像を生成する演算装置と、前記照明光学系による偏射照明の照明方向を制御する偏射照明制御手段と、を含み、前記複数の第１の電子画像は、前記偏射照明制御手段により異なる照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を含み、前記偏射照明制御手段は、前記照明光学系の瞳位置近傍に配置された、偏斜照明の照明角度を規定する複数の開口を有する偏射照明手段と、前記複数の開口の少なくとも１つの開口上に配置された、第１の偏光方向の光を透過する第１の偏光子と、前記複数の開口の少なくとも１つの開口上に配置された、前記第１の偏光方向と直交する第２の偏光方向の光を透過する第２の偏光子と、を含み、前記第１の偏光子と前記第２の偏光子は、前記照明光学系の光軸に対して略対称な位置に配置され、前記撮像素子は、前記第１の偏光方向の光を検出する複数の第１の画素と、前記第２の偏光方向の光を検出する複数の第２の画素と、を含み、ｄを前記結像光学系の瞳中心と前記複数の開口が前記結像光学系の瞳位置に投影された複数の開口像の各々の瞳中心に最も近い開口端との距離とし、ｒを前記結像光学系の瞳半径とするとき、以下の条件式０．４≦ｄ／ｒを満たす可視化装置を提供する。
本発明の第１２の態様は、第９の態様乃至第１１の態様のいずれか１つに記載の可視化装置において、前記複数の第１の電子画像は、第１の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像と、第２の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像と、を含み、前記第１の照明方向と前記第２の照明方向は、前記照明光学系の光軸に対して略対称である可視化装置を提供する。
本発明の第１３の態様は、第９の態様乃至第１２の態様のいずれか１つに記載の可視化装置において、前記結像光学系は、前記被観察物体に対して当該結像光学系の焦点位置をずらして配置される可視化装置を提供する。
本発明の第１４の態様は、第９の態様乃至第１３の態様のいずれか１つに記載の可視化装置において、前記演算装置は、前記複数の第１の電子画像を差演算して、前記第２の電子画像を生成する可視化装置を提供する。
本発明の第１５の態様は、第１３の態様または第１４の態様に記載の可視化装置において、前記偏射照明制御手段は、前記照明光学系の瞳位置近傍に配置された、少なくとも第１の開口と第２の開口を有する前記偏射照明手段を含み、前記第１の開口と前記第２の開口は、前記照明光学系の光軸に対して略対称な位置に設けられ、前記光源は、前記第１の開口を照明する第１の光源と、前記第２の開口を照明する第２の光源と、を含む可視化装置を提供する。
本発明の第１６の態様は、第９の態様乃至第１５の態様のいずれか１つに記載の可視化装置において、さらに、前記演算装置により生成された第２の電子画像を表示する表示装置と、を含む可視化装置を提供する。
本発明の第１７の態様は、第９の態様乃至第１６の態様のいずれか１つに記載の可視化装置において、前記被観察物体は、液面が凹面に変形した培養液中にあり、前記液面は照明光に対して凹レンズのように作用する可視化装置を提供する。
本発明によれば、高いコントラストを有する位相分布画像を高速に生成する技術を提供することができる。
偏斜照明で第１の照明方向から被観察物体を照明する偏斜照明方法を説明するための図である。 偏斜照明で第１の照明方向から被観察物体を照明したときの結像光学系のＭＴＦとＰＴＦを示す図である。 偏斜照明で第１の照明方向から被観察物体を照明したときの結像光学系のＸ方向のＭＴＦとＰＴＦの積を示す図である。 偏斜照明で第２の照明方向から被観察物体を照明する偏斜照明方法を説明するための図である。 偏斜照明で第２の照明方向から被観察物体を照明したときの結像光学系のＭＴＦとＰＴＦを示す図である。 偏斜照明で第２の照明方向から被観察物体を照明したときの結像光学系のＸ方向のＭＴＦとＰＴＦの積を示す図である。 図３に例示されるＭＴＦとＰＴＦの積と図６に例示されるＭＴＦとＰＴＦの積とを差演算した結果を示す図である。 実施例１に係る顕微鏡装置の構成を例示した図である。 図８に例示される顕微鏡装置に含まれる偏斜照明手段の上面図である。 実施例２に係る顕微鏡装置の構成を例示した図である。 図１０に例示される顕微鏡装置に含まれる偏斜照明制御手段の上面図である。 実施例３に係る顕微鏡装置の構成を例示した図である。 図１２に例示される顕微鏡装置に含まれる偏斜照明手段の上面図である。 図１２に例示される顕微鏡装置に含まれるカラーＣＣＤの構成を例示した図である。 実施例４に係る顕微鏡装置の構成を例示した図である。 図１５に例示される顕微鏡装置に含まれる偏光カメラの構成を例示した図である。 図１５に例示される顕微鏡装置に含まれる偏斜照明手段の上面図である。 実施例５に係る顕微鏡装置の構成を例示した図である。 図１８に例示される顕微鏡装置による観察に用いられるマルチウェルプレートを例示した図である。 偏斜照明手段に形成される開口の位置について説明するための図である。 図２０に例示される開口の各々から偏斜照明で被観察物体を照明したときの結像光学系のＭＴＦを示す図である。 図２１に例示されるＭＴＦとそれと対称なＭＴＦとを差演算した結果を示す図である。 図１８に例示される顕微鏡装置に含まれる結像光学系の瞳面の上面図である。 液面の凹レンズ作用による開口像の変化について説明するための図である。
本発明の各実施例に係る位相物体の可視化方法について、概説する。
本発明の各実施例に係る可視化方法は、位相物体である被観察物体を偏斜照明で照明して、異なる照明方向から照明された被観察物体の複数の位相分布画像（以降、第１の電子画像と記す。）を取得する工程と、第１の工程で取得した複数の第１の電子画像を演算して、新たな位相分布画像（以降、第２の電子画像と記す。）を生成する工程を含んでいる。
本発明の各実施例に係る可視化方法は、位相物体をデフォーカス状態で観察するときに生じる瞳面での波面収差を利用して観察光に位相差を生じさせて、それによって、位相物体を可視化する点では、非特許文献１、特許文献３、及び、特許文献４に開示される技術と同様である。
また、本発明の各実施例に係る可視化方法は、波面収差が異なる状態で取得された複数の位相分布画像を利用して、非特許文献１で開示される技術に比べて高いコントラストを有する位相分布画像を生成する点では、特許文献３及び特許文献４に開示される技術と同様である。
しかしながら、本発明の各実施例に係る可視化方法は、特許文献３及び特許文献４で開示される技術が位相物体を合焦位置から前後にずらしたときの位相分布画像を用いて高いコントラストを有する位相分布画像を生成するのに対して、偏斜照明で異なる照明方向から照明された位相物体の位相分布画像（第１の電子画像）を用いて高いコントラストを有する位相分布画像（第２の電子画像）を生成する点で、特許文献３及び特許文献４に開示される技術と異なっている。
例えば、各実施例で後述するような方法により、偏斜照明の照明方向を高速に切り換えることができる。または、切り換え動作を伴うことなく、照明方向の異なる複数の位相分布画像（第１の電子画像）を取得することができる。このため、本発明の各実施例に係る可視化方法によれば、位相物体を合焦位置から前後に移動させる場合に比べて、複数の位相分布画像（第１の電子画像）を高速に取得することができる。従って、高いコントラストを有する位相分布画像（第２の電子画像）をより高速に生成することが可能であり、位相分布画像（第２の電子画像）のリアルタイム性を高めることができる。
また、位相物体を合焦位置から前後に高速に移動させる場合には、ステージや対物レンズなどの機械的な駆動が位相物体に振動として伝わってしまい、位相分布画像に悪影響を及ぼすことがある。これに対して、偏斜照明の照明方向の切り換えでは、機械的な駆動は、例えば、後述する実施例１に例示されるように、通常、光軸に直交する方向に発生する。このため、位相物体に振動が伝わる場合であっても、その影響は極めて限定的である。また、例えば、後述する実施例２、実施例３、及び実施例４に例示されるように、機械的な駆動を完全に排除して、照明方向の異なる複数の位相分布画像（第１の電子画像）を取得することも可能である。従って、振動による画質の劣化を伴うことなく、高いコントラストを有する位相分布画像の生成を高速化することができる。
また、本発明の各実施例に係る可視化方法は、さらに、以下の特徴を有することが望ましい。
まず第１に、複数の第１の電子画像を取得する工程は、偏斜照明で第１の照明方向から照明された位相物体である被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、偏斜照明で第２の照明方向から照明された被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、を含み、第１の照明方向と第２の照明方向が、被観察物体を照明する照明光学系の光軸に対して略対称であることが望ましい。
これにより、コントラストが反転した２枚の位相分布画像（第１の電子画像）を取得することができる。このため、より高いコントラストを有する位相分布画像（第２の電子画像）を生成することができる。なお、この点についての詳細な説明は、後述する。
