JP4883086B2 - 顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡装置に関する。

従来、顕微鏡の被検物は、振幅物体と位相物体に大別される。振幅物体は光の明暗や色を変化させるので、その変化を目やＣＣＤ等の撮像素子でコントラストとして識別できる。一方、位相物体は光の位相を変化させるだけなので、そのままではコントラストが低く識別が難しい。そこで従来より、位相物体の位相変化を識別可能なコントラストに変換する手法が提案されてきた（例えば、特許文献１参照）。
特開平１１−９５１７４号公報

しかしながら、特開平１１−９５１７４号公報の開示例では、位相物体の位相変化を識別可能なコントラストに変換するためには、光源がコヒーレント光源に限定されると言う問題がある。

本発明は、上記課題に鑑みて行われたものであり、顕微鏡で通常使われるハロゲンや水銀ランプ等の白色光源のような広がりを持った光源を用いて位相物体の位相変化を十分なコントラストで観察可能にする顕微鏡装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明の第１の態様は、光源からの照明光を標本に照射する照明光学系と、前記標本からの光を対物レンズで集光し標本像を結像する結像光学系と、前記照明光学系内の前記対物レンズの後側焦点面と共役な面の近傍に配置され、前記照明光を制限する開口を有する開口部材と、前記結像光学系内の前記対物レンズの後側焦点面近傍、または前記後側焦点面の共役面の近傍に配置され、前記標本からの光に１８０度の位相差を与える第１の位相領域と第２の位相領域とを有する位相板とを備え、前記第１の位相領域と前記第２の位相領域との位相境界部分は、前記開口と共役な位置に形成される前記開口の像内に配置されて成ることを特徴とする顕微鏡装置を提供する。

また、本発明の第１の態様によれば、前記開口は、スリット状開口であり、前記位相境界部分は、前記スリット状開口と共役な位置に形成される前記スリット状開口の像の長辺方向と略平行に配置されてなることが好ましい。

また、本発明の第１の態様によれば、前記スリット状開口の短辺方向の幅ｄ１は、以下の条件式（１）を満たすことが好ましい。
（１） ０．０５ ≦ ｄ１／（２×ＮＡ×ｆ×ｍ） ≦ ０．６
但し、
ＮＡ：前記対物レンズの開口数
ｆ：前記対物レンズの焦点距離
ｍ：前記対物レンズの後側焦点面から前記照明光学系内の前記スリット状の開口が配置される面への倍率

また、本発明の第１の態様によれば、前記位相板において、前記位相境界部分をＹ軸とし、前記Ｙ軸と光軸とに垂直な軸をＸ軸、前記Ｙ軸と前記Ｘ軸との交点を原点とするとき、
さらに前記Ｙ軸に対して対称な透過率分布を持ち、前記原点の近傍で前記透過率が最小で前記原点から離れるに従って前記透過率が高くなる透過率制御板を有することが好ましい。

また、本発明の第１の態様によれば、前記位相板において、前記位相境界部分をＹ軸とし、前記Ｙ軸と光軸とに垂直な軸をＸ軸、前記Ｙ軸と前記Ｘ軸との交点を原点とするとき、さらに、前記Ｙ軸に対して対称な透過率分布を持ち、前記原点から離れるにつれて階段状に透過率が高くなる、透過率制御板を有することが好ましい。

また、本発明の第１の態様によれば、前記開口部材の前記開口は、輪帯開口であり、前記位相板の前記位相境界部分は、円形状であり、前記位相境界部分は、前記輪帯開口と共役な位置に形成される前記輪帯開口の像の略中央に配置されてなることが好ましい。

また、本発明の第１の態様によれば、前記輪帯開口の開口幅ｄ２は、以下の条件を満たすことことが好ましい。
０．０２５ ≦ ｄ２／（２×ＮＡ×ｆ×ｍ） ≦ ０．３
但し、
ＮＡ：前記対物レンズの開口数
ｆ：前記対物レンズの焦点距離
ｍ：前記対物レンズの後側焦点面から前記照明光学系内の前記輪帯状開口が配置される
面への倍率

また、本発明の第１の態様によれば、さらに、位相板における、前記開口と共役な位置の透過率を制御する透過率制御板を有し、前記透過率ｔは、略一定であり、以下の条件を満たすことが好ましい。
０ ≦ ｔ ≦ ５０ （単位：％）

また、本発明の第１の態様によれば、さらに、光軸を中心とした同心円状の透過率分布を有する透過率制御板を有し、前記同心円状の透過率分布は、前記位相板の前記輪帯開口と略共役な開口位置で最も透過率が低く、前記輪帯開口と略共役な開口位置から遠ざかるに従って段階的に透過率が高くなり、前記輸帯開口と共役な開口の内周部から前記輪帯開口の中心方向と前記輪帯開口と共役な開口の外周部の外側方向で略対称であることが好ましい。

また、本発明の第１の態様によれば、複数の前記位相板と複数の前記透過率制御板とを有し、前記複数の位相板と前記複数の透過率制御板は、前記結像光学系の光軸に対してそれぞれ独立に交換可能に形成されていることが好ましい。

