JP6218394B2 - 標本観察方法及び標本観察装置 - Google Patents

Description

本発明は、標本観察方法及び標本観察装置に関するものである。

標本を平行光束で照明すると、標本からは、非回折光（以下、０次回折光という）と回折光が生じる。顕微鏡では、標本の像は、０次回折光と回折光の合成によって形成される。

像面における複素振幅Ｅは、例えば、以下の式で表される。
Ｅ＝Ａ₁ｅ^-iφ1(r)ｅ^iωt＋Ａ₂ｅ^-iφ2(r)ｅ^iωt
ここで、
Ａ₁は０次回折光の振幅、
Ａ₂は回折光の振幅、
φ1(r)は０次回折光の位相、
φ2(r)は回折光の位相、
である。

像面では光の強度が観測されるため、像面における光の強度Ｉは以下の式で表される。
Ｉ＝｜Ｅ｜²＝Ａ₁ ²＋Ａ₂ ²＋２Ａ₁Ａ₂cosψ
ここで、
ψは位相差であって、ψ＝φ1(r)−φ2(r)、
である。

上述のように、標本の像（光学像）の形成には、０次回折光と回折光が必要である。そこで、以下の説明では、０次回折光と１次回折光とによって、標本の像（光学像）が形成されるものとする。１次回折光の位相は０次回折光の位相に対してπ／２遅れているので、ψ＝０−（−π／２）＝π／２となる。この場合、２Ａ₁Ａ₂cosψ＝０となるので、位相情報をコントラスト情報として得られない。その結果、合焦位置で、無色透明な標本、例えば、細胞を観察しようとしても、明視野観察では細胞の像はほとんど観察できない。

無色透明な標本を観察する方法として、位相差観察がある。位相差観察では、位相差顕微鏡が用いられる。この位相差顕微鏡については、様々な提案がされている。その１つに、広い観察範囲で像（位相差像）を観察するために、結像光学系の合焦位置からずらした位置で標本を観察する顕微鏡がある（特許文献１）。特許文献１に開示された顕微鏡は、部分開口と波面導入手段を備えている。部分開口は照明光学系の略瞳位置に配置され、波面導入手段は結像光学系の瞳位置に配置されている。そして、波面導入手段は、結像光学系の瞳の径に応じて大きさが変化する波面を導入するようになっている。

標本の位置を結像光学系の合焦位置からずらすと、０次回折光と回折光との間に光路長差（位相差）が発生する。この場合、２Ａ₁Ａ₂cosψ≠０になるので、位相情報をコントラスト情報として得られる。ただし、Ａ₁ ²の値は、２Ａ₁Ａ₂cosψの値に比べると非常に大きい。そこで、特許文献１の顕微鏡では、結像光学系の瞳位置に波面導入手段、すなわち吸収膜を配置してＡ₁の値を小さくしている。

特開２００５−１７３２８８号公報

特許文献１の顕微鏡では、結像光学系に波面導入手段が配置されている。よって、明視野観察の状態になっているとは言えない。例えば、標本を、無色透明な標本から明暗のある標本に入れ替える。この状態で明視野観察を行うと、標本の像は波面導入手段の影響を受けてしまう。例えば、波面導入手段が吸収膜だと、標本の像が暗くなる。そのため、明暗のある標本を明視野で観察するためには、波面導入手段を光路から取り出す必要がある。特に、波面導入手段が顕微鏡対物レンズ内に設けられている場合は、顕微鏡対物レンズを交換する必要がある。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本、例えば、細胞を観察できる標本観察方法及び標本観察装置を提供することを目的とする。

上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明の標本観察方法は、標本の電子画像を取得する取得ステップと、電子画像の信号から直流成分を減算する減算ステップと、を有し、直流成分の減算は、位相差により変化する成分が相対的に大きくなるように行われ、取得ステップは明視野観察の状態で行われ、減算ステップにおける電子画像は、所定の状態で取得された画像であって、所定の状態になる前に、第１の波長帯域の光で標本の位置と結像光学系の合焦位置を一致させ、該所定の状態では、少なくとも、第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成されており、第２の波長帯域は第１の波長帯域のうちの一部と一致しているか、又は第１の波長帯域とは異なり、合焦位置とは、標本の持つ空間周波数において、０次回折光における波面収差量と１次回折光における波面収差量が、共に０である位置のことであることを特徴とする。

また、本発明の標本観察装置は、光源と、照明光学系と、結像光学系と、撮像装置と、画像処理装置と、を有し、照明光学系は、光源からの照明光を標本に照射するように配置され、結像光学系は、標本からの光が入射するように配置されると共に、標本の光学像を形成し、撮像装置は光学像の位置に配置され、画像処理装置は、上述の標本観察方法を行うことを特徴とする。

本発明によれば、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本、例えば、細胞を観察できる標本観察方法及び標本観察装置を提供できる。