一方、特許文献３及び特許文献４で開示される技術では、コントラストの反転した位相分布画像を得るためには、合焦位置から前後に同じ距離だけ対称にデフォーカスした位置で位相物体を撮像する必要がある。このため、特許文献３及び特許文献４で開示される技術では、原則として観察開始前に厳密な合焦作業が必要である。これに対して、本発明の各実施例に係る可視化方法では、厳密な合焦作業は不要である。通常の明視野観察では、位相物体は合焦位置では観察されず、合焦位置からのズレ量（デフォーカス量）に応じて位相物体にコントラストが生じる。このため、合焦作業は比較的負担の大きな作業である。従って、本発明の各実施例に係る可視化方法は、可視化作業の簡素化といった点でも効果的である。
第２に、本発明の各実施例に係る可視化方法は、被観察物体の複数の第１の電子画像を取得する工程の前に、被観察物体を、当該被観察物体の光学像を形成する結像光学系の焦点位置から、結像光学系の光軸方向にずらした位置に配置する工程を含むことが望ましい。
事前に位相分布画像を確認しながらデフォーカス量を調整することで、コントラストと解像度のバランスのとれた位相分布画像（第１の電子画像）が得られる。このため、高いコントラストで且つ良好な解像度を有する位相分布画像（第２の電子画像）の生成することができる。
また、この際、デフォーカス量は、微量として、撮像素子の画素サイズなどによって決まる焦点深度内に抑えることが望ましい。これにより、結像光学系の瞳関数に位相分布を発生させて波面収差を生じさせる一方で、被観察物体を通常の振幅物体として扱う蛍光観察では、観察像に与える影響を最小限に抑えることができる。従って、蛍光観察との併用、さらには、蛍光観察との同時実施も可能となる。
上述したように、位相物体を可視化するためには、位相物体を結像光学系の焦点位置からずらした位置に配置する必要があるが、通常、位相物体にはある程度の厚みがあるため、デフォーカス作業を明示的に行わなくても、位相物体は可視化され得る。しかしながら、コントラストと解像度のバランスのとれた位相分布画像を取得するため、及び、デフォーカス量を焦点深度内に抑えるためには、事前にデフォーカス量を調整することが望ましい。
なお、本発明の各実施例に係る可視化方法では、事前にデフォーカス量を調整した後は、デフォーカス量を固定した状態で複数の位相分布画像（第１の電子画像）が取得される点が、特許文献３及び特許文献４で開示される技術とは異なることに留意する。
第３に、第２の電子画像を生成する工程は、複数の第１の電子画像を差演算する工程を含むことが望ましい。
より具体的には、コントラストの反転した位相分布画像（第１の電子画像）を差演算することが望ましい。コントラストの反転した位相分布画像を差演算することで、位相物体のコントラストをより強調することができる。また、背景部分については、偏斜照明の照明方向に関わらずおよそ同じ像強度分布で可視化されるため、差演算により像強度分布が相殺されることになる。このため、より高いコントラストを有する位相分布画像（第２の電子画像）を生成することができる。
以下、図１から図７を参照しながら、偏斜照明で異なる照明方向（特に、照明光学系の光軸に対して略対称な照明方向）から照明された被観察物体の複数の位相分布画像を用いて、高いコントラストを有する位相分布画像を生成し得ることについて説明する。
まず、デフォーカス状態で観察することで位相物体を可視化し得ることについて説明する。
結像光学系を介して得られる被観察物体の像強度分布関数Ｉは、以下の式（１）で表されることが知られている。
Ｉ（ｘ）＝Ｆ−１［ＯＴＦ（ｆ）・ＯＡ（ｆ）］ ・・・（１）
ここで、ｘはｘ方向の空間座標を、ｆはｘ方向の空間周波数を、ＯＴＦは結像光学系の光伝達関数（OTF: Optical Transfer Function）を、ＯＡは被観察物体の振幅分布のフーリエ変換を示している。また、Ｆ−１［］は逆フーリエ変換を示す演算子である。
光伝達関数（OTF）は、結像光学系の結像性能を示す関数であり、コントラストの低下率を示す変調伝達関数（MTF: Modulation Transfer Function）と、位相のずれ具合を示す位相伝達関数（PTF: Phase Transfer Function）を用いて、以下の式（２）で表される。
ＯＴＦ（ｆ）＝ＭＴＦ（ｆ）・ｅｘｐ（２πｉ・ＰＴＦ（ｆ）） ・・・（２）
従って、像強度分布関数Ｉは、式（１）及び式（２）から、式（３）のように表される。
Ｉ（ｘ）＝Ｆ−１［ＭＴＦ（ｆ）・ｅｘｐ（２πｉ・ＰＴＦ（ｆ））・ＯＡ（ｆ）］
・・・（３）
さらに、被観察物体が位相物体であってその位相分布が小さい場合には、像強度分布関数Ｉは、近似的に式（４）で表される。
Ｉ（ｘ）＝Ｆ−１［ＭＴＦ（ｆ）・２πｉ・ＰＴＦ（ｆ）・ＯＰ（ｆ）］＋ＢＧＣ
・・・（４）
ここで、ＯＰ（ｆ）は位相物体の位相分布のフーリエ変換であり、ＢＧＣは位相物体を透過した０次光成分による像のバックグランド成分である。
式（４）から明らかなように、被観察物体が位相物体であるとき、ＰＴＦが０になる場合には、位相物体は背景に対してコントラストを有さず、ＰＴＦが値を有する場合にのみ、位相物体は背景に対してコントラストを有する。ＰＴＦは、理想的な光学系の合焦状態では０になるが、デフォーカス状態では、瞳面で波面収差が生じるため、値を有することになる。従って、位相物体が合焦位置にあるときには位相物体が可視化されないが、デフォーカス状態で観察することで位相物体を可視化することができる。
また、背景に対するコントラストがＭＴＦとＰＴＦの積をパラメータとして決定されることも、式（４）から明らかである。
次に、図１から図６を参照しながら、異なる照明方向の偏斜照明により、コントラストが反転した位相分布画像（第１の電子画像）を得られることについて説明する。
図１は、偏斜照明で第１の照明方向から被観察物体を照明する偏斜照明方法を説明するための図である。図１（ａ）は、照明光学系と偏斜照明手段の側面概略図である。図１（ｂ）は、偏斜照明手段の上面図である。
図１（ａ）に例示されるように、照明光学系を構成するコンデンサレンズ２の瞳位置に配置される偏斜照明手段３を用いることで、コンデンサレンズ２の焦点位置に配置された位相物体１を偏斜照明で照明することができる。より具体的には、偏斜照明手段３は、図１（ｂ）に例示されるように、開口３ａを有する遮光部材３ｂで構成されていて、開口３ａを光軸ＡＸに対して偏心した位置に設けることで、特定の方向から特定の照明角（厳密には、照明角は開口の幅に応じて特定の範囲を有する。）の光で照明する偏斜照明を実現することができる。なお、図１（ａ）及び図１（ｂ）では、Ｘマイナス方向から照明角θ１で照明する第１の照明方向の偏斜照明が例示されている。
図２及び図３は、偏斜照明で第１の照明方向から被観察物体を照明したときの結像光学系の結像特性を示す図である。図２（ａ）は、結像光学系のＸ方向のＭＴＦを示し、図２（ｂ）は、結像光学系のＸ方向のＰＴＦを示し、図２（ｃ）は、結像光学系のＹ方向のＭＴＦを示し、図２（ｄ）は、結像光学系のＹ方向のＰＴＦを示し、図３は、結像光学系のＸ方向のＭＴＦとＸ方向のＰＴＦの積を示している。
図２（ａ）及び図２（ｃ）に例示されるように、第１の照明方向の偏斜照明では、結像光学系のＹ方向のＭＴＦは空間周波数０を中心に対称な形状を有するのに対して、結像光学系のＸ方向のＭＴＦは空間周波数０に対して非対称な形状を有している。より具体的には、結像光学系のＸ方向のＭＴＦは、空間周波数のプラス方向に偏り、且つ、正負でカットオフ周波数が異なっている。
また、上述したようにデフォーカス状態では結像光学系のＰＴＦは値を有するが、図２（ｂ）及び図２（ｄ）に例示されるように、第１の照明方向の偏斜照明では、デフォーカスにより生じる結像光学系のＹ方向のＰＴＦは空間周波数０を中心に対称な形状を有するのに対して、デフォーカスにより生じる結像光学系のＸ方向のＰＴＦは空間周波数０に対して非対称な形状を有している。より具体的には、結像光学系のＸ方向のＰＴＦは空間周波数のプラス方向に偏っている。
従って、図３に例示されるように、結像光学系のＸ方向のＭＴＦとＰＴＦの積も、空間周波数のプラス方向に偏った、正負で空間周波数範囲の異なる、空間周波数０に対して非対称な形状を有することになる。
図４は、偏斜照明で第２の照明方向から被観察物体を照明する偏斜照明方法を説明するための図である。図４（ａ）は、照明光学系と偏斜照明手段の側面概略図である。図４（ｂ）は、偏斜照明手段の上面図である。
図４（ａ）及び図４（ｂ）では、図１（ａ）及び図１（ｂ）と異なり、開口３ａが光軸ＡＸに対してＸプラス方向に偏心した位置に設けられている。より具体的には、図４（ｂ）に例示される開口３ａの位置と図１（ｂ）に例示される開口３ａの位置は、光軸ＡＸに対して略対称である。これにより、図４（ａ）に例示されるように、位相物体１はＸプラス方向から照明角θ１の光で照明されるため、光軸ＡＸに対して第１の照明方向と略対称な第２の照明方向の偏斜照明を実現することができる。
図５及び図６は、偏斜照明で第２の照明方向から被観察物体を照明したときの結像光学系の結像特性を示す図である。図５（ａ）は、結像光学系のＸ方向のＭＴＦを示し、図５（ｂ）は、結像光学系のＸ方向のＰＴＦを示し、図５（ｃ）は、結像光学系のＹ方向のＭＴＦを示し、図５（ｄ）は、結像光学系のＹ方向のＰＴＦを示し、図６は、結像光学系のＸ方向のＭＴＦとＸ方向のＰＴＦの積を示している。
