DE102016115856B4

DE102016115856B4 - Verfahren zur Bildgebung in einem Mikroskop mit schiefer Beleuchtung

Info

Publication number: DE102016115856B4
Application number: DE102016115856.9A
Authority: DE
Inventors: Benjamin Deissler; Albrecht Weiss; Alexander Weiss
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2016-08-25
Filing date: 2016-08-25
Publication date: 2020-01-02
Anticipated expiration: 2036-08-26
Also published as: EP3504575A1; US20190391380A1; DE102016115856A1; WO2018036911A1; US10823951B2

Abstract

Verfahren zur Bildgebung in einem Mikroskop (200) mit schiefer Beleuchtung, wobei ein Objekt von einem schräg auf die Objektebene (204) des Mikroskops (200) einfallenden Beleuchtungsstrahlengang (211), beleuchtet wird und ein mikroskopisches Bild des Objekts und ein entsprechendes digitales Bildsignal erzeugt werden,dadurch gekennzeichnet,dass das digitale Bildsignal mittels digitaler Bildverarbeitung unter Verwendung eines Faltungskerns zur Kontraststeigerung bearbeitet und hieraus ein kontrastgesteigertes digitales Bild erzeugt wird, wobei ein Faltungskern verwendet wird,dessen Orientierung in Relation zur Richtung der schiefen Beleuchtung ausgerichtet ist, um die Kontraststeigerung weiter zu erhöhen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bildgebung in einem Mikroskop mit schiefer Beleuchtung, wobei ein Objekt von einem schräg auf die Objektebene des Mikroskops einfallenden Beleuchtungsstrahlengang beleuchtet wird und ein mikroskopisches Bild des Objekts und ein entsprechendes digitales Bildsignal erzeugt werden.
Stand der Technik
Üblicherweise kann in der Hellfeld-Mikroskopie zur Steigerung des Kontrasts und zur Erzeugung eines plastischen Reliefeindrucks bei kontrastarmen Proben das Verfahren der schiefen Beleuchtung eingesetzt werden. Dabei wird nur ein dezentraler Ausschnitt in der Aperturblendenebene, also ein Ausschnitt im Wesentlichen außerhalb der optischen Achse der Aperturblende, ausgeleuchtet, sodass die Wellenfronten des Beleuchtungslichts das Präparat mehr oder weniger schräg, also in einem bestimmten Winkelbereich geneigt zur optischen Achse, durchsetzen. Aufgrund der Asymmetrie der Beleuchtung mitteln sich die verschieden geneigten Wellenfronten bei Interferenz im Bild nicht aus, was dazu führt, dass eine Kante im Objekt auf einer Seite hell und auf der anderen Seite dunkel dargestellt wird, sodass ein reliefartiger Bildeindruck entsteht.
Eine Untersuchung im schrägen Auflicht wird beispielsweise bei der Wafer-Untersuchung eingesetzt, um die an den Strukturen der Wafer-Oberfläche auftretenden Beugungseffekte dazu zu nutzen, diese Strukturen kontrastreich und plastisch abzubilden. Die Auflicht- als auch die Durchlichtmikroskopie mit schräger Beleuchtung kommen mit Vorteil bei Phasenobjekten zum Einsatz und stellen eine technisch einfache und damit kostengünstige Alternative zur Interferenzmikroskopie dar. In der Regel wird mit einer Köhlerschen Beleuchtung gearbeitet, wobei eine einseitig schräge Beleuchtung, beispielsweise durch Dezentrierung der Aperturblende, erhalten werden kann, wie in der DE 35 27 426 C1 vorgeschlagen. Die dort vorgeschlagene Aperturblende kann zu beiden Seiten hin aus der optischen Achse verfahren werden
Aus dem Deutschen Patent, DE 10 2010 042351 B4 , der Anmelderin ist ein anderer Aufbau zur schrägen Auflichtbeleuchtung bekannt, bei dem innerhalb der Aperturblende eine Blendenöffnung dezentriert zur optischen Achse positioniert werden kann. Die Blendenöffnung ist dabei Bestandteil einer Blendenscheibe, die Blendenöffnungen verschieden großen Durchmessers trägt. Das dort vorgeschlagene Mikroskopbeleuchtungssystem zur schrägen Auflichtbeleuchtung kann prinzipiell auch bei vorliegender Erfindung zum Einsatz kommen. Insofern sei bereits hier ausdrücklich zu Einzelheiten von Aufbau und Funktionsweise eines solchen Mikroskopbeleuchtungssystems auf die genannte Schrift verwiesen.
