JP6124774B2 - 位相分布計測方法、及び、位相分布計測装置 - Google Patents
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Description
以下では、このような新たな課題を改善して、生体試料の観察領域内の位相分布を精度良く求める方法について、図1を参照しながら説明する。
以下、上述した位相計測方法の実施例について具体的に説明する。
次に、以上のように構成された顕微鏡システム100による位相計測方法について具体的に説明する。
Def1={I1(θ)−I1(−θ)}/{I1(θ)+I1(−θ)−I1(0)}
Def2={I2(θ)−I2(−θ)}/{I2(θ)+I2(−θ)−I2(0)}
Ph1=PhS1+PhG1
Ph2=PhS2+PhG2
なお、図12Aから図12Cの観察波長は550±30nmである。光源2の中にはハロゲンランプと干渉フィルターが配置され、干渉フィルターにより照明光を550±30nmの波長範囲に準単色化している。
なお、白色LED光源を用いることも可能である。その際は実施例1と同様にさらに干渉フィルターを配置することにより準単色化して用いる。
なお、このクリプトの画像は波長488nmのアルゴンレーザを用いたものである。レーザは単色性に優れているので、像コントラストの高い観察が可能となる。
2 光源
3 レンズ
4 視野絞り
5 像コントラスト変化ユニット
5a、33、34 偏光板
5b、36 λ/4板
6、10 ノマルスキープリズム
7 コンデンサレンズ
8 ステージ
9 対物レンズ
11 検光子
12 結像レンズ
13 CCDカメラ
20 コンピュータ
21、22、23、24、26、27 駆動機構
30 位相変調手段
31、32 LED光源
33a、34a 振動方向
40 検出手段
41、42 PMT
50 照明手段
51 レーザ光源
52 ビーム走査装置
53 リレーレンズ
54 ミラー
100、101、102 顕微鏡システム
B1、B2、B3、B11、B12、B13 位相分布
C1、C2、C3 構造
S 生体試料
M1、M2、M3 画像
Claims (20)
- 位相分布を像強度分布に変換する顕微鏡によって形成される生体試料の光学像を像コントラストを変化させながら取り込み、像コントラストの異なる複数枚の画像を形成する像コントラスト画像形成工程と、
前記複数枚の画像に基づいて前記生体試料の位相分布に対応する成分と前記生体試料の位相分布以外に対応する成分とを算出して、前記位相分布に対応する成分を前記生体試料の位相分布以外に対応する成分で割り算することで規格化された位相成分画像を形成する位相成分画像形成工程と、
前記位相成分画像を、画像の空間周波数により複数の周波数成分に分解する空間周波数分解工程と、
前記周波数成分の各々に対して各々に対応する光学的応答特性を用いてデコンボリューション処理を行い、前記生体試料の内部で屈折した光によって形成された屈折成分の位相分布と前記生体試料の内部の構造で回折した光によって形成された構造成分の位相分布を算出する位相分布算出工程と、
前記屈折成分の位相分布と前記構造成分の位相分布を合成して前記生体試料の位相分布を算出する生体試料の位相分布合成工程と、を有する
ことを特徴とする生体試料の内部の位相分布計測方法。 - 請求項1に記載の位相分布計測方法において、
前記空間周波数分解工程は、前記位相成分画像にカーネルサイズが異なるフィルターで画像の平均化処理を行い、画像の空間周波数により前記位相成分画像を、空間周波数が最も低い背景成分と、前記屈折成分と、空間周波数が最も高い前記構造成分と、に分解する
ことを特徴とする位相分布計測方法。 - 請求項1に記載の位相分布計測方法において、
前記顕微鏡は、観察物体の位相分布を像強度分布として撮像する微分干渉顕微鏡であり、さらに、
前記顕微鏡のシァー方向を切り替える工程と、
切り替え前後の2方向のシァー方向で算出された前記生体試料の2つの位相分布を合成する工程と、を有する
ことを特徴とする位相分布計測方法。 - 請求項3に記載の位相分布計測方法において、さらに、
前記2方向のシァー方向で算出された前記構造成分の2つの位相分布の相関からシァー方向を切り替える際に発生する画像の位置ずれ量を算出する工程と、
算出された前記位置ずれ量を用いて切り替え前後の前記2方向のシァー方向で算出した前記生体試料の2つの位相分布の位置ずれを補正する工程と、を有する
ことを特徴とする位相分布計測方法。 - 請求項1に記載の位相分布計測方法において、さらに、
観察面に対するデフォーカス状態での光学的応答特性を用いて前記構造成分にデコンボリューション処理を行って前記構造成分の第2の位相分布を算出する第2位相分布算出工程と、
前記構造成分の第2の位相分布と前記観察面に対する合焦状態での光学的応答特性を用いて算出された前記構造成分の位相分布とを比較する位相分布比較工程と、
位相分布の比較結果に基づいて、前記構造成分の位相分布から前記デフォーカスによるボケが生じた位相分布を取り除くボケ位相分布除去工程と、を有し、
前記生体試料の位相分布合成工程は、前記構造成分の位相分布から前記デフォーカスによるボケが生じた位相分布が取り除かれた位相分布と、前記屈折成分の位相分布とを合成する
ことを特徴とする位相分布計測方法。 - 請求項5に記載の位相分布計測方法において、
前記第2位相分布算出工程は、前記デフォーカスにより発生する位相伝達関数を考慮して算出される光学的応答特性を用いて、前記構造成分にデコンボリューション処理を行う