第１実施形態の標本観察方法のフローチャートである。 第１の波長帯域（中心波長λ１＝５５０ｎｍ）と、第２の波長帯域（中心波長λ２＝４５０ｎｍ）と合焦位置の関係、及び波面収差量を示す図であって、（ａ）は第１の波長帯域の光で標本の位置と合焦位置を一致させたときの図、（ｂ）は第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成されているときの図である。 第１の波長帯域（中心波長λ１＝５５０ｎｍ）での標本の電子画像である。 第２の波長帯域（中心波長λ２＝４５０ｎｍ）での標本の電子画像である。 第１の波長帯域（中心波長λ１＝５５０ｎｍ）と、第２の波長帯域（中心波長λ２＝６５０ｎｍ）と合焦位置の関係、及び波面収差量を示す図であって、（ａ）は第１の波長帯域の光で標本の位置と合焦位置を一致させたときの図、（ｂ）は第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成されているときの図である。 第１の波長帯域（中心波長λ１＝５５０ｎｍ）での標本の電子画像である。 第２の波長帯域（中心波長λ２＝６５０ｎｍ）での標本の電子画像である。 実施形態の標本観察方法のフローチャートであって、（ａ）は第２実施形態の標本観察方法のフローチャート、（ｂ）は第３実施形態の標本観察方法のフローチャートである。 各空間周波数における大きさを示す図であって、（ａ）は減算ステップ実行前の状態、（ｂ）は減算ステップ実行後の状態を示す図である。 第４実施形態の標本観察方法のフローチャートである。 第１実施形態の標本観察装置の構成を示す図である。 第２実施形態の標本観察装置の構成を示す図である。 第３実施形態の標本観察装置の構成を示す図であるって、（ａ）は、標本観察装置の概略構成を示す図、（ｂ）は光学系の構成を示す図である。

本発明のある態様にかかる実施形態の作用効果を説明する。なお、本実施形態の作用効果を具体的に説明するに際しては、具体的な例を示して説明することになる。しかし、それらの例示される態様はあくまでも本発明に含まれる態様のうちの一部に過ぎず、その態様には数多くのバリエーションが存在する。したがって、本発明は例示される態様に限定されるものではない。

実施形態の標本観察方法及び標本観察装置について説明する。以下の各実施形態の標本観察方法及び標本観察装置は、明視野観察の状態で用いられるものである。本実施形態における明視野観察では、蛍光観察のように、励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタからなる蛍光ミラーユニットは用いられない。よって、明視野観察の状態では、標本が無色透明の場合、標本の像を形成する光（以下、適宜、「結像光」という）の波長帯域と標本を照明する光（以下、適宜、「照明光」という）の波長帯域とは、合焦時、一致している。

また、本実施形態における明視野観察では、位相差観察における位相膜や、微分干渉観察における微分干渉プリズムは用いられない。よって、標本の一点から出た光についてみると、明視野観察の状態では、照明光学系における光の波面の変化と結像光学系における波面の変化はいずれもレンズのみで生じる。

また、本実施形態における明視野観察では、標本から来る光束の一部を減光するような減光フィルタは用いられない。よって、明視野観察の状態では、標本から標本の像までの間で、結像光に強度変化は生じない（ただし、レンズに起因する強度変化は除く）。

第１実施形態の標本観察方法は、標本の電子画像を取得する取得ステップと、電子画像の信号から直流成分を減算する減算ステップと、を有し、取得ステップは明視野観察の状態で行われ、減算ステップにおける電子画像は、所定の状態で取得された画像であって、所定の状態になる前に、第１の波長帯域の光で標本の位置と結像光学系の合焦位置を一致させ、所定の状態では、少なくとも、第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成されており、第２の波長帯域は第１の波長帯域のうちの一部と一致しているか、又は第１の波長帯域とは異なることを特徴とする。

第１実施形態の標本観察方法について、図１を用いて説明する。図１は、第１実施形態の標本観察方法のフローチャートである。

第１実施形態の標本観察方法は、取得ステップＳ１０と、減算ステップＳ２０とを有する。これにより、第１実施形態の標本観察方法では、明瞭な電子画像が得られる。

第１実施形態の標本観察方法では、まず、取得ステップＳ１０が実行される。取得ステップＳ１０では、標本の電子画像（以下、適宜、「電子画像」という）の取得が行われる。標本の像（光学像）は、結像光学系によって形成される。電子画像の取得では、この像をＣＣＤやＣＭＯＳのような撮像素子で撮像する。撮像によって、標本の像は電子画像（デジタルデータ）に変換される。なお、標本の像は明視野観察の状態で形成されているので、電子画像の取得も明視野観察の状態で行われる。

取得ステップＳ１０が終わると、減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０では、電子画像の信号に対して直流成分（バイアス成分）の減算が行われる。ここで、減算ステップＳ２０における電子画像は、所定の状態で取得された画像である。

減算ステップＳ２０における電子画像は、所定の状態、すなわち、第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成されているときの画像である。また、所定の状態になる前では、第１の波長帯域の光で標本の位置と結像光学系の合焦位置（以下、適宜、「合焦位置」という）を一致させている。そして、第２の波長帯域は第１の波長帯域のうちの一部と一致しているか、又は第１の波長帯域とは異なっている。このように、第１実施形態の標本観察方法では、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時（瞬間）とでは、光の波長帯域が異なっている。

ここで、標本が格子状の位相物体の場合、標本を照明すると、標本から０次回折光と回折光が出てくる。結像光学系がある程度の軸上色収差を持っている状態で、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時とで、光の波長帯域を異ならせる。すると、電子画像を取得する前の光と電子画像を取得する時の光との間に、波面収差の差（光路長差）が発生する。この点ついて、図２〜図７を使って説明する。なお、回折光として１次回折光を用いて説明する。また、結像光学系は軸上色収差をある程度有しているものとする。

図２は、第１の波長帯域（中心波長λ１＝５５０ｎｍ）での合焦位置と第２の波長帯域（中心波長λ２＝４５０ｎｍ）での合焦位置との関係、及び波面収差量を示す図であって、（ａ）は第１の波長帯域の光で標本の位置と合焦位置を一致させたときの図、（ｂ）は第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成されているときの図である。図３は、第１の波長帯域（中心波長λ１＝５５０ｎｍ）での標本の電子画像である。図４は、第２の波長帯域（中心波長λ２＝４５０ｎｍ）での標本の電子画像である。図５は、第１の波長帯域（中心波長λ１＝５５０ｎｍ）での合焦位置と第２の波長帯域（中心波長λ２＝６５０ｎｍ）での合焦位置との関係、及び波面収差量を示す図であって、（ａ）は第１の波長帯域の光で標本の位置と合焦位置を一致させたときの図、（ｂ）は第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成されているときの図である。図６は、第１の波長帯域（中心波長λ１＝５５０ｎｍ）での標本の電子画像である。図７は、第２の波長帯域（中心波長λ２＝６５０ｎｍ）での標本の電子画像である。なお、図３、４、６及び７は、いずれも減算ステップＳ２０が実行された後の電子画像である。また、図３、４、６及び７における標本は細胞である。

