WO2014132485A1

WO2014132485A1 - 標本観察方法及び標本観察装置

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Publication number: WO2014132485A1
Application number: PCT/JP2013/078635
Authority: WO
Inventors: 鈴木　良政
Original assignee: オリンパス株式会社
Priority date: 2013-02-28
Filing date: 2013-10-15
Publication date: 2014-09-04
Also published as: EP2963475A4; EP2963475A1; US10241316B2; US20160025959A1

Abstract

標本観察方法であって、標本の電子画像を取得する取得ステップと、電子画像の信号から直流成分を減算する減算ステップと、を有し、取得ステップは明視野観察の状態で行われ、減算ステップにおける電子画像は、第１の所定の状態で取得された画像であって、該第１の所定の状態では、少なくとも、標本の位置と結像光学系の合焦位置とが異なっている。また、標本観察装置１であって、光源２１と、照明光学系と２２、結像光学系３１と、撮像装置３２と、画像処理装置４０と、を有し、照明光学系２２は、光源２１からの照明光を標本Ｓに照射するように配置され、結像光学系３１は、標本Ｓからの光が入射するように配置されると共に、標本Ｓの光学像を形成し、撮像装置３２は光学像の位置に配置され、画像処理装置４０は、上述の標本観察方法を行う。

Description

標本観察方法及び標本観察装置

　本発明は、標本観察方法及び標本観察装置に関するものである。

　標本を平行光束で照明すると、標本からは、非回折光（以下、０次回折光という）と回折光が生じる。顕微鏡では、標本の像は、０次回折光と回折光の合成によって形成される。
　像面における複素振幅Ｅは、例えば、以下の式で表される。
　Ｅ＝Ａ_１ｅ^{−ｉφ１（ｒ）}ｅ^ｉωｔ＋Ａ_２ｅ^{−ｉφ２（ｒ）}ｅ^ｉωｔ
　ここで、
　Ａ_１は０次回折光の振幅、
　Ａ_２は回折光の振幅、
　φ１（ｒ）は０次回折光の位相、
　φ２（ｒ）は回折光の位相、
である。
　像面では光の強度が観測されるため、像面における光の強度Ｉは以下の式で表される。
　Ｉ＝｜Ｅ｜^２＝Ａ_１ ^２＋Ａ_２ ^２＋２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψ
　ここで、
　ψは位相差であって、ψ＝φ１（ｒ）−φ２（ｒ）、
である。
　上述のように、標本の像（光学像）の形成には、０次回折光と回折光が必要である。そこで、以下の説明では、０次回折光と１次回折光とによって、標本の像（光学像）が形成されるものとする。１次回折光の位相は０次回折光の位相に対してπ／２遅れているので、ψ＝０−（−π／２）＝π／２となる。この場合、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψ＝０となるので、位相情報をコントラスト情報として得られない。その結果、合焦位置で、無色透明な標本、例えば、細胞を観察しようとしても、明視野観察では細胞の像はほとんど観察できない。
　無色透明な標本を観察する方法として、位相差観察がある。位相差観察では、位相差顕微鏡が用いられる。この位相差顕微鏡については、様々な提案がされている。その１つに、広い観察範囲で像（位相差像）を観察するために、結像光学系の合焦位置からずらした位置で標本を観察する顕微鏡がある（特許文献１）。特許文献１に開示された顕微鏡は、部分開口と波面導入手段を備えている。部分開口は照明光学系の略瞳位置に配置され、波面導入手段は結像光学系の瞳位置に配置されている。そして、波面導入手段は、結像光学系の瞳の径に応じて大きさが変化する波面を導入するようになっている。
　標本の位置を結像光学系の合焦位置からずらすと、０次回折光と回折光との間に光路長差（位相差）が発生する。この場合、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψ≠０になるので、位相情報をコントラスト情報として得られる。ただし、Ａ_１ ^２の値は、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値に比べると非常に大きい。そこで、特許文献１の顕微鏡では、結像光学系の瞳位置に波面導入手段、すなわち吸収膜を配置してＡ_１の値を小さくしている。

特開２００５−１７３２８８号公報

　特許文献１の顕微鏡では、結像光学系に波面導入手段が配置されている。よって、明視野観察の状態になっているとは言えない。例えば、標本を、無色透明な標本から明暗のある標本に入れ替える。この状態で明視野観察を行うと、標本の像は波面導入手段の影響を受けてしまう。例えば、波面導入手段が吸収膜だと、標本の像が暗くなる。そのため、明暗のある標本を明視野で観察するためには、波面導入手段を光路から取り出す必要がある。特に、波面導入手段が顕微鏡対物レンズ内に設けられている場合は、顕微鏡対物レンズを交換する必要がある。
　本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本、例えば、細胞を観察できる標本観察方法及び標本観察装置を提供することを目的とする。

　上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明の標本観察方法は、標本の電子画像を取得する取得ステップと、電子画像の信号から直流成分を減算する減算ステップと、を有し、取得ステップは明視野観察の状態で行われ、減算ステップにおける電子画像は、第１の所定の状態で取得された画像であって、該第１の所定の状態では、少なくとも、標本の位置と結像光学系の合焦位置とが異なっていることを特徴とする。
　また、本発明の別の標本観察方法は、標本の電子画像を取得する取得ステップと、電子画像の信号から直流成分を減算する減算ステップと、を有し、取得ステップは明視野観察の状態で行われ、減算ステップにおける電子画像は、第２の所定の状態で取得された画像であって、第２の所定の状態になる前に、第１の波長帯域の光で標本の位置と結像光学系の合焦位置を一致させ、該第２の所定の状態では、少なくとも、第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成されており、第２の波長帯域は第１の波長帯域のうちの一部と一致しているか、又は第１の波長帯域とは異なることを特徴とする。
　また、本発明の標本観察装置は、光源と、照明光学系と、結像光学系と、撮像装置と、画像処理装置と、を有し、照明光学系は、光源からの照明光を標本に照射するように配置され、結像光学系は、標本からの光が入射するように配置されると共に、標本の光学像を形成し、撮像装置は光学像の位置に配置され、画像処理装置は、上述の標本観察方法を行うことを特徴とする。

　本発明によれば、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本、例えば、細胞を観察できる標本観察方法及び標本観察装置を提供できる。

　図１は第１実施形態及び第９実施形態の標本観察方法のフローチャートである。
　図２は標本の位置と合焦位置との関係、及び波面収差量を示す図であって、（ａ）は合焦状態のときの図、（ｂ）は非合焦状態（ずれ量ΔＺ＝１０μｍ）のときの図である。
　図３は合焦状態のときの標本の電子画像である。
　図４は非合焦状態（ずれ量ΔＺ＝１０μｍ）のときの標本の電子画像である。
　図５は標本の位置と合焦位置との関係、及び波面収差量を示す図であって、（ａ）は合焦状態のときの図、（ｂ）は非合焦状態（ずれ量ΔＺ＝２０μｍ）のときの図である。
　図６は合焦状態のときの標本の電子画像である。
　図７は非合焦状態（ずれ量ΔＺ＝２０μｍ）のときの標本の電子画像である。
　図８は標本の位置と合焦位置との関係、及び波面収差量を示す図であって、（ａ）は合焦状態のときの図、（ｂ）は非合焦状態（ずれ量ΔＺ＝１０μｍ）のときの図である。
　図９は標本の位置と合焦位置との関係、及び波面収差量を示す図であって、（ａ）は合焦状態のときの図、（ｂ）は非合焦状態（ずれ量ΔＺ＝２０μｍ）のときの図である。
　図１０は第２実施形態の標本観察方法に関する図であって、（ａ）は標本観察方法の簡単なフローチャート、（ｂ）は標本と結像光学系の間隔と、コントラストの関係を示すグラフである。
　図１１は第２実施形態の標本観察方法の詳細なフローチャートである。
　図１２は実施形態の標本観察方法のフローチャートであって、（ａ）は第３実施形態及び第１０実施形態の標本観察方法のフローチャート、（ｂ）は第４実施形態及び第１１実施形態の標本観察方法のフローチャートである。
　図１３は各空間周波数における大きさを示す図であって、（ａ）は減算ステップ実行前の状態、（ｂ）は減算ステップ実行後の状態を示す図である。
　図１４は第５実施形態及び第１２実施形態の標本観察方法のフローチャートである。
　図１５は第１実施形態の標本観察装置の構成を示す図である。
　図１６は第２実施形態の標本観察装置の構成を示す図である。
　図１７は第３実施形態の標本観察装置の構成を示す図であって、（ａ）は、標本観察装置の概略構成を示す図、（ｂ）は光学系の構成を示す図である。
　図１８は照明光の入射方向と回折光の回折方向の関係、及び波面収差量を示す図であって、（ａ）は、照明光の入射方向が光軸と平行である場合、（ｂ）は照明光の入射方向と光軸とのなす角度が小さい場合、（ｃ）は照明光の入射方向と光軸との角度が大きい場合を示す図である。
　図１９は照明光学系がテレセントリック光学系である様子を示す図である。
　図２０は開口数がそれぞれ異なる２つの対物レンズにおける波面収差の様子を示す図である。
　図２１は第１の波長帯域（中心波長λ１＝５５０ｎｍ）と、第２の波長帯域（中心波長λ２＝４５０ｎｍ）と合焦位置の関係、及び波面収差量を示す図であって、（ａ）は第１の波長帯域の光で標本の位置と合焦位置を一致させたときの図、（ｂ）は第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成されているときの図である。
　図２２は第１の波長帯域（中心波長λ１＝５５０ｎｍ）での標本の電子画像である。
　図２３は第２の波長帯域（中心波長λ２＝４５０ｎｍ）での標本の電子画像である。
　図２４は第１の波長帯域（中心波長λ１＝５５０ｎｍ）と、第２の波長帯域（中心波長λ２＝６５０ｎｍ）と合焦位置の関係、及び波面収差量を示す図であって、（ａ）は第１の波長帯域の光で標本の位置と合焦位置を一致させたときの図、（ｂ）は第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成されているときの図である。
　図２５は第１の波長帯域（中心波長λ１＝５５０ｎｍ）での標本の電子画像である。
　図２６は第２の波長帯域（中心波長λ２＝６５０ｎｍ）での標本の電子画像である。
　図２７は第４実施形態の標本観察装置の構成を示す図である。
　図２８は第５実施形態の標本観察装置の構成を示す図である。
　図２９は第６実施形態の標本観察装置の構成を示す図であるって、（ａ）は、標本観察装置の概略構成を示す図、（ｂ）は光学系の構成を示す図である。