また、本発明の第１の態様によれば、前記位相板は、前記結像光学系の光軸に対して挿脱可能に形成されていることが好ましい。

また、本発明の第１の態様によれば、前記位相板は、ＸＹＺ軸方向に移動可能であることが好ましい。

本発明によれば、顕微鏡で通常使われるハロゲンや水銀ランプ等の白色光源のような広がりを持った光源を用いて位相物体の位相変化を十分なコントラストで観察可能にする顕微鏡装置を提供することができる。

以下、本発明の実施の形態に関し図面を参照しつつ説明する。以下の実施の形態では、透過型顕微鏡を用いて説明する。

（第１実施形態）
図１は、本発明の第１実施形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図である。

図１において、ハロゲンランプや水銀ランプ等の白色光源１から射出した照明光は、コレクタレンズ２で集光されスリット状の開口３ａを有するスリット部材３を透過し、コンデンサレンズ４を含む照明光学系１０により試料（標本）５を照明する。試料５を透過した光は、対物レンズ６で集光され１８０度の位相差を与えるπ位相板７を透過して結像光学系３０を介して像面８に試料像として形成される。

π位相板７は、対物レンズ６の後側焦点面の近傍に配置され、スリット部材３は、π位相板７と共役な面であるコンデンサレンズ４の前側焦点面近傍に配置される。ここで、対物レンズ６の後側焦点面とコンデンサレンズ４の前側焦点面とは共役の関係にある。なお、π位相板７は結像光学系３０内の対物レンズ６の後側焦点面と共役な面の近傍に配置しても良い。また、スリット部材３は照明光学系１０内のコンデンサレンズ４の前側焦点面と共役な面の近傍に配置しても良い。

ここで、光軸方向をＺ軸とし、光軸に直交する面上にＸＹ軸を設定する。π位相板７はＸＹＺ方向に移動可能である。Ｚ軸方向の移動は、対物レンズ６を交換した際の、対物レンズ６の後側焦点位置の変化に対応するために設けられている。ＸＹ軸方向の移動は、π位相板７の芯だし調整および目視観察時や不図示の撮像素子等による画像取得時のコントラスト調節に使用する。このようにして顕微鏡装置１００が構成されている。

図２Ａ、２Ｂ、２Ｃは、π位相板７とスリット状の開口３ａの詳細を示す説明図である。図２Ａは、図１の矢印Ａ側からπ位相板７を見た図を表し、光軸に垂直なＸＹ軸は互いに垂直で、かつπ位相板７面内に含まれる。図２Ａにおいて、外周円７ａは対物レンズ６の対物瞳の有効径を表し、対物瞳の有効径はｘ＝１、及びｙ＝１に規格化して示している。なお、この規格化は、以降の他の実施形態でも同様である。また図２Ａ中の四角い実線はスリット部材３のスリット状の開口３ａの共役な開口を示し、π位相板７面上に投影したときのスリット状の開口像を示し、符号は同じ３ａで示す。図２Ｂは、π位相板７面上における対物瞳径に対応したＸ軸方向の透過率分布を表し、図２Ｃは、π位相板７の位相分布を示す。π位相板７は、Ｙ軸を基準に、−Ｘ側に位相差−π／２の位相板７ｅを、＋Ｘ側に位相差＋π／２の位相板７ｆを有し、両者の境界である位相境界部７ｃがＹ軸と一致している場合を示している。なお、ここでは位相板７ｅが−π／２、位相板７ｆが＋π／２であり、両方で位相差πを有する場合について説明したが、位相板７ｅを通過する標本からの光に対して、位相板７ｆを通過する標本からの光がπ（１８０°）の位相差を持つように構成すれば良く、上記構成に限定されることはない。また、π位相板７の透過率分布や位相分布が外周円７ａよりも外側でもゼロでない値を持つ理由は、π位相板７をＸＹ軸方向に移動した時に対物レンズ６の瞳の有効径がケラレないためである。

次に、結像シミュレーションについて説明する。

図２Ｃの外周円７ａ内におけるＸ軸方向の位相分布Ｆ(ｘ)を式(ａ１)に示す。
Ｆ(ｘ)＝ｉ ・ ｓｇｎ(ｘ)、
ここで、 ｓｇｎ(ｘ)＝ １、 ０＜ｘ≦１
０、 ｘ＝０
-１、 −１≦ｘ＜０ (ａ１)

(ａ１)式は、１次元ヒルベルト変換の周波数空間における伝達関数である。位相分布図２Ｃがｘ＝０を境界として位相差がπであるため、位相分布をもつ試料５を通過した光はその約半分がπの位相シフトを受けて像面８に到達し干渉する。その結果、試料５の位相分布が像面８にて強度分布として可視化される。

