WO2018036911A1 - Verfahren zur bildgebung in einem mikroskop mit schiefer beleuchtung - Google Patents

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WO2018036911A1
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illumination
microscope
digital image
contrast
imaging
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PCT/EP2017/070882
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Benjamin DEISSLER
Albrecht Weiss
Alexander Weiss
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Leica Microsystems Cms Gmbh
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    • G06T2207/10056—Microscopic image

Definitions

  • the present invention relates to a method for imaging in a microscope with oblique illumination, wherein an object is illuminated by an obliquely incident on the object plane of the microscope illumination beam path and a microscopic image of the object and a corresponding digital image signal are generated.
  • the method of oblique illumination can be used to increase the contrast and to produce a plastic relief impression in low-contrast samples.
  • a decentral section in the aperture diaphragm plane ie a section substantially outside the optical axis of the aperture diaphragm, is illuminated, so that the wavefronts of the illumination light pass through the preparation more or less obliquely, ie inclined in a certain angular range to the optical axis.
  • the differently inclined wavefronts are not sufficient for interference in the image, which results in an edge in the object being rendered bright on one side and dark on the other side, resulting in a relief-like image impression.
  • Incident light and transmitted light microscopy with oblique illumination are advantageously used for phase objects and represent a technically simple and thus cost-effective alternative to interference microscopy.
  • Köhler illumination is used, with oblique illumination on one side, for example by decentration of the light Aperture, can be obtained, as proposed in DE 35 27 426 C1.
  • the aperture diaphragm proposed there can be moved on both sides out of the optical axis
  • Contrasting methods on the basis of the described oblique illumination are used for various low-contrast sample types, in particular also in connection with microtiter plates.
  • oblique lighting When using the oblique lighting When focusing in the z-direction, ie in the direction of the optical axis of the microscope objective, there is a lateral shift of the image.
  • the gain in contrast due to oblique illumination is the stronger, the more decentralized the objective pupil is illuminated.
  • this leads to problems in the use of microtiter plates since on the one hand due to the depth of the wells geometrically caused shadowing and on the other hand the meniscus on the liquid surface a shift of the illuminated surface in the objective pupil as a function of the xy movement caused the sample.
  • the object of the present invention is to specify a method for imaging in a microscope with slant illumination, with which the imaging of this contrasting method is improved and in particular the abovementioned disadvantages are to be avoided. Disclosure of the invention
  • the present invention proposes a method for imaging in a microscope with oblique illumination with the features of claim 1.
  • Advantageous embodiments are the subject of the dependent claims and the following description.
  • an object is illuminated by an illumination beam path incident obliquely on the object plane.
  • a microscopic image of this object is generated.
  • the microscope considered here essentially has a microscope objective, with different lenses often being available for selection, as well as a tube optic.
  • the microscopic image of the object can be viewed directly by a viewer and / or via a camera. To display the image on a digital camera, it is necessary to generate a digital image signal from the existing microscopic optical image.
  • a digital image for example for documentation purposes, is generated without direct consideration.
  • the relief-like image impression produced by the oblique illumination is again increased with increased contrast by processing the digital image signal by means of digital image processing using a convolution kernel (also referred to as convolution filter or convolution filter) to increase the contrast and from this a contrast-enhanced image digital image is generated.
  • a convolution kernel also referred to as convolution filter or convolution filter
  • the oblique illumination beam path is generated by illuminating a decentralized area in or near an aperture plane of an illumination arrangement of the microscope, this illuminated area being conjugate to a half pupil size one arranged entrance pupil of the microscope objective may amount.
  • the illuminated area may in particular be larger than would typically be necessary to produce a sufficient contrast gain and relief impression in the case of oblique illumination imaging.
  • the illuminated area is preferably 100%, in particular 70%, in particular 50% larger than necessary for imaging with oblique illumination.
  • This contrast-enhanced image is then further processed to increase the contrast with the aid of digital image processing.
  • a Köhler illumination arrangement can be used to produce the oblique illumination, a structure as known from the aforementioned patent DE 10 2010 042351 B4. With regard to construction and mode of operation, reference is expressly made again to this document.
  • the orientation of the convolution kernel is aligned in relation to the direction of the oblique illumination in such a way that the contrast-increasing effects increase. This is especially the case when the direction from which the oblique illumination hits the sample coincides with the direction of the sequence of numbers (2, 1, -2) of the convolution kernel, here considered as a vector, assuming that the Sample and the image of the sample are aligned the same (north of the image coincides with north of the sample).
  • a symmetrical square convolution kernel is used whose symmetry axis is oriented perpendicular to the direction of the oblique illumination.
  • Digital image processing can be performed anywhere in the presence of a digital image signal. It is advantageous if the digital image is recorded by a camera and displayed by a central computer (CPU) or a monitor of the microscope connected to it. The digital processing then takes place, for example, anywhere between the camera and the CPU, for example directly in the camera, in a separate module between the camera and the CPU or in the CPU itself. It takes place in real time, so that the process takes place in an online image For example, it can be used for navigation in the object field.
  • CPU central computer
  • the information (for example, one byte for each of the colors red, green, and blue) of each image pixel is recalculated using the corresponding information of the adjacent pixels with the weight given by the convolution kernel. It is furthermore advantageous if the illuminated decentralized area in or near a (conjugate) aperture plane of an illumination arrangement of the microscope and / or the convolution kernel used is determined as a function of a microscope objective used. In this way, when using different objectives with different magnification and aperture, the relationship between slant illumination and relief filter can be adjusted by changing or adjusting apertures in said aperture plane and / or by using another convolution kernel. This can ensure sufficient illumination of the object field and shadowing can be minimized. It should be noted that the method according to the invention can be used both in a microscope with a finite imaging beam path and in a microscope with an infinite imaging beam path.