　本発明のある態様にかかる実施形態の作用効果を説明する。なお、本実施形態の作用効果を具体的に説明するに際しては、具体的な例を示して説明することになる。しかし、それらの例示される態様はあくまでも本発明に含まれる態様のうちの一部に過ぎず、その態様には数多くのバリエーションが存在する。したがって、本発明は例示される態様に限定されるものではない。
　実施形態の標本観察方法及び標本観察装置について説明する。以下の第１実施形態から第８実施形態までの標本観察方法及び第１実施形態から第３実施形態までの標本観察装置は、明視野観察の状態で用いられるものである。これらの実施形態における明視野観察では、蛍光観察のように、励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタからなる蛍光ミラーユニットは用いられない。よって、明視野観察の状態では、標本が無色透明の場合、標本の像を形成する光（以下、適宜、「結像光」という）の波長帯域は、標本を照明する光（以下、適宜、「照明光」という）の波長帯域のうちの一部と一致しているか、又は結像光の波長帯域と照明光の波長帯域とは一致している。
　また、本実施形態における明視野観察では、位相差観察における位相膜や、微分干渉観察における微分干渉プリズムは用いられない。よって、標本の一点から出た光についてみると、明視野観察の状態では、照明光学系における光の波面の変化と結像光学系における波面の変化はいずれもレンズのみで生じる。
　また、本実施形態における明視野観察では、標本から来る光束の一部を減光するような減光フィルタは用いられない。よって、明視野観察の状態では、標本から標本の像までの間で、結像光に強度変化は生じない（ただし、レンズに起因する強度変化は除く）。
　第１実施形態の標本観察方法は、標本の電子画像を取得する取得ステップと、電子画像の信号から直流成分を減算する減算ステップと、を有し、取得ステップは明視野観察の状態で行われ、減算ステップにおける電子画像は、第１の所定の状態で取得された画像であって、第１の所定の状態では、少なくとも、標本の位置と結像光学系の合焦位置とが異なっていること
を特徴とする。
　第１実施形態の標本観察方法について、図１を用いて説明する。図１は、第１実施形態の標本観察方法及び後述の第９実施形態の標本観察方法のフローチャートである。
　第１実施形態の標本観察方法は、取得ステップＳ１０と、減算ステップＳ２０とを有する。これにより、第１実施形態の標本観察方法では、明瞭な電子画像が得られる。
　第１実施形態の標本観察方法では、まず、取得ステップＳ１０が実行される。取得ステップＳ１０では、標本の電子画像（以下、適宜、「電子画像」という）の取得が行われる。標本の像（光学像）は、結像光学系によって形成される。電子画像の取得では、この像をＣＣＤやＣＭＯＳのような撮像素子で撮像する。撮像によって、標本の像は電子画像（デジタルデータ）に変換される。なお、標本の像は明視野観察の状態で形成されているので、電子画像の取得も明視野観察の状態で行われる。
　取得ステップＳ１０が終わると、減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０では、電子画像の信号に対して直流成分（バイアス成分）の減算が行われる。減算ステップＳ２０における電子画像は、第１の所定の状態で取得された画像である。この第１の所定の状態では、少なくとも、標本の位置と結像光学系の合焦位置（以下、適宜、「合焦位置」という）とが異なっている。
　標本の位置と結像光学系の合焦位置とを異ならせるには、例えば、合焦位置からずれていると思われる位置まで、目測で標本を移動させれば良い。また、まず合焦位置に標本の位置を一致させ、その後、合焦位置から離れる方向に標本を移動させても良い。あるいは、合焦位置が予め分かっている場合、合焦位置からずれた位置を予め決めておくことができるので、その位置まで標本を移動させれば良い。
　減算ステップＳ２０における電子画像は、少なくとも、標本の位置と合焦位置とが異なっているときの画像である。よって、電子画像の取得時には、標本の位置と合焦位置とが異なっている状態、すなわち、標本の位置が合焦位置からずれている状態が含まれる。
　ここで、標本が格子状の位相物体の場合、標本を照明すると、標本から０次回折光と回折光が出てくる。標本の位置が合焦位置からずれている状態では、０次回折光と回折光との間に波面収差の差（光路長差）が発生する。この点ついて、図２~図９を使って説明する。なお、回折光として１次回折光を用いて説明する。また、結像光学系の収差は無収差であるとする。また、結像光学系の合焦位置と標本の位置との差、すなわち、標本の位置の合焦位置からのずれ量を、適宜、ずれ量ΔＺという。
　図２は、標本の位置と合焦位置との関係、及び波面収差量を示す図であって、図２（ａ）は、合焦状態のときの図、図２（ｂ）は、非合焦状態（ずれ量ΔＺ＝１０μｍ）のときの図である。図３は、合焦状態のときの標本の電子画像である。図４は、非合焦状態（ずれ量ΔＺ＝１０μｍ）のときの標本の電子画像である。図５は、標本の位置と合焦位置との関係、及び波面収差量を示す図であって、図５（ａ）は、合焦状態のときの図、図５（ｂ）は、非合焦状態（ずれ量ΔＺ＝２０μｍ）のときの図である。図６は、合焦状態のときの標本の電子画像である。図７は、非合焦状態（ずれ量ΔＺ＝２０μｍ）のときの標本の電子画像である。なお、図３、４、６及び７は、いずれも減算ステップＳ２０が実行された後の画像である。また、図３、４、６及び７における標本は細胞である。
　また、合焦状態とは、標本Ｓの位置が合焦位置と一致した状態のことであって、非合焦状態とは、標本Ｓの位置が合焦位置からずれた状態のことである。また、ずれの方向は、図２（ｂ）と図５（ｂ）のいずれにおいても上方向（結像光学系３１に近づく方向）である。
　また、標本Ｓについては、図２と図５で空間周波数が異なっている。図２と図５では、標本Ｓは、いずれも格子状の位相物体である。ただし、図２における標本Ｓでは、空間周波数が高い（位相の凹凸の周期が短い）。一方、図５における標本Ｓでは、図２の標本Ｓよりも空間周波数が低い（位相の凹凸の周期が図２の標本Ｓよりも長い）。
　また、グラフは瞳位置での波面収差の量を表している。グラフの縦軸は波面収差量（単位は波長）、横軸は瞳面（瞳面上）の中心からの距離を表している。瞳面の中心からの距離は規格化されているので、無名数となっている。横軸の数値０は瞳面の中心位置、数値１は瞳面の最も外側の位置を表している。
　図２（ａ）に示すように、光軸上の一点から出た光には、光線Ｌ_Ｃと光線Ｌ_Ｐとが含まれている。光線Ｌ_Ｃは光軸上を進む光線である。ここで、光線Ｌ_Ｃと瞳面の交点は、瞳面の中心位置に一致している。一方、光線Ｌ_Ｐは、光軸ＡＸに対して所定の角度で結像光学系３１に入射する光線である。ここで、光線Ｌ_Ｐと瞳面の交点は、瞳面の中心から所定の距離だけ離れた位置になっている。
　標本Ｓを照明光（平行光束）で照明すると、標本Ｓから０次回折光と１次回折光が出てくる。ここで、標本Ｓと光軸が交わる点（光軸上の一点）に着目すると、０次回折光は回折されないので、この点から出た０次回折光は光軸上を進んで瞳の中心に到達する。よって、０次回折光は光線Ｌ_Ｃとみなすことができる。一方、１次回折光は所定の方向に回折されるので、この点から出た１次回折光は光軸に対して所定の角度で結像光学系３１に入射する。結像光学系３１に入射した１次回折光は、瞳面の中心から離れた位置に到達する。よって、１次回折光は光線Ｌ_Ｐとみなすことができる。
　まず、標本Ｓが高い空間周波数を持つ場合について説明する。合焦状態では、標本Ｓの位置Ｐ_Ｓは合焦位置Ｐ_Ｆと一致している。この状態では、図２（ａ）のグラフに示すように、瞳面のどの位置においても波面収差量は０になっている。これは、０次回折光における波面収差量と１次回折光における波面収差量が、共に０であることを示している。波面収差量に（２π／λ）を乗じた値は位相量に相当するので、合焦時は、０次回折光と１次回折光のいずれにおいても、位相に変化は生じない。１次回折光の位相は、０次回折光の位相に対してπ／２遅れたままなので、ψ＝０−（−π／２）＝π／２となる。この場合、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψ＝０となるので、位相情報をコントラスト情報として得られない。その結果、電子画像はコントラストが無い画像になる。
　ただし、実際の結像光学系には軸上色収差が残存している。そのため、白色光で標本Ｓを照明すると、波長よっては標本Ｓの位置Ｐ_Ｓと合焦位置Ｐ_Ｆとが一致しなくなる。この場合、結像光には、１次回折光に波面収差量が加わった波長の光が含まれる。そのため、本来であれば、電子画像はコントラストが無い画像になるが、実際には、図３に示すように、電子画像はコントラストを若干持った画像になる。
　一方、非合焦状態では、標本の位置Ｐ_Ｓは合焦位置Ｐ_Ｆからずれている。図２（ｂ）では、標本Ｓの位置Ｐ_Ｓが合焦位置Ｐ_Ｆよりも上方向（結像光学系３１に近づく方向）にずれている。この状態では、図２（ｂ）のグラフに示すように、瞳面の中心では波面収差量は０であるが、瞳面の中心から離れた位置では波面収差が発生する。ここで、波面収差は参照波面に対する実際の波面のずれで、このずれは位相のずれになる。そのため、波面収差が発生している範囲内に、１次回折光の位置があると、１次回折光の位相は、本来持っている位相に波面収差量が加わったものになる。このように、標本Ｓの位置Ｐ_Ｓを合焦位置Ｐ_Ｆからずらすことで、１次回折光の位相を変化させられる。
　図２（ｂ）のグラフに示すように、位置Ｐ_Ｗにおける波面収差量は−λ／４である。そこで、瞳面での１次回折光の位置が位置Ｐ_Ｗ一致するように、合焦位置Ｐ_Ｆからのずれ量ΔＺを調整する。言い換えると、瞳面における１次回折光の位置において波面収差量が−λ／４となるように、ずれ量ΔＺを調整する。図２（ｂ）では、ずれ量ΔＺを１０μｍにすることで、瞳面での１次回折光の位置を位置Ｐ_Ｗに一致させている。
　このようにすることで、０次回折光における波面収差量を０にしたままで、１次回折光における波面収差量を−λ／４にできる。上述のように、波面収差量に（２π／λ）を乗じた値は位相量であるので、非合焦時は、０次回折光については位相に変化は生じないが、１次回折光については位相に変化が生じる。具体的には、１次回折光では、もともとの位相の遅れπ／２に加えて、更に位相がλ／４×（２π／λ）＝π／２遅れる。１次回折光の位相は、０次回折光の位相に対してπ遅れた状態になるので、ψ＝０−（−π）＝πとなる。この場合、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψ≠０となるので、位相情報がコントラスト情報として得られる。その結果、図４に示すように、電子画像は、コントラストを明らかに持った画像になる。よって、この電子画像を、例えば、表示装置に表示すれば、観察者は標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。
　次に、標本Ｓが低い空間周波数を持つ場合について説明する。合焦状態では、標本Ｓの位置Ｐ_Ｓは合焦位置Ｐ_Ｆと一致している。この状態では、図５（ａ）のグラフに示すように、瞳面のどの位置においても波面収差量は０になっている。これは、図２（ａ）と同じである。そのため、電子画像はコントラストが無い画像になる。ただし、上述の理由により、図６に示すように、電子画像は、コントラストを若干持った画像になる。
　一方、非合焦状態では、図５（ｂ）に示すように、標本Ｓの位置Ｐ_Ｓが合焦位置Ｐ_Ｆよりも上方向（結像光学系に近づく方向）にずれている。この状態では、図５（ｂ）のグラフに示すように、瞳面の中心では波面収差量は０であるが、瞳面の中心から離れた位置では波面収差が発生する。ここで、図５における標本Ｓの構造は、図２における標本Ｓの構造と異なる。
　この場合、１次回折光の回折角は、図５（ｂ）と図２（ｂ）とで異なる。図５（ｂ）における回折角は、図２（ｂ）に比べて小さくなる。そのため、瞳面における１次回折光の位置も、図５（ｂ）と図２（ｂ）とで異なる。図５（ｂ）のグラフに示すように、波面収差量が−λ／４となる位置はＰ_Ｗ’となる。位置Ｐ_Ｗ’は、図２の位置Ｐ_Ｗに比べて瞳面の中心に近い位置になっている。
　上述のように、位置Ｐ_Ｗ’における波面収差量は−λ／４である。そこで、瞳面での１次回折光の位置が位置Ｐ_Ｗ’と一致するように、ずれ量ΔＺを調整する。言い換えると、瞳面における１次回折光の位置において波面収差量が−λ／４となるように、ずれ量ΔＺを調整する。図５（ｂ）では、ずれ量ΔＺを２０μｍにすることで、瞳面での１次回折光の位置を位置Ｐ_Ｗ’に一致させている。
　このようにすると、０次回折光における波面収差量を０にしたままで、１次回折光における波面収差量を−λ／４にできる。これは、図２（ｂ）と同じである。そのため、図７に示すように、電子画像は、コントラストを明らかに持った画像になる。よって、観察者は標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。
　図２（ｂ）や図５（ｂ）では、１次回折光における波面収差量が−λ／４になっている。この場合、０次回折光の位相と１次回折光の位相は逆位相の関係になる。逆位相の関係では、０次回折光と１次回折光は弱め合うことになる。よって、電子画像では、背景に比べて標本Ｓが暗くなる。これは、位相差観察におけるダークコントラストに相当する。
　また、回折光の回折角は、標本Ｓが持っている空間周波数によって異なる。例えば、標本Ｓを格子状の位相物体とした場合、格子の間隔が広いということは、標本Ｓが持っている空間周波数が低いということになる。一方、格子の間隔が狭いということは、標本Ｓが持っている空間周波数が高いということになる。ここで、格子の間隔が広いほど回折角は小さく、格子の間隔が狭いほど回折角は大きくなる。よって、標本Ｓが低い空間周波数を持つ場合回折角は小さく、標本Ｓが高い空間周波数を持つ場合回折角は大きくなる。
　細胞には、様々な空間周波数を持つ構造が含まれている。そのため、標本Ｓが細胞の場合、波面収差量が−λ／４となる位置を、どの空間周波数における１次回折光の位置と一致させるかで、標本の像の見え方が変わってくる。
　高い空間周波数における１次回折光の位置で波面収差量が−λ／４となるように、ずれ量ΔＺを調整すると（調整１）、電子画像では、空間周波数の高い部分が明瞭になる。一方、低い空間周波数における１次回折光の位置で波面収差量が−λ／４となるように、ずれ量ΔＺを調整すると（調整２）、電子画像では、空間周波数の低い部分が明瞭になる。
　図４は調整１による電子画像で、図７は調整２による電子画像である。なお、標本は同じである。図４の電子画像と図７の電子画像を比べると、図４の電子画像では細胞の外周（空間周波数が高い部分）が明瞭になっているのに対して、図７の電子画像では細胞の内側（空間周波数が低い部分）が明瞭になっていることがわかる。
　また、ずれの方向は下方向（結像光学系３１から離れる方向）であっても良い。その様子を図８と図９に示す。なお、図８と図９の詳細な説明は、図２と図５と同様であるので省略する。
　図８は標本の位置と合焦位置との関係、及び波面収差量を示す図であって、（ａ）は合焦状態のときの図、（ｂ）は非合焦状態（ずれ量ΔＺ＝１０μｍ）のときの図である。図９は標本の位置と合焦位置との関係、及び波面収差量を示す図であって、（ａ）は合焦状態のときの図、（ｂ）は非合焦状態（ずれ量ΔＺ＝２０μｍ）のときの図である。
　図８（ｂ）や図９（ｂ）では、１次回折光における波面収差量が＋λ／４になっている。この場合、０次回折光の位相と１次回折光の位相は同位相の関係になる。同位相の関係では、０次回折光と１次回折光は強め合うことになる。よって、電子画像では、背景に比べて標本Ｓが明るくなる。これは、位相差観察におけるブライトコントラストに相当する。
　また、電子画像は示さないが、１次回折光の回折角は、図８（ｂ）の方が図９（ｂ）に比べて大きい。よって、図８（ｂ）の電子画像では細胞の外周（空間周波数が高い部分）が明瞭になるのに対して、図９（ｂ）の電子画像では細胞の内側（空間周波数が低い部分）が明瞭になる。
　なお、本実施形態の観察方法では、ずれ量ΔＺはそれほど大きくない。この場合、合焦位置に対して標本Ｓの位置をずらしても、結像光学系３１に対する１次回折光の入射位置はほとんど変化しない。そのため、瞳面での１次回折光の位置も、ほとんど変化しないものとみなせる。よって、標本Ｓの位置を移動させるだけで、１次回折光に追加される波面収差量が−λ／４となるようにできる。
　取得ステップＳ１０が終わると、続いて減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０では、電子画像の信号に対して直流成分（バイアス成分）の減算が行われる。
　上述のように、取得ステップＳ１０では、標本の位置と合焦位置とが異なっている。そのため、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψ≠０になる。この場合、像面における光の強度Ｉは以下のように
なる。
　Ｉ＝Ａ_１ ^２＋Ａ_２ ^２＋２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψ
　ここで、Ａ_１ ^２＋Ａ_２ ^２は標本の像における直流成分（バイアス成分）、すなわち、電子画像の信号うちの直流成分（バイアス成分）を表している。このうち、０次回折光の振幅Ａ_１ ^２は、非常に大きな値を持つ。そこで、減算ステップＳ２０で、Ａ_１ ^２の値を小さくする。このようにすることで、Ａ_１ ^２＋Ａ_２ ^２の値に対して２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値を相対的に大きくできる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。
　以上のように、第１実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本を明瞭に観察できる。
　第２実施形態の標本観察方法は、減算ステップよりも後に比較ステップを有し、取得ステップを少なくとも３回行い、先に取得した電子画像と後に取得した電子画像とを、比較ステップで比較し、所定の条件を満足する電子画像が得られるまで、取得ステップから比較ステップまでを繰り返し行うものである。
　第２実施形態の標本観察方法について、図１０と図１１を用いて説明する。図１０（ａ）は、第２実施形態の標本観察方法の簡単なフローチャート、図１０（ｂ）は、標本と結像光学系の間隔と、コントラストの関係を示すグラフである。また、図１１は、第２実施形態の標本観察方法の詳細なフローチャートである。
　第２実施形態の標本観察方法は、図１０（ａ）に示すように、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０に加え、更に、比較ステップＳ３０−１を有する。比較ステップＳ３０−１は減算ステップＳ２０よりも後に実行される。また、取得ステップＳ１０は少なくとも３回行い、先に取得した電子画像と後に取得した電子画像とを、比較ステップＳ３０−１で比較する。更に、所定の条件を満足する電子画像が得られるまで、取得ステップＳ１０から比較ステップＳ３０−１までを繰り返し行う。これにより、第２実施形態の標本観察方法では、より明瞭な電子画像が自動的に得られる。
　電子画像における画質を評価するものに、コントラストがある。このコントラストは、図１０（ｂ）に示すように、標本Ｓと結像光学系３１の間隔（以下、適宜、「間隔Ｄ」という）によって変化する。間隔Ｄが広い状態から狭まるにつれて、区間Ｘ１ではコントラストは徐々に上昇し、その後、区間Ｘ２ではコントラストは徐々に低下する。続いて、区間Ｘ３ではコントラストは徐々に上昇し、区間Ｘ４ではコントラストは徐々に低下する。
　そこで、画質の高い電子画像を取得するには、間隔Ｄをコントラストが大きいときの間隔にすれば良い。すなわち、間隔Ｄを、区間Ｘ１と区間Ｘ２の境界部分の間隔（以下、適宜、「間隔ＤＭ１」という）、あるは、区間Ｘ３と区間Ｘ４の境界部分の間隔（以下、適宜、「間隔ＤＭ２」という）にすれば良い。
　しかしながら、図１０（ｂ）に示すコントラストの曲線では、コントラストの値によっては、同じコントラストになる間隔Ｄが、区間Ｘ１~区間Ｘ４のそれぞれの区間内に存在する。そのため、最初に電子画像を取得したときの間隔（以下、適宜、「間隔Ｄ１」という）が、区間Ｘ１~区間Ｘ４のうちの、どの区間内に存在するかを特定する必要がある。
　また、最初に取得した電子画像のコントラストが低い場合、コントラストが大きくなるようにする必要がある。しかしながら、間隔Ｄを広い状態から狭くしていった場合、区間Ｘ１と区間Ｘ３ではコントラストは徐々に上昇し、逆に、区間Ｘ２と区間Ｘ４ではコントラストは徐々に低下する。そのため、コントラストを大きくするために、間隔Ｄを広げるようにするのか、狭めるようにするのかを特定する必要がある。
　そこで、比較ステップＳ３０−１では、これらの点を考慮した比較が行われる。第２実施形態の標本観察方法について、図１１を用いてより詳しく説明する。
　まず、取得回数を計測するために、変数ｎに０が設定される（Ｓ３００）。続いて、取得ステップＳ１０（１回目）と減算ステップＳ２０が実行される。なお、この取得ステップＳ１０では、間隔Ｄ１で電子画像の取得が行われる。
　続いて、取得回数の判断が行われる（Ｓ３０１）。ここでは、変数ｎの値が０なので、Ｓ３０１の判断結果はＹＥＳとなる。そこで、変数ｎに１が加算され（Ｓ３０２）、取得した電子画像が記憶部１に保存される（Ｓ３０３）。そして、標本Ｓと結像光学系３１の間隔（間隔Ｄ）が所定量だけ広げられる（Ｓ３０４）。なお、所定量は、予め設定されているものとする。
　Ｓ３０４が終了すると、再び、取得ステップＳ１０（２回目）が実行される。このとき、間隔Ｄが間隔Ｄ１よりも広がった状態で、電子画像の取得が行われる。その後、減算ステップＳ２０が実行され、取得回数の判断が行われる（Ｓ３０１、Ｓ３０５）。ここでは、変数ｎの値が１になっているので、Ｓ３０１の判断結果はＮＯ、Ｓ３０５の判断結果はＹＥＳになる。そこで、変数ｎに１が加算され（Ｓ３０６）、取得した電子画像が記憶部２に保存される（Ｓ３０７）。
　続いて、記憶部１の電子画像と記憶部２の電子画像について、コントラストの比較が行われる（Ｓ３０８）。ここで、判断結果がＹＥＳの場合、すなわち、
　記憶部１の電子画像のコントラスト＞記憶部２の電子画像のコントラスト
の場合、区間Ｘ１内又は区間Ｘ３内に間隔Ｄ１が存在している。
　区間Ｘ１内又は区間Ｘ３内に間隔Ｄ１が存在している場合、コントラストを大きくするためには、間隔Ｄを狭くすれば良い。そこで、間隔Ｄを狭くする指定が行われる（Ｓ３０９）。なお、フローチャートには示していないが、Ｓ３０９では、間隔Ｄを所定量だけ狭める処理も行われる。このときの所定量は、Ｓ３０４での所定量と同じであっても、異なっていても良い。
　一方、判断結果がＮＯ場合、すなわち、
　記憶部１の電子画像のコントラスト＜記憶部２の電子画像のコントラスト
の場合、区間Ｘ２内又は区間Ｘ４内に間隔Ｄ１が存在している。
　区間Ｘ２内又は区間Ｘ４内に間隔Ｄ１が存在している場合、コントラストを大きくするためには、間隔Ｄを広くすれば良い。そこで、間隔Ｄを広くする指定が行われる（Ｓ３１０）。なお、フローチャートには示していないが、Ｓ３１０では、間隔Ｄを所定量だけ広げる処理も行われる。このときの所定量は、Ｓ３０４での所定量と同じであっても、異なっていても良い。更に、記憶部２に保存していた電子画像が記憶部１に保存される（Ｓ３１１）。この記憶部１には、先に取得した電子画像が保存されていることになる。
　ここで、比較ステップＳ３０−１には、Ｓ３０１からＳ３１１までの処理が含まれているが、Ｓ３０１からＳ３１１までの処理は１回だけ行えば良い。よって、取得ステップＳ１０から比較ステップＳ３０−１までを繰り返し行ったとしても、Ｓ３０１からＳ３１１までの処理は繰り返し行われない。
　Ｓ３０９またはＳ３１１が終了すると、再び、取得ステップＳ１０（３回目）が実行される。このとき、間隔Ｄが所定量だけ広がった状態又は狭まった状態で、電子画像の取得が行われる。その後、減算ステップＳ２０が実行され、取得回数の判断が行われる（Ｓ３０１、Ｓ３０５）。ここでは、変数ｎが３になっているので、Ｓ３０１の判断結果はＮＯ、Ｓ３０５の判断結果もＮＯになる。そして、取得した電子画像が記憶部２に保存される（Ｓ３１２）。この記憶部２には、後に取得した電子画像が保存されていることになる。