試料５における位相分布が像面８で試料像として可視化される様子を以下に説明する。

簡単のために１次元(Ｘ軸方向)で考える。またスリット状の開口３ａが無限小ピンホールであると仮定する。試料５を点光源で照明した試料５の振幅分布をｓ（ｘ’）、そのフーリエ変換をＳ（ｘ）とし、像面８における試料像の振幅分布をｇ（ｘ’）、そのフーリエ変換をＧ(ｘ)とする。Ｓ（ｘ）、Ｇ（ｘ）、Ｆ（ｘ）は(ａ２)式の関係で表される。
Ｇ(ｘ)＝Ｓ(ｘ)・Ｆ(ｘ) (ａ２)
ここで、試料５として弱位相物体を仮定すると、
ｓ(ｘ’)＝ｅｘｐ（ｉφ（ｘ’））≒1＋ｉφ(ｘ’) (ａ３)
であり、試料５による回折光はそのフーリエ変換Ｓ(ｘ)で与えられる。
Ｓ（ｘ）＝δ(ｘ)＋Φ(ｘ) (ａ４)
ただしΦ(ｘ)はφのフーリエ変換である。
(ａ２)式に代入すると、位相分布成分φ(ｘ)が残る。
Ｇ(ｘ)＝Φ(ｘ)・Ｆ(ｘ) (ａ５)

Ｆ(ｘ)はヒルベルト変換の周波数空間における伝達関数であるから、φ(ｘ’)のヒルベルト変換をφＨ(ｘ’)とすると、像振幅分布ｇ(ｘ’)は、
ｇ(ｘ’)＝φＨ(ｘ’) (ａ６)
像強度分布は、
｜ｇ（ｘ’）｜^２＝φＨ（ｘ’）^２ (ａ７)
となる。

これを像空間に移行すると、試料５を点光源で照明した分布ｓ（ｘ’）に(ａ１)式のフーリエ逆変換ｆ（ｘ’）を点像分布関数として畳み込み積分したものがｇ（ｘ’）となり、(ａ８)式で表す。
ｇ(ｘ’)＝ｓ(ｘ’)＊ｆ（ｘ’）、 （＊は畳み込み積分を表す） (ａ８)

図３にｆ（ｘ’）のグラフを示す。図３より、ヒルベルト変換における点像分布は、位相物体に対してコントラストをもち、そのコントラスト形状はいわゆる微分像の様子を呈することがわかる。

以下に、理想レンズによる結像シミュレーションの比較結果を示す。

計算条件は生物観察において汎用的な４０倍の対物レンズを想定し、照明光のコヒーレンシーσを、
σ＝ｄ１／（２×ＮＡ×ｆ×ｍ） （０）
で表す。ｄ１は、照明光を制限する開口の開口幅であり、図２Ａのスリット幅ｄ１に対応している。

式（０）において対物レンズ６の開口数ＮＡ＝０．６、対物レンズ６の焦点距離ｆ＝５ｍｍ、対物レンズ６の後側焦点面からスリット部材３が配置される面への倍率ｍ＝１とする。

また試料は、透過率＝１（１００％）、位相差１００ｎｍ、幅Ｗ＝１００μｍ(像面換算)の矩形位相物体が視野中央(ｘ＝０)にあると仮定する。波長はλ＝５８８ｎｍである。

式（０）のσ＝０、すなわち光源１をコヒーレント光源とみなしたときの結像シミュレーション結果を図４Ａ〜４Ｄに示す。ここで、σ＝０とは、開口幅ｄ１が無限小と仮定した場合であり、ｄ１＝０を示すものではない。なお、σ＝０のコヒーレント光源を用いた場合は、スリット部材３は不要であり、本願発明を適用することが無意味となる。図４Ａ〜４Ｄに示す結像シミュレーション結果が得られる。図４Ａは、π位相板７の位相境界部７ｃを光軸に一致させて配置した（原点：ｘ＝０）ときに相当し、図４Ｂ〜４Ｄはπ位相板７の位置をＸ軸方向に０．２ｍｍずつずらしていったときの結像シミュレーション結果である。図４Ａより、いわゆる微分像に類似したコントラスト像が得られているものの、ノイズの多い像であることがわかる。例えば、ｘ値が−５０μｍ以下、およびｘ値が＋５０μｍ以上ではバックグラウンド信号が凸凹の波状になるノイズが見られる。さらに図４Ｂ〜４Ｄに示すようにπ位相板７をＸ軸方向にずらすと、いわゆる擬似レリーフ像のようなコントラスト像が得られるが、同時にＸ軸方向ずらし量に応じた周波数成分のうねりがバックグラウンド信号に乗ってしまうことがわかる。これは、π位相板７のＸ軸方向のずらしが、ずらし量に応じた周波数変調をかけたことに相当することによる。このようなうねり成分がバックグラウンド信号にのるのは顕微鏡像として好ましくない。

このように、σ＝０、すなわち光源１がコヒーレント光源である場合には好ましいコントラスト像を得ることが困難であることがわかる。

次に本発明においてσを、σ＝０．０５、０．１、０．２（スリット幅ｄ１を変えた場合に相当する）の時のｘ＝０における結像シミュレーション結果を図５Ａ〜５Ｃに示す。図５Ａ〜５Ｃにより、照明光学系１０中に各スリット幅ｄ１のスリット状の開口３ａを有するスリット部材３を設ける事により、コントラストはコヒーレント光源（σ＝０：図４Ａ参照）の場合よりも低くなるが、バックグラウンド信号のノイズが明らかに少なくなると共に、いわゆる微分像の特性も良くなっている事がわかる。