また、グラフは瞳位置での波面収差の量を表している。グラフの縦軸は波面収差量（単位は波長）、横軸は瞳面（瞳面上）の中心からの距離を表している。瞳面の中心からの距離は規格化されているので、無名数となっている。横軸の数値０は瞳面の中心位置、数値１は瞳面の最も外側の位置を表している。

図２（ａ）に示すように、光軸上の一点から出た光には、光線Ｌ_Cと光線Ｌ_Pとが含まれている。光線Ｌ_Cは光軸上を進む光線である。ここで、光線Ｌ_Cと瞳面の交点は、瞳面の中心位置に一致している。一方、光線Ｌ_Pは、光軸ＡＸに対して所定の角度で結像光学系３１に入射する光線である。ここで、光線Ｌ_Pと瞳面の交点は、瞳面の中心から所定の距離だけ離れた位置になっている。

標本Ｓを照明光（平行光束）で照明すると、標本Ｓから０次回折光と１次回折光が出てくる。ここで、標本Ｓと光軸が交わる点（光軸上の一点）に着目すると、０次回折光は回折されないので、この点から出た０次回折光は光軸上を進んで瞳の中心に到達する。よって、０次回折光は光線Ｌ_Cとみなすことができる。一方、１次回折光は所定の方向に回折されるので、この点から出た１次回折光は光軸に対して所定の角度で結像光学系３１に入射する。結像光学系３１に入射した１次回折光は、瞳面の中心から離れた位置に到達する。よって、１次回折光は光線Ｌ_Pとみなすことができる。

まず、第１の波長帯域の中心波長λ１が５５０ｎｍ、第２の波長帯域の中心波長λ２が４５０ｎｍの場合について説明する。第１の波長帯域の光で標本の位置と合焦位置を一致させた状態では、第１の波長帯域の合焦位置Ｐ₅₅₀は標本Ｓの位置Ｐ_Sと一致している。この状態では、図２（ａ）のグラフに示すように、瞳面のどの位置においても波面収差量はほぼ０になっている。これは、０次回折光における波面収差量と１次回折光における波面収差量が、共にほぼ０であることを示している。波面収差量に（２π／λ）を乗じた値は位相量に相当するので、合焦時は、０次回折光と１次回折光のいずれにおいても、位相に変化は生じない。１次回折光の位相は、０次回折光の位相に対してπ／２遅れたままなので、ψ＝０−（−π／２）＝π／２となる。この場合、２Ａ₁Ａ₂cosψ＝０となるので、位相情報をコントラスト情報として得られない。その結果、電子画像はコントラストが無い画像になる。

一方、第２の波長帯域で標本の光学像が形成されている状態では、第２の波長帯域の合焦位置は標本の位置からずれている。図２（ｂ）では、第２の波長帯域の合焦位置Ｐ₄₅₀は標本Ｓの位置Ｐ_S（合焦位置Ｐ₅₅₀）よりも下方向（結像光学系３１から離れる方向）にずれている。この状態では、図２（ｂ）のグラフに示すように、瞳面の中心では波面収差量は０であるが、瞳面の中心から離れた位置では波面収差が発生する。ここで、波面収差は参照波面に対する実際の波面のずれで、このずれは位相のずれになる。そのため、波面収差が発生している範囲内に、１次回折光の位置があると、１次回折光の位相は、本来持っている位相に波面収差量が加わったものになる。このように、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時とで、光の波長帯域を異ならせることで、１次回折光の位相を変化させられる。図２（ｂ）のグラフに示すように、瞳の中心からの距離が０．４の位置を位置Ｐ_Wとすると、位置Ｐ_Wにおける波面収差量は−λ／４になる。

このようにすることで、０次回折光における波面収差量を０にしたままで、１次回折光における波面収差量を−λ／４にできる。上述のように、波面収差量に（２π／λ）を乗じた値は位相量であるので、非合焦時は、０次回折光については位相に変化は生じないが、１次回折光については位相に変化が生じる。具体的には、１次回折光では、もともとの位相の遅れπ／２に加えて、更に位相がπ／２遅れる。１次回折光の位相は、０次回折光の位相に対してπ遅れた状態になるので、ψ＝０−（−π）＝πとなる。この場合、２Ａ₁Ａ₂cosψ≠０となるので、位相情報がコントラスト情報として得られる。その結果、図４に示すように、電子画像は、コントラストを明らかに持った画像になる。よって、この電子画像を、例えば、表示装置に表示すれば、観察者は標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。

次に、第１の波長帯域の中心波長λ１が５５０ｎｍ、第２の波長帯域の中心波長λ２が６５０ｎｍの場合について説明する。第１の波長帯域の光で標本Ｓの位置と合焦位置を一致させた状態では、第１の波長帯域の合焦位置Ｐ₅₅₀は標本Ｓの位置Ｐ_Sと一致している。これは、図２（ａ）と同じである。そのため、電子画像はコントラストが無い画像になる。