　続いて、記憶部１の電子画像と記憶部２の電子画像について、コントラストの比較が行われる（Ｓ３１３）。ここで、この比較では、所定の条件として、
　記憶部１の電子画像のコントラスト＞記憶部２の電子画像のコントラスト
を用いる。また、記憶部１には、常にコントラストの高い電子画像が保存されている。
　判断結果がＹＥＳの場合、すなわち、
　記憶部１の電子画像のコントラスト＞記憶部２の電子画像のコントラスト
の場合、所定の条件が満足されたことになる。これは、十分にコントラストの高い電子画像が得られたことを示しているので、比較を終了する。
　一方、判断結果がＮＯ場合、すなわち、
　記憶部１の電子画像のコントラスト＜記憶部２の電子画像のコントラスト
の場合、所定の条件が満足されていないことになる。これは、取得した電子画像のコントラストが十分に高いとは言えないことを意味している。そこで、変数ｎに１が加算され（Ｓ３１４）、取得した電子画像が記憶部１に保存される（Ｓ３１５）。
　更に、指定された間隔変化に従って、間隔Ｄが所定量だけ変化される（Ｓ３１６）。指定された間隔変化とは、間隔Ｄを狭くする変化（Ｓ３０９で指定）や間隔Ｄを広くする変化（Ｓ３１０で指定）のことである。
　Ｓ３１６の終了後、再び、取得ステップＳ１０が実行される。これ以降の処理は、Ｓ３１３における判断結果がＹＥＳになるまで繰り返し行われる。判断結果がＹＥＳになると比較を終了する。
　このように、第２実施形態の標本観察方法では、Ｓ３１３における判断結果がＹＥＳとなるまで繰り返し処理を行う。この繰り返し処理を行うことで、十分にコントラストの高い電子画像が自動的に得られる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。
　なお、Ｓ３１３では、所定の条件を、
　記憶部１の電子画像のコントラスト＞記憶部２の電子画像のコントラスト
とした。しかしながら、以下のように、２つの電子画像のコントラストの差が許容値Ｅよりも小さくなることを、所定の条件にしても良い。
　｜記憶部１の電子画像のコントラスト−記憶部２の電子画像のコントラスト｜＜Ｅ
　また、図１１のフローチャートでは、区間Ｘ１内又は区間Ｘ２内に間隔Ｄ１が存在している場合、最終的に取得される電子画像は間隔ＤＭ１の画像になる。一方、区間Ｘ３内又は区間Ｘ４内に間隔Ｄ１が存在している場合、最終的に取得される電子画像は間隔ＤＭ２の画像になる。
　しかしながら、別の処理を加えて、区間Ｘ１内又は区間Ｘ２内に間隔Ｄ１が存在している場合であっても、間隔ＤＭ２での電子画像が得られるようにしても良い。同様に、区間Ｘ３内又は区間Ｘ４内に間隔Ｄ１が存在している場合であっても、間隔ＤＭ１での電子画像が得られるようにしても良い。この場合、処理の途中で、標本Ｓの位置と結像光学系３１の合焦位置とが一致した状態になるが、この状態になったとしても、取得ステップＳ１０は実行される。なお、別の処理については、説明を省略する。
　以上のように、第２実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
　第３実施形態の標本観察方法は、減算ステップよりも後に増幅ステップを有し、増幅ステップでは、減算ステップ後の電子画像の信号を増幅するものである。
　第３実施形態の標本観察方法について、図１２（ａ）を用いて説明する。図１２（ａ）は、第３実施形態の標本観察方法及び後述の第１０実施形態の標本観察方法のフローチャートである。
　第３実施形態の標本観察方法は、図１２（ａ）に示すように、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０に加え、更に、増幅ステップＳ３０−２を有する。これにより、第３実施形態の標本観察方法では、より明瞭な電子画像が得られる。
　上述のように、Ａ_１ ^２＋Ａ_２ ^２は標本の像の直流成分、すなわち、電子画像の信号うちの直流成分を表している。減算ステップＳ２０では、Ａ_１ ^２の値を小さくすることで、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値をＡ_１ ^２＋Ａ_２ ^２の値に対して相対的に大きくしている。
　これに対して、第３実施形態の標本観察方法では、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０の終了後に、増幅ステップＳ３０−２が実行される。増幅ステップＳ３０−２では、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値を大きくしている（増幅している）。このようにすることで、Ａ_１ ^２＋Ａ_２ ^２の値に対して２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値を相対的により大きくできる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。
　なお、増幅ステップＳ３０−２を、第２実施形態の標本観察方法に用いても良い。この場合、増幅ステップＳ３０−２は、比較ステップＳ３０−１よりも前に実行される。
　以上のように、第３実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
　第４実施形態の標本観察方法は、電子画像の信号をフーリエ変換する変換ステップと、逆フーリエ変換を行う逆変換ステップと、を有し、変換ステップは、減算ステップよりも前に行われ、逆変換ステップは、少なくとも減算ステップよりも後に行われるものである。
　第４実施形態の標本観察方法について、図１２（ｂ）と図１３を用いて説明する。図１２（ｂ）は、第４実施形態の標本観察方法及び後述の第１１実施形態の標本観察方法のフローチャートである。図１３は、各空間周波数における大きさを示す図であって、（ａ）は減算ステップ実行前の状態、（ｂ）は減算ステップ実行後の状態を示す図である。
　第４実施形態の標本観察方法は、図１２（ｂ）に示すように、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０に加え、更に、変換ステップＳ１５−１と逆変換ステップＳ３０−３とを有する。これにより、第４実施形態の標本観察方法では、より明瞭な電子画像が簡単に得られる。
　上述のように、減算ステップＳ２０では、Ａ_１ ^２の値を小さくすることで、Ａ_１ ^２＋Ａ_２ ^２の値に対して２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値を相対的に大きくしている。ここで、周波数空間で減算ステップＳ２０が実行されると、減算を効率的に行える。
　減算ステップＳ２０における減算について、図１３を用いて説明する。上述のように、細胞のような標本には、様々な空間周波数を持つ構造が含まれている。そこで、標本Ｓの像の明るさを空間周波数ごとに分離できれば、空間周波数ごとに減算が行える。
　そこで、第４実施形態の標本観察方法では、取得ステップＳ１０の終了後に、変換ステップＳ１５−１が実行される。変換ステップＳ１５−１では、電子画像の信号をフーリエ変換する。その結果、図１３（ａ）に示すように、空間周波数ごとに、その大きさ（縦軸、明るさに相当）が分離される。図１３（ａ）では、横軸の数値は空間周波数を示しており、空間周波数が０では、その大きさは１００で、空間周波数が１では、その大きさは３０になっている。
　ここで、空間周波数の値（横軸の数値）は、回折光の次数と対応している。そのため、空間周波数０では、その大きさ（縦軸の数値）は０次回折光の明るさに対応する。同様に、空間周波数１では、その大きさは１次回折光の明るさに対応する。そこで、変換ステップＳ１５−１の終了後に、減算ステップＳ２０が実行される。この減算ステップＳ２０では、空間周波数０での大きさを小さくしている。例えば、図１３（ｂ）に示すように、空間周波数０での大きさを、１００から５０に半減させている。これは、Ａ_１ ^２の値を小さくすることに相当する。このようにすることで、０次光の明るさを小さくできる。
　続いて、逆変換ステップＳ３０−３が実行される。逆変換ステップＳ３０−３では、逆フーリエ変換を行う。これにより、電子画像の信号を得ることができる。なお、減算ステップＳ２０によって、０次光の明るさ、すなわち、Ａ_１ ^２の値が小さくなっている。そのため、Ａ_１ ^２＋Ａ_２ ^２の値に対して２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値を相対的により大きくできる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。
　なお、変換ステップＳ１５−１と逆変換ステップＳ３０−３を、第２実施形態の標本観察方法や第３実施形態の標本観察方法に用いても良い。この場合、変換ステップＳ１５−１は、減算ステップＳ２０よりも前に実行される。また、逆変換ステップＳ３０−３は、減算ステップＳ２０よりも後に実行される。
　以上のように、第４実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
　第５実施形態の標本観察方法は、事前取得ステップと、規格化ステップと、を有し、事前取得ステップでは、標本が無い状態で電子画像を取得し、規格化ステップでは、電子画像で標本の電子画像を規格化し、減算ステップの前に、規格化ステップを行うものである。
　第５実施形態の標本観察方法について、図１４を用いて説明する。図１４は第５実施形態の標本観察方法及び後述の第１２実施形態の標本観察方法のフローチャートである。
　第５実施形態の標本観察方法は、図１４に示すように、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０に加え、更に、事前取得ステップＳ００と規格化ステップＳ１５−２とを有する。これにより、第５実施形態の標本観察方法では、より明瞭な電子画像が得られる。
　なお、図１４では、減算ステップＳ２０の後に、増幅ステップＳ３０−２が備わっているが、この増幅ステップＳ３０−２は必須ではない。
　標本Ｓの像の明るさは、照明光学系による影響や結像光学系による影響を受けることがある。例えば、照明光学系や結像光学系を光が通過することで、通過後の光の明るさにむらが生じる。この場合、照明光学系や結像光学系による明るさのむらのために、標本Ｓの像にも明るさにむらが生じる。この明るさのむらは電子画像の画質を低下させるので、除去することが好ましい。
　そこで、第５実施形態の標本観察方法では、取得ステップＳ１０の実行に先立って、事前取得ステップＳ００が実行される。事前取得ステップＳ００では、標本Ｓが無い状態で電子画像Ａの取得が行われる。このとき、電子画像Ａは、明るさのむらのみの画像になる。
　続いて、取得ステップＳ１０が実行され、標本Ｓの電子画像Ｂの取得が行われる。この電子画像Ｂは、標本Ｓの像に、照明光学系や結像光学系による明るさのむらが加わった画像になる。そこで、規格化ステップＳ１５−２が実行される。規格化ステップＳ１５−２では、電子画像Ａで電子画像Ｂを規格化する。すなわち、以下の演算、
　電子画像Ｂ／電子画像Ａ
を規格化ステップＳ１５−２において行う。これにより、電子画像Ｂにおける明るさのむらが、電子画像Ａにおける明るさのむらでキャンセルされる。そのため、規格化後の電子画像は、照明光学系や結像光学系による明るさのむらが低減された画像になる。
　規格化ステップＳ１５−２の終了後、減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０では、規格化後の電子画像においてＡ_１ ^２の値を小さくし、これにより、Ａ_１ ^２＋Ａ_２ ^２の値に対して２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値を相対的に大きくする。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。
　なお、事前取得ステップＳ００と規格化ステップＳ１５−２を、第２実施形態の標本観察方法から第４実施形態の標本観察方法までのいずれに用いても良い。この場合、事前取得ステップＳ００は、取得ステップＳ１０よりも前に実行される。また、規格化ステップＳ１５−２は、減算ステップＳ２０よりも前に実行される。
　以上のように、第５実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
　第６実施形態の標本観察方法は、結像光学系の合焦位置に対して標本の位置を複数回変化させ、変化させた標本の位置で、取得ステップと減算ステップが行われ、これにより、減算ステップを実行した後の電子画像を複数生成し、生成した複数の電子画像を加算するものである。
　第６実施形態の標本観察方法によれば、電子画像の生成の際に、低い周波数空間から高い空間周波数までの各々の周波数空間でコントラストが高くなっている画像が使われる。よって、生成された電子画像では、どの空間周波数においてもコントラストが高くなっている。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。
　以上のように、第６実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、明瞭に無色透明な標本を観察できる。
　第７実施形態の標本観察方法は、加算の前に、複数の電子画像の各々について、電子画像のうちでコントラストが最も高い部分を抽出し、抽出した部分を使って加算を行うものである。
　第７実施形態の標本観察方法によれば、加算によって電子画像を生成する時に、各周波数空間でコントラストが最も高くなっている部分のみが使われている。よって、生成された電子画像では、どの空間周波数においてもコントラストが非常に高くなっている。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。
　以上のように、第７実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
　第８実施形態の標本観察方法では、標本の位置の変化は、第１の所定の状態における波面収差量の符号が同じ状態で行われるものである。
　上述のように、１次回折光における波面収差量が−λ／４になると、電子画像はダークコントラストの画像になる。すなわち、電子画像では、背景に比べて標本Ｓが暗くなる。一方、１次回折光における波面収差量が＋λ／４になると、電子画像はブライトコントラストの画像になる。すなわち、電子画像では、背景に比べて標本Ｓが明るくなる。
　そこで、加算によって電子画像を生成する時は、波面収差量の符号が同じ状態の画像を用いるのが良い。このようにすることで、生成した電子画像を、ダークコントラストのみに基づく画像、あるいは、ブライトコントラストのみに基づく画像にできる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。
　以上のように、第８実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
　本実施形態の標本観察装置について説明する。第１実施形態から第３実施形態までの標本観察装置は、光源と、照明光学系と、結像光学系と、撮像装置と、画像処理装置と、を有し、照明光学系は、光源からの照明光を標本に照射するように配置され、結像光学系は、標本からの光が入射するように配置されると共に、標本の光学像を形成し、撮像装置は光学像の位置に配置され、画像処理装置は、上述の第１実施形態から第８実施形態までの標本観察方法を行うことを特徴とする。
　第１実施形態の標本観察装置の構成を図１５に示す。標本観察装置１は、正立型顕微鏡を用いた観察システムである。標本観察装置１は、本体部１０と、照明部２０と、観察部３０と、画像処理装置４０と、を備える。ここで、照明部２０と観察部３０とは、本体部１０に取り付けられている。また、本体部１０と画像処理装置４０とは、有線または無線で接続されている。
　なお、標本観察装置１は、表示装置５０を備えていても良い。表示装置５０は、有線または無線で画像処理装置４０に接続されている。
　本体部１０はステージ１１を有する。ステージ１１は保持部材である。このステージ１１には、標本Ｓが載置される。標本Ｓの移動はステージに取り付けられた操作ノブ（不図示）や焦準ノブ（不図示）で行われる。操作ノブの操作により、光軸と垂直な面内で、標本Ｓが移動する。焦準ノブの操作により、光軸に沿って標本Ｓが移動する。
　照明部２０は、光源２１と照明光学系２２とを有する。照明光学系２２は、コンデンサレンズ２３と開口絞り２４とを有する。なお、図１５に示すように、照明光学系２２は、レンズ２５と、ミラー２６と、レンズ２７とを備えていても良い。図１５では、コンデンサレンズ２３と開口絞り２４はステージ１１に保持されている。照明光学系２２は、光源２１からステージ１１までの間の光路中に配置されている。
　観察部３０は、結像光学系３１と撮像装置３２とを有する。なお、観察部３０は、レボルバ３３と観察鏡筒３４とを備えていても良い。結像光学系３１は、顕微鏡対物レンズ３５と撮像レンズ３６とを有する。なお、図１５に示すように、結像光学系３１は、結像レンズ３７とプリズム３８とを備えていても良い。結像光学系３１は、ステージ１１から撮像装置３２までの間の光路中に配置されている。撮像装置３２は撮像素子３９を有する。
　標本観察装置１では、照明部２０は、ステージ１１を挟んで観察部３０と対向する側に配置されている。よって、標本観察装置１では、標本Ｓは透過照明で照明される。
　光源２１から照明光が出射する。照明光は照明光学系２２を通過して、ステージ１１に到達する。この照明光によって、標本Ｓが照明される。標本Ｓからの光は結像光学系３１によって集光され、これにより、集光位置に標本Ｓの像（光学像）が形成される。結像光学系３１の光路中にプリズム３８がない場合、撮像装置３２の撮像素子３９によって標本Ｓの像が撮像される。
　撮像によって、標本Ｓの像は電子画像（デジタルデータ）に変換される。電子画像は画像処理装置４０に送られる。画像処理装置４０では各種の処理が行われる。ここで、標本観察装置１が表示装置５０を備えている場合、電子画像は表示装置５０に表示される。観察者は表示装置５０に表示された電子画像を見ることで、標本Ｓ（標本Ｓの像）を観察できる。
　撮像装置３２は、自動利得制御を行う回路を備えていても良い。このようにすると、撮像した電子画像の明るさ（コントラスト）を一定にできる。なお、自動利得制御を行う回路は、画像処理装置４０が備えていても良い。
　なお、結像光学系３１の光路中に、プリズム３８を挿入することもできる。このようにすることで、標本Ｓからの光は、観察鏡筒３４の接眼レンズに導かれる。観察者は、接眼レンズを介して、標本Ｓの光学像を観察できる。
　標本観察装置１を用いて、実施形態の標本観察方法を実施する手順について説明する。ここでは、第１実施形態の標本観察方法を例に説明する。なお、光源２１として、白色光源を用いる。
　まず、観察者は、照明光学系２２と結像光学系３１を、明視野観察の状態となるようにする。続いて、観察者は、ステージ１１に標本Ｓを載置する。そして、観察者は、合焦位置からずれていると思われる位置まで、目測で標本を移動させる。これにより、明視野観察の状態で、なお且つ標本Ｓの位置と合焦位置とが異なった状態になる。続いて、画像処理装置４０を作動させる。なお、これらの作業は、順不同で行って良い。
　画像処理装置４０が作動することで、標本Ｓの像が撮像可能になるので、取得ステップＳ１０が実行される。取得ステップＳ１０が実行されることで、電子画像の取得が行われる。取得ステップＳ１０で取得された電子画像は、画像処理装置４０内の一時記憶部（不図示）に保存される。
　続いて、減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０では、Ａ_１ ^２の値を小さくすることで、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値がＡ_１ ^２＋Ａ_２ ^２の値に対して相対的に大きくなる。減算ステップＳ２０の実行結果は、例えば、表示装置５０に表示される。
　上述のように、標本Ｓの位置の設定は目測で行われている。この場合、標本Ｓの位置と合焦位置とが大きく異なっている可能性が高いので、標本Ｓの像は大きくぼけている。そのため、標本Ｓの像が撮像されても、観察者は表示装置５０で電子画像を観察できない。
　そこで、観察者は焦準ノブを操作して、標本Ｓを合焦位置に向けて移動させる。標本Ｓの位置が顕微鏡対物レンズ３５から大きく離れている場合、観察者は、標本Ｓが顕微鏡対物レンズ３５に近づく方向にステージ１１を移動させれば良い。一方、標本Ｓの位置が顕微鏡対物レンズ３５に非常に近い場合、観察者は、標本Ｓが顕微鏡対物レンズ３５から離れる方向にステージ１１を移動させれば良い。
　標本Ｓを移動させている間、撮像は常に行われている。よって、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０も、常に実行されている。そこで、観察者は、表示装置５０で電子画像を見ながら標本Ｓを光軸に沿って移動させ、コントラストの良い電子画像が得られた時点で標本Ｓの移動を終わる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。
　なお、本体部１０は、モータ１２を備えていても良い。図１５では、モータ１２はステージ１１に接続されている。モータ１２によって、ステージ１１を光軸に沿って移動させることで、標本Ｓの移動ができる。
　以上のように、第１実施形態の標本観察装置によれば、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本を観察できる。
　第２実施形態の標本観察装置の構成を図１６に示す。標本観察装置１’は、倒立型顕微鏡を用いた観察システムである。標本観察装置１と同じ部材については同じ番号を付け、説明は省略する。
　標本観察装置１’では、標本観察装置１と同じように、照明部２０は、ステージ１１が挟んで観察部３０と対向する側に配置されている。よって、標本観察装置１’においても、標本Ｓを透過照明で照明できる。ただし、標本観察装置１’は、照明部２０とは別に、照明部２０’も備えている。照明部２０’は、観察部３０と同じ側に配置されている。よって、標本観察装置１’では、照明部２０’を用いて標本Ｓを落射照明で照明できる。
　照明部２０’は、光源２１’と照明光学系２２’とを有する。照明光学系２２’は、コンデンサレンズと開口絞りとを有する。ここで、照明光学系２２’では、顕微鏡対物レンズ３５を介して照明が行われる。よって、顕微鏡対物レンズ３５がコンデンサレンズに相当する。なお、開口絞りは図示を省略している。また、図１６に示すように、照明光学系２２’は、レンズ２５’と、ハーフミラーＨＭと、レンズ２７’とを備えていても良い。照明光学系２２’は、光源２１’からステージ１１までの間の光路中に配置されている。また、ハーフミラーＨＭと顕微鏡対物レンズ３３は、照明光学系２２’を構成すると共に、結像光学系３１を構成している。
　結像光学系３１の光路中にプリズム３８がある場合、撮像装置３２の撮像素子３９によって標本Ｓの像が撮像される。また、結像光学系３１の光路外にプリズム３８を移動させることで、標本Ｓの光を観察鏡筒３４の接眼レンズに導くことができる。この場合、標本Ｓの光は、ミラーＭによって観察鏡筒３４に向けて反射される。
　また、標本観察装置１’では、モータ１２がレボルバ３３に接続されている。よって、標本観察装置１’では、モータ１２によって、レボルバ３３が光軸に沿って移動する。レボルバ３３が光軸に沿って移動することで、顕微鏡対物レンズ３５（結像光学系３１）が光軸に沿って移動する。これにより、標本Ｓの位置と合焦位置とを異なる状態にできる。
　標本観察装置１’では、標本Ｓは透過照明か落射照明で照明できる。落射照明について説明する。落射照明では、光源２１’から照明光が出射する。照明光は照明光学系２２’を通過して、ステージ１１に到達する。この照明光によって標本Ｓが照明される。標本Ｓからの光は結像光学系３１によって集光され、これにより、集光位置に標本Ｓの像（光学像）が形成される。結像光学系３１の光路中にプリズム３８がある場合、撮像装置３２の撮像素子３９によって標本Ｓの像が撮像される。
　撮像によって、標本Ｓの像は電子画像（デジタルデータ）に変換される。電子画像は画像処理装置４０に送られる。画像処理装置４０では各種の処理が行われる。ここで、標本観察装置１が表示装置５０を備えている場合、電子画像は表示装置５０に表示される。観察者は表示装置５０に表示された電子画像を見ることで、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。