また、図５Ｄは、σ＝０．１、ｘ＝０．３ｍｍの結像シミュレーション結果である。Ｘ軸方向のずらしによりコントラストがいわゆる擬似レリーフ像を形成するが、図４Ｃに比べてバックグラウンド信号に周波数変調成分のうねりは発生せず、ほぼ均一なバックグラウンド信号が得られることが判る。これは、スリット幅ｄ１の範囲内で周波数変調成分が積算されて平均化される効果によるものである。この効果は計算によれば図５Ａのσ＝０．０５では不足しておりバックグラウンド信号に凸凹の波状のノイズが残るが、図４Ａに比較すると実用上問題ない程度のノイズである。図５Ｂのσ＝０．１では、さらにノイズが減少し良好なコントラスト像が得られる。この結果から、σの下限値が０．０５程度であることがわかる。なお、本発明の効果を確実にするためには、σの下限値を０．１にする事が好ましい。

このような背景の積算効果は、σの値を大きくするほど高くなる傾向にあるが、一方で図５Ａ〜５Ｃのようにコントラストが相対的に低くなるので、むやみにσの値を大きくすることはできず、ある上限値が存在することがわかる。以下、σの上限値の条件について考える。

図６は、ｘ＝０においてσの値を変化させたときの、コントラスト値が変化していく様子をＡで示す。図６中には、参考として明視野観察で同じ試料５を観察したときのコントラスト値をＢで示してある。明視野観察におけるコントラスト値はσ＝０のとき最大で０．２２である。少なくとも明視野観察よりもコントラストに優れる必要があることから、これと同じコントラスト値をとるσ値をグラフより求めると約０．６となり、これがσの上限値となる。なお、本発明の効果を確実にするためにはσの上限値を０．５にする事が好ましい。これにより、コントラストをよりよくすることができる。

以上の結果から、本発明にかかる顕微鏡装置１００では、以下の条件式（１）を満足することが望ましい。
（１） ０．０５ ≦ ｄ１／（２×ＮＡ×ｆ×ｍ） ≦ ０．６
但し、ｄ１はスリット状の開口３ａの開口幅、ＮＡは対物レンズ６の開口数、ｆは対物レンズ６の焦点距離、ｍは対物レンズ６の後側焦点面から照明光学系１０内のスリット状の開口３ａが配置される面への倍率である。

また、実用上は、σ＝０．４であるのがより望ましい。もちろん、コントラスト重視、あるいはノイズ低減効果重視の場合にはこの限りではなく、用途や目的に応じて条件式（１）の範囲内でσ値を選択すれば良い。

（第２実施形態）
次に、本発明の第２実施形態にかかる顕微鏡装置について図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、図８Ａ〜８Ｆを参照しつつ説明する。本第２実施形態の顕微鏡装置１００は、第１実施形態の顕微鏡装置１００と光学系の構成は同様でπ位相板の一部に透過率を制御するフィルタを有することが異なるのみであり、構成全体の説明は第１実施形態と同様であり詳細な説明を省略する。

図７Ａ、７Ｂ、７Ｃは、本発明の第２実施形態の顕微鏡装置１００のπ位相板１７の諸特性を示し、図７Ａはπ位相板１７の構成を、図7Ｂはπ位相板１７の透過率特性を、図７Ｃはπ位相板１７の位相特性をそれぞれ示している。

図７Ａにおいて、π位相板１７の外周円１７ａは対物レンズ６の対物瞳の有効径を表している。また図７Ａ中の四角い実線はスリット部材３のスリット状の開口１３ａの共役な開口を示し、π位相板１７面上で観察したときのスリット状の開口像を示し、同じ符号１３ａを付してある。また、このスリット状の開口１３ａを覆うように透過率ｔのフィルタ１８が形成されている。なお、フィルタ１８は、π位相板１７の表面に形成しても良いし、別体に形成してπ位相板１７と一体的に構成しても良い。

図７Ｂは、π位相板１７面上における対物瞳径１７ａに対応したＸ軸方向の透過率分布を表し、フィルタ１８の部分のみ透過率が減少している。図７Ｃは、π位相板１７の位相分布を示し、Ｙ軸を基準に、−Ｘ側に位相差−π／２の位相板１７ｅを、＋Ｘ側に位相差＋π／２の位相板１７ｆを有し、両者の境界である位相境界部１７ｃがＹ軸に一致している場合を示している。なお、ここでは位相板１７ｅが−π／２、位相板１７ｆが＋π／２で位相差πを有する場合について説明したが、位相板１７ｅを通過する標本からの光に対して、位相板１７ｆを通過する標本からの光がπ（１８０°）の位相差を持つように構成すれば良く、上記構成に限定されることはない。このようにして、π位相板１７が形成されている。また、第１実施形態と同様に、スリット幅ｄ１は条件式（１）の範囲を満たしていることが望ましい。