一方、第２の波長帯域λ２で標本の光学像が形成されている状態では、第２の波長帯域の合焦位置Ｐ₆₅₀は標本Ｓの位置Ｐ_S（合焦位置Ｐ₅₅₀）よりも下方向（結像光学系３１から離れる方向）にずれている。この状態では、図５（ｂ）のグラフに示すように、瞳面の中心では波面収差量は０であるが、瞳面の中心から離れた位置では波面収差が発生する。ここで、合焦位置Ｐ₆₅₀は合焦位置Ｐ₄₅₀と異なっている。

この場合、瞳面における１次回折光の位置における波面収差量は、図５（ｂ）と図２（ｂ）とで異なる。図５（ｂ）のグラフに示すように、瞳の中心からの距離が０．４の位置Ｐ_Wでは、波面収差量は約−１λ／１０になっている。

このように、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時とで、光の波長帯域を異ならせることで、０次回折光における波面収差量を０にしたままで、１次回折光における波面収差量を−λ／１０にできる。波面収差量は異なるが、これは図２（ｂ）と同じような状態である。そのため、図７に示すように、電子画像は、コントラストを明らかに持った画像になる。よって、観察者は標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。

図２（ｂ）では、１次回折光における波面収差量が−λ／４になっている。この場合、０次回折光の位相と１次回折光の位相は逆位相の関係になる。逆位相の関係では、０次回折光と１次回折光は弱めあうことになる。よって、電子画像では、背景に比べて標本Ｓが暗くなる。これは、位相差観察におけるダークコントラストに相当する。

また、１次回折光における波面収差量がλ／４になる場合、０次回折光の位相と１次回折光の位相は同位相の関係になる。同位相の関係では、０次回折光と１次回折光は強めあうことになる。よって、電子画像では、背景に比べて標本Ｓが明るくなる。これは、位相差観察におけるブライトコントラストに相当する。

また、回折光の回折角は、標本Ｓが持っている空間周波数によって異なる。例えば、標本Ｓを格子状の位相物体とした場合、格子の間隔が広いということは、標本Ｓが持っている空間周波数が低いということになる。一方、格子の間隔が狭いということは、標本Ｓが持っている空間周波数が高いということになる。ここで、格子の間隔が広いほど回折角は小さく、格子の間隔が狭いほど回折角は大きくなる。よって、標本Ｓが低い空間周波数を持つ場合回折角は小さく、標本Ｓが高い空間周波数を持つ場合回折角は大きくなる。

細胞には、様々な空間周波数を持つ構造が含まれている。そのため、標本Ｓが細胞の場合、波面収差量が−λ／４となる位置を、どの空間周波数における１次回折光の位置と一致させるかで、標本の像の見え方が変わってくる。

高い空間周波数における１次回折光の位置で波面収差量が−λ／４となるように、第２の波長帯域を設定すると、電子画像では、空間周波数の高い部分が明瞭になる。一方、低い空間周波数における１次回折光の位置で波面収差量が−λ／４となるように、第２の波長帯域を設定すると、電子画像では、空間周波数の低い部分が明瞭になる。

例えば、図５（ｂ）に示すように、瞳の中心からの距離が０．６４の位置を位置Ｐ_W’とすると、位置Ｐ_W’における波面収差量は−λ／４になる。よって、１次回折光が位置Ｐ_W’を通過するような空間周波数を標本Ｓが持っていれば、その空間周波数に相当する部分を明瞭に観察できる。

また、第２の波長帯域の合焦位置が標本Ｓの位置（第１の波長帯域の合焦位置）よりも上方向にずれるようにしても良い。例えば、第１の波長帯域の中心波長λ１を６５０ｎｍ、第２の波長帯域の中心波長λ２を５５０ｎｍにしても良い。

なお、本実施形態の観察方法では、第１の波長帯域と第２の波長帯域とでは、中心波長の差はそれほど大きくない。この場合、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時とで光の波長帯域を異ならせても、結像光学系３１に対する１次回折光の入射位置はほとんど変化しない。そのため、瞳面での１次回折光の位置も、ほとんど変化しないものとみなせる。よって、波長帯域を変えるだけで、１次回折光に追加される波面収差量を変化させられる。

上述のように、取得ステップＳ１０では、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時とで、光の波長帯域が異なっている。そのため、２Ａ₁Ａ₂cosψ≠０になる。この場合、像面における光の強度Ｉは以下のようになる。
Ｉ＝Ａ₁ ²＋Ａ₂ ²＋２Ａ₁Ａ₂cosψ

ここで、Ａ₁ ²＋Ａ₂ ²は標本の像における直流成分（バイアス成分）、すなわち、電子画像の信号うちの直流成分（バイアス成分）を表している。このうち、０次回折光の振幅Ａ₁ ²は、非常に大きな値を持つ。そこで、減算ステップＳ２０で、Ａ₁ ²の値を小さくする。このようにすることで、Ａ₁ ²＋Ａ₂ ²の値に対して２Ａ₁Ａ₂cosψの値を相対的に大きくできる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。

以上のように、第１実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本を明瞭に観察できる。

第２実施形態の標本観察方法は、減算ステップよりも後に増幅ステップを有し、増幅ステップでは、減算ステップ後の電子画像の信号を増幅するものである。

第２実施形態の標本観察方法について、図８（ａ）を用いて説明する。図８（ａ）は、第２実施形態の標本観察方法のフローチャートである。

第２実施形態の標本観察方法は、図８（ａ）に示すように、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０に加え、更に、増幅ステップＳ３０−２を有する。これにより、第２実施形態の標本観察方法では、より明瞭な電子画像が得られる。

上述のように、Ａ₁ ²＋Ａ₂ ²は標本の像の直流成分、すなわち、電子画像の信号うちの直流成分を表している。減算ステップＳ２０では、Ａ₁ ²の値を小さくすることで、２Ａ₁Ａ₂cosψの値をＡ₁ ²＋Ａ₂ ²の値に対して相対的に大きくしている。