　標本観察装置１’を用いて、実施形態の標本観察方法を実施する手順について説明する。ここでは、第２実施形態の標本観察方法を例に説明する。なお、光源２１’として、白色光源を用いる。
　まず、観察者は、照明光学系２２’と結像光学系３１を、明視野観察の状態となるようにする。そして、観察者は、ステージ１１に標本Ｓを載置する。続いて、画像処理装置４０を作動させる。なお、これらの作業は、順不同で行って良い。
　観察者は、観察開始の情報を画像処理装置４０に入力する。ここで、画像処理装置４０に、合焦位置からのずれ量の情報が予め記憶されているとする。画像処理装置４０はレボルバ３３（顕微鏡対物レンズ３５）の現在の位置と合焦位置からのずれ量との情報に基づいて、移動量を算出する。算出した結果に基づいて、画像処理装置４０はモータ１２に駆動信号を送信する。送信された信号に基づいて、モータ１２はレボルバ３３を移動させ、標本Ｓの位置が、合焦位置からずれた状態にする。このようにすることで、標本Ｓの位置と合焦位置とが異なった状態にできる。
　明視野観察の状態、且つ標本Ｓの位置と合焦位置とが異なる状態になったところで、取得ステップＳ１０（１回目）が実行される。これにより、電子画像の取得が行われる。取得された電子画像は、画像処理装置４０内の一時記憶部（不図示）に保存される。続いて、減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０の終了後、電子画像は画像処理装置４０内の記憶部１（不図示）に保存される。なお、記憶部１に保存した電子画像は、例えば、表示装置５０に表示される。
　減算ステップＳ２０の終了後、画像処理装置４０はモータ１２に駆動信号を送信する。このときの駆動信号は、間隔Ｄ（標本Ｓと顕微鏡対物レンズ３５の間隔）を所定量だけ広げる信号である。この信号に従って、顕微鏡対物レンズ３５がステージ１１から遠ざかるように、モータ１２はレボルバ３３を移動させる。
　顕微鏡対物レンズ３５が所定量だけ移動すると、取得ステップＳ１０（２回目）と減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０の終了後、電子画像は画像処理装置４０内の記憶部２（不図示）に保存される。
　続いて、記憶部１の電子画像と記憶部２の電子画像について、コントラストの比較が行われる。判断結果がＹＥＳの場合、間隔Ｄを狭くする指定が行われる。一方、判断結果がＮＯ場合、間隔Ｄを広くする指定が行われると共に、記憶部２に保存していた電子画像が記憶部１に保存される。
　間隔Ｄに関する指定が終了すると、取得ステップＳ１０（３回目）と減算ステップＳ２０が実行される。続いて、記憶部１の電子画像と記憶部２の電子画像について、コントラストの比較が行われる。そして、所定の条件を満足するまで、取得ステップＳ１０から比較ステップ３０−１までが繰り返し行われる。
　所定の条件を満足すると、全ての処理が終了する。これにより、十分にコントラストの高い電子画像が自動的に得られる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。
　以上のように、第２実施形態の標本観察装置によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
　第３実施形態の標本観察装置の構成を図１７に示す。図１７（ａ）は、観察装置の概略構成を示す図、図１７（ｂ）は、光学系の構成を示す図である。
　標本観察装置３００は、電子内視鏡を用いた観察システムである。標本観察装置３００は、電子内視鏡１００と画像処理装置２００とから構成されている。電子内視鏡１００は、スコープ部１００ａと接続コード部１００ｂとを備えている。また、画像処理装置２００には、表示ユニット２０４が接続されている。
　スコープ部１００ａは、操作部１４０と挿入部１４１に大別される。挿入部１４１は、細長で患者の体腔内へ挿入可能になっている。また、挿入部１４１は、可撓性を有する部材で構成されている。観察者は、操作部１４０に設けられているアングルノブ等により、諸操作を行うことができる。
　また、操作部１４０からは、接続コード部１００ｂが延設されている。接続コード部１００ｂは、ユニバーサルコード１５０を備えている。ユニバーサルコード１５０は、コネクタ２５０を介して画像処理装置２００に接続されている。
　ユニバーサルコード１５０は、各種の信号等の送受信に用いられる。各種の信号としては、電源電圧信号及びＣＣＤ駆動信号等がある。これらの信号は、電源装置やビデオプロセッサからスコープ部１００ａに送信される。また、各種の信号として映像信号がある。この信号は、スコープ部１００ａからビデオプロセッサに送信される。なお、画像処理装置２００内のビデオプロセッサには、図示しないＶＴＲデッキ、ビデオプリンタ等の周辺機器が接続可能である。ビデオプロセッサは、スコープ部１００ａからの映像信号に対して信号処理を施す。映像信号に基づいて、表示ユニット２０４の表示画面上に内視鏡画像が表示される。
　挿入部１４１の先端部１４２には、光学系が配置されている。ここで、電子内視鏡１００は拡大内視鏡である。そのため、光学系は、標本Ｓの拡大像を形成するようになっている。内視鏡における観察対象としては、体内の組織がある。以下の説明では、体内の組織も標本Ｓに含まれるものとする。
　照明部は、光源と照明光学系とを有する。光源からの光は光ファイバ４０１から出射する。照明光学系は、レンズ４０２と、ミラー４０３と、レンズ４０４と、ハーフプリズム４０５と、対物レンズ４０６とを備える。観察部は、結像光学系と撮像装置とを有する。結像光学系は、対物レンズ４０６と、ハーフプリズム４０５と、結像レンズ４０７とを有する。撮像装置は撮像素子４０８を有する。この光学系では、標本Ｓは落射照明で照明される。
　標本観察装置３００を用いて、実施形態の標本観察方法を実施する手順について説明する。ここでは、第３実施形態の標本観察方法を例に説明する。なお、光源として、白色光源を用いる。
　まず、観察者は、照明光学系と結像光学系を、明視野観察の状態となるようにする。続いて、観察者は、合焦位置からずれた位置だと思われる位置まで、目測で挿入部１４１を移動させる。そして、画像処理装置２００を作動させる。なお、これらの作業は、順不同で行って良い。
　画像処理装置２００が作動することで、標本Ｓの像が撮像可能になるので、取得ステップＳ１０が実行される。取得ステップＳ１０が実行されることで、電子画像の取得が行われる。取得ステップＳ１０で取得された電子画像は、画像処理装置２００内の一時記憶部（不図示）に保存される。
　続いて、減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０では、Ａ_１ ^２の値を小さくすることで、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値がＡ_１ ^２＋Ａ_２ ^２の値に対して相対的に大きくなる。
　減算ステップＳ２０の終了後、増幅ステップＳ３０−２が実行される。増幅ステップＳ３０−２では、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値を大きくする（増幅する）。これにより、Ａ_１ ^２＋Ａ_２ ^２の値に対して２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値が相対的により大きくなる。増幅ステップＳ３０−２の実行結果は、例えば、表示装置２０４に表示される。
　挿入部１４１を移動させている間、撮像は常に行われている。よって、取得ステップＳ１０、減算ステップＳ２０及び増幅ステップＳ３０−２も、常に実行されている。そこで、観察者は、表示装置２０４で電子画像を見ながら挿入部１４１を移動させ、コントラストの良い電子画像が得られた時点で挿入部１４１の移動を終わる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。
　なお、対物レンズ４０６、結像レンズ４０７及び撮像素子４０８の少なくとも１つを、光軸に沿って移動させても良い。これらの移動には、例えば、マイクロアクチュエータ（不図示）やボイスコイルモータ（不図示）を用いれば良い。このようにすれば、ずれ量ΔＺの調整を細かにできる。よって、挿入部１４１の移動は、ある程度のコントラストを持つ電子画像が取得できたところまでで済む。
　以上のように、第３実施形態の標本観察装置によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
　また、上述の各実施形態の標本観察装置では、以下の条件式（１）を満足することが好ましい。
　０．０１＜ＮＡ_ｉｌｌ／ＮＡ_ｏｂ＜１　　　（１）
　ここで、
　ＮＡ_ｉｌｌは、照明光学系の標本側の開口数、
　ＮＡ_ｏｂは、結像光学系の標本側の開口数、
である。
　条件式（１）を満足することで、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
　条件式（１）の下限値を下回ると、照明光学系の標本側の開口数が小さくなりすぎる。この場合、照明光の光量不足や、照明むらが大きくなる。また、電子画像において、カバーガラスの汚れやゴミが目立つようになる。
　条件式（１）の上限値を上回ると、照明光学系の標本側の開口数が大きくなりすぎる。この場合、光軸に対して斜めから入射する照明光が増加する。そのため、コントラストの良い電子画像を得るのが難しくなる。この点について、図１８を用いて説明する。
　図１８は、照明光の入射方向と回折光の回折方向の関係、及び波面収差量を示す図であって、図１８（ａ）は、照明光の入射方向が光軸と平行である場合、図１８（ｂ）は照明光の入射方向と光軸との角度が小さい場合、図１８（ｃ）は照明光の入射方向と光軸との角度が大きい場合を示す図である。
　標本Ｓから生じる回折光は、照明光の標本Ｓへの入射方向に依存する。図１８（ａ）に示すように、照明光Ｌ_ｉｌｌの入射方向が光軸と平行である場合、０次回折光Ｌ_０は、光軸上を進んで瞳位置に到達する。一方、＋１次回折光Ｌ_＋１は光軸に対して＋θの角度で結像光学系に入射して、瞳位置に到達する。また、−１次回折光Ｌ_−１は光軸に対して−θの角度で結像光学系に入射して、瞳位置に到達する。
　上述のように、標本Ｓの位置と合焦位置がずれていると波面収差が生じる。この波面収差は、瞳面の中心に対して対称に発生する。そのため、図１８（ａ）の場合、０次回折光Ｌ_０に加わる波面収差量は０であるが、＋１次回折光Ｌ_＋１と−１次回折光Ｌ_−１には、所定量の波面収差が加わることになる。
　ここで、＋１次回折光Ｌ_＋１の回折方向と−１次回折光Ｌ_−１の回折方向は、光軸を挟んで対称になっており、波面収差も、瞳面の中心（光軸）に対して対称に発生している。そのため、＋１次回折光Ｌ_＋１に加わる波面収差量と、−１次回折光Ｌ_−１に加わる波面収差量は同じになる。
　図１８（ａ）では、０次回折光Ｌ_０には光軸上を進むので、０次回折光Ｌ_０に加わる波面収差量は０である。＋１次回折光Ｌ_＋１と−１次回折光Ｌ_−１には、共に−λ／４の波面収差量が加わる。
　その結果、０次回折光Ｌ_０の位相に変化は生じない。一方、＋１次回折光Ｌ_＋１の位相と−１次回折光Ｌ_−１の位相は、もともとの遅れπ／２に対してπ／２が更に加わるので、遅れは合計でπになる。すると、ψ＝０−（−π）＝πとなる。この場合、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψ≠０となるので、位相情報がコントラスト情報として得られる。また、コントラストは、いわゆるダークコントラストになる。−１次回折光Ｌ_−１については、＋１次回折光Ｌ_＋１と同じである。
　次に、図１８（ｂ）に示すように、照明光Ｌ_ｉｌｌの入射方向と光軸との角度が小さい場合（角度がθの場合）、０次回折光Ｌ_０は、照明光Ｌ_ｉｌｌの入射方向と同じ方向に進む。よって、０次回折光Ｌ_０は光軸に対して＋θの角度で結像光学系に入射して、瞳位置に到達する。一方、＋１次回折光Ｌ_＋１は、所定の方向よりも更に外側（光軸から離れる方向）に回折される。よって、＋１次回折光Ｌ_＋１は、光軸に対して＋２θの角度で結像光学系に入射して、瞳位置に到達する。また、−１次回折光Ｌ_−１も回折されるが、−１次回折光Ｌ_−１は光軸上を進んで瞳位置に到達する。
　ここで、＋１次回折光Ｌ_＋１の回折方向と−１次回折光Ｌ_−１の回折方向は、光軸を挟んで非対称になっているが、波面収差は、瞳面の中心（光軸）に対して対称に発生している。そのため、０次回折光Ｌ_０に加わる波面収差量、＋１次回折光Ｌ_＋１に加わる波面収差量及び−１次回折光Ｌ_−１に加わる波面収差量は、それぞれ異なる。
　図１８（ｂ）では、０次回折光Ｌ_０には−λ／４の波面収差量が加わり、＋１次回折光Ｌ_＋１には−３λ／４の波面収差量が加わる。一方、−１次回折光Ｌ_−１は光軸上を進むので、−１次回折光Ｌ_−１に加わる波面収差量は０になる。
　その結果、０次回折光Ｌ_０の位相はπ／２遅れる。一方、＋１次回折光Ｌ_＋１の位相は、もともとの遅れπ／２に対して３π／２が更に加わるので、遅れは合計で２πになる。すると、ψ＝−π／２−（−２π）＝３π／２となる。この場合、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψ＝０となるので、位相情報はコントラスト情報として得られない。一方、−１次回折光Ｌ_＋１については、加わる波面収差量が０なので、−１次回折光Ｌ_＋１の位相は、もともとの遅れπ／２だけになる。すると、φ＝−λ／２−（−λ／２）＝０となる。この場合、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψ≠０となるので、位相情報がコントラスト情報として得られる。また、コントラストは、いわゆるブライトコントラストになる。
　次に、図１８（ｃ）に示すように、照明光Ｌ_ｉｌｌの入射方向と光軸との角度が大きい場合（角度が２θの場合）、０次回折光Ｌ_０は、照明光Ｌ_ｉｌｌの入射方向と同じ方向に進む。よって、０次回折光Ｌ_０は光軸に対して＋２θの角度で結像光学系に入射して、瞳位置に到達する。一方、＋１次回折光Ｌ_＋１は、結像光学系の有効口径よりも外側に回折される。よって、＋１次回折光Ｌ_＋１は瞳位置に到達しない。また、−１次回折光Ｌ_−１は光軸に対して＋θの角度で結像光学系に入射して、瞳位置に到達する。
　ここで、＋１次回折光Ｌ_＋１の回折方向と−１次回折光Ｌ_−１の回折方向は、光軸を挟んで非対称になっているが、波面収差は、瞳面の中心（光軸）に対して対称に発生している。そのため、０次回折光Ｌ_０に加わる生じる波面収差量と、−１次回折光Ｌ_−１に加わる生じる波面収差量は異なる。
　図１８（ｃ）では、０次回折光Ｌ_０には−３λ／４の波面収差量が加わり、−１次回折光Ｌ_−１には、−λ／４の波面収差量が加わる。
　その結果、０次回折光Ｌ_０の位相は３π／２遅れる。一方、−１次回折光Ｌ_＋１の位相は、もともとの遅れπ／２に対して更にπ／２が加わるので、遅れは合計でπになる。すると、ψ＝−３π／２−（−π）＝−π／２となる。この場合、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψ＝０となるので、位相情報はコントラスト情報として得られない。
　照明光学系の標本側の開口数が小さい場合、照明光Ｌ_ｉｌｌの入射方向は光軸と平行な方向になる。すなわち、図１８（ａ）に示す状態になる。よって、光軸上の点の像は、いわゆるダークコントラストの状態で観察できる。ところが、照明光学系の標本側の開口数が大きくなるにしたがって、図１８（ｂ）や図１８（ｃ）に示すように、入射方向が光軸と交差する照明光Ｌ_ｉｌｌが加わってくる。
　そうすると、光軸上の点の像は、ダークコントラストの像に、ブライトコントラストの像が加わったものになる。そのため、像のコントラストが低下することになる。このように、照明光学系の標本側の開口数が大きくなると、コントラストの低下につながる光が増えてしまうことになる。
　なお、条件式（１）に代えて、下記の条件式（１’）を満足すると良い。
　０．０２＜ＮＡ_ｉｌｌ／ＮＡ_ｏｂ＜０．９　　　（１’）
　さらに、条件式（１）に代えて、以下の条件式（１”）を満足するとなお良い。
　０．０３＜ＮＡ_ｉｌｌ／ＮＡ_ｏｂ＜０．８　　　（１”）
　また、上述の各実施形態の標本観察装置では、以下の条件式（２）を満足することが好ましい。
　０．１μｍ＜ΔＺ×ＮＡ_ｏｂ ^２＜３０μｍ　　　（２）
　ここで、
　ΔＺは、結像光学系の合焦位置と標本の位置との差、
　ＮＡ_ｏｂは、結像光学系の標本側の開口数、
である。
　条件式（２）を満足することで、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
　条件式（２）の下限値を下回ると、結像光学系の合焦位置と標本の位置との差が小さくなりすぎる。この場合、回折光に加わる波面収差量が小さくなる。特に、１次回折光に加わる波面収差量がλ／４よりも小さくなる。そのため、コントラストの良い電子画像を得るのが難しくなる。
　条件式（２）の上限値を上回ると、結像光学系の合焦位置と標本の位置との差が大きくなりすぎる。この場合、回折光に加わる波面収差量が大きくなる。特に、１次回折光に加わる波面収差量がλ／４よりも大きくなる。また、光学像が大きくぼやけてしまう。その結果、解像度の高い電子画像を得るのが難しくなる。
　なお、条件式（２）に代えて、下記の条件式（２’）を満足すると良い。
　０．２μｍ＜ΔＺ×ＮＡ_ｏｂ ^２＜２５μｍ　　　（２’）
　さらに、条件式（２）に代えて、以下の条件式（２”）を満足するとなお良い。
　０．３μｍ＜ΔＺ×ＮＡ_ｏｂ ^２＜２０μｍ　　　（２”）
　また、上述の各実施形態の標本観察装置では、以下の条件式（３）を満足することが好ましい。
　０．０５μｍ＜ΔＺ×ＮＡ_ｉｌｌ＜１０μｍ　　　（３）
　ここで、
　ΔＺは、結像光学系の合焦位置と標本の位置との差、
　ＮＡ_ｉｌｌは、照明光学系の標本側の開口数、
である。
　条件式（３）を満足することで、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
　条件式（３）の下限値を下回ると、結像光学系の合焦位置と標本の位置との差が小さくなりすぎる。この場合、回折光に加わる波面収差量が小さくなる。特に、１次回折光に加わる波面収差量がλ／４よりも小さくなる。そのため、コントラストの良い電子画像を得るのが難しくなる。
　条件式（３）の上限値を上回ると、結像光学系の合焦位置と標本の位置との差が大きくなりすぎる。この場合、回折光に加わる波面収差量が大きくなる。特に、１次回折光に加わる波面収差量がλ／４よりも大きくなる。また、光学像が大きくぼやけてしまう。その結果、解像度の高い電子画像を得るのが難しくなる。また、条件式（３）の上限値を上回ると、照明光学系の標本側の開口数が大きくなりすぎる。この場合、光軸に対して斜めに入射する照明光が増加する。そのため、コントラストの良い電子画像を得るのが難しくなる。
　なお、条件式（３）に代えて、下記の条件式（３’）を満足すると良い。
　０．１μｍ＜ΔＺ×ＮＡ_ｉｌｌ＜８μｍ　　　（３’）
　さらに、条件式（３）に代えて、以下の条件式（３”）を満足するとなお良い。
　０．２μｍ＜ΔＺ×ＮＡ_ｉｌｌ＜６μｍ　　　（３”）
　また、上述の各実施形態の標本観察装置では、照明光学系は、コンデンサレンズと開口絞りを有することが好ましい。
　このようにすることで、対物レンズの光学性能にあわせて、照明光学系の標本側の開口数を適切な値に設定できる。そのため、コントラストの良い電子画像が得られる。
　また、上述の各実施形態の標本観察装置では、照明光学系は、ケーラー照明光学系であることが好ましい。
　このようにすることで、標本をむら無く照明できる。そのため、上述の標本観察方法における処理（画像処理）を簡素にできる。
　また、上述の各実施形態の標本観察装置では、照明光学系は、テレセントリック光学系であることが好ましい。
　このようにすることで、観察範囲の全域において、コントラストの良い電子画像が得られる。
　図１９は、照明光学系がテレセントリック光学系である様子を示す図である。照明光学系は、コンデンサレンズ６２と、開口絞り６０とを有する。コンデンサレンズ６２の前側焦点面６１に、開口絞り６０が配置されている。そのため、開口絞り６０の中心から出射した軸上光束（実線で示す線）はコンデンサレンズ６２で平行光束に変換され、標本の位置６３に到達する。一方、開口絞り６０の周辺から出射した軸外光束（破線で示す線）もコンデンサレンズ６２で平行光束に変換され、標本の位置６３に到達する。ここで、照明光学系がテレセントリック光学系になっているので、軸外光束では、その主光線が光軸と平行になるようにコンデンサレンズに入射する。
　図１９に示すように、開口絞り６０の中心を通る光束は光軸と平行になって標本の位置に到達する。標本は光軸と平行光束で照明され、標本からは０次回折光と１次回折光が出てくる。このうち、０次回折光は光軸と平行に進む。一方、＋１次回折光と−１次回折光は光軸から離れる方向に進む。
　また、＋１次回折光と−１次回折光は、光軸に対して対称になって進む。この場合、＋１次回折光に加わる波面収差量と−１次回折光に加わる波面収差量は、共に等しくなる。０次回折光と＋１次回折光が弱め合えば、０次回折光と−１次回折光も弱め合う。逆に、０次回折光と＋１次回折光が強め合えば、０次回折光と−１次回折光も強め合う。そのため、観察範囲の全域において、コントラストの良い電子画像が得られる。
　また、上述の各実施形態の標本観察装置は、波長選択手段を有することが好ましい。あるいは、上述の各実施形態の標本観察装置では、照明光が単色光であることが好ましい。
　このようにすることで、コントラストの良い電子画像が得られる。特に、軸上色収差の発生量が大きい結像光学系を用いても、コントラストの良い電子画像が得られる。
　結像光学系の収差は少ないほど良い。本実施形態の標本観察装置（標本観察方法）では、特に、軸上色収差について良好に補正されていることが望ましい。軸上色収差色の発生量が大きいと、波長によって波面収差の発生量が異なってくる。例えば、白色光で標本を照明した場合、１次回折光に加わる波面収差量が、ある波長の光では１／４λで、別の波長の光では−１／４λになる可能性がある。
　この場合、ある波長の光では、ダークコントラストの像になるのに対して、別の波長の光では、ブライトコントラストの像になる。そのため、白色光全体でみると、コントラストの良い電子画像を得るのが難しくなる。
　そこで、標本観察装置が波長選択手段を有すると、コントラストの低下を抑制できる。標本観察装置が波長選択手段を持つことで、波長による波面収差の発生量のばらつきが無くなる。そのため、コントラストの良い電子画像が得られる。特に、軸上色収差が大きい結像光学系を用いる場合、波長選択手段を有すると、コントラストの良い電子画像が得られる。照明光が単色光の場合も同様である。
　上述のように、本実施形態における明視野観察の状態では、標本が無色透明な標本の場合、照明光と結像光は共通の波長の光を有していれば良い。そこで、標本観察装置１（図１５）では、照明光学系２０の光路中に、光学フィルタＦＬ（波長選択手段）が配置できるようになっている。また、標本観察装置１’（図１６）では、結像光学系３１の光路中に、光学フィルタＦＬと光学フィルタＦＬ’（不図示）を交互に配置できるようになっている。なお、標本観察装置３００（図１７）では、光学フィルタＦＬは図示してないが、標本観察装置１や標本観察装置１’と同様にできる。
　なお、光学フィルタＦＬは、移動可能にしておいても良い。また、光学フィルタＦＬの数は１枚に限られない。分光透過率特性がそれぞれ異なる光学フィルタＦＬを複数枚用意しておき、１枚又は複数枚を光路中に配置するようにしても良い。
　また、光学フィルタＦＬを配置する場所は、照明光学系と結像光学系のどちらか一方、又はその両方にすれば良い。また、撮像装置に光学フィルタＦＬを配置しても良い。撮像素子が光学フィルタを有している場合は、この光学フィルタを用いれば良い。
　また、光学フィルタＦＬが、長波長の光を透過させる特性を有する場合、この光学フィルタＦＬを用いれば、細胞に与えるダメージを低減できる。一方、光学フィルタＦＬが、短波長の光を透過させる特性を有する場合、この光学フィルタＦＬを用いれば、解像度の高い電子画像が得られる。
　また、光源自体を、波長帯域が狭い光を発するものにしても良い。このようにすれば、光学系の光路中に光学フィルタを配置しなくても良くなる。また、光源は複数用いても良い。