また、スリット幅ｄ１のスリット状の開口１３ａを覆うフィルタ１８の透過率ｔは、５０％以下となるようにしてあるため、図８Ａに示すように、いわゆる直接光（０次光）成分が弱められて第１実施形態と比べると視野は暗くなる。しかし信号光強度比がバックグラウンド信号に対して相対的に強くなるため、結果的にコントラストは第１実施形態よりも向上する。特にＸ軸方向のずらし量が小さい（ｘ＝０近傍）状態でのコントラスト向上効果が高い。用途や目的に応じてフィルタ１８は、適切な透過率ｔを選べば良い。

図８Ａ〜８Ｆは、図７Ａに示すπ位相板１７において、σ＝０．１の場合の結像シミュレーション結果の一例を示し、図８Ａはｔ＝１０％、ｘ＝０、図８Ｂはｔ＝１０％、ｘ＝０．４ｍｍＸ軸方向にずらした場合をそれぞれ示す。シミュレーション条件は、第１実施形態と同様である。図５と比較して、特にｘ＝０（図５Ｂと図８Ａ参照）でのコントラストが向上しているのがわかる。図８Ｃはｔ＝４０％、ｘ＝０、図８Ｄはｔ＝４０％、ｘ＝０．４ｍｍ、図８Ｅはｔ＝５０％、ｘ＝０ｍｍ、図８Ｆはｔ＝５０％、ｘ＝０．４ｍｍにおける結像シミュレーション結果をそれぞれ示している。これらの図から、透過率ｔを上げるにつれてバックグラウンドの光強度が上がり、相対的にコントラストが低くなることが判るが、ｔ＝５０％の場合でも十分実用に耐えるコントラストを保っていることが判る。これらの結果から、透過率ｔは以下の条件式（２）を満たすことが望ましい。
（２） ０≦ ｔ ≦ ５０ （単位：％）

なお、本第２実施形態では、スリット状の開口１３ａの開口幅ｄ１の範囲で透過率ｔが一定となる場合を説明したが、本第２実施形態の変形例として透過率ｔがｘ＝０の位置を最低値として、ｘ＝０からＸ軸方向に沿って離れるに従って透過率ｔが増加する、Ｙ軸を対称軸とする透過率分布とすることもできる。例えば、透過率ｔがｘ値に比例する、ｓｉｎ^２（ｘ）に比例する、或いはｘ値に対して段階的に変化するように構成することができる。

（第３実施形態）
次に、本発明の第３実施形態にかかる顕微鏡装置について説明する。本第３実施形態では、第１実施形態における位相板とスリット部材の構成が異なり、その他の構成は第１実施形態と同様であるため、位相板と開口部材についてのみ説明する。

図９Ａは、本発明の第３実施形態にかかる顕微鏡装置のπ位相板２７と開口部材３に形成した輪帯開口２３ａとの位置関係を示している。すなわち、本第３実施形態では、第１実施形態の図１において、スリット部材３の位置に輪帯幅ｄ２の輪帯開口２３ａを有する開口部材３が配置され、対物レンズ６の後側焦点面近傍には、−π／２の位相差を与える円板状の位相板２７ｅと、その外周側に＋π／２の位相差を与える輪帯状の位相板２７ｆとを有するπ位相板２７が配置されている。また図９Ｂは、π位相板２７の透過率特性を示し、図９Ｃは、π位相板２７の位相差特性をそれぞれ示している。なお、ここでは位相板２７ｅが−π／２、位相板２７ｆが＋π／２で位相差πを有する場合について説明したが、位相板２７ｅを通過する標本からの光に対して、位相板２７ｆを通過する標本からの光がπ（１８０°）の位相差を持つように構成すれば良く、上記構成に限定されることはない。

また図９Ａ、９Ｂ、９Ｃにおいて、位相板２７ｅと位相板２７ｆと境界である円形の位相境界部分２７ｃは、照明光学系１０のπ位相板２７と共役な位置に配置された輪帯幅ｄ２の輪帯開口２３ａのほぼ中央付近に位置付けられるように配置されている。

π位相板２７と輪帯開口２３ａが配置された顕微鏡装置１００により得られる画像は、第１実施形態でｘ＝０としたときに類似している（よってここでは像の計算結果を省略する）。第１実施形態では開口幅ｄ１の方向（即ち、Ｘ軸方向）にしか像が分解を特たないという方向性を有するのに対して、本第３実施形態では輪帯開口２３ａで試料５を輪帯照明しているため、得られる像は方向性を持たないという特徴がある。そのため、得られる２次元像はいわゆるエッジ強調画像のような見え方となる。

また、輪帯開口２３ａの開口幅ｄ２と第１実施形態のスリット状の開口３ａの開口幅ｄ１とは、
ｄ２＝ｄ１／２
の関係を満たしている。この結果、本第３実施形態では、第１実施形態の条件式（１）に相当する条件式（３）を満足することが望ましい。
（３） ０．０２５ ≦ ｄ２／（２×ＮＡ×ｆ×ｍ） ≦ ０．３

条件式（３）の意味するところは、第１実施形態と同様であり説明を省略する。なお、本発明の効果を確実にするために、条件式（３）の下限値を０．０５にする事が好ましい。また、本発明の効果を確実にするためには、条件式（３）の上限値を、０．２５にする事が好ましい。また、本発明の効果を更に確実にするためには、条件式（３）の上限値を０．２０にする事が好ましい。