これに対して、第２実施形態の標本観察方法では、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０の終了後に、増幅ステップＳ３０−２が実行される。増幅ステップＳ３０−２では、２Ａ₁Ａ₂cosψの値を大きくしている（増幅している）。このようにすることで、Ａ₁ ²＋Ａ₂ ²の値に対して２Ａ₁Ａ₂cosψの値を相対的により大きくできる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。

なお、増幅ステップＳ３０−２を、第１実施形態の標本観察方法に用いても良い。この場合、増幅ステップＳ３０−２は、比較ステップＳ３０−１よりも前に実行される。

以上のように、第２実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。

第３実施形態の標本観察方法は、電子画像の信号をフーリエ変換する変換ステップと、逆フーリエ変換を行う逆変換ステップと、を有し、変換ステップは、減算ステップよりも前に行われ、逆変換ステップは、少なくとも減算ステップよりも後に行われるものである。

第３実施形態の標本観察方法について、図８（ｂ）と図９を用いて説明する。図８（ｂ）は、第３実施形態の標本観察方法のフローチャートである。図９は、各空間周波数における大きさを示す図であって、（ａ）は減算ステップ実行前の状態、（ｂ）は減算ステップ実行後の状態を示す図である。

第３実施形態の標本観察方法は、図８（ｂ）に示すように、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０に加え、更に、変換ステップＳ１５−１と逆変換ステップＳ３０−３とを有する。これにより、第３実施形態の標本観察方法では、より明瞭な電子画像が簡単に得られる。

上述のように、減算ステップＳ２０では、Ａ₁ ²の値を小さくすることで、Ａ₁ ²＋Ａ₂ ²の値に対して２Ａ₁Ａ₂cosψの値を相対的に大きくしている。ここで、周波数空間で減算ステップＳ２０が実行されると、減算を効率的に行える。

減算ステップＳ２０における減算について、図９を用いて説明する。上述のように、細胞のような標本には、様々な空間周波数を持つ構造が含まれている。そこで、標本Ｓの像の明るさを空間周波数ごとに分離できれば、空間周波数ごとに減算が行える。

そこで、第３実施形態の標本観察方法では、取得ステップＳ１０の終了後に、変換ステップＳ１５−１が実行される。変換ステップＳ１５−１では、電子画像の信号をフーリエ変換する。その結果、図９（ａ）に示すように、空間周波数ごとに、その大きさ（縦軸、明るさに相当）が分離される。図９（ａ）では、横軸の数値は空間周波数を示しており、空間周波数が０では、その大きさは１００で、空間周波数が１では、その大きさは３０になっている。

ここで、空間周波数の値（横軸の数値）は、回折光の次数と対応している。そのため、空間周波数０では、その大きさ（縦軸の数値）は０次回折光の明るさに対応する。同様に、空間周波数１では、その大きさは１次回折光の明るさに対応する。そこで、変換ステップＳ１５−１の終了後に、減算ステップＳ２０が実行される。この減算ステップＳ２０では、空間周波数０での大きさを小さくしている。例えば、図９（ｂ）に示すように、空間周波数０での大きさを、１００から５０に半減させている。これは、Ａ₁ ²の値を小さくすることに相当する。このようにすることで、０次光の明るさを小さくできる。

続いて、逆変換ステップＳ３０−３が実行される。逆変換ステップＳ３０−３では、逆フーリエ変換を行う。これにより、電子画像の信号を得ることができる。なお、減算ステップＳ２０によって、０次光の明るさ、すなわち、Ａ₁ ²の値が小さくなっている。そのため、Ａ₁ ²＋Ａ₂ ²の値に対して２Ａ₁Ａ₂cosψの値を相対的により大きくできる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。

なお、変換ステップＳ１５−１と逆変換ステップＳ３０−３を、第２実施形態の標本観察方法に用いても良い。この場合、変換ステップＳ１５−１は、減算ステップＳ２０よりも前に実行される。また、逆変換ステップＳ３０−３は、減算ステップＳ２０よりも後に実行される。

以上のように、第３実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。

第４実施形態の標本観察方法は、事前取得ステップと、規格化ステップと、を有し、事前取得ステップでは、標本が無い状態で電子画像を取得し、規格化ステップでは、電子画像で標本の電子画像を規格化し、減算ステップの前に、規格化ステップを行うものである。

第４実施形態の標本観察方法について、図１０を用いて説明する。図１０は第４実施形態の標本観察方法のフローチャートである。

第４実施形態の標本観察方法は、図１０に示すように、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０に加え、更に、事前取得ステップＳ００と規格化ステップＳ１５−２とを有する。これにより、第４実施形態の標本観察方法では、より明瞭な電子画像が得られる。

なお、図１０では、減算ステップＳ２０の後に、増幅ステップＳ３０−２が備わっているが、この増幅ステップＳ３０−２は必須ではない。

標本Ｓの像の明るさは、照明光学系による影響や結像光学系による影響を受けることがある。例えば、照明光学系や結像光学系を光が通過することで、通過後の光の明るさにむらが生じる。この場合、照明光学系や結像光学系による明るさのむらのために、標本Ｓの像にも明るさにむらが生じる。この明るさのむらは電子画像の画質を低下させるので、除去することが好ましい。

そこで、第４実施形態の標本観察方法では、取得ステップＳ１０の実行に先立って、事前取得ステップＳ００が実行される。事前取得ステップＳ００では、標本Ｓが無い状態で電子画像Ａの取得が行われる。このとき、電子画像Ａは、明るさのむらのみの画像になる。