　また、上述の各実施形態の標本観察装置では、結像光学系はテレセントリック光学系であることが好ましい。
　このようにすることで、観察範囲のどこにおいても、０次回折光の角度を略同じにできる。そのため、観察範囲のどこにおいても、コントラストの良い電子画像が得られる。
　また、上述の各実施形態の標本観察装置では、結像光学系は開口絞りを有することが好ましい。また、上述の各実施形態の標本観察装置では、結像光学系は対物レンズを有し、開口絞りは対物レンズに設けられていることが好ましい。
　このようにすることで、標本に応じてコントラストの良い画像が得られる。
　顕微鏡対物レンズを用いて説明する。図２０は、開口数（ＮＡ）がそれぞれ異なる２つの顕微鏡対物レンズにおける波面収差の様子を示す図である。図２０において、実線で示す曲線と破線で示す曲線は、共に開口数と波面収差量の関係を示している。実線は、開口数が大きい顕微鏡対物レンズ（以下、適宜、「対物レンズＯＢ_１」という）における波面収差量を示している。一方、破線は、開口数が小さい顕微鏡対物レンズ（以下、適宜、「対物レンズＯＢ_２」という）における波面収差量を示している。
　対物レンズＯＢ_１と対物レンズＯＢ_２では、共に開口数が０．２となる位置で波面収差量が−λ／４になっている。そこで、１次回折光の位置を開口数が０．２となる位置に一致させるようにすることで、コントラストの良い電子画像が得られる。
　しかしながら、対物レンズＯＢ_２の開口数に比べて、対物レンズＯＢ_１は開口数が大きい。そのため、対物レンズＯＢ_１には、１次回折光よりも高次の回折光が入射する。ここで、高次の回折光にも波面収差量が加わる。そのため、波面収差量の大きさによっては、０次回折光と高次の回折光が弱めあったり強めあったりする。その結果、対物レンズＯＢ_１では、コントラストの良い電子画像を得るのが難しくなる。
　そこで、対物レンズＯＢ_１に開口絞りを設けることで、対物レンズＯＢ_１の開口数を制限できる。すなわち、対物レンズＯＢ_１の開口数を対物レンズＯＢ_２の開口数と同じ程度にできる。その結果、コントラストの良い電子画像が得られる。
　なお、顕微鏡対物レンズから撮像装置までの間で開口数を制限できるのであれば、開口絞りを配置する位置はどこでも良い。よって、結像光学系に開口絞りを持たせても良い。また、対物レンズとしては、顕微鏡対物レンズの他に、例えば、内視鏡対物レンズがある。
　また、上述の各実施形態の標本観察装置では、以下の条件式（４）を満足することが好ましい。
　０．５＜λ／（Ｐ×ＮＡ_ｉｍ）＜２０　　　（４）
　ここで、
　λは、撮像素子に入射する光の波長、
　Ｐは、撮像装置における撮像素子の画素ピッチ、
　ＮＡ_ｉｍは、結像光学系の撮像装置側の開口数、
である。
　なお、ＮＡ_ｉｍは、結像光学系の標本側の開口数を結像光学系の投影倍率で割った値になる。
　条件式（４）を満足することで、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。また、解像度の高い電子画像が得られる。
　条件式（４）の下限値を下回ると、撮像素子におけるナイキスト周波数が、結像光学系（例えば、対物レンズ）のカットオフ周波数を大幅に下回る。そのため、電子画像の画質が悪くなる。条件式（４）の上限値を上回ると、結像光学系の分解能に比べて、撮像素子の画素が小さくなりすぎる。すなわち、電子画像は、画素数が必要以上に多い画像になる。そのため、電子画像の取扱いが困難になる。
　また、上述の各実施形態の標本観察装置は、駆動機構を有し、駆動機構は、保持部材、撮像装置及び結像光学系の少なくとも１つを、光軸に沿って移動させることが好ましい。
　このようにすることで、電子画像を容易に取得できる。特に、結像光学系や撮像素子を移動させると良い。結像光学系や撮像素子を移動させると、標本Ｓを静止状態にできる。そのため、標本が、非常にやわらかい構造を有している場合や、観察対象が液体中に浮遊しているような場合であっても、標本の状態を変化させることなく（形状の変形や液体中の位置を変化させることなく）電子画像が取得できる。
　別の実施形態の標本観察方法及び標本観察装置について説明する。以下の第９実施形態から第１５実施形態までの標本観察方法及び第４実施形態から第６実施形態までの標本観察装置は、明視野観察の状態で用いられるものである。本実施形態における明視野観察では、蛍光観察のように、励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタからなる蛍光ミラーユニットは用いられない。よって、明視野観察の状態では、標本が無色透明の場合、標本の像を形成する光（以下、適宜、「結像光」という）の波長帯域と標本を照明する光（以下、適宜、「照明光」という）の波長帯域とは、合焦時、一致している。
　また、本実施形態における明視野観察では、位相差観察における位相膜や、微分干渉観察における微分干渉プリズムは用いられない。よって、標本の一点から出た光についてみると、明視野観察の状態では、照明光学系における光の波面の変化と結像光学系における波面の変化はいずれもレンズのみで生じる。
　また、本実施形態における明視野観察では、標本から来る光束の一部を減光するような減光フィルタは用いられない。よって、明視野観察の状態では、標本から標本の像までの間で、結像光に強度変化は生じない（ただし、レンズに起因する強度変化は除く）。
　第９実施形態の標本観察方法は、標本の電子画像を取得する取得ステップと、電子画像の信号から直流成分を減算する減算ステップと、を有し、取得ステップは明視野観察の状態で行われ、減算ステップにおける電子画像は、第２の所定の状態で取得された画像であって、第２の所定の状態になる前に、第１の波長帯域の光で標本の位置と結像光学系の合焦位置を一致させ、第２の所定の状態では、少なくとも、第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成されており、第２の波長帯域は第１の波長帯域のうちの一部と一致しているか、又は第１の波長帯域とは異なることを特徴とする。
　第９実施形態の標本観察方法について、図１を用いて説明する。図１は、第９実施形態の標本観察方法のフローチャートである。
　第９実施形態の標本観察方法は、取得ステップＳ１０と、減算ステップＳ２０とを有する。これにより、第９実施形態の標本観察方法では、明瞭な電子画像が得られる。
　第９実施形態の標本観察方法では、まず、取得ステップＳ１０が実行される。取得ステップＳ１０では、標本の電子画像（以下、適宜、「電子画像」という）の取得が行われる。標本の像（光学像）は、結像光学系によって形成される。電子画像の取得では、この像をＣＣＤやＣＭＯＳのような撮像素子で撮像する。撮像によって、標本の像は電子画像（デジタルデータ）に変換される。なお、標本の像は明視野観察の状態で形成されているので、電子画像の取得も明視野観察の状態で行われる。
　取得ステップＳ１０が終わると、減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０では、電子画像の信号に対して直流成分（バイアス成分）の減算が行われる。ここで、減算ステップＳ２０における電子画像は、第２の所定の状態で取得された画像である。
　減算ステップＳ２０における電子画像は、第２の所定の状態、すなわち、第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成されているときの画像である。また、第２の所定の状態になる前では、第１の波長帯域の光で標本の位置と結像光学系の合焦位置（以下、適宜、「合焦位置」という）を一致させている。そして、第２の波長帯域は第１の波長帯域のうちの一部と一致しているか、又は第１の波長帯域とは異なっている。このように、第９実施形態の標本観察方法では、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時（瞬間）とでは、光の波長帯域が異なっている。
　ここで、標本が格子状の位相物体の場合、標本を照明すると、標本から０次回折光と回折光が出てくる。結像光学系がある程度の軸上色収差を持っている状態で、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時とで、光の波長帯域を異ならせる。すると、電子画像を取得する前の光と電子画像を取得する時の光との間に、波面収差の差（光路長差）が発生する。この点ついて、図２１~図２６を使って説明する。なお、回折光として１次回折光を用いて説明する。また、結像光学系は軸上色収差をある程度有しているものとする。
　図２１は、第１の波長帯域（中心波長λ１＝５５０ｎｍ）での合焦位置と第２の波長帯域（中心波長λ２＝４５０ｎｍ）での合焦位置との関係、及び波面収差量を示す図であって、（ａ）は第１の波長帯域の光で標本の位置と合焦位置を一致させたときの図、（ｂ）は第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成されているときの図である。図２２は、第１の波長帯域（中心波長λ１＝５５０ｎｍ）での標本の電子画像である。図２３は、第２の波長帯域（中心波長λ２＝４５０ｎｍ）での標本の電子画像である。図２４は、第１の波長帯域（中心波長λ１＝５５０ｎｍ）での合焦位置と第２の波長帯域（中心波長λ２＝６５０ｎｍ）での合焦位置との関係、及び波面収差量を示す図であって、（ａ）は第１の波長帯域の光で標本の位置と合焦位置を一致させたときの図、（ｂ）は第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成されているときの図である。図２５は、第１の波長帯域（中心波長λ１＝５５０ｎｍ）での標本の電子画像である。図２６は、第２の波長帯域（中心波長λ２＝６５０ｎｍ）での標本の電子画像である。なお、図２２、２３、２５及び２６は、いずれも減算ステップＳ２０が実行された後の電子画像である。また、図２２、２３、２５及び２６における標本は細胞である。
　また、グラフは瞳位置での波面収差の量を表している。グラフの縦軸は波面収差量（単位は波長）、横軸は瞳面（瞳面上）の中心からの距離を表している。瞳面の中心からの距離は規格化されているので、無名数となっている。横軸の数値０は瞳面の中心位置、数値１は瞳面の最も外側の位置を表している。
　図２１（ａ）に示すように、光軸上の一点から出た光には、光線Ｌ_Ｃと光線Ｌ_Ｐとが含まれている。光線Ｌ_Ｃは光軸上を進む光線である。ここで、光線Ｌ_Ｃと瞳面の交点は、瞳面の中心位置に一致している。一方、光線Ｌ_Ｐは、光軸ＡＸに対して所定の角度で結像光学系３１に入射する光線である。ここで、光線Ｌ_Ｐと瞳面の交点は、瞳面の中心から所定の距離だけ離れた位置になっている。
　標本Ｓを照明光（平行光束）で照明すると、標本Ｓから０次回折光と１次回折光が出てくる。ここで、標本Ｓと光軸が交わる点（光軸上の一点）に着目すると、０次回折光は回折されないので、この点から出た０次回折光は光軸上を進んで瞳の中心に到達する。よって、０次回折光は光線Ｌ_Ｃとみなすことができる。一方、１次回折光は所定の方向に回折されるので、この点から出た１次回折光は光軸に対して所定の角度で結像光学系３１に入射する。結像光学系３１に入射した１次回折光は、瞳面の中心から離れた位置に到達する。よって、１次回折光は光線Ｌ_Ｐとみなすことができる。
　まず、第１の波長帯域の中心波長λ１が５５０ｎｍ、第２の波長帯域の中心波長λ２が４５０ｎｍの場合について説明する。第１の波長帯域の光で標本の位置と合焦位置を一致させた状態では、第１の波長帯域の合焦位置Ｐ_５５０は標本Ｓの位置Ｐ_Ｓと一致している。この状態では、図２１（ａ）のグラフに示すように、瞳面のどの位置においても波面収差量はほぼ０になっている。これは、０次回折光における波面収差量と１次回折光における波面収差量が、共にほぼ０であることを示している。波面収差量に（２π／λ）を乗じた値は位相量に相当するので、合焦時は、０次回折光と１次回折光のいずれにおいても、位相に変化は生じない。１次回折光の位相は、０次回折光の位相に対してπ／２遅れたままなので、ψ＝０−（−π／２）＝π／２となる。この場合、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψ＝０となるので、位相情報をコントラスト情報として得られない。その結果、図２２に示すように、電子画像はコントラストが無い画像になる。
　一方、第２の波長帯域で標本の光学像が形成されている状態では、第２の波長帯域の合焦位置は標本の位置からずれている。図２１（ｂ）では、第２の波長帯域の合焦位置Ｐ_４５０は標本Ｓの位置Ｐ_Ｓ（合焦位置Ｐ_５５０）よりも下方向（結像光学系３１から離れる方向）にずれている。この状態では、図２１（ｂ）のグラフに示すように、瞳面の中心では波面収差量は０であるが、瞳面の中心から離れた位置では波面収差が発生する。ここで、波面収差は参照波面に対する実際の波面のずれで、このずれは位相のずれになる。そのため、波面収差が発生している範囲内に、１次回折光の位置があると、１次回折光の位相は、本来持っている位相に波面収差量が加わったものになる。このように、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時とで、光の波長帯域を異ならせることで、１次回折光の位相を変化させられる。図２１（ｂ）のグラフに示すように、瞳の中心からの距離が０．４の位置を位置Ｐ_Ｗとすると、位置Ｐ_Ｗにおける波面収差量は−λ／４になる。
　このようにすることで、０次回折光における波面収差量を０にしたままで、１次回折光における波面収差量を−λ／４にできる。上述のように、波面収差量に（２π／λ）を乗じた値は位相量であるので、非合焦時は、０次回折光については位相に変化は生じないが、１次回折光については位相に変化が生じる。具体的には、１次回折光では、もともとの位相の遅れπ／２に加えて、更に位相がπ／２遅れる。１次回折光の位相は、０次回折光の位相に対してπ遅れた状態になるので、ψ＝０−（−π）＝πとなる。この場合、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψ≠０となるので、位相情報がコントラスト情報として得られる。その結果、図２３に示すように、電子画像は、コントラストを明らかに持った画像になる。よって、この電子画像を、例えば、表示装置に表示すれば、観察者は標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。
　次に、第１の波長帯域の中心波長λ１が５５０ｎｍ、第２の波長帯域の中心波長λ２が６５０ｎｍの場合について説明する。第１の波長帯域の光で標本Ｓの位置と合焦位置を一致させた状態では、第１の波長帯域の合焦位置Ｐ_５５０は標本Ｓの位置Ｐ_Ｓと一致している。これは、図２１（ａ）と同じである。そのため、図２５に示すように、電子画像はコントラストが無い画像になる。
　一方、第２の波長帯域λ２で標本の光学像が形成されている状態では、第２の波長帯域の合焦位置Ｐ_６５０は標本Ｓの位置Ｐ_Ｓ（合焦位置Ｐ_５５０）よりも下方向（結像光学系３１から離れる方向）にずれている。この状態では、図２４（ｂ）のグラフに示すように、瞳面の中心では波面収差量は０であるが、瞳面の中心から離れた位置では波面収差が発生する。ここで、合焦位置Ｐ_６５０は合焦位置Ｐ_４５０と異なっている。
　この場合、瞳面における１次回折光の位置における波面収差量は、図２４（ｂ）と図２１（ｂ）とで異なる。図２４（ｂ）のグラフに示すように、瞳の中心からの距離が０．４の位置Ｐ_Ｗでは、波面収差量は約−１λ／１０になっている。
　このように、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時とで、光の波長帯域を異ならせることで、０次回折光における波面収差量を０にしたままで、１次回折光における波面収差量を−λ／１０にできる。波面収差量は異なるが、これは図２１（ｂ）と同じような状態である。そのため、図２６に示すように、電子画像は、コントラストを明らかに持った画像になる。よって、観察者は標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。
　図２１（ｂ）では、１次回折光における波面収差量が−λ／４になっている。この場合、０次回折光の位相と１次回折光の位相は逆位相の関係になる。逆位相の関係では、０次回折光と１次回折光は弱めあうことになる。よって、電子画像では、背景に比べて標本Ｓが暗くなる。これは、位相差観察におけるダークコントラストに相当する。
　また、１次回折光における波面収差量がλ／４になる場合、０次回折光の位相と１次回折光の位相は同位相の関係になる。同位相の関係では、０次回折光と１次回折光は強めあうことになる。よって、電子画像では、背景に比べて標本Ｓが明るくなる。これは、位相差観察におけるブライトコントラストに相当する。
　また、回折光の回折角は、標本Ｓが持っている空間周波数によって異なる。例えば、標本Ｓを格子状の位相物体とした場合、格子の間隔が広いということは、標本Ｓが持っている空間周波数が低いということになる。一方、格子の間隔が狭いということは、標本Ｓが持っている空間周波数が高いということになる。ここで、格子の間隔が広いほど回折角は小さく、格子の間隔が狭いほど回折角は大きくなる。よって、標本Ｓが低い空間周波数を持つ場合回折角は小さく、標本Ｓが高い空間周波数を持つ場合回折角は大きくなる。
　細胞には、様々な空間周波数を持つ構造が含まれている。そのため、標本Ｓが細胞の場合、波面収差量が−λ／４となる位置を、どの空間周波数における１次回折光の位置と一致させるかで、標本の像の見え方が変わってくる。
　高い空間周波数における１次回折光の位置で波面収差量が−λ／４となるように、第２の波長帯域を設定すると、電子画像では、空間周波数の高い部分が明瞭になる。一方、低い空間周波数における１次回折光の位置で波面収差量が−λ／４となるように、第２の波長帯域を設定すると、電子画像では、空間周波数の低い部分が明瞭になる。
　例えば、図２４（ｂ）に示すように、瞳の中心からの距離が０．６４の位置を位置Ｐ_Ｗ’とすると、位置Ｐ_Ｗ’における波面収差量は−λ／４になる。よって、１次回折光が位置Ｐ_Ｗ’を通過するような空間周波数を標本Ｓが持っていれば、その空間周波数に相当する部分を明瞭に観察できる。
　また、第２の波長帯域の合焦位置が標本Ｓの位置（第１の波長帯域の合焦位置）よりも上方向にずれるようにしても良い。例えば、第１の波長帯域の中心波長λ１を６５０ｎｍ、第２の波長帯域の中心波長λ２を５５０ｎｍにしても良い。
　なお、本実施形態の観察方法では、第１の波長帯域と第２の波長帯域とでは、中心波長の差はそれほど大きくない。この場合、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時とで光の波長帯域を異ならせても、結像光学系３１に対する１次回折光の入射位置はほとんど変化しない。そのため、瞳面での１次回折光の位置も、ほとんど変化しないものとみなせる。よって、波長帯域を変えるだけで、１次回折光に追加される波面収差量を変化させられる。
　上述のように、取得ステップＳ１０では、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時とで、光の波長帯域が異なっている。そのため、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψ≠０になる。この場合、像面における光の強度Ｉは以下のようになる。
　Ｉ＝Ａ_１ ^２＋Ａ_２ ^２＋２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψ
　ここで、Ａ_１ ^２＋Ａ_２ ^２は標本の像における直流成分（バイアス成分）、すなわち、電子画像の信号うちの直流成分（バイアス成分）を表している。このうち、０次回折光の振幅Ａ_１ ^２は、非常に大きな値を持つ。そこで、減算ステップＳ２０で、Ａ_１ ^２の値を小さくする。このようにすることで、Ａ_１ ^２＋Ａ_２ ^２の値に対して２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値を相対的に大きくできる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。
　以上のように、第９実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本を明瞭に観察できる。
　第１０実施形態の標本観察方法は、減算ステップよりも後に増幅ステップを有し、増幅ステップでは、減算ステップ後の電子画像の信号を増幅するものである。
　第１０実施形態の標本観察方法について、図１２（ａ）を用いて説明する。図１２（ａ）は、第１０実施形態の標本観察方法のフローチャートである。
　第１０実施形態の標本観察方法は、図１２（ａ）に示すように、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０に加え、更に、増幅ステップＳ３０−２を有する。これにより、第１０実施形態の標本観察方法では、より明瞭な電子画像が得られる。
　上述のように、Ａ_１ ^２＋Ａ_２ ^２は標本の像の直流成分、すなわち、電子画像の信号うちの直流成分を表している。減算ステップＳ２０では、Ａ_１ ^２の値を小さくすることで、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値をＡ_１ ^２＋Ａ_２ ^２の値に対して相対的に大きくしている。
　これに対して、第１０実施形態の標本観察方法では、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０の終了後に、増幅ステップＳ３０−２が実行される。増幅ステップＳ３０−２では、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値を大きくしている（増幅している）。このようにすることで、Ａ_１ ^２＋Ａ_２ ^２の値に対して２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値を相対的により大きくできる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。
　なお、増幅ステップＳ３０−２を、第９実施形態の標本観察方法に用いても良い。この場合、増幅ステップＳ３０−２は、比較ステップＳ３０−１よりも前に実行される。
　以上のように、第１０実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
　第１１実施形態の標本観察方法は、電子画像の信号をフーリエ変換する変換ステップと、逆フーリエ変換を行う逆変換ステップと、を有し、変換ステップは、減算ステップよりも前に行われ、逆変換ステップは、少なくとも減算ステップよりも後に行われるものである。
　第１１実施形態の標本観察方法について、図１２（ｂ）と図１３を用いて説明する。図１２（ｂ）は、第１１実施形態の標本観察方法のフローチャートである。図１３は、各空間周波数における大きさを示す図であって、（ａ）は減算ステップ実行前の状態、（ｂ）は減算ステップ実行後の状態を示す図である。
　第１１実施形態の標本観察方法は、図１２（ｂ）に示すように、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０に加え、更に、変換ステップＳ１５−１と逆変換ステップＳ３０−３とを有する。これにより、第１１実施形態の標本観察方法では、より明瞭な電子画像が簡単に得られる。
　上述のように、減算ステップＳ２０では、Ａ_１ ^２の値を小さくすることで、Ａ_１ ^２＋Ａ_２ ^２の値に対して２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値を相対的に大きくしている。ここで、周波数空間で減算ステップＳ２０が実行されると、減算を効率的に行える。
　減算ステップＳ２０における減算について、図１３を用いて説明する。上述のように、細胞のような標本には、様々な空間周波数を持つ構造が含まれている。そこで、標本Ｓの像の明るさを空間周波数ごとに分離できれば、空間周波数ごとに減算が行える。
　そこで、第１１実施形態の標本観察方法では、取得ステップＳ１０の終了後に、変換ステップＳ１５−１が実行される。変換ステップＳ１５−１では、電子画像の信号をフーリエ変換する。その結果、図１３（ａ）に示すように、空間周波数ごとに、その大きさ（縦軸、明るさに相当）が分離される。図１３（ａ）では、横軸の数値は空間周波数を示しており、空間周波数が０では、その大きさは１００で、空間周波数が１では、その大きさは３０になっている。