  • the illumination beam path can form an incident-light illumination beam path or a transmitted-light illumination beam path.
  • the invention has the advantage that it is possible to obtain a contrast-enhanced image with a relief impression without the above-described problems noticeably coming to fruition, which would be caused by oblique illumination on the one hand and digital image processing alone on the other hand.
  • the lateral image shift in focusing as well as the noise and the loss of object similarity by the convolution are minimized. This effect could not be expected.
  • the invention is particularly suitable for the use of samples in microtiter plates, since due to the depth of the wells and because of the liquid meniscus, neither the oblique illumination alone nor any known phase contrasting methods can be used to effectively increase the contrast.
  • the differential interference contrast (DIC) is not applicable when using plastic microtiter plates because of the loss of polarization direction.
  • FIG. 1 shows a schematic cross-sectional view of the structure of an oblique illumination
  • FIG. 2 schematically shows an embodiment of a microscope for imaging with slanted transmitted light illumination
  • FIG. 3 schematically shows an embodiment of a microscope for imaging with slant incident illumination
  • FIG. 4 shows schematically the method sequence according to the invention.
  • the basic principle of the oblique illumination is shown in FIG.
  • the illustrated illumination arrangement has an aperture stop 101 and a condenser 103.
  • a decentral area 105 of the aperture 101 is illuminated by an illumination beam path 102.
  • the decentralized area 105 lies outside the optical axis 106 or lies largely outside this optical axis 106, but may contain these.
  • the decisive factor is that the decentralized region 105 is not symmetrical with respect to the optical axis 106, as shown in FIG.
  • the illumination light is collected by a condenser 103 and focused on the object plane 104. As shown in FIG.
  • FIG. 2 shows a possible embodiment of a microscope 200 for imaging with oblique illumination, in which case the case of transmitted light illumination is shown.
  • a possible embodiment of the oblique illumination in a microscope with epi-illumination can be seen in FIG.
  • FIG. 2 very schematically shows a microscope 200, which has the essential components of the microscope objective 208 and the tube optics 209.
  • the objective 208 defines an optical axis 206.
  • the microscope 200 further comprises a microscope stage 215, on which an object is mounted in an object plane 204, which is to be examined microscopically in transmitted light.
  • a camera 230 captures the microscopic optical image and converts it to a digital image.
  • the digital image may be displayed on a monitor 242 for a viewer.
  • the digital microscope 200 considered here has a central control unit or CPU 241 for controlling the various microscope components.
  • a central control unit or CPU 241 for controlling the various microscope components.
  • an aperture control 243 is shown here, which is controlled by the CPU 241. This will be discussed below.
  • the CPU 241 also typically controls the microscope stage 215 to move the same, selecting a lens 218, and other components.
  • the illumination arrangement of the microscope 200 comprises a light source 201, a downstream lens 202, a further lens 203 and a diaphragm 210 arranged in the aperture plane or near the aperture plane.
  • the diaphragm 210 is followed by a condenser 212, which projects the illumination beam path 211 onto the object plane 204 focused.
  • the beam path shown here is the realization of Köhler's transmitted light illumination.
  • the diaphragm 210 is arranged in a plane conjugate to the light source 201.
  • the diaphragm 210 is in an entrance pupil of the microscope objective 208 conjugated level arranged. In this way, a uniform illumination of the object plane 204 and thus of the observed preparation section is achieved.
  • the light source 201 is imaged into the aperture diaphragm plane via the illumination optics consisting of the lenses 202 and 203.
  • a decentered illumination beam path 211 is generated from the original illumination beam path 211 'by means of an aperture 205 located there it is also an aperture disk with different apertures, as described in detail in DE 10 2010 042 351 B4 In this respect, reference should again be made explicitly to this document with regard to construction and mode of operation.
  • the corresponding digital image signal is digitally reworked in embodiments shown here in a computing unit 240.
  • the arithmetic unit 240 shown here may be part of the camera 230, but also part of the CPU 241.
  • the digital processing can therefore take place directly in the camera 230 or directly in the CPU 241 or, as shown here, in the arithmetic unit 240.
  • the digital image processing by means of a particularly square convolution kernel can be carried out in real time, so that the processed image without noticeable delay for a user as an online image, for example, for navigation in the object field on a monitor 242 can be displayed.
  • the orientation in the above example given by the direction of the sequence of numbers (2, 1, -2), which is perpendicular to the axis of symmetry (0, 1, 0), in relation to the direction of the oblique illumination, here coming from the south align to further increase the contrast increase.
  • the direction of the oblique illumination is aligned with respect to the course of such structures in order to be able to represent them optimally plastically.
  • the size of the illuminated region 205 of the diaphragm 210 is particularly advantageous initially to select the size of the illuminated region 205 of the diaphragm 210 in such a way that an image with oblique illumination is conventionally generated. Subsequently, the size of the region 205 can be increased, for example, until the half-side illumination of the objective pupil. This is possible due to the subsequent digital image processing without loss of image quality.
  • the region 205 is enlarged, for example, by introducing a slightly larger aperture into the illumination beam path 211.
  • the diaphragm 210 may be designed, for example, as an aperture wheel.
  • the control of the diaphragm 210 via the aperture control 243 which in turn is controlled by the CPU 241. It is particularly preferred if the illuminated region 205 is selected to be about 50% -70% larger than is conventionally necessary for imaging with oblique illumination.
  • a suitable convolution kernel is selected in particular by the CPU 241 and transferred to the arithmetic unit 240 for image processing.