続いて、取得ステップＳ１０が実行され、標本Ｓの電子画像Ｂの取得が行われる。この電子画像Ｂは、標本Ｓの像に、照明光学系や結像光学系による明るさのむらが加わった画像になる。そこで、規格化ステップＳ１５−２が実行される。規格化ステップＳ１５−２では、電子画像Ａで電子画像Ｂを規格化する。すなわち、以下の演算、
電子画像Ｂ／電子画像Ａ
を規格化ステップＳ１５−２において行う。これにより、電子画像Ｂにおける明るさのむらが、電子画像Ａにおける明るさのむらでキャンセルされる。そのため、規格化後の電子画像は、照明光学系や結像光学系による明るさのむらが低減された画像になる。

規格化ステップＳ１５−２の終了後、減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０では、規格化後の電子画像においてＡ₁ ²の値を小さくし、これにより、Ａ₁ ²＋Ａ₂ ²の値に対して２Ａ₁Ａ₂cosψの値を相対的に大きくする。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。

なお、事前取得ステップＳ００と規格化ステップＳ１５−２を、第２実施形態の標本観察方法や第３実施形態の標本観察方法に用いても良い。この場合、事前取得ステップＳ００は、取得ステップＳ１０よりも前に実行される。また、規格化ステップＳ１５−２は、減算ステップＳ２０よりも前に実行される。

以上のように、第４実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。

第５実施形態の標本観察方法は、第１の波長帯域に対して第２の波長帯域を複数回変化させ、変化させた第２の波長帯域で、取得ステップと減算ステップが実行され、これにより、減算ステップを実行した後の電子画像を複数生成し、生成した複数の電子画像を加算するものである。

第５実施形態の標本観察方法によれば、電子画像の生成の際に、低い空間周波数から高い空間周波数までの各々の空間周波数でコントラストが高くなっている画像が使われる。よって、生成された電子画像では、どの空間周波数においてもコントラストが高くなっている。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。

以上のように、第５実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、明瞭に無色透明な標本を観察できる。

第６実施形態の標本観察方法は、加算の前に、複数の電子画像の各々について、電子画像のうちでコントラストが最も高い部分を抽出し、抽出した部分を使って加算を行うものである。

第６実施形態の標本観察方法によれば、加算によって電子画像を生成する時に、各空間周波数でコントラストが最も高くなっている部分のみが使われている。よって、生成された電子画像では、どの空間周波数においてもコントラストが非常に高くなっている。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。

以上のように、第６実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。

第７実施形態の標本観察方法では、第２の波長帯域の変化は、所定の状態における波面収差量の符号が同じ状態で行われるものである。

上述のように、１次回折光における波面収差量が−λ／４になると、電子画像はダークコントラストの画像になる。すなわち、電子画像では、背景に比べて標本Ｓが暗くなる。一方、１次回折光における波面収差量が＋λ／４になると、電子画像はブライトコントラストの画像になる。すなわち、電子画像では、背景に比べて標本Ｓが明るくなる。

そこで、加算によって電子画像を生成する時は、波面収差量の符号が同じ状態の画像を用いるのが良い。このようにすることで、生成した電子画像を、ダークコントラストのみに基づく画像、あるいは、ブライトコントラストのみに基づく画像にできる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）をより明瞭に観察できる。

以上のように、第７実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。

本実施形態の標本観察装置について説明する。本実施形態の標本観察装置は、光源と、照明光学系と、結像光学系と、撮像装置と、画像処理装置と、を有し、照明光学系は、光源からの照明光を標本に照射するように配置され、結像光学系は、標本からの光が入射するように配置されると共に、標本の光学像を形成し、撮像装置は光学像の位置に配置され、画像処理装置は、上述の実施形態の標本観察方法を行うことを特徴とする。

第１実施形態の標本観察装置の構成を図１１に示す。標本観察装置１は、正立型顕微鏡を用いた観察システムである。標本観察装置１は、本体部１０と、照明部２０と、観察部３０と、画像処理装置４０と、を備える。ここで、照明部２０と観察部３０とは、本体部１０に取り付けられている。また、本体部１０と画像処理装置４０とは、有線または無線で接続されている。

なお、標本観察装置１は、表示装置５０を備えていても良い。表示装置５０は、有線または無線で画像処理装置４０に接続されている。

本体部１０はステージ１１を有する。ステージ１１は保持部材である。このステージ１１には、標本Ｓが載置される。標本Ｓの移動はステージに取り付けられた操作ノブ（不図示）や焦準ノブ（不図示）で行われる。操作ノブの操作により、光軸と垂直な面内で、標本Ｓが移動する。焦準ノブの操作により、光軸に沿って標本Ｓが移動する。

照明部２０は、光源２１と照明光学系２２とを有する。照明光学系２２は、コンデンサレンズ２３と、開口絞り２４と、光学フィルタＦＬとを有する。なお、図１１に示すように、照明光学系２２は、レンズ２５と、ミラー２６と、レンズ２７とを備えていても良い。図１１では、コンデンサレンズ２３と開口絞り２４はステージ１１に保持されている。照明光学系２２は、光源２１からステージ１１までの間の光路中に配置されている。

観察部３０は、結像光学系３１と撮像装置３２とを有する。なお、観察部３０は、レボルバ３３と観察鏡筒３４とを備えていても良い。結像光学系３１は、顕微鏡対物レンズ３５と撮像レンズ３６とを有する。なお、図１１に示すように、結像光学系３１は、結像レンズ３７とプリズム３８とを備えていても良い。結像光学系３１は、ステージ１１から撮像装置３２までの間の光路中に配置されている。撮像装置３２は撮像素子３９を有する。