第２の照明方向は光軸ＡＸに対して第１の照明方向と略対称である。このため、図５（ａ）から図５（ｄ）で例示される第２の照明方向の偏斜照明での結像光学系のＰＴＦ及びＭＴＦと、図２（ａ）から図２（ｄ）に例示される第１の照明方向の偏斜照明での結像光学系のＰＴＦ及びＭＴＦとは、空間周波数０を軸として略対称な関係にある。従って、図６に例示される第２の照明方向の偏斜照明での結像光学系のＸ方向のＭＴＦとＰＴＦの積と、図３に例示される第１の照明方向の偏斜照明での結像光学系のＸ方向のＭＴＦとＰＴＦの積も、空間周波数０を軸として略対称な関係となる。
ＭＴＦとＰＴＦの積は、上述したように、位相分布画像のコントラストを決定するパラメータである。このため、ＭＴＦとＰＴＦの積が略対称な関係にある第１の照明方向からの偏斜照明と第２の照明方向からの偏斜照明では、得られる位相分布画像のコントラストも略反転している。すなわち、偏斜照明の照明方向を光軸に対して略対称とすることで、コントラストが反転した位相分布画像が得られることになる。
次に、図７を参照しながら、コントラストが反転した位相分布画像（第１の電子画像）を用いて、より高いコントラストを有する位相分布画像（第２の電子画像）が生成できることについて説明する。
図７は、図３に例示されるＭＴＦとＰＴＦの積と図６に例示されるＭＴＦとＰＴＦの積とを差演算した結果を示す図である。
図７に例示されるように、第１の照明方向の偏斜照明で得られるＭＴＦとＰＴＦの積から、第２の照明方向の偏斜照明で得られるＭＴＦとＰＴＦの積を、差演算して得られるＭＴＦとＰＴＦの積は、原点に対して対称な奇関数となる。より具体的には、差演算の結果として得られるＭＴＦとＰＴＦの積は、演算前の２つのＭＴＦとＰＴＦの積の空間周波数範囲を包含し、且つ、より大きな値を有する奇関数であり、Ｘ方向にレリーフ状（微分像）のコントラストを有する像強度分布が得られる。
また、第１の照明方向の偏斜照明で得られる像強度分布から第２の照明方向の偏斜照明で得られる像強度分布を差演算すると、式（４）に含まれるバックグランド成分（ＢＧＣ）が取り除かれる。従って、差演算により得られる位相分布画像（第２の電子画像）は、Ｘ方向にレリーフ状のコントラストを有する像強度分布のみを有する画像となる。
以上のように、偏斜照明で異なる照明方向（特に、照明光学系の光軸に対して略対称な照明方向）から照明することで、コントラストが略反転した位相分布画像（第１の電子画像）を得ることが可能である。さらに、コントラストが略反転した位相分布画像を演算（特に、差演算）することで、より高いコントラストを有する位相分布画像（第２の電子画像）を生成することができる。
また、図７に例示されるように、偏斜照明で異なる照明方向から照明して得られた位相分布画像を用いることで、一定の方向から照明して得られた位相分布画像よりも、広い空間周波数範囲を再現することができる。
また、差演算により得られる位相分布画像（第２の電子画像）は、被観察物体の位相分布を微分して得られる微分像である。位相分布画像（第２の電子画像）の空間周波数を用いて、デコンボリューション処理を行うことで、被観察物体の位相分布に比例した像強度分布を得ることができる。このようなデコンボリューション処理については、ISHIWATA Hiroshi, ITOH Masahide, YATAGAI Toyohiko, 「A new method of three-dimensional measurement by differential interference contrast microscope」, Opt. Commun, ２００６年４月１日, Vol.260, No.1, pp.117-126で開示されている。従って、被観察物体の位相分布を求めることができる。
以下、図面を参照しながら、上記方法を実施する可視化装置ついて各実施例で説明する。
図８は、本実施例に係る顕微鏡装置の構成を例示した図である。図９は、図８に例示される顕微鏡装置に含まれる偏斜照明手段の上面図である。
図８に例示される顕微鏡装置１０は、被観察物体である位相物体を可視化する可視化装置であり、光源１１ａとコレクタレンズ１１ｂを含む光源ユニット１１と、光源１１ａからの光を位相物体１３である生体標本に導くコンデンサレンズ１２ａを含む照明光学系１２と、位相物体１３の光学像を像面上に形成する結像光学系１４と、像面に配置された撮像素子１５と、偏光子の制御等を行う制御装置１６と、照明光学系１２による偏斜照明の照明方向を制御する偏斜照明制御手段１８と、を含んでいる。また、制御装置１６には、撮像素子１５から得られる位相物体１３の複数の位相分布画像（第１の電子画像）を演算して、新たな位相分布画像（第２の電子画像）を生成する演算装置１６ａが含まれている。
なお、演算装置１６ａは、制御装置１６の外部に独立して配置され、画像の演算を行うものとしてもよい。
さらに、顕微鏡装置１０は、制御装置１６の演算装置１６ａにより生成された位相分布画像（第２の電子画像）を表示する表示装置１７を含んでいる。結像光学系１４は、対物レンズ１４ａを含んでいて、位相物体１３に対して結像光学系１４の焦点位置をずらして配置されている。
図８に例示されるように、偏斜照明制御手段１８は、照明光学系１２（コンデンサレンズ１２ａ）の瞳位置近傍に配置されている開口を有する偏斜照明手段１９と、第１の偏光方向の光を透過する第１の偏光子である偏光子２０ａと、第１の偏光方向と直交する第２の偏光方向の光を透過する第２の偏光子である偏光子２０ｂと、光の偏光方向を制御する偏光方向制御手段である偏光子２１と、を含んでいる。偏光子２１は、光源１１と偏光子２０ａ及び偏光子２０ｂとの間に、光軸ＡＸと平行な回転軸周りに回転可能に配置されている。また、偏光子２０ａと偏光子２０ｂは、照明光学系１２の光軸ＡＸに対して略対称な位置に配置されている。ここで、偏光子２０a、２０ｂ、２１としてフィルム型の偏光板等が好適に用いられる。
図９に例示されるように、偏斜照明手段１９は、開口１９ａと開口１９ｂと遮光部材１９ｃとからなり、開口１９ａと開口１９ｂは、光軸ＡＸに対して対称な位置に配置されている。
図８及び図９に例示されるように、開口１９ａ上に偏光子２０ａが配置されていて、開口１９ｂ上に偏光子２０ｂが配置されている。また、偏光子２１は開口１９ａと開口１９ｂの両方の上に配置されている。
以上のように構成された顕微鏡装置１０では、偏光子２０ａと偏光子２０ｂと偏光子２１は偏光シャッターとして機能する。このため、偏斜照明手段１９と偏光シャッターからなる偏斜照明制御手段１８は、偏光子２１の回転を制御することで偏光シャッターを動作させて、偏斜照明手段１９からの偏斜照明の方向を制御することができる。従って、顕微鏡装置１０によれば、偏斜照明制御手段１８により異なる照明方向から照明された位相物体１３の位相分布画像を取得することができる。
具体的には、まず、偏光子２１を回転させて、偏光子２０ａが透過する偏光方向（第１の偏光方向）と偏光子２１が透過する偏光方向を一致させて、偏光子２０ｂが透過する偏光方向（第２の偏光方向）と偏光子２１が透過する偏光方向を直交させる。これにより、偏斜照明で開口１９ａからのみ位相物体１３を照明する。換言すると、偏斜照明で第１の照明方向から位相物体１３を照明する。
さらに、偏光子２１を回転させて、偏光子２０ｂが透過する偏光方向（第２の偏光方向）と偏光子２１が透過する偏光方向を一致させて、偏光子２０ａが透過する偏光方向（第１の偏光方向）と偏光子２１が透過する偏光方向を直交させる。これにより、偏斜照明で開口１９ｂからのみ位相物体１３を照明する。換言すると、偏斜照明で第２の照明方向から位相物体１３を照明する。
このような偏斜照明の切り換え動作に連動して、顕微鏡装置１０は、第１の照明方向から位相物体１３が照明されている間に、撮像素子１５から画像を取り込むことで、偏斜照明で第１の照明方向から照明された位相物体１３の位相分布画像を取得することができる。また、第２の照明方向から位相物体１３が照明されている間に、撮像素子１５から画像を取り込むことで、偏斜照明で第２の照明方向から照明された位相物体１３の位相分布画像を取得することができる。
なお、開口１９ａと開口１９ｂが照明光学系１２の光軸ＡＸに対して略対称であるため、第１の照明方向と第２の照明方向は照明光学系１２の光軸ＡＸに対して略対称である。このため、上述したように、第１の照明方向と第２の照明方向で得られる位相分布画像のコントラストは略反転している。従って、得られた２枚の位相分布画像を制御装置１６の演算装置１６ａが差演算することで、より高いコントラストを有する位相分布画像（第２の電子画像）を生成することができる。
また、偏斜照明の照明方向は、偏光子２１の回転により高速に切り換えることができる。従って、異なる照明方向の位相分布画像（第１の電子画像）を高速に取得することが可能であり、制御装置１６の演算装置１６ａにより高速に高いコントラストを有する新たな位相分布画像（第２の電子画像）を生成することができる。
以上、本実施例に係る顕微鏡装置１０によれば、高いコントラストを有する位相分布画像を高速に生成することができる。また、本実施例に係る顕微鏡装置１０では、偏斜照明の照明方向の切り換えを高速化しても、位相物体１３に振動が生じるおそれが少ない。このため、画像生成の高速化に伴う画質の劣化も抑えることができる。また、図８に例示されるように、結像光学系１４内には、光学素子等の追加は不要である。従って、結像光学系１４の透過率を低下させることがないため、蛍光観察との併用に好適である。