　ここで、空間周波数の値（横軸の数値）は、回折光の次数と対応している。そのため、空間周波数０では、その大きさ（縦軸の数値）は０次回折光の明るさに対応する。同様に、空間周波数１では、その大きさは１次回折光の明るさに対応する。そこで、変換ステップＳ１５−１の終了後に、減算ステップＳ２０が実行される。この減算ステップＳ２０では、空間周波数０での大きさを小さくしている。例えば、図１３（ｂ）に示すように、空間周波数０での大きさを、１００から５０に半減させている。これは、Ａ_１ ^２の値を小さくすることに相当する。このようにすることで、０次光の明るさを小さくできる。
　続いて、逆変換ステップＳ３０−３が実行される。逆変換ステップＳ３０−３では、逆フーリエ変換を行う。これにより、電子画像の信号を得ることができる。なお、減算ステップＳ２０によって、０次光の明るさ、すなわち、Ａ_１ ^２の値が小さくなっている。そのため、Ａ_１ ^２＋Ａ_２ ^２の値に対して２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値を相対的により大きくできる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。
　なお、変換ステップＳ１５−１と逆変換ステップＳ３０−３を、第１０実施形態の標本観察方法に用いても良い。この場合、変換ステップＳ１５−１は、減算ステップＳ２０よりも前に実行される。また、逆変換ステップＳ３０−３は、減算ステップＳ２０よりも後に実行される。
　以上のように、第１１実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
　第１２実施形態の標本観察方法は、事前取得ステップと、規格化ステップと、を有し、事前取得ステップでは、標本が無い状態で電子画像を取得し、規格化ステップでは、電子画像で標本の電子画像を規格化し、減算ステップの前に、規格化ステップを行うものである。
　第１２実施形態の標本観察方法について、図１４を用いて説明する。図１４は第１２実施形態の標本観察方法のフローチャートである。
　第１２実施形態の標本観察方法は、図１４に示すように、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０に加え、更に、事前取得ステップＳ００と規格化ステップＳ１５−２とを有する。これにより、第１２実施形態の標本観察方法では、より明瞭な電子画像が得られる。
　なお、図１４では、減算ステップＳ２０の後に、増幅ステップＳ３０−２が備わっているが、この増幅ステップＳ３０−２は必須ではない。
　標本Ｓの像の明るさは、照明光学系による影響や結像光学系による影響を受けることがある。例えば、照明光学系や結像光学系を光が通過することで、通過後の光の明るさにむらが生じる。この場合、照明光学系や結像光学系による明るさのむらのために、標本Ｓの像にも明るさにむらが生じる。この明るさのむらは電子画像の画質を低下させるので、除去することが好ましい。
　そこで、第１２実施形態の標本観察方法では、取得ステップＳ１０の実行に先立って、事前取得ステップＳ００が実行される。事前取得ステップＳ００では、標本Ｓが無い状態で電子画像Ａの取得が行われる。このとき、電子画像Ａは、明るさのむらのみの画像になる。
　続いて、取得ステップＳ１０が実行され、標本Ｓの電子画像Ｂの取得が行われる。この電子画像Ｂは、標本Ｓの像に、照明光学系や結像光学系による明るさのむらが加わった画像になる。そこで、規格化ステップＳ１５−２が実行される。規格化ステップＳ１５−２では、電子画像Ａで電子画像Ｂを規格化する。すなわち、以下の演算、
　電子画像Ｂ／電子画像Ａ
を規格化ステップＳ１５−２において行う。これにより、電子画像Ｂにおける明るさのむらが、電子画像Ａにおける明るさのむらでキャンセルされる。そのため、規格化後の電子画像は、照明光学系や結像光学系による明るさのむらが低減された画像になる。
　規格化ステップＳ１５−２の終了後、減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０では、規格化後の電子画像においてＡ_１ ^２の値を小さくし、これにより、Ａ_１ ^２＋Ａ_２ ^２の値に対して２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値を相対的に大きくする。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。
　なお、事前取得ステップＳ００と規格化ステップＳ１５−２を、第１０実施形態の標本観察方法や第１１実施形態の標本観察方法に用いても良い。この場合、事前取得ステップＳ００は、取得ステップＳ１０よりも前に実行される。また、規格化ステップＳ１５−２は、減算ステップＳ２０よりも前に実行される。
　以上のように、第１２実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
　第１３実施形態の標本観察方法は、第１の波長帯域に対して第２の波長帯域を複数回変化させ、変化させた第２の波長帯域で、取得ステップと減算ステップが実行され、これにより、減算ステップを実行した後の電子画像を複数生成し、生成した複数の電子画像を加算するものである。
　第１３実施形態の標本観察方法によれば、電子画像の生成の際に、低い周波数空間から高い空間周波数までの各々の周波数空間でコントラストが高くなっている画像が使われる。よって、生成された電子画像では、どの空間周波数においてもコントラストが高くなっている。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。
　以上のように、第１３実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、明瞭に無色透明な標本を観察できる。
　第１４実施形態の標本観察方法は、加算の前に、複数の電子画像の各々について、電子画像のうちでコントラストが最も高い部分を抽出し、抽出した部分を使って加算を行うものである。
　第１４実施形態の標本観察方法によれば、加算によって電子画像を生成する時に、各周波数空間でコントラストが最も高くなっている部分のみが使われている。よって、生成された電子画像では、どの空間周波数においてもコントラストが非常に高くなっている。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。
　以上のように、第１４実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
　第１５実施形態の標本観察方法では、第２の波長帯域の変化は、第２の所定の状態における波面収差量の符号が同じ状態で行われるものである。
　上述のように、１次回折光における波面収差量が−λ／４になると、電子画像はダークコントラストの画像になる。すなわち、電子画像では、背景に比べて標本Ｓが暗くなる。一方、１次回折光における波面収差量が＋λ／４になると、電子画像はブライトコントラストの画像になる。すなわち、電子画像では、背景に比べて標本Ｓが明るくなる。
　そこで、加算によって電子画像を生成する時は、波面収差量の符号が同じ状態の画像を用いるのが良い。このようにすることで、生成した電子画像を、ダークコントラストのみに基づく画像、あるいは、ブライトコントラストのみに基づく画像にできる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。
　以上のように、第１５実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
　本実施形態の標本観察装置について説明する。第４実施形態から第６実施形態までの標本観察装置は、光源と、照明光学系と、結像光学系と、撮像装置と、画像処理装置と、を有し、照明光学系は、光源からの照明光を標本に照射するように配置され、結像光学系は、標本からの光が入射するように配置されると共に、標本の光学像を形成し、撮像装置は光学像の位置に配置され、画像処理装置は、上述の第９実施形態から第１５実施形態までの標本観察方法を行うことを特徴とする。
　第４実施形態の標本観察装置の構成を図２７に示す。標本観察装置２は、正立型顕微鏡を用いた観察システムである。標本観察装置１と同じ部材については同じ番号を付け、説明は省略する。
　標本観察装置２では、照明部２０は、光源２１と照明光学系２２とを有する。照明光学系２２は、コンデンサレンズ２３と、開口絞り２４と、光学フィルタＦＬとを有する。なお、図２７に示すように、照明光学系２２は、レンズ２５と、ミラー２６と、レンズ２７とを備えていても良い。図２７では、コンデンサレンズ２３と開口絞り２４はステージ１１に保持されている。照明光学系２２は、光源２１からステージ１１までの間の光路中に配置されている。
　次に、標本観察装置２を用いて、実施形態の標本観察方法を実施する手順について説明する。ここでは、第９実施形態の標本観察方法を例に説明する。なお、光源２１として、白色光源を用いる。
　まず、観察者は、照明光学系２２と結像光学系３１を、明視野観察の状態となるようにする。続いて、観察者は、ステージ１１に標本Ｓを載置する。そして、観察者は、合焦位置からずれていると思われる位置まで、目測で標本を移動させる。これにより、明視野観察の状態で、なお且つ標本Ｓの位置と合焦位置とが異なった状態になる。続いて、画像処理装置４０を作動させる。なお、これらの作業は、順不同で行って良い。
　画像処理装置４０が作動することで、標本Ｓの像が撮像可能になるので、取得ステップＳ１０が実行される。取得ステップＳ１０が実行されることで、電子画像の取得が行われる。取得ステップＳ１０で取得された電子画像は、画像処理装置４０内の一時記憶部（不図示）に保存される。
　続いて、減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０では、Ａ_１ ^２の値を小さくすることで、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値がＡ_１ ^２＋Ａ_２ ^２の値に対して相対的に大きくなる。減算ステップＳ２０の実行結果は、例えば、表示装置５０に表示される。
　上述のように、標本Ｓの位置の設定は目測で行われている。この場合、標本Ｓの位置と合焦位置とが大きく異なっている可能性が高いので、標本Ｓの像は大きくぼけている。そのため、標本Ｓの像が撮像されても、観察者は表示装置５０で電子画像を観察できない。
　そこで、観察者は焦準ノブを操作して、標本Ｓを合焦位置に向けて移動させる。標本Ｓの位置が顕微鏡対物レンズ３５から大きく離れている場合、観察者は、標本Ｓが顕微鏡対物レンズ３５に近づく方向にステージ１１を移動させれば良い。一方、標本Ｓの位置が顕微鏡対物レンズ３５に非常に近い場合、観察者は、標本Ｓが顕微鏡対物レンズ３５から離れる方向にステージ１１を移動させれば良い。
　標本Ｓを移動させている間、撮像は常に行われている。よって、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０も、常に実行されている。そこで、観察者は、表示装置５０で電子画像を観察しながら標本Ｓを光軸に沿って移動させ、標本Ｓの位置を合焦位置に一致させる。このとき、照明光学系２２の光路中には光学フィルタは配置されていないので、標本Ｓは白色光（第１の波長帯域の光）で照明されている。このときの合焦位置は、緑色の光（波長が５００ｎｍ~５６０ｎｍの光）で合焦した時の位置とみなせる。
　続いて、照明光学系２２の光路中に光学フィルタＦＬを挿入する。ここで、光学フィルタＦＬの波長帯域（透過率特性）を、中心波長が４５０ｎｍ、波長幅が±２０ｎｍとする。この場合、光学フィルタＦＬの波長帯域は、白色光の波長帯域のうちの一部と一致している。
　光学フィルタＦＬを光路中に挿入すると、第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成された状態になる。そこで、第２の波長帯域の光で、電子画像の取得が行われる。これにより、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時（瞬間）とで、光の波長帯域が異なる状態になる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。
　以上のように、第４実施形態の標本観察装置によれば、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本を観察できる。
　第５実施形態の標本観察装置の構成を図２８に示す。標本観察装置２’は、倒立型顕微鏡を用いた観察システムである。標本観察装置１’と同じ部材については同じ番号を付け、説明は省略する。
　標本観察装置２’では、結像光学系３１は、光学フィルタＦＬ、ＦＬ’を有する。光学フィルタＦＬは結像光学系３１の光路中に配置されている。光学フィルタＦＬ’は結像光学系３１の光路外に配置されている。光学フィルタＦＬと光学フィルタＦＬ’は、交換可能になっている。
　次に、標本観察装置２’を用いて、実施形態の標本観察方法を実施する手順について説明する。ここでは、第９実施形態の標本観察方法を例に説明する。なお、光源２１’として、白色光源を用いる。
　まず、観察者は、照明光学系２２’と結像光学系３１を、明視野観察の状態となるようにする。そして、観察者は、ステージ１１に標本Ｓを載置する。次に、光学フィルタＬＦを結像光学系３１の光路に挿入する。ここで、光学フィルタＦＬの波長帯域（透過率特性）を、中心波長が５５０ｎｍ、波長幅が±２０ｎｍとする。続いて、画像処理装置４０を作動させる。なお、これらの作業は、順不同で行って良い。
　観察者は、観察開始の情報を画像処理装置４０に入力する。ここで、画像処理装置４０に、合焦位置の情報が予め記憶されているとする。画像処理装置４０はレボルバ３３（顕微鏡対物レンズ３５）の現在の位置と合焦位置との情報に基づいて、移動量を算出する。算出した結果に基づいて、画像処理装置４０はモータ１２に駆動信号を送信する。送信された信号に基づいて、モータ１２はレボルバ３３を移動させ、標本Ｓの位置が合焦位置と一致した状態にする。このときの合焦位置は、波長帯域が５５０ｎｍ±２０ｎｍの光（第１の波長帯域の光）で合焦した時の位置とみなせる。
　続いて、結像光学系３１の光路中から光学フィルタＦＬを取り出し、代わりに光学フィルタＦＬ’を挿入する。ここで、光学フィルタＦＬ’の波長帯域（透過率特性）を、中心波長が６５０ｎｍ、波長幅が±２０ｎｍとする。この場合、光学フィルタＦＬ’の波長帯域は、光学フィルタＦＬの波長帯域と異なっている。
　光学フィルタＦＬ’を光路中に挿入すると、第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成された状態になる。そこで、第２の波長帯域の光で、電子画像の取得が行われる。これにより、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時（瞬間）とで、光の波長帯域が異なる状態になる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。
　光学フィルタＦＬとして、波長可変干渉フィルタを用いても良い。波長可変干渉フィルタは、波長帯域（透過率特性）を変えられる光学フィルタである。波長可変干渉フィルタを用いれば、光学フィルタＦＬと光学フィルタＦＬ’との交換が不要になる。
　なお、次のようにしても良い。白色光（第１の波長帯域の光）で標本を照明して、標本Ｓの位置と合焦位置とが一致した状態にする。そして、結像光学系３１の光路中に光学フィルタＦＬを挿入する。光学フィルタＦＬを光路中に挿入すると、第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成された状態になる。この場合、光学フィルタＦＬの波長帯域は、白色光の光学フィルタＦＬ’の波長帯域と異なっている。よって、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時（瞬間）とで、光の波長帯域が異なる状態になる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。
　また、次のようにしても良い。照明光学系２２の光路中に光学フィルタＦＬを挿入して、標本Ｓの位置と合焦位置とが一致した状態にする。そして、照明光学系２２の光路中から光学フィルタＦＬを取り出し、代わりに結像光学系３１の光路中に光学フィルタＦＬ’を挿入する。光学フィルタＦＬ’を光路中に挿入すると、第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成された状態になる。この場合、光学フィルタＦＬの波長帯域は、光学フィルタＦＬ’の波長帯域と異なっている。よって、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時（瞬間）とで、光の波長帯域が異なる状態になる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。
　以上のように、第５実施形態の標本観察装置によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
　第６実施形態の標本観察装置の構成を図２９に示す。標本観察装置３０１は、電子内視鏡を用いた観察システムである。図２９（ａ）は、観察装置の概略構成を示す図、図２９（ｂ）は、光学系の構成を示す図である。標本観察装置３００と同じ部材については同じ番号を付け、説明は省略する。
　標本観察装置３０１では、照明部は、光源と照明光学系とを有する。光源からの光は光ファイバ４０１から出射する。照明光学系は、レンズ４０２と、ミラー４０３と、レンズ４０４と、ハーフプリズム４０５と、対物レンズ４０６とを備える。観察部は、結像光学系と撮像装置とを有する。結像光学系は、対物レンズ４０６と、ハーフプリズム４０５と、結像レンズ４０７と、光学フィルタ４０９とを有する。撮像装置は撮像素子４０８を有する。この光学系では、標本Ｓは落射照明で照明される。
　標本観察装置３０１を用いて、実施形態の標本観察方法を実施する手順について説明する。ここでは、第１１実施形態の標本観察方法を例に説明する。なお、光源として、白色光源を用いる。
　まず、観察者は、照明光学系と結像光学系を、明視野観察の状態となるようにする。続いて、観察者は、合焦位置と思われる位置まで、目測で挿入部１４１を移動させる。そして、画像処理装置２００を作動させる。なお、これらの作業は、順不同で行って良い。
　画像処理装置２００が作動することで、標本Ｓの像が撮像可能になるので、取得ステップＳ１０が実行される。取得ステップＳ１０が実行されることで、電子画像の取得が行われる。取得ステップＳ１０で取得された電子画像は、画像処理装置２００内の一時記憶部（不図示）に保存される。
　続いて、減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０では、Ａ_１ ^２の値を小さくすることで、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値がＡ_１ ^２＋Ａ_２ ^２の値に対して相対的に大きくなる。
　減算ステップＳ２０の終了後、増幅ステップＳ３０−２が実行される。増幅ステップＳ３０−２では、２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値を大きくする（増幅する）。これにより、Ａ_１ ^２＋Ａ_２ ^２の値に対して２Ａ_１Ａ_２ｃｏｓψの値が相対的により大きくなる。増幅ステップＳ３０−２の実行結果は、例えば、表示装置２０４に表示される。
　挿入部１４１を移動させている間、撮像は常に行われている。よって、取得ステップＳ１０、減算ステップＳ２０及び増幅ステップＳ３０−２も、常に実行されている。そこで、観察者は、表示装置２０４で電子画像を観察しながら挿入部１４１を移動させ、標本Ｓの位置を合焦位置に一致させる。このとき、照明光学系２２の光路中には光学フィルタは配置されていないので、標本Ｓは白色光（第１の波長帯域の光）で照明されている。このときの合焦位置は、緑色の光（波長が５００ｎｍ~５６０ｎｍの光）で合焦した時の位置とみなせる。
　続いて、照明光学系２２の光路中に光学フィルタＦＬを挿入する。ここで、光学フィルタＦＬの波長帯域（透過率特性）を、中心波長が６５０ｎｍ、波長幅が±２０ｎｍとする。この場合、光学フィルタＦＬの波長帯域は、白色光の波長帯域のうちの一部と一致している。
　光学フィルタＦＬを光路中に挿入すると、第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成された状態になる。そこで、第２の波長帯域の光で、電子画像の取得が行われる。これにより、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時（瞬間）とで、光の波長帯域が異なる状態になる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。
　なお、対物レンズ４０６、結像レンズ４０７及び撮像素子４０８の少なくとも１つを、光軸に沿って移動させても良い。これらの移動には、例えば、マイクロアクチュエータ（不図示）やボイスコイルモータ（不図示）を用いれば良い。このようにすれば、合焦状態の調整を細かにできる。よって、挿入部１４１の移動は、ある程度のコントラストを持つ電子画像が取得できたところまでで済む。
　以上のように、第６実施形態の標本観察装置によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
　また、上述の第４実施形態から第６実施形態までの標本観察装置では、以下の条件式（５）を満足することが好ましい。
　１０μｍ＜ｄ／ＮＡ_ｏｂ ^２＜１０００μｍ　　　（５）
　ここで、
　ｄは、第１の波長帯域に対する第２の波長帯域における軸上色収差の量、
　ＮＡ_ｏｂは、結像光学系の標本側の開口数、
である。
　条件式（５）を満足することで、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
　条件式（５）の下限値を下回ると、第１の波長帯域における波面収差量と第２の波長帯域における波面収差量との差が小さくなりすぎる。この場合、回折光に加わる波面収差量が小さくなる。特に、１次回折光に加わる波面収差量がλ／４よりも小さくなる。そのため、コントラストの良い電子画像を得るのが難しくなる。
　条件式（５）の上限値を上回ると、第１の波長帯域における波面収差量と第２の波長帯域における波面収差量との差が大きくなりすぎる。この場合、回折光に加わる波面収差量が大きくなる。特に、１次回折光に加わる波面収差量がλ／４よりも大きくなる。また、収差量が大きくなりすぎるので、光学像が大きくぼやけてしまう。その結果、解像度の高い電子画像を得るのが難しくなる。
　また、上述の第４実施形態から第６実施形態までの標本観察装置では、結像光学系は対物レンズを有し、対物レンズにおける軸上色収差は、波長変化に対して単調に変化することが好ましい。
　このようにすることで、コントラストの良い電子画像が得られる。対物レンズにおける軸上色収差が波長変化に対して単調に変化すると、波長による波面収差のカーブの変化が分かりやすい。そのため、第２の波長帯域の選択において、コントラストと解像度が高くなる波長帯域を容易に選択できる。
　また、上述の第４実施形態から第６実施形態までの標本観察装置では、撮像装置は撮像素子を有し、撮像素子では、波長帯域が異なる微小な光学フィルタが画素ごとに配置されていることが好ましい。
　このようにすることで、コントラストの良い電子画像が容易に得られる。撮像素子には、光学フィルタが配置されている。この光学フィルタは、微小な光学フィルタを複数備えている。微小な光学フィルタには、例えば、赤色フィルタ、緑色フィルタ、青フィルタがある。そして、色フィルタの各々は、複数個配置されている。
　そこで、色フィルタごとに画像信号を取り出せば、容易に、第２の波長帯域の光で形成された光学像を撮像できる。すなわち、照明光学系の光路中や結像光学系の光路中に、光学フィルタを配置させる必要が無い。なお、撮像素子はモノクロの撮像素子であっても良い。
　なお、本発明は、その趣旨を逸脱しない範囲で様々な変形例をとることができる。