標本観察装置１では、照明部２０は、ステージ１１を挟んで観察部３０と対向する側に配置されている。よって、標本観察装置１では、標本Ｓは透過照明で照明される。

光源２１から照明光が出射する。照明光は照明光学系２２を通過して、ステージ１１に到達する。この照明光によって、標本Ｓが照明される。標本Ｓからの光は結像光学系３１によって集光され、これにより、集光位置に標本Ｓの像（光学像）が形成される。結像光学系３１の光路中にプリズム３８がない場合、撮像装置３２の撮像素子３９によって標本Ｓの像が撮像される。

撮像によって、標本Ｓの像は電子画像（デジタルデータ）に変換される。電子画像は画像処理装置４０に送られる。画像処理装置４０では各種の処理が行われる。ここで、標本観察装置１が表示装置５０を備えている場合、電子画像は表示装置５０に表示される。観察者は表示装置５０に表示された電子画像を見ることで、標本Ｓ（標本Ｓの像）を観察できる。

撮像装置３２は、自動利得制御を行う回路を備えていても良い。このようにすると、撮像した電子画像の明るさ（コントラスト）を一定にできる。なお、自動利得制御を行う回路は、画像処理装置４０が備えていても良い。

なお、結像光学系３１の光路中に、プリズム３８を挿入することもできる。このようにすることで、標本Ｓからの光は、観察鏡筒３４の接眼レンズに導かれる。観察者は、接眼レンズを介して、標本Ｓの光学像を観察できる。

標本観察装置１を用いて、実施形態の標本観察方法を実施する手順について説明する。ここでは、第１実施形態の標本観察方法を例に説明する。なお、光源２１として、白色光源を用いる。

まず、観察者は、照明光学系２２と結像光学系３１を、明視野観察の状態となるようにする。続いて、観察者は、ステージ１１に標本Ｓを載置する。そして、観察者は、合焦位置からずれていると思われる位置まで、目測で標本を移動させる。これにより、明視野観察の状態で、なお且つ標本Ｓの位置と合焦位置とが異なった状態になる。続いて、画像処理装置４０を作動させる。なお、これらの作業は、順不同で行って良い。

画像処理装置４０が作動することで、標本Ｓの像が撮像可能になるので、取得ステップＳ１０が実行される。取得ステップＳ１０が実行されることで、電子画像の取得が行われる。取得ステップＳ１０で取得された電子画像は、画像処理装置４０内の一時記憶部（不図示）に保存される。

続いて、減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０では、Ａ₁ ²の値を小さくすることで、２Ａ₁Ａ₂cosψの値がＡ₁ ²＋Ａ₂ ²の値に対して相対的に大きくなる。減算ステップＳ２０の実行結果は、例えば、表示装置５０に表示される。

上述のように、標本Ｓの位置の設定は目測で行われている。この場合、標本Ｓの位置と合焦位置とが大きく異なっている可能性が高いので、標本Ｓの像は大きくぼけている。そのため、標本Ｓの像が撮像されても、観察者は表示装置５０で電子画像を観察できない。

そこで、観察者は焦準ノブを操作して、標本Ｓを合焦位置に向けて移動させる。標本Ｓの位置が顕微鏡対物レンズ３５から大きく離れている場合、観察者は、標本Ｓが顕微鏡対物レンズ３５に近づく方向にステージ１１を移動させれば良い。一方、標本Ｓの位置が顕微鏡対物レンズ３５に非常に近い場合、観察者は、標本Ｓが顕微鏡対物レンズ３５から離れる方向にステージ１１を移動させれば良い。

標本Ｓを移動させている間、撮像は常に行われている。よって、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０も、常に実行されている。そこで、観察者は、表示装置５０で電子画像を観察しながら標本Ｓを光軸に沿って移動させ、標本Ｓの位置を合焦位置に一致させる。このとき、照明光学系２２の光路中には光学フィルタは配置されていないので、標本Ｓは白色光（第１の波長帯域の光）で照明されている。このときの合焦位置は、緑色の光（波長が５００ｎｍ〜５６０ｎｍの光）で合焦した時の位置とみなせる。

続いて、照明光学系２２の光路中に光学フィルタＦＬを挿入する。ここで、光学フィルタＦＬの波長帯域（透過率特性）を、中心波長が４５０ｎｍ、波長幅が±２０ｎｍとする。この場合、光学フィルタＦＬの波長帯域は、白色光の波長帯域のうちの一部と一致している。

光学フィルタＦＬを光路中に挿入すると、第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成された状態になる。そこで、第２の波長帯域の光で、電子画像の取得が行われる。これにより、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時（瞬間）とで、光の波長帯域が異なる状態になる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。

なお、本体部１０は、モータ１２を備えていても良い。図１１では、モータ１２はステージ１１に接続されている。モータ１２によって、ステージ１１を光軸に沿って移動させることで、標本Ｓの移動ができる。

以上のように、第１実施形態の標本観察装置によれば、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本を観察できる。

第２実施形態の標本観察装置の構成を図１２に示す。標本観察装置１’は、倒立型顕微鏡を用いた観察システムである。標本観察装置１と同じ部材については同じ番号を付け、説明は省略する。

標本観察装置１’では、標本観察装置１と同じように、照明部２０は、ステージ１１が挟んで観察部３０と対向する側に配置されている。よって、標本観察装置１’においても、標本Ｓを透過照明で照明できる。ただし、標本観察装置１’は、照明部２０とは別に、照明部２０’も備えている。照明部２０’は、観察部３０と同じ側に配置されている。よって、標本観察装置１’では、照明部２０’を用いて標本Ｓを落射照明で照明できる。