さらに、位相分布画像の取得前に、デフォーカス量を調整してもよい。デフォーカス量を調整することによりコントラストと解像度のバランスのとれた位相分布画像を取得することができる。このため、顕微鏡装置１０により得られる位相分布画像のコントラストと解像度のバランスを改善することができる。また、デフォーカス量を焦点深度内に抑えることで、蛍光観察との併用または同時観察を良好な性能で実現することができる。また、デフォーカス量を調整することで予め得られる空間周波数範囲が特定できる。このため、この空間周波数範囲を用いてデコンボリューション処理を行うことにより、差演算により得られるレリーフ状のコントラストを有する画像（微分画像）ではなく、位相物体１３の位相分布に対応した像強度分布を有する画像を生成することができる。
なお、位相物体１３である生体標本の厚みを考慮すると、デフォーカス量の調整は必須の作業ではない。このため、高いコントラストを有する位相分布画像をより簡単な操作で生成することが可能であり、位相分布画像生成の作業工程を簡素化することができる。
また、図８では、偏光子２０ａと偏光子２０ｂと偏光子２１とからなる偏光シャッターを例示しているが、特にこれに限られない。
例えば、偏光子を用いず、図１（ｂ）の瞳位置に配置された開口パターンを回転させるものとしても良い。
また、偏光子２１の代わりに偏光子と液晶素子からなる偏光方向を回転させる液晶デバイスを用いても良い。液晶デバイスを用いて、液晶デバイスから射出される光の偏光方向を、偏光子２０ａを透過する偏光方向（偏光子２０ｂを透過する偏光方向）に対して平行または直交（直交又は平行）となるように制御することで、偏光子２１を回転させる場合に比べて、さらに偏斜照明の照明方向の切り換えを高速化することができる。
また、例えば、偏光子２０ａ、偏光子２０ｂ、及び偏光子２１の代わりに交互に開口パターンを表示させる液晶表示装置を用いても良い。液晶表示装置を用いて、液晶表示装置に表示される開口パターンの位置を第１の位置（偏光子２０ａに相当する位置）と第２の位置（偏光子２０ｂに相当する位置）で高速に切り換えることによっても、偏斜照明の照明方向を高速に切り換えることができる。
図１０は、本実施例に係る顕微鏡装置の構成を例示した図である。図１１は、図１０に例示される顕微鏡装置に含まれる偏斜照明制御手段の上面図である。
図１０に例示される顕微鏡装置３０は、光源ユニット１１の代わりにＬＥＤ光源３１を、偏斜照明制御手段１８の代わりに偏斜照明制御手段３８を含む点を除いて、図８に例示される顕微鏡装置１０と同様である。このため、以降では、図８に例示される顕微鏡装置１０と同一の構成要素には同一の符号を付して説明を省略する。
図１０及び図１１に例示されるように、本実施例に係る顕微鏡装置３０の偏斜照明制御手段３８は、ＬＥＤ光源３１と瞳位置近傍に配置された偏斜照明手段３９とから構成されている。
図１１に例示されるように、偏斜照明手段３９は、開口３９ａ（第１の開口）、開口３９ｂ（第２の開口）、開口３９ｃ（第３の開口）、開口３９ｄ（第４の開口）、及び遮光部材３９ｅから構成されている。開口３９ａと開口３９ｂはＸ軸と平行に、開口３９ｃと開口３９ｄはＹ軸と平行に、並べられていている。つまり、開口３９ａと開口３９ｂの組み合わせと開口３９ｃと開口３９ｄの組み合わせは、互いに直交な方向に配置されている。また、開口３９ａと開口３９ｂ、及び、開口３９ｃと開口３９ｄは、それぞれ光軸ＡＸに対して対称な位置に配置されている。
図１１に例示されるように、ＬＥＤ光源３１は、コンデンサレンズ１２ａの瞳位置近傍に配置された４つのＬＥＤ光源（ＬＥＤ光源３１ａ、ＬＥＤ光源３１ｂ、ＬＥＤ光源３１ｃ、ＬＥＤ光源３１ｄ）からなり、不図示の導光素子により瞳面を照明する。ＬＥＤ光源３１ａ（第１の光源）は、瞳面上の開口３９ａを均一に照明し、ＬＥＤ光源３１ｂ（第２の光源）は、瞳面上の開口３９ｂを均一に照明し、ＬＥＤ光源３１ｃ（第３の光源）は、瞳面上の開口３９ｃを均一に照明し、ＬＥＤ光源３１ｄ（第４の光源）は、瞳面上の開口３９ｄを均一に照明する。
以上のように構成された顕微鏡装置３０では、ＬＥＤ光源３１の発光制御により偏斜照明の照明方向を切り換えることができる。従って、顕微鏡装置３０によれば、偏斜照明制御手段３８により異なる照明方向から照明された位相物体１３の位相分布画像を取得することができる。
具体的には、ＬＥＤ光源３１ａを発光し、開口３９ａからのみ位相物体１３を照明する。換言すると、偏斜照明で第１の照明方向から位相物体１３を照明する。その後、ＬＥＤ光源３１ｂを発光し、開口３９ｂからのみ位相物体１３を照明する。換言すると、偏斜照明で第２の照明方向から位相物体１３を照明する。さらに、ＬＥＤ光源３１ｃを発光し、開口３９ｃからのみ位相物体１３を照明する。換言すると、偏斜照明で第３の照明方向から位相物体１３を照明する。さらに、ＬＥＤ光源３１ｄを発光し、開口３９ｄからのみ位相物体１３を照明する。換言すると、偏斜照明で第４の照明方向から位相物体１３を照明する。
このような偏斜照明の切り換え動作に連動して、顕微鏡装置３０は、撮像素子１５から画像を取り込むことで、偏斜照明で第１の照明方向から照明された位相物体１３の位相分布画像、偏斜照明で第２の照明方向から照明された位相物体１３の位相分布画像、偏斜照明で第３の照明方向から照明された位相物体１３の位相分布画像、及び、第４の照明方向から照明された位相物体１３の位相分布画像をそれぞれ別々に取得することができる。
なお、開口３９ａと開口３９ｂが照明光学系１２の光軸ＡＸに対して略対称であるため、第１の照明方向と第２の照明方向は照明光学系１２の光軸ＡＸに対して略対称である。このため、上述したように、第１の照明方向と第２の照明方向で得られる位相分布画像のコントラストは略反転している。また、開口３９ｃと開口３９ｄが照明光学系１２の光軸ＡＸに対して略対称であるため、第３の照明方向と第４の照明方向も照明光学系１２の光軸ＡＸに対して略対称である。このため、第３の照明方向と第４の照明方向で得られる位相分布画像のコントラストも略反転している。従って、第１の照明方向と第２の照明方向、または、第３の照明方向と第４の照明方向から得られた位相分布画像を制御装置１６の演算装置１６ａが差演算することで、より高いコントラストを有する位相分布画像（第２の電子画像）を生成することができる。
また、制御装置１６の演算装置１６ａによる差演算により生成される位相分布画像（第２の電子画像）は、レリーフ状のコントラストを有する画像（微分画像）であり、そのレリーフの方向は、照明方向によって変化する。具体的には、第１の照明方向と第２の照明方向で得られる位相分布画像（第１の電子画像）の差演算により生成された位相分布画像（第２の電子画像）と、第３の照明方向と第４の照明方向で得られる位相分布画像（第１の電子画像）の差演算により生成された位相分布画像（第２の電子画像）で、レリーフの方向は直交している。従って、位相物体１３の位相分布に方向性がある場合などには、偏斜照明の方向を選択することで、観察する上でより好ましい位相分布画像を得ることができる。
さらに、第１の照明方向と第２の照明方向で得られる位相分布画像（第１の電子画像）の差演算により生成されたレリーフ状のコントラストを有する位相分布画像（第２の電子画像）と、第３の照明方向と第４の照明方向で得られる位相分布画像（第１の電子画像）の差演算により生成されたレリーフ状のコントラストを有する位相分布画像（第２の電子画像）とを合成することで、任意の方向にレリーフ状のコントラストを有する位相分布画像を生成することができる。従って、観察する上でより好ましい位相分布画像を得ることができる。
また、偏斜照明の照明方向は、ＬＥＤ光源３１の発光制御により高速に切り換えることができる。従って、異なる照明方向の位相分布画像（第１の電子画像）を高速に取得することが可能であり、制御装置１６の演算装置１６ａにより高速に高いコントラストを有する新たな位相分布画像（第２の電子画像）を生成することができる。
以上、本実施例に係る顕微鏡装置３０によれば、実施例１に係る顕微鏡装置１０と同様に、高いコントラストを有する位相分布画像を高速に生成することができる。また、本実施例に係る顕微鏡装置３０では、切り換え動作に機械的な駆動は伴わない。このため、偏斜照明の照明方向の切り換えを高速化しても、位相物体１３に振動が生じるおそれがなく、画像生成の高速化に伴う画質の劣化も生じない。また、図１０に例示されるように、結像光学系１４内には、光学素子等の追加は不要である。従って、結像光学系１４の透過率を低下させることがないため、蛍光観察との併用に好適である。
その他、位相分布画像の取得前にデフォーカス量を調整することで、位相分布画像のコントラストと解像度のバランスを改善することができる点、デフォーカス量を焦点深度内に抑えることで、蛍光観察との併用または同時観察を良好な性能で実現することができる点、デコンボリューション処理を行うことで、位相物体１３の位相分布に対応した像強度分布を有する画像を生成することができる点については、実施例１に係る顕微鏡装置１０と同様である。また、デフォーカス量の調整は必須の作業ではなく、これにより、位相分布画像生成の作業工程を簡素化することができる点も、実施例１に係る顕微鏡装置１０と同様である。
また、図１０では、偏斜照明制御手段３８が４つの照明方向からの偏斜照明を制御する例を示したが、特にこれに限られない。開口及びＬＥＤ光源をさらに増やして、偏斜照明制御手段３８は、６つ以上の照明方向からの偏斜照明を制御してもよい。
図１２は、本実施例に係る顕微鏡装置の構成を例示した図である。図１３は、図１２に例示される顕微鏡装置に含まれる偏斜照明手段の上面図である。図１４は、図１２に例示される顕微鏡装置に含まれるカラーＣＣＤの構成を例示した図である。