  • the respectively used folding core and / or the illuminated decentralized region 205 could furthermore be determined in particular depending on the microscope objective 208 used.
  • the magnification ß réelle and aperture of the lens 208 may be an adapted illuminated area 205 and an adapted convolution core be advantageous. This ensures sufficient illumination of the object and shading can be minimized.
  • the present structure is particularly advantageous for samples in microtiter plates, in particular those in plastic wells which are examined in transmitted light illumination.
  • FIG. 3 which shows an embodiment of a microscope 200 for imaging with slant reflected illumination
  • FIG. 3 shows an embodiment of a microscope 200 for imaging with slant reflected illumination
  • the microscope 200 uses a lighting arrangement for reflected-light illumination.
  • the illumination arrangement in turn comprises a light source 201 and downstream lenses 202, 203 and an aperture 210 arranged in the aperture plane or near the aperture plane.
  • the lenses 202 and 203 define an optical axis 206 of the illumination arrangement. From the symmetric illumination beam path 211 '210 an asymmetrically opposed to the optical axis 206 area is cut out by the decentralized illuminated region 205 of the diaphragm, which is used to as an illumination path 211 for the oblique illumination.
  • the two downstream lenses 213 and 207 generate a parallel illumination beam path 211, which is coupled by a beam splitter 220 in the direction of the optical axis 206 of the microscope objective 208.
  • the microscope objective 208 focuses the illumination beam path 211 onto the object plane 204. All other details for imaging in the microscope 200, for digital image processing and for controlling the diaphragm 220 are in complete analogy to those of Figure 2. To avoid repetition, reference is therefore made to the statements there.
  • step S1 a microscope image is taken with slant illumination.
  • All information about the parameters of the oblique illumination are available to the CPU 241 and are taken into account in the next step S2 in the selection of a suitable convolution kernel.
  • the parameters of the oblique illumination include magnification and aperture of the objective 208 used, as well as size, geometry and position of the illuminated region 205 of the diaphragm 210.
  • Step S3 The contrast enhanced digital image may be displayed on a monitor 242 in step S4, for example.
  • the method described in FIG. 4 can also be executed in the structure of a microscope according to FIG.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bildgebung in einem Mikroskop (200) mit schiefer Beleuchtung, wobei ein Objekt von einem schräg auf die Objektebene (204) des Mikroskops (200) einfallenden Beleuchtungsstrahlengang (211) beleuchtet wird sowie ein mikroskopisches Bild des Objekts und ein entsprechendes digitales Bildsignal erzeugt werden, wobei das digitale Bildsignal mittels digitaler Bildverarbeitung unter Verwendung eines Faltungskerns zur Kontraststeigerung bearbeitet und hieraus ein kontrastgesteigertes digitales Bild erzeugt wird.

Description

Verfahren zur Bildgebung in einem Mikroskop mit schiefer Beleuchtung
Beschreibung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bildgebung in einem Mikroskop mit schiefer Beleuchtung, wobei ein Objekt von einem schräg auf die Objektebene des Mikroskops einfallenden Beleuchtungsstrahlengang beleuchtet wird und ein mikroskopisches Bild des Objekts und ein entsprechendes digitales Bildsignal erzeugt werden.
Stand der Technik
Üblicherweise kann in der Hellfeld-Mikroskopie zur Steigerung des Kontrasts und zur Erzeugung eines plastischen Reliefeindrucks bei kontrastarmen Proben das Verfahren der schiefen Beleuchtung eingesetzt werden. Dabei wird nur ein dezentraler Ausschnitt in der Aperturblendenebene, also ein Ausschnitt im Wesentlichen außerhalb der optischen Achse der Aperturblende, ausgeleuchtet, sodass die Wellenfronten des Beleuchtungslichts das Präparat mehr oder weniger schräg, also in einem bestimmten Winkelbereich geneigt zur optischen Achse, durchsetzen. Auf- grund der Asymmetrie der Beleuchtung mittein sich die verschieden geneigten Wellenfronten bei Interferenz im Bild nicht aus, was dazu führt, dass eine Kante im Objekt auf einer Seite hell und auf der anderen Seite dunkel dargestellt wird, sodass ein reliefartiger Bildeindruck entsteht.
Eine Untersuchung im schrägen Auflicht wird beispielsweise bei der Wafer- Untersuchung eingesetzt, um die an den Strukturen der Wafer-Oberfläche auftretenden Beugungseffekte dazu zu nutzen, diese Strukturen kontrastreich und plastisch abzubilden. Die Auflicht- als auch die Durchlichtmikroskopie mit schräger Beleuchtung kommen mit Vorteil bei Phasenobjekten zum Einsatz und stellen eine technisch einfache und damit kostengünstige Alternative zur Interferenzmikroskopie dar. In der Regel wird mit einer Köhlerschen Beleuchtung gearbeitet, wobei eine einseitig schräge Beleuchtung, beispielsweise durch Dezentrierung der Aperturblende, erhalten werden kann, wie in der DE 35 27 426 Cl vorgeschlagen. Die dort vorgeschlagene Aperturblende kann zu beiden Seiten hin aus der optischen Achse verfahren werden
Aus dem Deutschen Patent, DE 10 2010 042351 B4, der Anmelderin ist ein anderer Aufbau zur schrägen Auflichtbeleuchtung bekannt, bei dem innerhalb der Apertur- blende eine Blendenöffnung dezentriert zur optischen Achse positioniert werden kann. Die Blendenöffnung ist dabei Bestandteil einer Blendenscheibe, die Blendenöffnungen verschieden großen Durchmessers trägt. Das dort vorgeschlagene Mikroskopbeleuchtungssystem zur schrägen Auflichtbeleuchtung kann prinzipiell auch bei vorliegender Erfindung zum Einsatz kommen. Insofern sei bereits hier ausdrücklich zu Einzelheiten von Aufbau und Funktionsweise eines solchen Mikroskopbeleuchtungssystems auf die genannte Schrift verwiesen.