Kontrastierverfahren auf Basis der geschilderten schiefen Beleuchtung kommen für verschiedene kontrastarme Probentypen, insbesondere auch in Zusammenhang mit Mikrotiterplatten zum Einsatz. Bei Nutzung der schiefen Beleuchtung kommt es beim Fokussieren in z-Richtung, also in Richtung der optischen Achse des Mikroskopobjektivs, zu einer lateralen Verschiebung des Bildes. Der Kontrastgewinn durch schiefe Beleuchtung ist umso stärker, je dezentraler die Objektivpupille ausgeleuchtet wird. Dies führt aber bei der Verwendung von Mikrotiterplatten zu Problemen, da es zum einen aufgrund der Tiefe der Näpfchen zu geometrisch bedingten Abschattungen kommt und zum anderen der Meniskus an der Flüssigkeitsoberfläche eine Verschiebung der beleuchteten Fläche in der Objektivpupille in Abhängigkeit von der x-y-Bewegung der Probe verursacht.
Aufgabe vorliegender Erfindung ist es, ein Verfahren zur Bildgebung in einem Mikroskop mit schiefer Beleuchtung anzugeben, mit dem die Bildgebung dieses Kontrastierverfahrens verbessert und insbesondere die oben genannten Nachteile vermieden werden sollen.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung schlägt ein Verfahren zur Bildgebung in einem Mikroskop mit schiefer Beleuchtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 vor. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bildgebung in einem Mikroskop mit schiefer Beleuchtung wird ein Objekt von einem schräg auf die Objektebene einfallenden Beleuchtungsstrahlengang beleuchtet. In bekannter Weise wird ein mikroskopisches Bild dieses Objekts erzeugt. Das hier betrachtete Mikroskop weist im Wesentlichen ein Mikroskopobjektiv auf, wobei häufig verschiedene Objektive zur Auswahl stehen, sowie eine Tubusoptik. Das mikroskopische Bild des Objekts kann unmittelbar von einem Betrachter und/oder über eine Kamera betrachtet werden. Zur Anzeige des Bildes auf einer Digitalkamera ist es erforderlich, ein digitales Bildsignal aus dem vorhandenen mikroskopischen optischen Bild zu erzeugen. Selbstverständlich sind auch Fälle denkbar, bei denen ohne unmittelbare Betrachtung ein digitales Bild, etwa zu Dokumentationszwecken, erzeugt wird. Erfindungsgemäß wird nun der durch die schiefe Beleuchtung erzeugte reliefartige Bildeindruck mit gesteigertem Kontrast nochmals dadurch erhöht, dass das digitale Bildsignal mittels digitaler Bildverarbeitung unter Verwendung eines Faltungskerns (auch als Faltungsmatrix oder „Convolution-Filter“ bezeichnet) zur Kontraststeigerung bearbeitet und hieraus ein kontrastgesteigertes digitales Bild erzeugt wird. Hierbei wird ein Faltungskern verwendet, dessen Orientierung in Relation zur Richtung der schiefen Beleuchtung ausgerichtet ist, um die Kontraststeigerung weiter zu erhöhen.
Vorteile der Erfindung
Bei den hier betrachteten kontrastarmen Probentypen, wie sie beispielsweise bei der eingangs erwähnten Verwendung von Mikrotiterplatten vorliegen, hätte die alleinige Verwendung von digitaler Bildverarbeitung zur Kontraststeigerung und/oder zur Erzeugung eines Reliefeindrucks den Nachteil, dass es bei kontrastarmen Eingangsdaten leicht zu Artfakten, hohem Rauschen und einem zunehmenden Verlust der Objektähnlichkeit kommen kann. Aus diesem Grunde wurden derartige Bildverarbeitungsmethoden bei den hier vorliegenden Einsatzfall nicht in Betracht gezogen. Es hat sich nun überraschenderweise gezeigt, dass die digitale Bildverarbeitung in Kombination mit der Bildgebung in einem Mikroskop mit schiefer Beleuchtung gerade für den hier betrachteten Einsatzfall große Vorteile bringt. Beide kontraststeigernde Effekte verstärken sich positiv, ohne dass die genannten negativen Effekte den Vorteil der weiter erhöhten Kontraststeigerung mindern.