図１２に例示される顕微鏡装置４０は、撮像素子１５の代わりにカラーＣＣＤ４５を、偏斜照明制御手段１８の代わりに偏斜照明制御手段４８を含む点を除いて、図８に例示される顕微鏡装置１０と同様である。このため、以降では、図８に例示される顕微鏡装置１０と同一の構成要素には同一の符号を付して説明を省略する。
図１２に例示されるように、本実施例に係る顕微鏡装置４０の偏斜照明制御手段４８は、瞳位置近傍に配置された偏斜照明手段４９と、青色の波長域（第１の波長域）の光を透過するカラーフィルタ５０ａと、赤色の波長域（第２の波長域）の光を透過するカラーフィルタ５０ｂから構成されている。
なお、カラーフィルタ５０ａは、カラーＣＣＤ４５に含まれる青色フィルタと略同帯域または狭帯域の分光特性を有するバンドパスフィルタであることが望ましい。同様に、カラーフィルタ５０ｂは、カラーＣＣＤ４５に含まれる赤色フィルタと略同帯域または狭帯域の分光特性を有するバンドパスフィルタであることが望ましい。
図１３に例示されるように、偏斜照明手段４９は、開口４９ａと開口４９ｂと遮光部材４９ｃとからなり、開口４９ａと開口４９ｂは、光軸ＡＸに対して対称な位置に配置されている。
図１２及び図１３に例示されるように、開口４９ａ上にカラーフィルタ５０ａが配置されていて、開口４９ｂ上にカラーフィルタ５０ｂが配置されている。
以上のように構成された顕微鏡装置４０では、単板式や３板式のカラーＣＣＤ４５を用いることで、偏斜照明制御手段４８により異なる照明方向から照明された位相物体１３の位相分布画像を各色フィルタに対応した画素からの情報を取り出すことで取得することができる。
具体的には、カラーＣＣＤ４５として、図１４（ａ）に例示されるような単板式カラーＣＣＤ５１を用いる場合、単板式カラーＣＣＤ５１には、青色の波長域の光を検出する複数の画素Ｂ、赤色の波長域の光を検出する複数の画素Ｒ、緑色の波長域の光を検出する複数の画素Ｇが設けられている。このため、青色の波長域の光による第１の照明方向からの偏斜照明と赤色の波長域の光による第２の照明方向からの偏斜照明で位相物体１３を同時に照明しながら、単板式カラーＣＣＤ５１により、第１の照明方向から偏斜照明で照明された位相物体１３の位相分布画像と、第２の照明方向から偏斜照明で照明された位相物体１３の位相分布画像とを、照明光の波長域の違いを利用して、それぞれ別々に取得することができる。
なお、単板式カラーＣＣＤ５１の画素の配列としては、図１４（ａ）に例示されるように、緑色の画素が赤色または青色の画素の２倍設けられているベイヤー配列が一般的である。青色と赤色の波長域の光で位相物体１３を照明してベイヤー配列を有する単板式カラーＣＣＤ５１で光を検出する場合、それぞれ単板式カラーＣＣＤ５１の全画素の１／４の画素で光が検出される。従って、補間演算により全画素分のデータが生成されるが、検出に使用される画素数が少ないため生成される位相分布画像（第１の電子画像）の画像情報も減少してしまう。
この点を考慮して、単板式カラーＣＣＤ５１を用いる場合には、カラーフィルタ５０ａ、カラーフィルタ５０ｂの代わりに、それぞれ、緑色の波長域の光を透過するカラーフィルタ５０ｃ、青色と赤色の波長域を含むマゼンダ波長域の光を透過するカラーフィルタ５０ｄを用いても良い。これにより、緑色の波長域の光による第１の照明方向からの偏斜照明と赤色及び青色の波長域の光による第２の照明方向からの偏斜照明で位相物体１３を同時に照明しながら、単板式カラーＣＣＤ５１により、第１の照明方向から偏斜照明で照明された位相物体１３の位相分布画像と、第２の照明方向から偏斜照明で照明された位相物体１３の位相分布画像とを、照明光の波長域の違いを利用して、それぞれ別々に取得することができる。この場合、カラーフィルタ５０ａ及びカラーフィルタ５０ｂを用いて取得する場合に比べて、２倍の画素で光を検出することができるため、より情報量の大きい位相分布画像（第１の電子画像）を得ることができる。
また、カラーＣＣＤ４５として、図１４（ｂ）に例示されるような３板式カラーＣＣＤ５２を用いる場合、３板式カラーＣＣＤ５２には、入射光を赤色、青色、緑色の波長域の光に波長分離するダイクロイックプリズム５３と、分離された各波長域の光を検出する３つのＣＣＤ（赤色用ＣＣＤ５４ａ、緑色用ＣＣＤ５４ｂ、青色用ＣＣＤ５４ｃ）が設けられている。このため、青色の波長域の光による第１の照明方向からの偏斜照明と赤色の波長域の光による第２の照明方向からの偏斜照明で位相物体１３を同時に照明しながら、照明光の波長域の違いを利用して、青色用ＣＣＤ５４ｃにより第１の照明方向から偏斜照明で照明された位相物体１３の位相分布画像を、赤色用ＣＣＤ５４ａにより第２の照明方向から偏斜照明で照明された位相物体１３の位相分布画像を、それぞれ別々に取得することができる。
なお、開口４９ａと開口４９ｂが照明光学系１２の光軸ＡＸに対して略対称であるため、第１の照明方向と第２の照明方向は照明光学系１２の光軸ＡＸに対して略対称である。このため、上述したように、第１の照明方向と第２の照明方向で得られる位相分布画像のコントラストは略反転している。従って、第１の照明方向と第２の照明方向から得られた位相分布画像を制御装置１６の演算装置１６ａが差演算することで、より高いコントラストを有する位相分布画像（第２の電子画像）を生成することができる。
また、顕微鏡装置４０では、偏斜照明の照明方向の切り換え動作は必要ない。従って、異なる照明方向の位相分布画像（第１の電子画像）を高速に取得することが可能であり、制御装置１６の演算装置１６ａにより高速に高いコントラストを有する新たな位相分布画像（第２の電子画像）を生成することができる。
以上、本実施例に係る顕微鏡装置４０によれば、実施例１に係る顕微鏡装置１０と同様に、高いコントラストを有する位相分布画像を高速に生成することができる。また、本実施例に係る顕微鏡装置４０では、切り換え動作は不要である。このため、位相物体１３に振動が生じるおそれがなく、画像生成の高速化に伴う画質の劣化も生じない。また、図１２に例示されるように、結像光学系１４内には、光学素子等の追加は不要である。従って、結像光学系１４の透過率を低下させることがないため、蛍光観察との併用に好適である。
その他、位相分布画像の取得前にデフォーカス量を調整することで、位相分布画像のコントラストと解像度のバランスを改善することができる点、デフォーカス量を焦点深度内に抑えることで、蛍光観察との併用または同時観察を実現することができる点、デコンボリューション処理を行うことで、位相物体１３の位相分布に対応した像強度分布を有する画像を生成することができる点については、実施例１に係る顕微鏡装置１０と同様である。また、デフォーカス量の調整は必須の作業ではなく、これにより、位相分布画像生成の作業工程を簡素化することができる点も、実施例１に係る顕微鏡装置１０と同様である。
図１５は、本実施例に係る顕微鏡装置の構成を例示した図である。図１６は、図１５に例示される顕微鏡装置に含まれる偏光カメラの構成を例示した図である。図１７は、図１５に例示される顕微鏡装置に含まれる偏斜照明手段の上面図である。
図１５に例示される顕微鏡装置６０は、撮像素子１５の代わりに偏光カメラ６５を、偏斜照明制御手段１８の代わりに偏斜照明制御手段６８を含む点を除いて、図８に例示される顕微鏡装置１０と同様である。このため、以降では、図８に例示される顕微鏡装置１０と同一の構成要素には同一の符号を付して説明を省略する。
図１５に例示されるように、本実施例に係る顕微鏡装置６０の偏斜照明制御手段６８は、瞳位置近傍に配置された偏斜照明手段６９と、第１の偏光方向の光を透過する第１の偏光子である偏光子７０ａと、第１の偏光方向と直交する第２の偏光方向の光を透過する第２の偏光子である偏光子７０ｂと、を含んでいる。偏斜照明制御手段６８では、実施例１の偏斜照明制御手段１８と異なり、光軸ＡＸと平行な回転軸周りに回転可能に配置された偏光子２１は省略されている。
図１６に例示されるように、偏光カメラ６５は、偏光方向（図１６の矢印の方向）が４５°ずつ異なる４つの偏光子が２×２に並ぶ４つの画素がそれぞれ４つの偏光方向に対応した光を検出するように、繰り返し配置された複数の画素からなる撮像素子であり、例えば、川上彰次郎、「積層型フォトニック結晶の産業的諸応用」、応用物理、第７７巻、第５号に開示されている。ここでは、偏光カメラ６５は、偏光カメラ６５の４つの偏光子が透過する偏光方向のうち２つの偏光方向を、偏光子７０ａを透過する偏光方向と偏光子７０ｂを透過する偏向方向に一致させて配置されている。
図１７に例示されるように、偏斜照明手段６９は、開口６９ａと開口６９ｂと遮光部材６９ｃとからなり、開口６９ａと開口６９ｂは、光軸ＡＸに対して対称な位置に配置されている。
図１５及び図１７に例示されるように、開口６９ａ上に偏光子７０ａが配置されていて、開口６９ｂ上に偏光子７０ｂが配置されている。
以上のように構成された顕微鏡装置６０では、偏光カメラ６５を用いることで、偏斜照明制御手段６８により異なる照明方向から照明された位相物体１３の位相分布画像を取得することができる。
具体的には、顕微鏡装置６０は、開口６９ａを通過した第１の偏光方向の光による第１の照明方向からの偏斜照明と開口６９ｂを通過した第２の偏光方向の光による第２の照明方向からの偏斜照明で位相物体１３を同時に照明しながら、偏光カメラ６５により、第１の照明方向から偏斜照明で照明された位相物体１３の位相分布画像と、第２の照明方向から偏斜照明で照明された位相物体１３の位相分布画像とを、照明光の偏光方向の違いを利用して、それぞれ別々に取得することができる。