ことを特徴とする位相分布計測方法。 - 請求項5に記載の位相分布計測方法において、
前記ボケ位相分布除去工程は、前記構造成分の位相分布と前記デフォーカス状態での光学的応答特性を用いて算出された位相分布との差画像を形成して、前記観察面から特定の焦点深度内にある前記構造成分の位相分布を分離する
ことを特徴とする位相分布計測方法。 - 請求項5に記載の位相分布計測方法において、
前記ボケ位相分布除去工程は、
前記構造成分の第2の位相分布から前記顕微鏡の焦点深度から外れた部分を抽出して、抽出した位相分布を前記デフォーカス状態での光学的応答特性でコンボリューションを行いボケが生じた位相分布を算出する工程と、
前記構造成分の位相分布から、算出されたボケが生じた位相分布を引き算する工程と、を有する
ことを特徴とする位相分布計測方法。 - 請求項1または請求項5に記載の位相分布計測方法において、さらに、
観察面に対して焦点面を光軸方向に変化させる焦点面変更工程と、
各焦点面で算出された前記構造成分の位相分布を比較して、前記観察面の上下に存在する前記生体試料の構造から前記観察面に漏れこむ位相分布を識別する漏れ位相分布識別工程と、
識別された位相分布を前記構造成分の位相分布から取り除く漏れ位相分布除去工程と、を有する
ことを特徴とする位相分布計測方法。 - 請求項9に記載の位相分布計測方法において、
位相分布を比較する工程は、
各焦点面で前記焦点面での前記構造成分の位相量が前記焦点面の上下に隣接する焦点面での前記構造成分の位相量よりも大きくなる光軸と直交するXY平面内の領域を抽出する工程と、
抽出した領域の前記構造成分の位相分布に、前記焦点面の上下に隣接する焦点面とのデフォーカスにより発生する位相伝達関数を考慮して算出される光学的応答特性を用いてコンボリューション処理を行う工程と、を有する
ことを特徴とする位相分布計測方法。 - 請求項1に記載の位相分布計測方法において、さらに、
観察面に対して焦点面を光軸方向に変化させる工程と、
各焦点面で算出された前記構造成分の位相分布を比較して前記観察面の前後から連続的に存在する前記生体試料の構造の位相分布を識別する工程と、
識別された前記構造の位相分布を連続的に接続する工程と、を有する
ことを特徴とする位相分布計測方法。 - 生体試料の位相分布を像強度分布に変換する顕微鏡であって、前記像強度分布の像コントラストを変化させる像コントラスト変化ユニットを有する顕微鏡と、
像コントラストの異なる複数枚の画像を取得するように、前記像コントラスト変化ユニットを制御する制御ユニットと、
請求項1に記載の位相分布計測方法により、前記制御ユニットによる制御により取得された前記複数枚の画像から前記生体試料の位相分布を算出する演算ユニットと、を有する
ことを特徴とする位相分布計測装置。 - 生体試料の位相分布を像強度分布に変換する顕微鏡であって、前記像強度分布の像コントラストを変化させる像コントラスト変化ユニットを有する顕微鏡と、
像コントラストの異なる複数枚の画像を取得するように、前記像コントラスト変化ユニットを制御する制御ユニットと、
請求項5に記載の位相分布計測方法により、前記制御ユニットによる制御により取得された前記複数枚の画像から前記生体試料の位相分布を算出する演算ユニットと、を有する
ことを特徴とする位相分布計測装置。 - 生体試料の位相分布を像強度分布に変換する顕微鏡であって、前記像強度分布の像コントラストを変化させる像コントラスト変化ユニットを有する顕微鏡と、
観察面に対して焦点面を光軸方向に変化させる焦点位置制御ユニットと、
像コントラストの異なる複数枚の画像を取得するように、前記像コントラスト変化ユニットを制御する制御ユニットと、
請求項9に記載の位相分布計測方法により、前記制御ユニットによる制御により取得された前記複数枚の画像から、前記観察面の上下に存在する前記生体試料の構造から漏れこむ位相分布を取り除いた前記生体試料の位相分布を算出する演算ユニットと、を有する
ことを特徴とする位相分布計測装置。 - 請求項12乃至請求項14のいずれか1項に記載の位相分布計測装置において、
前記位相分布計測装置は、前記生体試料である培養されているES細胞またはiPS細胞の内部構造を位相分布として計測する
ことを特徴とする位相分布計測装置。 - 請求項15に記載の位相分布計測装置において、
前記位相分布計測装置は、前記ES細胞または前記iPS細胞のコロニー内部で正常な細胞と変異している細胞を判別する
ことを特徴とする位相分布計測装置。 - 請求項15に記載の位相分布計測装置において、
前記位相分布計測装置は、前記ES細胞または前記iPS細胞の未分化状態を識別する
ことを特徴とする位相分布計測装置。 - 請求項12乃至請求項14のいずれか1項に記載の位相分布計測装置において、
前記位相分布計測装置は、ES細胞またはiPS細胞が分化することによって形成された組織内の変位細胞を識別する
ことを特徴とする位相分布計測装置。 - 請求項12乃至請求項14のいずれか1項に記載の位相分布計測装置において、
前記位相分布計測装置は、幹細胞が分化することによって形成された組織内の構造及び変異細胞を識別する
ことを特徴とする位相分布計測装置。 - 請求項12乃至請求項14のいずれか1項に記載の位相分布計測装置において、
前記位相分布計測装置は、生体組織内の変異細胞を標識化することなく識別する
ことを特徴とする位相分布計測装置。
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