Hierbei ist es insbesondere von Vorteil, wenn der schräge Beleuchtungsstrahlengang durch Ausleuchtung eines dezentralen Bereichs in oder nahe einer Aperturebene einer Beleuchtungsanordnung des Mikroskops erzeugt wird, wobei dieser ausgeleuchtete Bereich bis zu einer halben Pupillengröße einer konjugiert hierzu angeordneten Eintrittspupille des Mikroskopobjektivs betragen kann. Der ausgeleuchtete Bereich kann dabei insbesondere größer sein als er zur Erzeugung eines ausreichenden Kontrastgewinns und Reliefeindrucks bei der Bildgebung mit schiefer Beleuchtung herkömmlich typischerweise notwendig wäre. Für eine Kontraststeigerung alleine durch schiefe Beleuchtung wird typischerweise nur ein äußeres Viertel der Objektivpupille ausgeleuchtet (unter Inkaufnahme von ungewollten Artefakten). Für das erfindungsgemäße Verfahren ist vorzugsweise der ausgeleuchtete Bereich 100 %, insbesondere 70 %, insbesondere 50% größer als zur Bildgebung mit schiefer Beleuchtung notwendig. Dieses im Kontrastbereich gesteigerte Bild wird anschließend mit Hilfe digitaler Bildverarbeitung weiter zur Steigerung des Kontrasts verrechnet.
Zur schiefen Beleuchtung wird mit Hilfe von entsprechenden Blenden in oder nahe der Aperturblendenebene oder - was hiervon ausdrücklich umfasst sein soll - in oder nahe einer zur Aperturblendenebene konjungierten Ebene oder durch die Ansteuerung dort befindlicher Lichtmodule nur ein dezentraler Bereich und somit nur ein dezentraler Teil der Objektivpupille ausgeleuchtet. Bei Verwendung einer Köhlerschen Beleuchtungsanordnung kann zur Erzeugung der schiefen Beleuchtung ein Aufbau verwendet werden, wie er aus der bereits genannten Patentschrift DE 10 2010 042351 B4 bekannt ist. Bezüglich Aufbau und Funktionsweise sei nochmals ausdrücklich auf diese Schrift verwiesen.
An sich ist der Einsatz insbesondere quadratischer Faltungskerne, also beispielsweise 3 x 3 oder 4 x 4 - Faltungsmatrizen, zur Kontraststeigerung von digitalen Bildern bekannt. Eine derartige Faltungsmatrix weist auf der einen Seite der Symmetrieachse negative und auf der anderen Seite der Symmetrieachse positive Werte des gleichen Betrags auf. Die Ausrichtung der Symmetrieachse der Matrix bestimmt die Richtung des im Relief wahrgenommenen Lichteinfalls. Die durch die schiefe Beleuchtung erzeugte kontrastgesteigerte Reliefstruktur im Mikroskopbild kann erfindungsgemäß durch den Einsatz solcher Faltungskerne noch gesteigert werden. Insbesondere werden hierzu Faltungskerne der Form $\begin{array}{l} {(\begin{matrix} - 1 & - 2 & - 1 \\ 0 & 1 & 0 \\ 1 & 2 & 1 \end{matrix})}_{,} & {(\begin{matrix} 0 & - 1 & - 2 \\ 1 & 1 & - 1 \\ 2 & 1 & 0 \end{matrix})}_{,} & {(\begin{matrix} 1 & 0 & - 1 \\ 2 & 1 & - 2 \\ 1 & 0 & - 1 \end{matrix})}_{,} & {(\begin{matrix} 2 & 1 & 0 \\ 1 & 1 & - 1 \\ 0 & - 1 & - 2 \end{matrix})}_{,} \\ {(\begin{matrix} 1 & 2 & 1 \\ 0 & 1 & 0 \\ - 1 & - 2 & - 1 \end{matrix})}_{,} & {(\begin{matrix} 0 & 1 & 2 \\ - 1 & 1 & 1 \\ - 2 & - 1 & 0 \end{matrix})}_{,} & {(\begin{matrix} - 1 & 0 & 1 \\ - 2 & 1 & 2 \\ - 1 & 0 & 1 \end{matrix})}_{oder} & (\begin{matrix} - 2 & - 1 & 0 \\ - 1 & 1 & 1 \\ 0 & 1 & 2 \end{matrix}) \end{array}$
verwendet. Hierbei ist es besonders vorteilhaft, wenn die Orientierung des Faltungskerns so in Relation zur Richtung der schiefen Beleuchtung ausgerichtet wird, dass sich die kontraststeigernden Effekte verstärken. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn die Richtung, aus der die schiefe Beleuchtung auf die Probe trifft, mit der Richtung der Zahlenfolge (2, 1, -2 ) des Faltungskerns, hier als Vektor aufgefasst, übereinstimmt, wobei angenommen ist, dass die Probe und das Bild der Probe gleich ausgerichtet sind (Norden des Bildes stimmt mit Norden der Probe überein).