なお、開口６９ａと開口６９ｂが照明光学系１２の光軸ＡＸに対して略対称であるため、第１の照明方向と第２の照明方向は照明光学系１２の光軸ＡＸに対して略対称である。このため、上述したように、第１の照明方向と第２の照明方向で得られる位相分布画像のコントラストは略反転している。従って、第１の照明方向と第２の照明方向から得られた位相分布画像を制御装置１６の演算装置１６ａが差演算することで、より高いコントラストを有する位相分布画像（第２の電子画像）を生成することができる。
また、顕微鏡装置６０では、偏斜照明の照明方向の切り換え動作は必要ない。従って、異なる照明方向の位相分布画像（第１の電子画像）を高速に取得することが可能であり、制御装置１６の演算装置１６ａにより高速に高いコントラストを有する新たな位相分布画像（第２の電子画像）を生成することができる。
以上、本実施例に係る顕微鏡装置６０によれば、実施例１に係る顕微鏡装置１０と同様に、高いコントラストを有する位相分布画像を高速に生成することができる。また、本実施例に係る顕微鏡装置６０では、切り換え動作は不要である。このため、位相物体１３に振動が生じるおそれがなく、画像生成の高速化に伴う画質の劣化も生じない。また、図１５に例示されるように、結像光学系１４内には、光学素子等の追加は不要である。従って、結像光学系１４の透過率を低下させることがないため、蛍光観察との併用に好適である。
その他、位相分布画像の取得前にデフォーカス量を調整することで、位相分布画像のコントラストと解像度のバランスを改善することができる点、デフォーカス量を焦点深度内に抑えることで、蛍光観察との併用または同時観察を実現することができる点、デコンボリューション処理を行うことで、位相物体１３の位相分布に対応した像強度分布を有する画像を生成することができる点については、実施例１に係る顕微鏡装置１０と同様である。また、デフォーカス量の調整は必須の作業ではなく、これにより、位相分布画像生成の作業工程を簡素化することができる点も、実施例１に係る顕微鏡装置１０と同様である。
なお、上述した実施例１から実施例４では、位相物体の一例として、生体標本を例示しているが、特にこれに限らない。例えば、表面に微小な段差を有する金属は、表面の段差により生じる光路長差によって、光に位相差を生じさせる。このため、段差を有する金属も位相物体とみなすことができる。従って、特に明示する場合を除き、本明細書中の“位相物体”には、位相物体とみなすことができるものを含むものとする。
図１８は、本実施例に係る顕微鏡装置の構成を例示した図である。図１９は、図１８に例示される顕微鏡装置による観察に用いられるマルチウェルプレートを例示した図である。図１９（ａ）は、マルチウェルプレートの斜視図であり、図１９（ｂ）は、マルチウェルプレートの断面図である。
図１８に例示される顕微鏡装置８０は、位相物体１３を上方から照明し位相物体１３を下方から観察する倒立顕微鏡として構成されている点、被観察物体である位相物体１３が図１９（ａ）及び図１９（ｂ）に例示されるマルチウェルプレート８１の培養液８３中で培養されている点を除いて、図８に例示される顕微鏡装置１０と同様である。このため、以降では、図８に例示される顕微鏡装置１０と同一の構成要素には同一の符号を付して説明を省略する。
本実施例で用いられるマルチウェルプレート８１は、図１９（ａ）に例示されるように、ウェル８２と呼ばれる小さな容器を複数備えた構造を有している。また、図１９（ｂ）に例示されるように、マルチウェルプレート８１の各ウェル８２には、培養液８３に浸した位相物体１３が配置されている。マルチウェルプレート８１のような培養容器で培養された位相物体を被観察物体とする場合も、スライド標本（プレパラート）として準備された位相物体や段差を有する金属などを被観察物体とする場合と同様に、偏斜照明を用いた上述した方法により可視化することができる。従って、本実施例に係る顕微鏡装置８０によっても、実施例１に係る顕微鏡装置１０と同様に、高いコントラストを有する位相分布画像を高速に生成することができる。
なお、本実施例では、培養容器としてマルチウェルプレートを例示したが、培養容器はマルチウェルプレートに限定されるものではなく、例えば、シャーレ（ディッシュともいう。）であってもよい。
ところで、スライド標本を偏斜照明で照明して観察する場合、主に、上述したように位相物体内の微細構造で回折した光が背景に対するコントラストを生じさせることにより位相物体が可視化される。これに対して、本実施例で例示されるように培養容器に培養された位相物体を偏斜照明で照明して観察する場合は、微細構造で生じる回折光に加えて、位相物体と培養液の境界で屈折した光も位相物体の可視化に寄与する。なお、スライド標本では、細胞を固定する媒質が細胞に近い屈折率であること、細胞が生きているときのような形状を保てないこと等の理由により、細胞と媒質の境界での光の屈折は極微弱となる。このため、屈折した光は生じず、回折光のみが生じるとみなすことができる。
また、回折光による像の形成では、上述したようにＰＴＦとＭＴＦの積がコントラストを決定するパラメータとなっており、位相のずれ具合を示すＰＴＦがＭＴＦと同様に像形成に寄与しているのに対して、輪郭像の形成では、光学系のＰＴＦの影響は限定的である。輪郭像の形成では、ＭＴＦの影響が支配的であり、ＭＴＦは、細胞と培養液との境界での屈折力と光学系に投下される光の強度に依存する。
一般に、ＭＴＦ及びＰＴＦは、照明光学系内に配置する開口の位置と形状によって変化する。このため、開口の位置と形状を調整することで、位相物体の像強度分布を変化させることができる。以下、より好ましい開口の位置と形状について具体的に説明する。
図２０は、開口の位置が異なる偏斜照明手段を例示した図である。図２０（ａ）には、光軸ＡＸ、つまり、瞳中心から比較的近い位置に形成された開口ＡＰ１を有する偏斜照明手段８４が例示されている。図２０（ｂ）には、瞳中心から比較的離れた位置に形成された開口ＡＰ２を有する偏斜照明手段８５が例示されている。
図２１は、図２０に例示される偏斜照明手段を使用して被観察物体を照明したときの結像光学系のＭＴＦを示す図である。図２１（ａ）には、図２０（ａ）に例示される偏斜照明手段８４を使用して被観察物体を照明したときの結像光学系のＭＴＦが示されている。図２１（ｂ）には、図２０（ｂ）に例示される偏斜照明手段８５を使用して被観察物体を照明したときの結像光学系のＭＴＦが示されている。
図２２は、図２１に例示されるＭＴＦとそれと対称なＭＴＦとを差演算した結果を示す図である。図２２（ａ）には、図２１（ａ）に例示されるＭＴＦとそれと対称なＭＴＦとを差演算した結果が示されている。図２２（ｂ）には、図２１（ｂ）に例示されるＭＴＦとそれと対称なＭＴＦとを差演算した結果が示されている。
図２１（ａ）及び図２１（ｂ）に示されるように、開口ＡＰ１を有する偏斜照明手段８４を用いることで、開口ＡＰ２を有する偏斜照明手段８５を用いる場合と比較して、ＭＴＦは空間周波数０に対して対称に近い形状を示す。このため、図２１（ａ）及び図２１（ｂ）に示されるＭＴＦと略対称な方向から照明して得られるＭＴＦとの差分を取ると、図２２（ａ）及び図２２（ｂ）に示されるように、開口ＡＰ１を有する偏斜照明手段８４を用いた場合の方が、開口ＡＰ２を有する偏斜照明手段８５を用いた場合に比べて、応答のない低周波領域Ｎが広くなる。
従って、細胞と培養液との境界で生じる屈折光が空間周波数の低い領域に相当することを考慮すると、本実施例で例示されるような培養容器で培養されている位相物体を観察する場合には、偏斜照明手段１９は、瞳中心からある程度離れた位置に形成された開口１９ａ及び開口１９ｂを有することが望ましい。
より具体的には、図２３に例示されるように、結像光学系１４の瞳において、以下の条件式を満たすことが望ましい。
０．４≦ｄ／ｒ ・・・（５）
ここで、ｄは、結像光学系１４の瞳Ｐの中心と偏斜照明手段１９の複数の開口（開口１９ａ、開口１９ｂ）が結像光学系１４の瞳位置に投影された複数の開口像（開口像１４ｂ、開口像１４ｃ）の各々の瞳Ｐの中心に最も近い開口端（以降、内側開口端と記す。）との距離である。即ち、結像光学系１４の瞳Ｐの中心と結像光学系１４の瞳Ｐの中心に最も近い位置に入射する光が結像光学系１４の瞳Ｐを通過する位置との距離である。ｒは、結像光学系１４の瞳半径である。
また、開口像の幅（図２３のｘ方向の長さ）が狭い場合には、特定の周波数領域については良好な応答性能を示すが、高周波領域で良好な応答性能が得られない。このため、細胞（位相物体）内の微細構造を高解像に可視化するためには、偏斜照明手段１９は、スリット幅の広い開口１９ａ及び開口１９ｂを有することが望ましい。
より具体的には、図２３に例示されるように瞳Ｐの中心から瞳半径ｒだけ離れた位置、または、瞳半径ｒよりもさらに離れたに位置に、開口像１４ｂ及び開口像１４ｃの瞳中心に最も遠い開口端（以降、外側開口端と記す。）が形成されることが望ましい。
以上のように、本実施例で例示されるような培養容器で培養されている位相物体を観察する場合には、偏斜照明手段１９は、開口像の内側開口端が結像光学系１４の瞳中心から０．４ｒ以上（ｒは瞳半径）離れて位置し、且つ、開口像の外側開口端が結像光学系１４の瞳中心からｒ以上離れて位置するような開口を有することが望ましい。即ち、瞳中心からある程度離れた位置にあり、且つ、アスペクト比が高すぎない形状を有する開口が望ましい。このような開口を有する偏斜照明手段を用いることで、培養容器で培養されている位相物体を観察する場合であっても、偏斜照明により得られる輪郭像と位相分布画像（回折像）の両方で高いコントラストを実現することができる。