Kontrastierverfahren auf Basis der geschilderten schiefen Beleuchtung kommen für verschiedene kontrastarme Probentypen, insbesondere auch in Zusammen- hang mit Mikrotiterplatten zum Einsatz. Bei Nutzung der schiefen Beleuchtung kommt es beim Fokussieren in z-Richtung, also in Richtung der optischen Achse des Mikroskopobjektivs, zu einer lateralen Verschiebung des Bildes. Der Kontrastgewinn durch schiefe Beleuchtung ist umso stärker, je dezentraler die Objektivpupille ausgeleuchtet wird. Dies führt aber bei der Verwendung von Mikrotiterplat- ten zu Problemen, da es zum einen aufgrund der Tiefe der Näpfchen zu geometrisch bedingten Abschattungen kommt und zum anderen der Meniskus an der Flüssigkeitsoberfläche eine Verschiebung der beleuchteten Fläche in der Objektivpupille in Abhängigkeit von der x-y-Bewegung der Probe verursacht. Aufgabe vorliegender Erfindung ist es, ein Verfahren zur Bildgebung in einem Mikroskop mit schiefer Beleuchtung anzugeben, mit dem die Bildgebung dieses Kontrastierverfahrens verbessert und insbesondere die oben genannten Nachteile vermieden werden sollen. Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung schlägt ein Verfahren zur Bildgebung in einem Mikroskop mit schiefer Beleuchtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 vor. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche sowie der nachfol- genden Beschreibung.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bildgebung in einem Mikroskop mit schiefer Beleuchtung wird ein Objekt von einem schräg auf die Objektebene einfallenden Beleuchtungsstrahlengang beleuchtet. In bekannter Weise wird ein mikro- skopisches Bild dieses Objekts erzeugt. Das hier betrachtete Mikroskop weist im Wesentlichen ein Mikroskopobjektiv auf, wobei häufig verschiedene Objektive zur Auswahl stehen, sowie eine Tubusoptik. Das mikroskopische Bild des Objekts kann unmittelbar von einem Betrachter und/oder über eine Kamera betrachtet werden. Zur Anzeige des Bildes auf einer Digitalkamera ist es erforderlich, ein digitales Bildsignal aus dem vorhandenen mikroskopischen optischen Bild zu erzeugen. Selbstverständlich sind auch Fälle denkbar, bei denen ohne unmittelbare Betrachtung ein digitales Bild, etwa zu Dokumentationszwecken, erzeugt wird. Erfindungsgemäß wird nun der durch die schiefe Beleuchtung erzeugte reliefartige Bildeindruck mit gesteigertem Kontrast nochmals dadurch erhöht, dass das digita- le Bildsignal mittels digitaler Bildverarbeitung unter Verwendung eines Faltungskerns (auch als Faltungsmatrix oder "Convolution-Filter" bezeichnet) zur Kontraststeigerung bearbeitet und hieraus ein kontrastgesteigertes digitales Bild erzeugt wird.
Vorteile der Erfindung
Bei den hier betrachteten kontrastarmen Probentypen, wie sie beispielsweise bei der eingangs erwähnten Verwendung von Mikrotiterplatten vorliegen, hätte die alleinige Verwendung von digitaler Bildverarbeitung zur Kontraststeigerung und/oder zur Erzeugung eines Reliefeindrucks den Nachteil, dass es bei kontrastarmen Eingangsdaten leicht zu Artfakten, hohem Rauschen und einem zunehmenden Verlust der Objektähnlichkeit kommen kann. Aus diesem Grunde wurden derartige Bildverarbeitungsmethoden bei den hier vorliegenden Einsatzfall nicht in Betracht gezogen. Es hat sich nun überraschenderweise gezeigt, dass die digitale Bildverarbeitung in Kombination mit der Bildgebung in einem Mikroskop mit schiefer Beleuchtung gerade für den hier betrachteten Einsatzfall große Vorteile bringt. Beide kontraststeigernde Effekte verstärken sich positiv, ohne dass die genannten negativen Effekte den Vorteil der weiter erhöhten Kontraststeigerung mindern.
Hierbei ist es insbesondere von Vorteil, wenn der schräge Beleuchtungsstrahlengang durch Ausleuchtung eines dezentralen Bereichs in oder nahe einer Aperturebene einer Beleuchtungsanordnung des Mikroskops erzeugt wird, wobei dieser ausgeleuchtete Bereich bis zu einer halben Pupillengröße einer konjugiert hierzu angeordneten Eintrittspupille des Mikroskopobjektivs betragen kann. Der ausgeleuchtete Bereich kann dabei insbesondere größer sein als er zur Erzeugung eines ausreichenden Kontrastgewinns und Reliefeindrucks bei der Bildgebung mit schiefer Beleuchtung herkömmlich typischerweise notwendig wäre. Für eine Kontrast- Steigerung alleine durch schiefe Beleuchtung wird typischerweise nur ein äußeres Viertel der Objektivpupille ausgeleuchtet (unter Inkaufnahme von ungewollten Artefakten). Für das erfindungsgemäße Verfahren ist vorzugsweise der ausgeleuchtete Bereich 100 %, insbesondere 70 %, insbesondere 50% größer als zur Bildgebung mit schiefer Beleuchtung notwendig. Dieses im Kontrastbereich gestei- gerte Bild wird anschließend mit Hilfe digitaler Bildverarbeitung weiter zur Steigerung des Kontrasts verrechnet.