Zum Beispiel wird bei einer schiefen Beleuchtung aus dem Norden des Bildes der folgende Faltungskern verwendet: $(\begin{matrix} 1 & 2 & 1 \\ 0 & 1 & 0 \\ - 1 & - 2 & - 1 \end{matrix})$
Die digitale Bilderverarbeitung kann an beliebiger Stelle bei vorhandenem digitalen Bildsignal erfolgen. Es ist vorteilhaft, wenn das digitale Bild durch eine Kamera aufgenommen und durch einen zentralen Rechner (CPU) bzw. einem daran angeschlossenen Monitor des Mikroskops angezeigt wird. Die digitale Verarbeitung erfolgt dann beispielsweise an einer beliebigen Stelle zwischen Kamera und CPU, zum Beispiel direkt in der Kamera, in einem eigenen Modul zwischen Kamera und CPU oder in der CPU selbst. Sie erfolgt dabei in Echtzeit, sodass das Verfahren in einem Online-Bild beispielsweise zur Navigation im Objektfeld genutzt werden kann.
Bei der digitalen Bildverarbeitung wird die Information (beispielsweise jeweils ein Byte für jede der Farben rot, grün und blau) jedes Bildpixels unter Verwendung der entsprechenden Information der benachbarten Pixel mit der jeweils durch den Faltungskern gegebenen Gewichtung neu berechnet.
Es ist weiterhin vorteilhaft, wenn der ausgeleuchtete dezentrale Bereich in oder nahe einer (konjugierten) Aperturebene einer Beleuchtungsanordnung des Mikroskops und/oder der verwendete Faltungskern in Abhängigkeit von einem verwendeten Mikroskopobjektiv bestimmt wird. Bei Verwendung verschiedener Objektive mit unterschiedlicher Vergrößerung und Apertur kann auf diese Weise das Verhältnis zwischen schiefer Beleuchtung und Relieffilter durch den Wechsel oder eine Anpassung von Blenden in besagter Aperturebene und/oder durch Nutzung eines anderen Faltungskerns angepasst werden. Damit können eine ausreichende Ausleuchtung des Objektfeldes sichergestellt und Abschattungen minimiert werden.
Es sei darauf hingewiesen, dass das erfindungsgemäße Verfahren sowohl bei einem Mikroskop mit endlichem Abbildungsstrahlengang als auch bei einem Mikroskop mit unendlichem Abbildungsstrahlengang verwendet werden kann. Weiterhin kann der Beleuchtungsstrahlengang einen Auflicht-Beleuchtungsstrahlengang oder einen Durchlicht-Beleuchtungsstrahlengang bilden.
Zusammenfassend hat die Erfindung den Vorteil, dass man ein kontrastgesteigertes Bild mit Reliefeindruck erhalten kann, ohne dass die oben geschilderten Probleme merklich zum Tragen kommen, die durch schiefe Beleuchtung einerseits und durch die digitale Bildverarbeitung andererseits alleine genommenen verursacht würden. Die laterale Bildverschiebung beim Fokussieren sowie das Rauschen und der Verlust der Objektähnlichkeit durch die Faltung werden minimiert. Dieser Effekt konnte nicht erwartet werden. Die Erfindung ist insbesondere für die Verwendung von Proben in Mikrotiterplatten geeignet, da hier aufgrund der Tiefe der Näpfchen und wegen des Flüssigkeitsmeniskus weder die schiefe Beleuchtung alleine noch etwa bekannte Phasenkontrastverfahren zur effektiver Kontrasterhöhung eingesetzt werden können. Auch der Differentialinterferenzkontrast (DIC) ist bei der Verwendung von Kunststoff-Mikrotiterplatten wegen des Verlusts der Polarisationsrichtung nicht einsetzbar.
Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und der beiliegenden Zeichnung.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung ist anhand eines Ausführungsbeispieles in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung beschrieben.