なお、培養容器を用いて位相物体を観察する場合、図１９（ｂ）に例示されるように、培養液の液面が表面張力により凹面に変形する点に留意する必要がある。凹面に変形した液面は、照明光に対して凹レンズのように作用する。このため、位相差顕微鏡では、照明光学系内のリングスリットと結像光学系内の位相膜との共役関係が乱れ、ひいては、位相差分布画像が劣化する。このような変形は、マルチウェルプレート、特に、ウェル数が９６個ある９６穴マルチウェルプレートのようにウェル径が小さなマルチウェルプレートで顕著であり、従って、マルチウェルプレートを用いた観察では、位相差顕微鏡により良好な位相分布画像を得ることは難しい。これに対して、本実施例に係る顕微鏡装置８０では、以下に詳述するように、液面が凹面に変形した場合であっても、劣化が抑制された良好な位相分布画像を得ることができる。
本実施例に係る顕微鏡装置８０では、培養液の液面が凹面である場合には、液面の凹レンズ作用により、液面が平面である場合と比較して、偏斜照明手段１９の開口１９ａ及び開口１９ｂが、結像光学系１４の瞳位置に縮小投影される。しかしながら、上述したように開口像は瞳の周辺部分に投影されるように設計されるため、顕微鏡装置８０では、予め縮小投影されることを考慮して、縮小投影の前後にわたって上式（５）を満たすように偏斜照明手段１９に開口１９を形成することができる。
具体的には、図２４に例示されるように、液面が平面である場合には結像光学系１４の瞳面に開口像１４ｄが投影され、且つ、液面が凹面であり縮小投影される場合には開口像１４ｅが投影されるように、偏斜照明手段１９の開口１９ａを形成すればよい。このように、液面が平面である場合に外側開口端が瞳からはみ出して投影されるように開口を形成することで、凹レンズ作用により開口像が瞳の中心に向って移動しても、上記（５）を満たすことができる。
また、偏斜照明手段１９に開口の形状を調整する機構を設けて、マルチウェルプレートのウェル径に合わせて開口の形状を調整してもよい。このような機構によっても、上記（５）を満たすことができる。
さらに、本実施例に係る顕微鏡装置８０では、液面の凹レンズ作用により、開口像が結像光学系１４の瞳面から光軸方向にずれた位置に投影される。しかしながら、このような開口像の光軸方向へのずれは、偏斜照明手段１９を光軸方向に移動可能に構成することで抑制することが可能である。
なお、マルチウェルプレートのような培養容器で培養された位相物体を観察するための顕微鏡装置は、本実施例に係る顕微鏡装置８０に限られず、実施例１から実施例４のいずれの顕微鏡装置によっても同様に観察することができる。また、式（５）で示した開口像の条件式は、培養容器で培養された位相物体を観察する場合に限られず、スライド標本などの他の標本を観察する場合であっても満足することが望ましい。これは、細胞内には微細構造の他に緩やかに形状が変化する構造も存在し、この様な構造で回折する光は、培養容器で培養された位相物体の境界面で屈折する光と同様に、ＭＴＦの影響も大きく受けるからである。
また、上述した実施例１から実施例５では、顕微鏡の一例として、透過型顕微鏡を例示しているが、特にこれに限らない。明細書により開示される技術は、例えば、落射型顕微鏡に適用してもよい。特に、上記金属を可視化する場合には、落射型顕微鏡に適用することが望ましい。
また、上述した実施例１から実施例５では、位相物体を可視化する装置の一例として、顕微鏡を例示しているが、特にこれに限られない。本明細書により開示される技術は、例えば、検査装置などの他の装置に適用してもよく、位相物体を可視化する任意の可視化装置に適用することができる。
また、上述した実施例１から実施例５では、矩形形状の開口を例示しているが、特にこれに限られない。任意の形状の開口を用いても良く、例えば、開口は円形形状であっても、台形形状であっても良い。また、光軸に対して同心円状に開口を形成してもよい。
１、１３・・・位相物体、２、１２ａ・・・コンデンサレンズ、３、１９、３９、４９、６９、８４、８５・・・偏斜照明手段、３ａ、１９ａ、１９ｂ、３９ａ、３９ｂ、３９ｃ、３９ｄ、４９ａ、４９ｂ、６９ａ、６９ｂ、ＡＰ１、ＡＰ２・・・開口、３ｂ、１９ｃ、３９ｅ、４９ｃ、６９ｃ・・・遮光部材、１０、３０、４０、６０、８０・・・顕微鏡装置、１１・・・光源ユニット、１１ａ・・・光源、１１ｂ・・・コレクタレンズ、１２・・・照明光学系、１４・・・結像光学系、１４ａ・・・対物レンズ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄ、１４ｅ・・・開口像、１５・・・撮像素子、１６・・・制御装置、１６ａ・・・演算装置、１７・・・表示装置、１８、３８、４８、６８・・・偏斜照明制御手段、２０ａ、２０ｂ、２１、７０ａ、７０ｂ・・・偏光子、３１、３１ａ、３１ｂ、３１ｃ、３１ｄ・・・ＬＥＤ光源、４５・・・カラーＣＣＤ、５０ａ、５０ｂ・・・カラーフィルタ、５１・・・単板式カラーＣＣＤ、５２・・・３板式カラーＣＣＤ、５３・・・ダイクロイックプリズム、５４ａ、５４ｂ、５４ｃ・・・ＣＣＤ、６５・・・偏光カメラ、８１・・・マルチウェルプレート、８２・・・ウェル、８３・・・培養液、ＡＸ・・・光軸

Claims (17)

  1. 被観察物体を偏射照明で照明して、異なる照明方向から照明された前記被観察物体の複数の第１の電子画像を取得する工程と、
    前記複数の第１の電子画像を演算して、第２の電子画像を生成する工程と、を含み、
    前記複数の第１の電子画像を取得する工程は、
    ｄを結像光学系の瞳中心と前記結像光学系の瞳中心に最も近い位置に入射する光が前記結像光学系の瞳を通過する位置との距離とし、ｒを前記結像光学系の瞳半径とするとき、以下の条件式
    ０．４≦ｄ／ｒ
    を満たすように前記被観察物体を偏射照明で照明する工程を含む
    ことを特徴とする可視化方法。
  2. 請求項１に記載の可視化方法において、
    前記複数の第１の電子画像を取得する工程は、
    偏射照明で第１の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、
    偏射照明で第２の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、を含み、
    前記第１の照明方向と前記第２の照明方向は、前記被観察物体を照明する照明光学系の光軸に対して略対称である
    ことを特徴とする可視化方法。
  3. 請求項１または請求項２に記載の可視化方法において、さらに、
    前記複数の第１の電子画像を取得する工程の前に、前記被観察物体を、当該被観察物体の光学像を形成する結像光学系の焦点位置から、前記結像光学系の光軸方向にずらした位置に配置する工程を含む
    ことを特徴とする可視化方法。
  4. 請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の可視化方法において、
    前記第２の電子画像を生成する工程は、前記複数の第１の電子画像を差演算する工程を含む
    ことを特徴とする可視化方法。
  5. 請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の可視化方法において、
    前記複数の第１の電子画像を取得する工程は、
    偏射照明で第１の照明方向から前記被観察物体を照明する工程と、
    偏射照明で第２の照明方向から前記被観察物体を照明する工程と、
    偏射照明で前記第１の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、
    偏射照明で前記第２の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、を含み、
    前記第１の照明方向と前記第２の照明方向は、前記被観察物体を照明する照明光学系の光軸に対して略対称である
    ことを特徴とする可視化方法。
  6. 請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の可視化方法において、
    前記複数の第１の電子画像を取得する工程は、
    偏射照明で第１の照明方向と第２の照明方向から同時に前記被観察物体を照明する工程と、
    偏射照明で前記第１の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、
    偏射照明で前記第２の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、を含み、
    前記第１の照明方向と前記第２の照明方向は、前記被観察物体を照明する照明光学系の光軸に対して略対称である
    ことを特徴とする可視化方法。
  7. 請求項１又は請求項２に記載の可視化方法において、
    前記複数の第１の電子画像を取得する工程は、
    偏射照明で第１の照明方向と第２の照明方向から同時に前記被観察物体を照明する工程と、
    偏射照明で前記第１の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、