図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃは、本第３実施形態の変形例を示す。図１０Ａはπ位相板３７を、図１０Ｂはπ位相板３７の透過率特性を、図１０Ｃは位相特性をそれぞれ示している。

図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃにおいて、π位相板３７は輪帯幅ｄ２の輪帯開口２３ａの位置の透過率ｔが、輪帯開口２３ａ以外の部分に比べて低い透過率ｔを有するようにフィルタ３８が形成されている。なお、透過率ｔのフィルタ３８は、π位相板３７面上に形成されてあっても良いし、フィルタ３８を別体に作成してπ位相板３７と一体的に構成しても良い。

また、透過率ｔは、第１実施形態と同様に以下の条件式（２）を満足することが望ましい。
（２） ０ ≦ ｔ ≦ ５０ （単位：％）

このように、輪帯幅ｄ２の輪帯開口２３ａ部分に、透過率ｔのフィルタ３８を設けることによって、得られる試料像は第２実施形態と同様にバックグラウンド光は暗くなり、信号光が相対的に強くなるため、透過率ｔの領域が無い図９の場合にくらべてコントラストが高くなる。

なお、フィルタ部分３８は、上記のように輪帯幅ｄ２に亘って透過率ｔが一定に形成しても良いし、位相差の境界領域３７ｃを最低値とし、境界領域３７ｃに対して対称に透過率ｔが高くなるような透過率分布を有するフィルタ部分３８としても良い。その場合、透過率ｔの変化は、境界領域３７ｃの半径をｒｃとして半径に対し｜ｒ−ｒｃ｜に比例する、ｓｉｎ^２（｜ｒ−ｒｃ｜）に比例する、｜ｒ−ｒｃ｜に応じて段階的に高くなる、などの分布をとることが可能である。

また、位相板２７、３７は、ＸＹＺ軸方向に移動可能に構成されており、その作用、効果は第１実施形態と同様である。

(第４実施形態)
次に、本発明の第４実施形態にかかる顕微鏡装置について説明する。図１１は、本発明の第４実施形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図である。本第４実施形態が第１実施形態から第３実施形態と異なる点は、第１実施形態から第３実施形態では、開口部材とπ位相板がそれぞれ１個の場合であったが、本第４実施形態は、開口部材が複数の開口を有し、それぞれの開口を照明光学系の光軸に挿脱切替可能であり、開口形状に対応したπ位相板を複数有する位相板ホルダを有し結像光学系の光軸に挿脱切替可能に構成されている。第１実施形態と同様の構成には同じ符号を付し説明を省略する。

図１１において、第４実施形態にかかる顕微鏡装置２００は、照明光学系１０中の、対物レンズ６の後側焦点面と共役な位置にスライダー式の開口部材５３が配置され、結像光学系３０の対物レンズ６の後側焦点面の近傍に、スライダー式の位相板ホルダ５７が配置されて構成されている。なお、スライダー式のπ位相板ホルダ５７は結像光学系３０内の対物レンズ６の後側焦点面と共役な面の近傍に配置しても良い。また、スライダー式の開口部材５３は照明光学系１０内のコンデンサレンズ４の前側焦点面と共役な面の近傍に配置しても良い。

スライダー式の開口部材５３には、図１２Ｂに示す、スリット状の開口３ａ、１３ａ、及び輪帯開口２３ａがほぼ同一平面内に配置され、照明光学系１０の光軸に対して交換可能に構成されている。なお、開口３ａは第１実施形態で、開口１３ａは第２実施形態で、開口２３ａは第３実施形態で説明された開口と同等であり構成等の説明を省略する。

スライダー式位相板ホルダ５７には、図１２Ａに示す、スリット状の開口３ａに対して用いられるπ位相板７、スリット状の開口１３ａに対して用いられるフィルタ１８を有するπ位相板１７、及び輪帯開口２３ａに対して用いられるπ位相板２７がほぼ同一平面内に配置され、光軸に対して交換可能に構成されている。なお、π位相板７は第１実施形態で、π位相板１７は第２実施形態で、π位相板２７は第３実施形態で説明されたπ位相板と同等であり構成等の説明を省略する。また、各π位相板７，１７，２７は一つの支持部材５７ａで支持され、光軸に垂直な平面内のＸＹ軸方向に微動可能とするために、支持部材５７ａをＸ軸方向に微動させるための微動機構５８とＹ軸方向に微動させるための微動機構５９とが設けられている。また、スライダー式位相板ホルダ５７はＺ軸方向にも移動可能に構成され、対物レンズ６の変更に伴う後側焦点面の変化に対応可能に構成されている。

本第４実施形態では、上述のように開口部材５３と位相板ホルダ５７が構成されているため、開口３ａ、１３ａ、２３ａとπ位相板７、１７、２７の組合せを必要に応じて切り替えることにより、試料５に応じた最適な観察方法を選択できる。位相板ホルダ５７の支持部材５７ａはＸＹ軸方向に微動可能であり、像のコントラストを調整することができる。なお、本第４実施形態ではスライダ式の開口部材５３及びスライダー式の位相板ホルダ５７で挿脱切り替えを説明したが、ターレット式で回転による挿脱切り替えやその他類似の方法でも良い。