　以上のように、本発明は、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本、例えば、細胞を観察できる標本観察方法及び標本観察装置に適している。

　ＡＸ　光軸
　ＦＬ、ＦＬ’　光学フィルタ
　ＨＭ　ハーフミラー
　Ｌ_ｉｌｌ　照明光
　Ｌ_Ｃ　光線（０次回折光）
　Ｌ_Ｐ　光線（１次回折光）
　Ｌ_０　０次回折光
　Ｌ_−１　−１次回折光
　Ｌ_＋１　＋１次回折光
　Ｍ　ミラー
　ＯＢ_１、ＯＢ_２　対物レンズ
　Ｐ_Ｓ　標本Ｓの位置
　Ｐ_Ｆ　結像光学系の合焦位置
　Ｓ　標本
　Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４　区間
　１、１’、２、２’　標本観察装置
　１０　本体部
　１１　ステージ
　１２　モータ
　２０、２０’　照明部
　２１、２１’　光源
　２２、２２’　照明光学系
　２３　コンデンサレンズ
　２４　開口絞り
　２５、２５’　レンズ
　２６　ミラー
　２７、２７’　レンズ
　３０　観察部
　３１　結像光学系
　３２　撮像装置
　３３　レボルバ
　３４　観察鏡筒
　３５　顕微鏡対物レンズ
　３６　撮像レンズ
　３７　結像レンズ
　３８　プリズム
　３９　撮像素子
　４０　画像処理装置
　５０　表示装置
　１００　電子内視鏡
　１００ａ　スコープ部
　１００ｂ　接続コード部
　１４０　操作部
　１４１　挿入部
　１４２　先端部
　１５０　ユニバーサルコード
　２００　画像処理装置
　２０４　表示ユニット
　２５０　コネクタ
　３００、３０１　標本観察装置
　４０１　光ファイバ
　４０２、４０４　レンズ
　４０３　ミラー
　４０５　ハーフプリズム
　４０６　対物レンズ
　４０７　結像レンズ
　４０８　撮像素子
　４０９　光学フィルタ