    偏射照明で前記第２の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、を含み、
    前記第１の照明方向と前記第２の照明方向は、前記被観察物体を照明する照明光学系の光軸に対して略対称であり、
    前記被観察物体を照明する工程は、
    前記照明光学系の瞳位置近傍に配置された偏射照明手段の開口上に配置された第１の偏光子であって、第１の偏光方向の光を透過する第１の偏光子により、前記第１の照明方向から照明し、
    前記開口上で且つ前記照明光学系の光軸に対して前記第１の偏光子と略対称な位置に配置された第２の偏光子であって、前記第１の偏光方向と直交する第２の偏光方向の光を透過する第２の偏光子により、前記第２の照明方向から照明する
    ことを特徴とする可視化方法。
  8. 請求項１又は請求項２に記載の可視化方法において、
    前記複数の第１の電子画像を取得する工程は、
    偏射照明で第１の照明方向と第２の照明方向から同時に前記被観察物体を照明する工程と、
    第１の波長域の光を検出する複数の第１の画素を含む撮像素子により偏射照明で前記第１の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、
    前記第１の波長域と異なる第２の波長域の光を検出する複数の第２の画素を含む前記撮像素子により偏射照明で前記第２の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を取得する工程と、を含み、
    前記第１の照明方向と前記第２の照明方向は、前記被観察物体を照明する照明光学系の光軸に対して略対称であり、
    前記被観察物体を照明する工程は、
    前記照明光学系の瞳位置近傍に配置された偏射照明手段の開口上に配置された前記第１の波長域の光を透過する第１の光学フィルタにより、前記第１の照明方向から照明し、
    前記開口上で且つに前記照明光学系の光軸に対して前記第１の光学フィルタと略対称な位置に配置された第２の光学フィルタであって、前記第２の波長域の光を透過する第２の光学フィルタにより、前記第２の照明方向から照明する
    ことを特徴とする可視化方法。
  9. 光源と、
    前記光源からの光を被観察物体に導く照明光学系と、
    前記被観察物体の光学像を像面上に形成する結像光学系と、
    前記像面に配置された撮像素子と、
    前記撮像素子から得られる前記被観察物体の複数の第１の電子画像を演算して、第２の電子画像を生成する演算装置と、
    前記照明光学系による偏射照明の照明方向を制御する偏射照明制御手段と、を含み、
    前記複数の第１の電子画像は、前記偏射照明制御手段により異なる照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を含み、
    前記偏射照明制御手段は、
    前記照明光学系の瞳位置近傍に配置された、偏斜照明の照明角度を規定する複数の開口を有する偏射照明手段と、
    前記複数の開口の少なくとも１つの開口上に配置された、第１の偏光方向の光を透過する第１の偏光子と、
    前記複数の開口の少なくとも１つの開口上に配置された、前記第１の偏光方向と直交する第２の偏光方向の光を透過する第２の偏光子と、
    前記光源と前記第１の偏光子及び前記第２の偏光子との間に、光の偏光方向を制御する偏光方向制御手段と、を含み、
    前記第１の偏光子と前記第２の偏光子は、前記照明光学系の光軸に対して略対称な位置に配置され、
    ｄを前記結像光学系の瞳中心と前記複数の開口が前記結像光学系の瞳位置に投影された複数の開口像の各々の瞳中心に最も近い開口端との距離とし、ｒを前記結像光学系の瞳半径とするとき、以下の条件式
    ０．４≦ｄ／ｒ
    を満たす
    ことを特徴とする可視化装置。
  10. 光源と、
    前記光源からの光を被観察物体に導く照明光学系と、
    前記被観察物体の光学像を像面上に形成する結像光学系と、
    前記像面に配置された撮像素子と、
    前記撮像素子から得られる前記被観察物体の複数の第１の電子画像を演算して、第２の電子画像を生成する演算装置と、
    前記照明光学系による偏射照明の照明方向を制御する偏射照明制御手段と、を含み、
    前記複数の第１の電子画像は、前記偏射照明制御手段により異なる照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を含み、
    前記偏射照明制御手段は、
    前記照明光学系の瞳位置近傍に配置された、偏斜照明の照明角度を規定する複数の開口を有する偏射照明手段と、
    前記複数の開口の少なくとも１つの開口上に配置された、第１の波長域の光を透過する第１の光学フィルタと、
    前記複数の開口の少なくとも１つの開口上に配置された、前記第１の波長域と異なる第２の波長域の光を透過する第２の光学フィルタと、を含み、
    前記第１の光学フィルタと前記第２の光学フィルタは、前記照明光学系の光軸に対して略対称な位置に配置され、
    前記撮像素子は、
    前記第１の波長域の光を検出する複数の第１の画素と、
    前記第２の波長域の光を検出する複数の第２の画素と、を含み、
    ｄを前記結像光学系の瞳中心と前記複数の開口が前記結像光学系の瞳位置に投影された複数の開口像の各々の瞳中心に最も近い開口端との距離とし、ｒを前記結像光学系の瞳半径とするとき、以下の条件式
    ０．４≦ｄ／ｒ
    を満たすことを特徴とする可視化装置。
  11. 光源と、
    前記光源からの光を被観察物体に導く照明光学系と、
    前記被観察物体の光学像を像面上に形成する結像光学系と、
    前記像面に配置された撮像素子と、
    前記撮像素子から得られる前記被観察物体の複数の第１の電子画像を演算して、第２の電子画像を生成する演算装置と、
    前記照明光学系による偏射照明の照明方向を制御する偏射照明制御手段と、を含み、
    前記複数の第１の電子画像は、前記偏射照明制御手段により異なる照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像を含み、
    前記偏射照明制御手段は、
    前記照明光学系の瞳位置近傍に配置された、偏斜照明の照明角度を規定する複数の開口を有する偏射照明手段と、
    前記複数の開口の少なくとも１つの開口上に配置された、第１の偏光方向の光を透過する第１の偏光子と、
    前記複数の開口の少なくとも１つの開口上に配置された、前記第１の偏光方向と直交する第２の偏光方向の光を透過する第２の偏光子と、を含み、
    前記第１の偏光子と前記第２の偏光子は、前記照明光学系の光軸に対して略対称な位置に配置され、
    前記撮像素子は、
    前記第１の偏光方向の光を検出する複数の第１の画素と、
    前記第２の偏光方向の光を検出する複数の第２の画素と、を含み、
    ｄを前記結像光学系の瞳中心と前記複数の開口が前記結像光学系の瞳位置に投影された複数の開口像の各々の瞳中心に最も近い開口端との距離とし、ｒを前記結像光学系の瞳半径とするとき、以下の条件式
    ０．４≦ｄ／ｒ
    を満たすことを特徴とする可視化装置。
  12. 請求項９乃至請求項１１のいずれか１項に記載の可視化装置において、
    前記複数の第１の電子画像は、
    第１の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像と、
    第２の照明方向から照明された前記被観察物体の第１の電子画像と、を含み、
    前記第１の照明方向と前記第２の照明方向は、前記照明光学系の光軸に対して略対称である
    ことを特徴とする可視化装置。
  13. 請求項９乃至請求項１２のいずれか１項に記載の可視化装置において、
    前記結像光学系は、前記被観察物体に対して当該結像光学系の焦点位置をずらして配置される
    ことを特徴とする可視化装置。
  14. 請求項９乃至請求項１３のいずれか１項に記載の可視化装置において、
    前記演算装置は、前記複数の第１の電子画像を差演算して、前記第２の電子画像を生成する
    ことを特徴とする可視化装置。
  15. 請求項１３または請求項１４に記載の可視化装置において、
    前記偏射照明制御手段は、前記照明光学系の瞳位置近傍に配置された、少なくとも第１の開口と第２の開口を有する前記偏射照明手段を含み、
    前記第１の開口と前記第２の開口は、前記照明光学系の光軸に対して略対称な位置に設けられ、
    前記光源は、
    前記第１の開口を照明する第１の光源と、
    前記第２の開口を照明する第２の光源と、を含む
    ことを特徴とする可視化装置。
  16. 請求項９乃至請求項１５のいずれか１項に記載の可視化装置において、さらに、
    前記演算装置により生成された第２の電子画像を表示する表示装置と、を含む
    ことを特徴とする可視化装置。
  17. 請求項９乃至請求項１６のいずれか１項に記載の可視化装置において、
    前記被観察物体は、液面が凹面に変形した培養液中にあり、前記液面は照明光に対して凹レンズのように作用する
    ことを特徴とする可視化装置。
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