Zur schiefen Beleuchtung wird mit Hilfe von entsprechenden Blenden in oder nahe der Aperturblendenebene oder - was hiervon ausdrücklich umfasst sein soll - in oder nahe einer zur Aperturblendenebene konjungierten Ebene oder durch die
Ansteuerung dort befindlicher Lichtmodule nur ein dezentraler Bereich und somit nur ein dezentraler Teil der Objektivpupille ausgeleuchtet. Bei Verwendung einer Köhlerschen Beleuchtungsanordnung kann zur Erzeugung der schiefen Beleuchtung ein Aufbau verwendet werden, wie er aus der bereits genannten Patentschrift DE 10 2010 042351 B4 bekannt ist. Bezüglich Aufbau und Funktionsweise sei nochmals ausdrücklich auf diese Schrift verwiesen.
An sich ist der Einsatz insbesondere quadratischer Faltungskerne, also beispielsweise 3 x 3 oder 4 x 4 - Faltungsmatrizen, zur Kontraststeigerung von digitalen Bildern bekannt. Eine derartige Faltungsmatrix weist auf der einen Seite der Symmetrieachse negative und auf der anderen Seite der Symmetrieachse positive Werte des gleichen Betrags auf. Die Ausrichtung der Symmetrieachse der Matrix bestimmt die Richtung des im Relief wahrgenommenen Lichteinfalls. Die durch die schiefe Beleuchtung erzeugte kontrastgesteigerte Reliefstruktur im Mikroskopbild kann erfindungsgemäß durch den Einsatz solcher direktionalen Faltungskerne noch gesteigert werden. Insbesondere werden hierzu Faltungskerne der Form
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000007_0002
verwendet. Hierbei ist es besonders vorteilhaft, wenn die Orientierung des Faltungskerns so in Relation zur Richtung der schiefen Beleuchtung ausgerichtet wird, dass sich die kontraststeigernden Effekte verstärken. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn die Richtung, aus der die schiefe Beleuchtung auf die Probe trifft, mit der Richtung der Zahlenfolge (2, 1, -2 ) des Faltungskerns, hier als Vektor aufgefasst, übereinstimmt, wobei angenommen ist, dass die Probe und das Bild der Probe gleich ausgerichtet sind (Norden des Bildes stimmt mit Norden der Probe überein).
Zum Beispiel wird bei einer schiefen Beleuchtung aus dem Norden des Bildes der folgende Faltungskern verwendet:
Figure imgf000007_0003
Allgemein gesprochen wird also insbesondere ein symmetrischer quadratischer Faltungskern verwendet, dessen Symmetrieachse senkrecht zur Richtung der schiefen Beleuchtung ausgerichtet ist. Die digitale Bilderverarbeitung kann an beliebiger Stelle bei vorhandenem digitalen Bildsignal erfolgen. Es ist vorteilhaft, wenn das digitale Bild durch eine Kamera aufgenommen und durch einen zentralen Rechner (CPU) bzw. einem daran angeschlossenen Monitor des Mikroskops angezeigt wird. Die digitale Verarbeitung erfolgt dann beispielsweise an einer beliebigen Stelle zwischen Kamera und CPU, zum Beispiel direkt in der Kamera, in einem eigenen Modul zwischen Kamera und CPU oder in der CPU selbst. Sie erfolgt dabei in Echtzeit, sodass das Verfahren in einem Online-Bild beispielsweise zur Navigation im Objektfeld genutzt werden kann. Bei der digitalen Bildverarbeitung wird die Information (beispielsweise jeweils ein Byte für jede der Farben rot, grün und blau) jedes Bildpixels unter Verwendung der entsprechenden Information der benachbarten Pixel mit der jeweils durch den Faltungskern gegebenen Gewichtung neu berechnet. Es ist weiterhin vorteilhaft, wenn der ausgeleuchtete dezentrale Bereich in oder nahe einer (konjugierten) Aperturebene einer Beleuchtungsanordnung des Mikroskops und/oder der verwendete Faltungskern in Abhängigkeit von einem verwendeten Mikroskopobjektiv bestimmt wird. Bei Verwendung verschiedener Objektive mit unterschiedlicher Vergrößerung und Apertur kann auf diese Weise das Ver- hältnis zwischen schiefer Beleuchtung und Relieffilter durch den Wechsel oder eine Anpassung von Blenden in besagter Aperturebene und/oder durch Nutzung eines anderen Faltungskerns angepasst werden. Damit können eine ausreichende Ausleuchtung des Objektfeldes sichergestellt und Abschattungen minimiert werden. Es sei darauf hingewiesen, dass das erfindungsgemäße Verfahren sowohl bei einem Mikroskop mit endlichem Abbildungsstrahlengang als auch bei einem Mikroskop mit unendlichem Abbildungsstrahlengang verwendet werden kann.
Weiterhin kann der Beleuchtungsstrahlengang einen Auflicht- Beleuchtungsstrahlengang oder einen Durchlicht-Beleuchtungsstrahlengang bilden.