Claims

　標本の電子画像を取得する取得ステップと、
　前記電子画像の信号から直流成分を減算する減算ステップと、を有し、
　前記取得ステップは明視野観察の状態で行われ、
　前記減算ステップにおける前記電子画像は、第１の所定の状態で取得された画像であって、
　該第１の所定の状態では、少なくとも、前記標本の位置と結像光学系の合焦位置とが異なっていることを特徴とする標本観察方法。
　前記減算ステップよりも後に比較ステップを有し、
　前記取得ステップを少なくとも３回行い、
　先に取得した電子画像と後に取得した電子画像とを、前記比較ステップで比較し、
　所定の条件を満足する電子画像が得られるまで、前記取得ステップから前記比較ステップまでを繰り返し行うことを特徴とする請求項１に記載の標本観察方法。
　前記減算ステップよりも後に増幅ステップを有し、
　前記増幅ステップでは、前記減算ステップ後の電子画像の信号を増幅することを特徴とする請求項１または２に記載の標本観察方法。
　前記電子画像の信号をフーリエ変換する変換ステップと、
　逆フーリエ変換を行う逆変換ステップと、を有し、
　前記変換ステップは、前記減算ステップよりも前に行われ、
　前記逆変換ステップは、少なくとも前記減算ステップよりも後に行われることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の標本観察方法。
　事前取得ステップと、
　規格化ステップと、を有し、
　前記事前取得ステップでは、前記標本が無い状態で電子画像を取得し、
　前記規格化ステップでは、該電子画像で前記標本の電子画像を規格化し、
　前記減算ステップの前に、前記規格化ステップを行うことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の標本観察方法。
　前記結像光学系の合焦位置に対して前記標本の位置を複数回変化させ、
　変化させた前記標本の位置で、前記取得ステップと前記減算ステップが行われ、
　これにより、前記減算ステップを実行した後の電子画像を複数生成し、
　生成した前記複数の電子画像を加算することを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の標本観察方法。
　前記加算の前に、前記複数の電子画像の各々について、前記電子画像のうちでコントラストが最も高い部分を抽出し、
　前記抽出した部分を使って前記加算を行うことを特徴とする請求項６に記載の標本観察方法。
　前記標本の位置の変化は、前記第１の所定の状態における波面収差量の符号が同じ状態で行われることを特徴とする請求項６または７に記載の標本観察方法。
　光源と、照明光学系と、結像光学系と、撮像装置と、画像処理装置と、を有し、
　前記照明光学系は、前記光源からの照明光を標本に照射するように配置され、
　前記結像光学系は、前記標本からの光が入射するように配置されると共に、前記標本の光学像を形成し、
　前記撮像装置は前記光学像の位置に配置され、
　前記画像処理装置は、請求項１から８のいずれか一項に記載の標本観察方法を行うことを特徴とする標本観察装置。
　表示装置を有し、
　前記表示装置は、前記画像処理装置からの出力信号を表示することを特徴とする請求項９に記載の標本観察装置。
　以下の条件式（１）を満足することを特徴とする請求項９または１０に記載の標本観察装置。
　０．０１＜ＮＡ_ｉｌｌ／ＮＡ_ｏｂ＜１　　　（１）
　ここで、
　ＮＡ_ｉｌｌは、前記照明光学系の前記標本側の開口数、
　ＮＡ_ｏｂは、前記結像光学系の前記標本側の開口数、
である。
　以下の条件式（２）を満足することを特徴とする請求項９から１１のいずれか一項に記載の標本観察装置。
　０．１μｍ＜ΔＺ×ＮＡ_ｏｂ ^２＜３０μｍ　　　（２）
　ここで、
　ΔＺは、前記結像光学系の合焦位置と前記標本の位置との差、
　ＮＡ_ｏｂは、前記結像光学系の前記標本側の開口数、
である。
　以下の条件式（３）を満足することを特徴とする請求項９から１２のいずれか一項に記載の標本観察装置。
　０．０５μｍ＜ΔＺ×ＮＡ_ｉｌｌ＜１０μｍ　　　（３）
　ここで、
　ΔＺは、前記結像光学系の合焦位置と前記標本の位置との差、
　ＮＡ_ｉｌｌは、前記照明光学系の前記標本側の開口数、
である。
　前記照明光学系は、コンデンサレンズと開口絞りを有することを特徴とする請求項９から１３のいずれか一項に記載の標本観察装置。
　前記照明光学系は、ケーラー照明光学系であることを特徴とする請求項９から１４のいずれか一項に記載の標本観察装置。
　前記照明光学系は、テレセントリック光学系であることを特徴とする請求項９から１５のいずれか一項に記載の標本観察装置。
　波長選択手段を有することを特徴とする請求項９から１６のいずれか一項に記載の標本観察装置。
　前記照明光が単色光であることを特徴とする請求項９から１７のいずれか一項に記載の標本観察装置。
　前記結像光学系は、テレセントリック光学系であることを特徴とする請求項９から１８のいずれか一項に記載の標本観察装置。
　前記結像光学系は、開口絞りを有することを特徴とする請求項９から１９のいずれか一項に記載の標本観察装置。
　前記結像光学系は対物レンズを有し、
　前記開口絞りは前記対物レンズに設けられていることを特徴とする請求項２０に記載の標本観察装置。
　以下の条件式（４）を満足することを特徴とする請求項９から２１のいずれか一項に記載の標本観察装置。
　０．５＜λ／（Ｐ×ＮＡ_ｉｍ）＜２０　　　（４）
　ここで、
　λは、前記撮像装置における撮像素子に入射する光の波長、
　Ｐは、前記撮像装置における撮像素子の画素ピッチ、
　ＮＡ_ｉｍは、前記結像光学系の前記撮像装置側の開口数、
である。
　駆動機構を有し、
　前記駆動機構は、前記保持部材、前記撮像装置及び前記結像光学系の少なくとも１つを、光軸に沿って移動させることを特徴とする請求項９から２２のいずれか一項に記載の標本観察装置。
　標本の電子画像を取得する取得ステップと、
　前記電子画像の信号から直流成分を減算する減算ステップと、を有し、
　前記取得ステップは明視野観察の状態で行われ、
　前記減算ステップにおける前記電子画像は、第２の所定の状態で取得された画像であって、
　前記第２の所定の状態になる前に、第１の波長帯域の光で前記標本の位置と結像光学系の合焦位置を一致させ、
　該第２の所定の状態では、少なくとも、第２の波長帯域の光で前記標本の光学像が形成されており、
　前記第２の波長帯域は前記第１の波長帯域のうちの一部と一致しているか、又は前記第１の波長帯域とは異なることを特徴とする標本観察方法。
　前記減算ステップよりも後に増幅ステップを有し、
　前記増幅ステップでは、前記減算ステップ後の電子画像の信号を増幅することを特徴とする請求項２４に記載の標本観察方法。
　前記電子画像の信号をフーリエ変換する変換ステップと、
　逆フーリエ変換を行う逆変換ステップと、を有し、
　前記変換ステップは、前記減算ステップよりも前に行われ、
　前記逆変換ステップは、少なくとも前記減算ステップよりも後に行われることを特徴とする請求項２４または２５に記載の標本観察方法。
　事前取得ステップと、
　規格化ステップと、を有し、
　前記事前取得ステップでは、前記標本が無い状態で電子画像を取得し、
　前記規格化ステップでは、該電子画像で前記標本の電子画像を規格化し、
　前記減算ステップの前に、前記規格化ステップを行うことを特徴とする請求項２４から２６のいずれか一項に記載の標本観察方法。
　前記第１の波長帯域に対して前記第２の波長帯域を複数回変化させ、
　変化させた前記第２の波長帯域で、前記取得ステップと前記減算ステップを実行し、
　これにより、前記減算ステップを実行した後の電子画像を複数生成し、
　生成した前記複数の電子画像を加算することを特徴とする請求項２４から２７のいずれか一項に記載の標本観察方法。
　前記加算の前に、前記複数の電子画像の各々について、前記電子画像のうちでコントラストが最も高い部分を抽出し、
　前記抽出した部分を使って前記加算を行うことを特徴とする請求項２８に記載の標本観察方法。
　前記第２の波長帯域の変化は、前記第２の所定の状態における波面収差量の符号が同じ状態で行われることを特徴とする請求項２８または２９に記載の標本観察方法。
　光源と、照明光学系と、結像光学系と、撮像装置と、画像処理装置と、を有し、
　前記照明光学系は、前記光源からの照明光を標本に照射するように配置され、
　前記結像光学系は、前記標本からの光が入射するように配置されると共に、前記標本の光学像を形成し、
　前記撮像装置は前記光学像の位置に配置され、
　前記画像処理装置は、請求項２４から３０のいずれか一項に記載の標本観察方法を行うこと
を特徴とする標本観察装置。
　表示装置を有し、
　前記表示装置は、前記画像処理装置からの出力信号を表示することを特徴とする請求項３１に記載の標本観察装置。
　以下の条件式（５）を満足することを特徴とする請求項３１または３２に記載の標本観察装置。
　１０μｍ＜ｄ／ＮＡ_ｏｂ ^２＜１０００μｍ　　　（５）
　ここで、
　ｄは、前記第１の波長帯域に対する前記第２の波長帯域における軸上色収差の量、
　ＮＡ_ｏｂは、前記結像光学系の前記標本側の開口数、
である。
　前記結像光学系は対物レンズを有し、
　該対物レンズにおける軸上色収差は、波長変化に対して単調に変化することを特徴とする請求項３１から３３のいずれか一項に記載の標本観察装置。
　前記撮像装置は撮像素子を有し、
前記撮像素子では、波長帯域が異なる微小な光学フィルタが画素ごとに配置されている
　ことを特徴とする請求項３１から３４のいずれか一項に記載の標本観察装置。