Figurenliste

1 zeigt eine schematische Querschnittsansicht zum Aufbau einer schiefen Beleuchtung,
2 zeigt schematisch eine Ausführungsform eines Mikroskops zur Bildgebung mit schiefer Durchlichtbeleuchtung,
3 zeigt schematisch eine Ausführungsform eines Mikroskops zur Bildgebung mit schiefer Auflichtbeleuchtung und
4 zeigt schematisch den Verfahrensablauf gemäß Erfindung.

Das Grundprinzip der schiefen Beleuchtung ist in 1 dargestellt Die dargestellte Beleuchtungsanordnung weist eine Aperturblende 101 und einen Kondensor 103 auf. Ein dezentraler Bereich 105 der Aperturblende101 wird durch einen Beleuchtungsstrahlengang 102 ausgeleuchtet. Der dezentrale Bereich 105 liegt außerhalb der optischen Achse 106 beziehungsweise liegt größtenteils außerhalb dieser optischen Achse 106, kann diese jedoch enthalten. Entscheidend ist, dass der dezentrale Bereich105 nicht symmetrisch zur optischen Achse 106 liegt, wie in 1 dargestellt. Das Beleuchtungslicht wird durch einen Kondensor 103 gesammelt und auf die Objektebene 104 fokussiert. Wie in 1 dargestellt, treffen die Lichtstrahlen des Beleuchtungsstrahlengangs 102 unter einem Winkel zur optischen Achse 106 auf die Objektebene 104. Aufgrund der vorhandenen Asymmetrie mitteln sich die verschieden geneigten Wellenfronten bei Interferenz im Bild nicht aus, was zu dem bereits beschriebenen Reliefeindruck und erhöhtem Kontrast führt.
2 zeigt eine mögliche Ausführungsform eines Mikroskops 200 zur Bildgebung mit schiefer Beleuchtung, wobei hier der Fall der Durchlichtbeleuchtung gezeigt ist. Eine mögliche Ausführungsform der schiefen Beleuchtung in einem Mikroskop mit Auflichtbeleuchtung kann 3 entnommen werden.
2 zeigt sehr schematisch ein Mikroskop 200, das die wesentlichen Bestandteile des Mikroskopobjektivs 208 und der Tubusoptik 209 aufweist. Das Objektiv 208 definiert eine optische Achse 206. Das Mikroskop 200 umfasst weiterhin einen Mikroskoptisch 215, auf dem ein Objekt in einer Objektebene 204 gelagert ist, das mikroskopisch im Durchlicht untersucht werden soll. Im vorliegenden Fall nimmt eine Kamera 230 das mikroskopische optische Bild auf und wandelt es in ein digitales Bild um. Das digitale Bild kann auf einem Monitor 242 für einen Betrachter dargestellt werden. Diese Vorgänge sind an sich bekannt und sollen daher nicht weiter erläutert werden.
Das hier betrachtete digitale Mikroskop 200 verfügt über eine zentrale Steuereinheit beziehungsweise CPU 241 zur Steuerung der verschiedenen Mikroskopkomponenten. Beispielhaft ist hier eine Blendensteuerung 243 dargestellt, die von der CPU 241 angesteuert wird. Hierauf wird weiter unten eingegangen. Die CPU 241 steuert in der Regel auch den Mikroskoptisch 215 zum Verfahren des selbigen, die Auswahl eines Objektivs 218 und andere Komponenten an.
Die Beleuchtungsanordnung des Mikroskops 200 umfasst eine Lichtquelle 201, eine nachgeschaltete Linse 202, eine weitere Linse 203 und eine in der Aperturebene oder nahe der Aperturebene angeordnete Blende 210. Der Blende 210 ist ein Kondensor 212 nachgeordnet, der den Beleuchtungsstrahlengang 211 auf die Objektebene 204 fokussiert. Optisch handelt es sich bei dem hier dargestellten Strahlengang um die Realisierung einer Köhlerschen Durchlichtbeleuchtung. Hierzu ist die Blende 210 in einer zur Lichtquelle 201 konjugierten Ebene angeordnet. Gleichzeitig ist die Blende 210 in einer zur Eintrittspupille des Mikroskopobjektivs 208 konjugierten Ebene angeordnet. Auf diese Weise wird eine gleichmäßige Ausleuchtung der Objektebene 204 und somit des beobachteten Präparatausschnitts erzielt. Die Lichtquelle 201 wird über die aus den Linsen 202 und(203 bestehenden Beleuchtungsoptik in die Apertur-Blendenebene abgebildet. Mittels einer dort befindlichen Blendenöffnung 205 wird aus dem ursprünglichen Beleuchtungsstrahlengang 211' ein dezentrierter Beleuchtungsstrahlengang 211 erzeugt. Bei der in 2 dargestellten Blende 210 kann es sich auch um eine Blendenscheibe mit verschiedenen Blendenöffnungen handeln, wie sie ausführlich in der DE 10 2010 042 351 B4 beschrieben ist. Insofern sei wiederum bezüglich Aufbau und Funktionsweise ausdrücklich auf diese Schrift verwiesen.