また、開口部がスリット状の開口３ａ、１３ａの場合の開口幅ｄ１は、条件式（１）を満足し、輪帯開口２３ａの場合の開口幅ｄ２は条件式（３）を満足し、フィルタ１８の透過率ｔは条件式（２）を満足する。

図１３及び図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃは、本発明の第４実施形態に係る変形例を示す図である。図１３は変形例にかかる顕微鏡装置２００を、図１４Ａは位相板を示し、図１４Ｂはフィルタを示し、図１４Ｃは両者を組み合わせた状態をそれぞれ示す。本変形例では、π位相板１７と透過率ｔを変えるフィルタ１８とを個別に光軸に挿脱可能に構成してある。また、開口３ａ、１３ａ、２３ａの交換の仕方は前述と同様である。

図１３、図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃにおいて、透過率ｔのフィルタ１８を有するスライダー式フィルタ部材１９とπ位相板１７を有するスライダー式π位相板２０が、結像光学系３０の光軸に挿脱可能に構成されている。スライダー式フィルタ部材１９とスライダー式π位相板２０とは、対物レンズ６の後側焦点面の近傍にそれぞれ挿脱可能に構成されている。なお、スライダー式フィルタ部材１９とスライダー式π位相板２０は、第２実施形態と同様の構成を例示してあり、その作用、効果等の説明は省略する。

本変形例では、照明光学系１０の光軸にスリット状の開口１３ａを挿入し、結像光学系３０の光軸にスライダー式π位相板２０を挿入した場合を示している。スライダー式π位相板２０のみを光路に挿入すると第１実施形態と同様の顕微鏡装置１００となり、さらにスライダー式フィルタ部材１９も結像光学系３０の光軸に挿入するとスライダー式π位相板２０とスライダー式フィルタ部材１９の特性を合わせた特性のπ位相板となり第２実施形態の顕微鏡装置１００が実現できる。さらに透過率分布や位相分布を微妙に変えたもの等をそれぞれ準備し交換することで、多様な観察条件を実現することが可能となる。

また、スライダー式フィルタ部材１９とスライダー式π位相板２０とを、スライダー式開口５３に配設されている開口の形状に対応するスライダー式フィルタ部材及びスライダー式π位相板にそれぞれ交換することで、上述した各実施形態と同様の効果を奏することができる。

また、開口部がスリット状の開口３ａ、１３ａの場合の開口幅ｄ１は、条件式（１）を満足し、輪帯開口２３ａの場合の開口幅ｄ２は条件式（３）を満足し、透過率ｔは条件式（２）を満足する。

なお、上記各実施形態では、透過型顕微鏡の場合について説明したが、反射型顕微鏡でも同様の効果を奏することができる。反射型顕微鏡の場合には、照明光学系と結像光学系とに共用される例えばハーフミラー部材に対して、開口を有する開口部材或いはスライダー式開口部材は照明光学系の光源とハーフミラー部材との間の対物レンズの後側焦点面と略共役な位置に配置し、π位相板またはスライダー式位相板ホルダ或いはフィルタ部材はハーフミラー部材と像面との間の対物レンズの後側焦点面と略共役な位置に配置することが必要である。

なお、上述の実施の形態は例に過ぎず、上述の構成や形状に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。

図１は、本発明の第１実施形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図である。 図２Ａ、２Ｂ、２Ｃは、第１実施形態の顕微鏡装置に配設されたπ位相板に関し、図２Ａは、その構成とスリット状開口の位置関係を示し、図２Ｂはπ位相板の透過率特性を示し、図２Ｃはπ位相板の位相特性をそれぞれ示す。 図３は、図２Ｃに示す位相特性を有するπ位相板の応答特性を示す。 図４Ａ〜４Ｄは、図２Ａに示すπ位相板のσ＝０において、ｘ値を変化させた時の結像シミュレーション結果を示す。 図５Ａ〜５Ｄは、図２Ａに示すπ位相板のｘ＝０において、σ値を変化させた時の結像シミュレーション結果を示す。 図６は、図２Ａに示すπ位相板のｘ＝０において、σ値を変化させた時のコントラストの明視野観察との比較結果を示す。 図７Ａ、７Ｂ、７Ｃは、本発明の第２実施形態に係る顕微鏡装置に配設された透過率ｔのフィルタを有するπ位相板に関し、図７Ａは、その構成とスリット状開口の位置関係を示し、図７Ｂはπ位相板の透過率特性を示し、図７Ｃはπ位相板の位相特性をそれぞれ示す。 図８Ａ〜８Ｆは、図７Ａに示すπ位相板のσ＝０．１において、透過率ｔとｘ値を変化させた時の結像シミュレーション結果を示す。 図９Ａ、９Ｂ、９Ｃは、本発明の第３実施形態に係る顕微鏡装置に配設されたπ位相板に関し、図９Ａは、その構成と輪帯開口の位置関係を示し、図９Ｂはπ位相板の透過率特性を示し、図９Ｃはπ位相板の位相特性をそれぞれ示す。 図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃは、本発明の第３実施形態の変形例であり、図１０Ａは透過率ｔのフィルタを有するπ位相板の構成と輪帯開口の位置関係を示す、図１０Ｂはπ位相板の透過率特性を示す、図１０Ｃはπ位相板の位相特性をそれぞれ示す。 図１１は、本発明の第４実施形態にかかる顕微鏡装置の概略構成図である。 図１２Ａ、１２Ｂは、第４実施形態に用いられるスライダー式開口部材とスライダー式位相板ホルダの一例をそれぞれ示す。 図１３は、本発明の第４実施形態にかかる顕微鏡装置の変形例の概略構成図である。 図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃは、第４実施形態の変形例に関し、図１４Ａはスライダー式フィルタ部材、図１４Ｂはスライダー式π位相板、図１４Ｃは、図１４Ａと図１４Ｂを組み合わせた状態の例を示す。