Zusammenfassend hat die Erfindung den Vorteil, dass man ein kontrastgesteigertes Bild mit Reliefeindruck erhalten kann, ohne dass die oben geschilderten Prob- lerne merklich zum Tragen kommen, die durch schiefe Beleuchtung einerseits und durch die digitale Bildverarbeitung andererseits alleine genommenen verursacht würden. Die laterale Bildverschiebung beim Fokussieren sowie das Rauschen und der Verlust der Objektähnlichkeit durch die Faltung werden minimiert. Dieser Effekt konnte nicht erwartet werden. Die Erfindung ist insbesondere für die Ver- wendung von Proben in Mikrotiterplatten geeignet, da hier aufgrund der Tiefe der Näpfchen und wegen des Flüssigkeitsmeniskus weder die schiefe Beleuchtung alleine noch etwa bekannte Phasenkontrastverfahren zur effektiver Kontrasterhöhung eingesetzt werden können. Auch der Differentialinterferenzkontrast (DIC) ist bei der Verwendung von Kunststoff-Mikrotiterplatten wegen des Verlusts der Po- larisationsrichtung nicht einsetzbar.
Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und der beiliegenden Zeichnung. Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Die Erfindung ist anhand eines Ausführungsbeispieles in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung beschrieben. Figurenbeschreibung
Figur 1 zeigt eine schematische Querschnittsansicht zum Aufbau einer schiefen Beleuchtung,
Figur 2 zeigt schematisch eine Ausführungsform eines Mikroskops zur Bild- gebung mit schiefer Durchlichtbeleuchtung,
Figur 3 zeigt schematisch eine Ausführungsform eines Mikroskops zur Bild- gebung mit schiefer Auflichtbeleuchtung und
Figur 4 zeigt schematisch den Verfahrensablauf gemäß Erfindung. Das Grundprinzip der schiefen Beleuchtung ist in Figur 1 dargestellt. Die dargestellte Beleuchtungsanordnung weist eine Aperturblende 101 und einen Kondensor 103 auf. Ein dezentraler Bereich 105 der Aperturblende 101 wird durch einen Beleuchtungsstrahlengang 102 ausgeleuchtet. Der dezentrale Bereich 105 liegt außerhalb der optischen Achse 106 beziehungsweise liegt größtenteils au- ßerhalb dieser optischen Achse 106, kann diese jedoch enthalten. Entscheidend ist, dass der dezentrale Bereichl05 nicht symmetrisch zur optischen Achse 106 liegt, wie in Figur 1 dargestellt. Das Beleuchtungslicht wird durch einen Kondensor 103 gesammelt und auf die Objektebene 104 fokussiert. Wie in Figur 1 dargestellt, treffen die Lichtstrahlen des Beleuchtungsstrahlengangs 102 unter einem Winkel zur optischen Achse 106 auf die Objektebene 104. Aufgrund der vorhandenen Asymmetrie mittein sich die verschieden geneigten Wellenfronten bei Interferenz im Bild nicht aus, was zu dem bereits beschriebenen Reliefeindruck und erhöhtem Kontrast führt. Figur 2 zeigt eine mögliche Ausführungsform eines Mikroskops 200 zur Bildge- bung mit schiefer Beleuchtung, wobei hier der Fall der Durchlichtbeleuchtung gezeigt ist. Eine mögliche Ausführungsform der schiefen Beleuchtung in einem Mikroskop mit Auflichtbeleuchtung kann Figur 3 entnommen werden.
Figur 2 zeigt sehr schematisch ein Mikroskop 200, das die wesentlichen Bestandteile des Mikroskopobjektivs 208 und der Tubusoptik 209 aufweist. Das Objektiv 208 definiert eine optische Achse 206. Das Mikroskop 200 umfasst weiterhin einen Mikroskoptisch 215, auf dem ein Objekt in einer Objektebene 204 gelagert ist, das mikroskopisch im Durchlicht untersucht werden soll. Im vorliegenden Fall nimmt eine Kamera 230 das mikroskopische optische Bild auf und wandelt es in ein digitales Bild um. Das digitale Bild kann auf einem Monitor 242 für einen Betrachter dargestellt werden. Diese Vorgänge sind an sich bekannt und sollen daher nicht weiter erläutert werden.
Das hier betrachtete digitale Mikroskop 200 verfügt über eine zentrale Steuereinheit beziehungsweise CPU 241 zur Steuerung der verschiedenen Mikroskopkomponenten. Beispielhaft ist hier eine Blendensteuerung 243 dargestellt, die von der CPU 241 angesteuert wird. Hierauf wird weiter unten eingegangen. Die CPU 241 steuert in der Regel auch den Mikroskoptisch 215 zum Verfahren des selbigen, die Auswahl eines Objektivs 218 und andere Komponenten an.
Die Beleuchtungsanordnung des Mikroskops 200 umfasst eine Lichtquelle 201, eine nachgeschaltete Linse 202, eine weitere Linse 203 und eine in der Aperture- bene oder nahe der Aperturebene angeordnete Blende 210. Der Blende 210 ist ein Kondensor 212 nachgeordnet, der den Beleuchtungsstrahlengang 211 auf die Objektebene 204 fokussiert. Optisch handelt es sich bei dem hier dargestellten Strahlengang um die Realisierung einer Köhlerschen Durchlichtbeleuchtung. Hierzu ist die Blende 210 in einer zur Lichtquelle 201 konjugierten Ebene angeordnet.
Gleichzeitig ist die Blende 210 in einer zur Eintrittspupille des Mikroskopobjektivs 208 konjugierten Ebene angeordnet. Auf diese Weise wird eine gleichmäßige Ausleuchtung der Objektebene 204 und somit des beobachteten Präparatausschnitts erzielt. Die Lichtquelle 201 wird über die aus den Linsen 202 und(203 bestehenden Beleuchtungsoptik in die Apertur-Blendenebene abgebildet. Mittels einer dort befindlichen Blendenöffnung 205 wird aus dem ursprünglichen Beleuchtungsstrahlengang 211' ein dezentrierter Beleuchtungsstrahlengang 211 erzeugt. Bei der in Figur 2 dargestellten Blende 210 kann es sich auch um eine Blendenscheibe mit verschiedenen Blendenöffnungen handeln, wie sie ausführlich in der DE 10 2010 042 351 B4 beschrieben ist. Insofern sei wiederum bezüglich Aufbau und Funktionsweise ausdrücklich auf diese Schrift verwiesen.