Das von dem hier dargestellten Mikroskop 200 erzeugte Bild des auf der Objektebene 204 befindlichen schräg beleuchteten Präparats wird von der Kamera 230 aufgenommen. Das entsprechende digitale Bildsignal wird in hier dargestellten Ausführungsbeispielen in einer Recheneinheit 240 digital nachbearbeitet. Selbstverständlich kann die hier dargestellte Recheneinheit 240 Bestandteil der Kamera 230, aber auch Bestandteil der CPU 241 sein. Die digitale Verarbeitung kann folglich direkt in der Kamera 230 oder direkt in der CPU 241 oder - wie hier dargestellt - in der Recheneinheit 240 erfolgen. Die digitale Bildverarbeitung mittels eines insbesondere quadratischen Faltungskerns kann dabei in Echtzeit vorgenommen werden, so dass das verarbeitete Bild ohne merkliche Verzögerung für einen Benutzer als online-Bild beispielsweise zur Navigation im Objektfeld auf einem Monitor 242 dargestellt werden kann.
Im Folgenden sei der Vorgang der Faltung eines Bildpixels eines Bildausschnitts mit einem Faltungskern der Form $(\begin{matrix} - 1 & - 2 & - 1 \\ 0 & 1 & 0 \\ 1 & 2 & 1 \end{matrix})$
exemplarisch dargestellt, wobei lediglich die Information einer Farbe (kodiert in Bytes) betrachtet werden soll.
Digitales Bild:
Kontrastgesteigertes digitales Bild:

...	...	...	...	...
...	4	4	4	...
...	-4	-4	-4	...
...	-6	-6	-6	...
...	2	2	2	...
...	2	2	2	...
...	10	10	10	...
...	12	12	12	...
...	4	4	4	...
...	...	...	...	...

Der betreffende Bildpixel (unterstrichen) wird verrechnet, indem das Skalarprodukt des ihn umgebende 3x3 Bildausschnitt (schattiert) mit dem 3x3 Faltungskern gebildet wird (-1x2 + -2x2 + -1x2 + 0x2 + 1x2 + 0x2 + 1x4 + 2x4 + 1x4 = 10).
In der Praxis ist es besonders vorteilhaft, die Orientierung in obigem Beispiel gegeben durch die Richtung der Zahlenfolge (2, 1, -2) in Relation zur Richtung der schiefen Beleuchtung, hier aus dem Süden kommend, auszurichten, um die Kontraststeigerung weiter zu erhöhen. In der Praxis wird außerdem, insbesondere bei regelmäßigen Strukturen in der Probe, die Richtung der schiefen Beleuchtung in Bezug auf den Verlauf solcher Strukturen ausgerichtet, um diese optimal plastisch darstellen zu können.
Es ist besonders vorteilhaft, zunächst die Größe des ausgeleuchteten Bereichs 205 der Blende 210 derart zu wählen, dass in herkömmlicherweise ein Bild mit schiefer Beleuchtung erzeugt wird. Anschließend kann die Größe des Bereichs 205 gesteigert werden, beispielsweise bis zur halbseitigen Beleuchtung der Objektivpupille. Dies ist aufgrund der nachfolgenden digitalen Bildverarbeitung ohne Verluste der Bildqualität möglich. Hierzu wird der Bereich 205 beispielsweise dadurch vergrößert, dass eine etwas größere Blendenöffnung in den Beleuchtungsstrahlengang 211 eingebracht wird. Hierzu kann die Blende 210 beispielsweise als Blendenrad ausgeführt sein. Die Ansteuerung der Blende 210 erfolgt über die Blendensteuerung 243, die ihrerseits von der CPU 241 angesteuert wird. Besonders bevorzugt ist es, wenn der ausgeleuchtete Bereich 205 etwa 50 % - 70 % größer gewählt ist als herkömmlich zur Bildgebung mit schiefer Beleuchtung notwendig.