Claims (12)

1. 光源からの照明光を標本に照射する照明光学系と、
   前記標本からの光を対物レンズで集光し標本像を結像する結像光学系と、
   前記照明光学系内の前記対物レンズの後側焦点面と共役な面の近傍に配置され、前記照明光を制限する開口を有する開口部材と、
   前記結像光学系内の前記対物レンズの後側焦点面近傍、または前記後側焦点面の共役面の近傍に配置され、前記標本からの光に１８０度の位相差を与える第１の位相領域と第２の位相領域とを有する位相板とを備え、
   前記第１の位相領域と前記第２の位相領域との位相境界部分は、前記開口と共役な位置に形成される前記開口の像内に配置されて成ることを特徴とする顕微鏡装置。
2. 前記開口は、スリット状開口であり、
   前記位相境界部分は、前記スリット状開口と共役な位置に形成される前記スリット状開口の像の長辺方向と略平行に配置されてなることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
3. 前記スリット状開口の短辺方向の幅ｄ１は、以下の条件を満たすことを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡装置。
   ０．０５ ≦ ｄ１／（２×ＮＡ×ｆ×ｍ） ≦ ０．６
   但し、
   ＮＡ：前記対物レンズの開口数
   ｆ：前記対物レンズの焦点距離
   ｍ：前記対物レンズの後側焦点面から前記照明光学系内の前記スリット状の開口が配置される面への倍率
4. 前記位相板において、前記位相境界部分をＹ軸とし、前記Ｙ軸と光軸とに垂直な軸をＸ軸、前記Ｙ軸と前記Ｘ軸との交点を原点とするとき、
   さらに、前記Ｙ軸に対して対称な透過率分布を持ち、前記原点の近傍で前記透過率が最小で前記原点から離れるに従って前記透過率が高くなる、透過率制御板を有することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
5. 前記位相板において、前記位相境界部分をＹ軸とし、前記Ｙ軸と光軸とに垂直な軸をＸ軸、前記Ｙ軸と前記Ｘ軸との交点を原点とするとき、
   さらに前記Ｙ軸に対して対称な透過率分布を持ち、前記原点から離れるにつれて階段状に透過率が高くなる透過率制御板を有することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
6. 前記開口部材の前記開口は、輪帯開口であり、
   前記位相板の前記位相境界部分は、円形状であり、
   前記位相境界部分は、前記輪帯開口と共役な位置に形成される前記輪帯開口の像の略中央に配置されてなることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
7. 前記輪帯開口の開口幅ｄ２は、以下の条件を満たすことを特徴とする請求項６に記載の顕微鏡装置。
   ０．０２５ ≦ ｄ２／（２×ＮＡ×ｆ×ｍ） ≦ ０．３
   但し、
   ＮＡ：前記対物レンズの開口数
   ｆ：前記対物レンズの焦点距離
   ｍ：前記対物レンズの後側焦点面から前記照明光学系内の前記輪帯状開口が配置される
   面への倍率
8. さらに、位相板における、前記開口と共役な位置の透過率を制御する透過率制御板を有し、
   前記透過率ｔは、略一定であり、以下の条件を満たすことを特徴とする請求項１から３および７のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
   ０ ≦ ｔ ≦ ５０ （単位：％）
9. さらに、光軸を中心とした同心円状の透過率分布を有する透過率制御板を有し、
   前記同心円状の透過率分布は、前記位相板の前記輪帯開口と略共役な開口位置で最も透過率が低く、前記輪帯開口と略共役な開口位置から遠ざかるに従って段階的に透過率が高くなり、前記輸帯開口と共役な開口の内周部から前記輪帯開口の中心方向と前記輪帯開口と共役な開口の外周部の外側方向で略対称であることを特徴とする請求項６または７に記載の顕微鏡装置。
10. 複数の前記位相板と複数の前記透過率制御板とを有し、
    前記複数の位相板と前記複数の透過率制御板は、前記結像光学系の光軸に対してそれぞれ独立に交換可能に形成されていることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
11. 前記位相板は、前記結像光学系の光軸に対して挿脱可能に形成されていることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
12. 前記位相板は、ＸＹＺ軸方向に移動可能であることを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。

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