Das von dem hier dargestellten Mikroskop 200 erzeugte Bild des auf der Objektebene 204 befindlichen schräg beleuchteten Präparats wird von der Kamera 230 aufgenommen. Das entsprechende digitale Bildsignal wird in hier dargestellten Ausführungsbeispielen in einer Recheneinheit 240 digital nachbearbeitet. Selbstverständlich kann die hier dargestellte Recheneinheit 240 Bestandteil der Kamera 230, aber auch Bestandteil der CPU 241 sein. Die digitale Verarbeitung kann folglich direkt in der Kamera 230 oder direkt in der CPU 241 oder - wie hier dargestellt - in der Recheneinheit 240 erfolgen. Die digitale Bildverarbeitung mittels eines insbesondere quadratischen Faltungskerns kann dabei in Echtzeit vorgenommen werden, so dass das verarbeitete Bild ohne merkliche Verzögerung für einen Benutzer als online-Bild beispielsweise zur Navigation im Objektfeld auf einem Monitor 242 dargestellt werden kann. Im Folgenden sei der Vorgang der Faltung eines Bildpixels eines Bildausschnitts mit einem direktionalen Faltungskern der Form
Figure imgf000012_0001
exemplarisch dargestellt, wobei lediglich die Information einer Farbe (kodiert in Bytes) betrachtet werden soll.
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000013_0002
Der betreffende Bildpixel (unterstrichen) wird verrechnet, indem das Skalarpro- dukt des ihn umgebende 3x3 Bildausschnitt (schattiert) mit dem 3x3 Faltungskern gebildet wird (-1x2 + -2x2 + -1x2 + 0x2 + 1x2 + 0x2 + 1x4 + 2x4 + 1x4 = 10). In der Praxis ist es besonders vorteilhaft, die Orientierung in obigem Beispiel gegeben durch die Richtung der Zahlenfolge (2, 1, -2), die senkrecht zur Symmetrieachse (0, 1, 0) steht, in Relation zur Richtung der schiefen Beleuchtung, hier aus dem Süden kommend, auszurichten, um die Kontraststeigerung weiter zu erhöhen. In der Praxis wird außerdem, insbesondere bei regelmäßigen Strukturen in der Probe, die Richtung der schiefen Beleuchtung in Bezug auf den Verlauf solcher Strukturen ausgerichtet, um diese optimal plastisch darstellen zu können.
Es ist besonders vorteilhaft, zunächst die Größe des ausgeleuchteten Bereichs 205 der Blende 210 derart zu wählen, dass in herkömmlicherweise ein Bild mit schie- fer Beleuchtung erzeugt wird. Anschließend kann die Größe des Bereichs 205 gesteigert werden, beispielsweise bis zur halbseitigen Beleuchtung der Objektivpupille. Dies ist aufgrund der nachfolgenden digitalen Bildverarbeitung ohne Verluste der Bildqualität möglich. Hierzu wird der Bereich 205 beispielsweise dadurch vergrößert, dass eine etwas größere Blendenöffnung in den Beleuchtungsstrahlen- gang 211 eingebracht wird. Hierzu kann die Blende 210 beispielsweise als Blendenrad ausgeführt sein. Die Ansteuerung der Blende 210 erfolgt über die Blendensteuerung 243, die ihrerseits von der CPU 241 angesteuert wird. Besonders bevorzugt ist es, wenn der ausgeleuchtete Bereich 205 etwa 50 % - 70 % größer gewählt ist als herkömmlich zur Bildgebung mit schiefer Beleuchtung notwendig.
Zur nachfolgenden digitalen Bildverarbeitung wird ein geeigneter Faltungskern insbesondere von der CPU 241 ausgewählt und zur Bildverarbeitung der Recheneinheit 240 übergeben. Der jeweils verwendete Faltungskern und/oder der ausgeleuchtete dezentrale Bereich 205 könnten weiterhin insbesondere in Abhängigkeit von dem verwendeten Mikroskopobjektiv 208 bestimmt werden. Je nach Vergrö- ßerung und Apertur des Objektivs 208 können ein daran angepasster ausgeleuchteter Bereich 205 sowie ein daran angepasster Faltungskern vorteilhaft sein. Damit kann eine ausreichende Ausleuchtung des Objekts sichergestellt und Abschattungen minimiert werden.
Der vorliegende Aufbau ist insbesondere für Proben in Mikrotiterplatten, insbesondere solchen in Plastiknäpfchen, die in Durchlichtbeleuchtung untersucht werden, vorteilhaft. Bezüglich der Ausführungsform gemäß Figur 3, die eine Ausführungsform eines Mikroskops 200 zur Bildgebung mit schiefer Auflichtbeleuchtung zeigt, sei im Wesentlichen auf die obigen Ausführungen in Zusammenhang mit Figur 2 verwiesen. Gleiche Bezugszeichen bedeuten identische oder im Wesentlichen gleiche Elemente wie in Figur 2.