Zur nachfolgenden digitalen Bildverarbeitung wird ein geeigneter Faltungskern insbesondere von der CPU 241 ausgewählt und zur Bildverarbeitung der Recheneinheit 240 übergeben. Der jeweils verwendete Faltungskern und/oder der ausgeleuchtete dezentrale Bereich 205 könnten weiterhin insbesondere in Abhängigkeit von dem verwendeten Mikroskopobjektiv 208 bestimmt werden. Je nach Vergrößerung und Apertur des Objektivs 208 können ein daran angepasster ausgeleuchteter Bereich 205 sowie ein daran angepasster Faltungskern vorteilhaft sein. Damit kann eine ausreichende Ausleuchtung des Objekts sichergestellt und Abschattungen minimiert werden.
Der vorliegende Aufbau ist insbesondere für Proben in Mikrotiterplatten, insbesondere solchen in Plastiknäpfchen, die in Durchlichtbeleuchtung untersucht werden, vorteilhaft.
Bezüglich der Ausführungsform gemäß 3, die eine Ausführungsform eines Mikroskops 200 zur Bildgebung mit schiefer Auflichtbeleuchtung zeigt, sei im Wesentlichen auf die obigen Ausführungen in Zusammenhang mit 2 verwiesen.
Gleiche Bezugszeichen bedeuten identische oder im Wesentlichen gleiche Elemente wie in 2.
Während die Beleuchtungsanordnung des Mikroskops 200 gemäß 2 eine Durchlichtbeleuchtung realisiert, setzt das Mikroskop 200 eine Beleuchtungsanordnung zur Auflichtbeleuchtung ein. Die Beleuchtungsanordnung umfasst wiederum eine Lichtquelle 201 und nachgeschaltete Linsen 202, 203 und eine in der Aperturebene oder nahe der Aperturebene angeordnete Blende 210. Die Linsen 202 und 203 definieren eine optische Achse 206 der Beleuchtungsanordnung. Aus dem symmetrischen Beleuchtungsstrahlengang 211' wird durch den dezentralen ausgeleuchteten Bereich 205 der Blende 210 ein asymmetrisch zur optischen Achse 206 liegender Bereich ausgeschnitten, der im Weiteren als Beleuchtungsstrahlengang 211 für die schiefe Beleuchtung verwendet wird. Die beiden nachgeschalteten Linsen 213 und 207 erzeugen einen parallelen Beleuchtungsstrahlengang 211, der von einem Strahlteiler 220 in Richtung optischer Achse 206 des Mikroskopobjektivs 208 eingekoppelt wird. Das Mikroskopobjektiv 208 fokussiert den Beleuchtungsstrahlengang 211 auf die Objektebene 204.
Alle anderen Details zur Bilderzeugung im Mikroskop 200, zur digitalen Bildverarbeitung sowie zur Ansteuerung der Blende 220 stehen in völliger Analogie zu denjenigen aus 2. Zur Vermeidung von Wiederholungen sei daher auf die dortigen Ausführungen verwiesen.
Das Verfahren ist nochmals in 4 kurz erläutert. Im Schritt S1 wird ein Mikroskopbild mit schiefer Beleuchtung aufgenommen. Hierzu sei auf die Ausführungen im Zusammenhang mit 2 verwiesen. Sämtliche Informationen über die Parameter der schiefen Beleuchtung (symbolisiert durch die Parameter P1) liegen der CPU 241 vor und werden im nächsten Schritt S2 bei der Auswahl eines passenden Faltungskerns berücksichtigt. Zu den Parametern der schiefen Beleuchtung gehören Vergrößerung und Apertur des verwendeten Objektivs 208 sowie Größe, Geometrie und Lage des ausgeleuchteten Bereichs 205 der Blende 210. Nach Auswahl des passenden Faltungskerns im Schritt S2 wird in der Recheneinheit 240 das digitalisierte mikroskopische Bild mit dem ausgewählten Faltungskern gefaltet (Schritt S3). Das kontrastgesteigerte digitale Bild kann im Schritt S4 beispielsweise auf einen Monitor 242 dargestellt werden. Das in 4 geschilderte Verfahren kann selbstverständlich auch in dem Aufbau eines Mikroskops gemäß 3 abgearbeitet werden.
Bezugszeichenliste

101: Aperturblende
102: Beleuchtungsstrahlengang
103: Kondensor
104: Objektebene
105: Ausgeleuchteter Bereich
106: Optische Achse
200: Mikroskop
201: Lichtquelle
202: Linse
203: Linse
204: Objektebene
205: Ausgeleuchteter Bereich
206: Optische Achse
207: Linse
208: Objektiv
209: Tubusoptik
210: Blende
211, 211': Beleuchtungsstrahlengang
212: Kondensor
213: Linse
215: Mikroskoptisch
220: Strahlteiler
230: Kamera
240: Recheneinheit
241: Zentrale Steuereinheit, CPU
242: Monitor
243: Blendensteuerung
S1 - S4: Verfahrensschritte
P1: Parameter

Claims

Verfahren zur Bildgebung in einem Mikroskop (200) mit schiefer Beleuchtung, wobei ein Objekt von einem schräg auf die Objektebene (204) des Mikroskops (200) einfallenden Beleuchtungsstrahlengang (211), beleuchtet wird und ein mikroskopisches Bild des Objekts und ein entsprechendes digitales Bildsignal erzeugt werden, dadurch gekennzeichnet, dass das digitale Bildsignal mittels digitaler Bildverarbeitung unter Verwendung eines Faltungskerns zur Kontraststeigerung bearbeitet und hieraus ein kontrastgesteigertes digitales Bild erzeugt wird, wobei ein Faltungskern verwendet wird, dessen Orientierung in Relation zur Richtung der schiefen Beleuchtung ausgerichtet ist, um die Kontraststeigerung weiter zu erhöhen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichtnet, dass ein quadratischer Faltungskern verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Faltungskern in Form einer Faltungsmatrix $\begin{array}{l} {(\begin{matrix} - 1 & - 2 & - 1 \\ 0 & 1 & 0 \\ 1 & 2 & 1 \end{matrix})}_{,} & {(\begin{matrix} 0 & - 1 & - 2 \\ 1 & 1 & - 1 \\ 2 & 1 & 0 \end{matrix})}_{,} & {(\begin{matrix} 1 & 0 & - 1 \\ 2 & 1 & - 2 \\ 1 & 0 & - 1 \end{matrix})}_{,} & {(\begin{matrix} 2 & 1 & 0 \\ 1 & 1 & - 1 \\ 0 & - 1 & - 2 \end{matrix})}_{,} \\ {(\begin{matrix} 1 & 2 & 1 \\ 0 & 1 & 0 \\ - 1 & - 2 & - 1 \end{matrix})}_{,} & {(\begin{matrix} 0 & 1 & 2 \\ - 1 & 1 & 1 \\ - 2 & - 1 & 0 \end{matrix})}_{,} & {(\begin{matrix} - 1 & 0 & 1 \\ - 2 & 1 & 2 \\ - 1 & 0 & 1 \end{matrix})}_{oder} & (\begin{matrix} - 2 & - 1 & 0 \\ - 1 & 1 & 1 \\ 0 & 1 & 2 \end{matrix}) \end{array}$
verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Richtung der als Vektor aufgefassten Zahlenfolge (2, 1, -2) des Faltungskerns mit der Richtung, aus der die schiefe Beleuchtung auf die Probe trifft, übereinstimmt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der schräge Beleuchtungsstrahlengang (211) durch Ausleuchtung eines dezentralen Bereichs (205) in oder nahe einer Aperturebene (210) einer Beleuchtungsanordnung des Mikroskops (200) erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der ausgeleuchtete Bereich (205) größer gewählt wird als zur Bildgebung mit schiefer Beleuchtung notwendig.
Verfahren nach Anspruch 6, daduch gekennzeichnet, dass der ausgeleuchtete Bereich 100 %, insbesondere 70 %, insbesondere 50% größer gewählt wird als zur Bildgebung mit schiefer Beleuchtung notwendig.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der ausgeleuchtete Bereich (205) bis zur halben Pupillengröße einer konjugiert hierzu angeordneten Eintrittspupille des Mikroskopobjektivs gewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der ausgeleuchtete dezentrale Bereich (205) und/oder der verwendete Faltungskern in Abhängigkeit von dem verwendeten Mikroskopobjektiv (208) bestimmt wird.