Während die Beleuchtungsanordnung des Mikroskops 200 gemäß Figur 2 eine Durchlichtbeleuchtung realisiert, setzt das Mikroskop 200 eine Beleuchtungsanordnung zur Auflichtbeleuchtung ein. Die Beleuchtungsanordnung umfasst wiederum eine Lichtquelle 201 und nachgeschaltete Linsen 202, 203 und eine in der Aperturebene oder nahe der Aperturebene angeordnete Blende 210. Die Linsen 202 und 203 definieren eine optische Achse 206 der Beleuchtungsanordnung. Aus dem symmetrischen Beleuchtungsstrahlengang 211' wird durch den dezentralen ausgeleuchteten Bereich 205 der Blende 210 ein asymmetrisch zur optischen Achse 206 liegender Bereich ausgeschnitten, der im Weiteren als Beleuchtungsstrah- lengang 211 für die schiefe Beleuchtung verwendet wird. Die beiden nachgeschalteten Linsen 213 und 207 erzeugen einen parallelen Beleuchtungsstrahlengang 211, der von einem Strahlteiler 220 in Richtung optischer Achse 206 des Mikroskopobjektivs 208 eingekoppelt wird. Das Mikroskopobjektiv 208 fokussiert den Beleuchtungsstrahlengang 211 auf die Objektebene 204. Alle anderen Details zur Bilderzeugung im Mikroskop 200, zur digitalen Bildverarbeitung sowie zur Ansteuerung der Blende 220 stehen in völliger Analogie zu denjenigen aus Figur 2. Zur Vermeidung von Wiederholungen sei daher auf die dortigen Ausführungen verwiesen.
Das Verfahren ist nochmals in Figur 4 kurz erläutert. Im Schritt Sl wird ein Mikroskopbild mit schiefer Beleuchtung aufgenommen. Hierzu sei auf die Ausführungen im Zusammenhang mit Figur 2 verwiesen. Sämtliche Informationen über die Parameter der schiefen Beleuchtung (symbolisiert durch die Parameter PI) liegen der CPU 241 vor und werden im nächsten Schritt S2 bei der Auswahl eines passenden Faltungskerns berücksichtigt. Zu den Parametern der schiefen Beleuchtung gehören Vergrößerung und Apertur des verwendeten Objektivs 208 sowie Größe, Geometrie und Lage des ausgeleuchteten Bereichs 205 der Blende 210. Nach Auswahl des passenden Faltungskerns im Schritt S2 wird in der Recheneinheit 240 das digitalisierte mikroskopische Bild mit dem ausgewählten Faltungskern gefaltet
(Schritt S3). Das kontrastgesteigerte digitale Bild kann im Schritt S4 beispielsweise auf einen Monitor 242 dargestellt werden. Das in Figur 4 geschilderte Verfahren kann selbstverständlich auch in dem Aufbau eines Mikroskops gemäß Figur 3 abgearbeitet werden.
Bezugszeichenliste:
101 Aperturblende
102 Beleuchtungsstrahlengang
103 Kondensor
104 Objektebene
105 Ausgeleuchteter Bereich
106 Optische Achse
200 Mikroskop
201 Lichtquelle
202 Linse
203 Linse
204 Objektebene
205 Ausgeleuchteter Bereich
206 Optische Achse
207 Linse
208 Objektiv
209 Tubusoptik
210 Blende
211, 211' Beleuchtungsstrahlengang
212 Kondensor
213 Linse
215 Mikroskoptisch
220 Strahlteiler
230 Kamera
240 Recheneinheit
241 Zentrale Steuereinheit, CPU
242 Monitor Blendensteuerung
Verfahrensschritte Parameter

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bildgebung in einem Mikroskop (200) mit schiefer Beleuchtung, wobei ein Objekt von einem schräg auf die Objektebene (204) des Mikroskops (200) einfallenden Beleuchtungsstrahlengang (211), beleuchtet wird und ein mikroskopisches Bild des Objekts und ein entsprechendes digitales Bildsignal erzeugt werden,
dadurch gekennzeichnet,
dass das digitale Bildsignal mittels digitaler Bildverarbeitung unter Verwendung eines Faltungskerns zur Kontraststeigerung bearbeitet und hieraus ein kontrastgesteigertes digitales Bild erzeugt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichtnet, dass ein quadratischer, insbesondere symmetrischer Faltungskern verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Faltungskern in Form einer Faltungsmatrix
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000019_0002
verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekenn- zeichnet, dass ein Faltungskern verwendet wird, dessen Orientierung in Relation zur Richtung der schiefen Beleuchtung ausgerichtet ist, um die Kontraststeigerung weiter zu erhöhen.
5. Verfahren nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Rich- tung der als Vektor aufgefassten Zahlenfolge (2, 1, -2) des Faltungskerns mit der
Richtung, aus der die schiefe Beleuchtung auf die Probe trifft, übereinstimmt.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der schräge Beleuchtungsstrahlengang (211) durch Ausleuchtung eines dezentralen Bereichs (205) in oder nahe einer Aperturebene (210) einer Beleuchtungsanordnung des Mikroskops (200) erzeugt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der ausgeleuchtete Bereich (205) größer gewählt wird als zur Bildgebung mit schiefer Beleuch- tung notwendig.
8. Verfahren nach Anspruch 7, daduch gekennzeichnet, dass der ausgeleuchtete Bereich 100 %, insbesondere 70 %, insbesondere 50% größer gewählt wird als zur Bildgebung mit schiefer Beleuchtung notwendig.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der ausgeleuchtete Bereich (205) bis zur halben Pupillengröße einer konjugiert hierzu angeordneten Eintrittspupille des Mikroskopobjektivs gewählt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der ausgeleuchtete dezentrale Bereich (205) und/oder der verwendete Faltungskern in Abhängigkeit von dem verwendeten Mikroskopobjektiv (208) bestimmt wird.
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