照明部２０’は、光源２１’と照明光学系２２’とを有する。照明光学系２２’は、コンデンサレンズと開口絞りとを有する。ここで、照明光学系２２’では、顕微鏡対物レンズ３５を介して照明が行われる。よって、顕微鏡対物レンズ３５がコンデンサレンズに相当する。なお、開口絞りは図示を省略している。また、図１２に示すように、照明光学系２２’は、レンズ２５’と、ハーフミラーＨＭと、レンズ２７’とを備えていても良い。照明光学系２２’は、光源２１’からステージ１１までの間の光路中に配置されている。また、ハーフミラーＨＭと顕微鏡対物レンズ３３は、照明光学系２２を構成すると共に、結像光学系３１を構成している。

結像光学系３１は、光学フィルタＦＬ、ＦＬ’を有する。光学フィルタＦＬは結像光学系３１の光路中に配置されている。光学フィルタＦＬ’は結像光学系３１の光路外に配置されている。光学フィルタＦＬと光学フィルタＦＬ’は、交換可能になっている。

結像光学系３１の光路中にプリズム３８がある場合、撮像装置３２の撮像素子３９によって標本Ｓの像が撮像される。また、結像光学系３１の光路外にプリズム３８を移動させることで、標本Ｓの光を観察鏡筒３４の接眼レンズに導くことができる。この場合、標本Ｓの光は、ミラーＭによって観察鏡筒３４に向けて反射される。

また、標本観察装置１’では、モータ１２がレボルバ３３に接続されている。よって、標本観察装置１’では、モータ１２によって、レボルバ３３が光軸に沿って移動する。レボルバ３３が光軸に沿って移動することで、顕微鏡対物レンズ３５（結像光学系３１）が光軸に沿って移動する。これにより、標本Ｓの位置と合焦位置とを異なる状態にできる。

標本観察装置１’では、標本Ｓは透過照明か落射照明で照明できる。落射照明について説明する。落射照明では、光源２１’から照明光が出射する。照明光は照明光学系２２’を通過して、ステージ１１に到達する。この照明光によって標本Ｓが照明される。標本Ｓからの光は結像光学系３１によって集光され、これにより、集光位置に標本Ｓの像（光学像）が形成される。結像光学系３１の光路中にプリズム３８がある場合、撮像装置３２の撮像素子３９によって標本Ｓの像が撮像される。

撮像によって、標本Ｓの像は電子画像（デジタルデータ）に変換される。電子画像は画像処理装置４０に送られる。画像処理装置４０では各種の処理が行われる。ここで、標本観察装置１’が表示装置５０を備えている場合、電子画像は表示装置５０に表示される。観察者は表示装置５０に表示された電子画像を見ることで、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。

標本観察装置１’を用いて、実施形態の標本観察方法を実施する手順について説明する。ここでは、第１実施形態の標本観察方法を例に説明する。なお、光源２１’として、白色光源を用いる。

まず、観察者は、照明光学系２２’と結像光学系３１を、明視野観察の状態となるようにする。そして、観察者は、ステージ１１に標本Ｓを載置する。次に、光学フィルタＦＬを結像光学系３１の光路に挿入する。ここで、光学フィルタＦＬの波長帯域（透過率特性）を、中心波長が５５０ｎｍ、波長幅が±２０ｎｍとする。続いて、画像処理装置４０を作動させる。なお、これらの作業は、順不同で行って良い。

観察者は、観察開始の情報を画像処理装置４０に入力する。ここで、画像処理装置４０に、合焦位置の情報が予め記憶されているとする。画像処理装置４０はレボルバ３３（顕微鏡対物レンズ３５）の現在の位置と合焦位置との情報に基づいて、移動量を算出する。算出した結果に基づいて、画像処理装置４０はモータ１２に駆動信号を送信する。送信された信号に基づいて、モータ１２はレボルバ３３を移動させ、標本Ｓの位置が合焦位置と一致した状態にする。このときの合焦位置は、波長帯域が５５０ｎｍ±２０ｎｍの光（第１の波長帯域の光）で合焦した時の位置とみなせる。

続いて、結像光学系３１の光路中から光学フィルタＦＬを取り出し、代わりに光学フィルタＦＬ’を挿入する。ここで、光学フィルタＦＬ’の波長帯域（透過率特性）を、中心波長が６５０ｎｍ、波長幅が±２０ｎｍとする。この場合、光学フィルタＦＬ’の波長帯域は、光学フィルタＦＬの波長帯域と異なっている。

光学フィルタＦＬ’を光路中に挿入すると、第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成された状態になる。そこで、第２の波長帯域の光で、電子画像の取得が行われる。これにより、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時（瞬間）とで、光の波長帯域が異なる状態になる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。

光学フィルタＦＬとして、波長可変干渉フィルタを用いても良い。波長可変干渉フィルタは、波長帯域（透過率特性）を変えられる光学フィルタである。波長可変干渉フィルタを用いれば、光学フィルタＦＬと光学フィルタＦＬ’との交換が不要になる。

なお、次のようにしても良い。白色光（第１の波長帯域の光）で標本を照明して、標本Ｓの位置と合焦位置とが一致した状態にする。そして、結像光学系３１の光路中に光学フィルタＦＬを挿入する。光学フィルタＦＬを光路中に挿入すると、第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成された状態になる。この場合、光学フィルタＦＬの波長帯域は、光学フィルタＦＬ’の波長帯域と異なっている。よって、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時（瞬間）とで、光の波長帯域が異なる状態になる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。

また、次のようにしても良い。照明光学系２２の光路中に光学フィルタＦＬを挿入して、標本Ｓの位置と合焦位置とが一致した状態にする。そして、照明光学系２２の光路中から光学フィルタＦＬを取り出し、代わりに結像光学系３１の光路中に光学フィルタＦＬ’を挿入する。光学フィルタＦＬ’を光路中に挿入すると、第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成された状態になる。この場合、光学フィルタＦＬの波長帯域は、光学フィルタＦＬ’の波長帯域と異なっている。よって、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時（瞬間）とで、光の波長帯域が異なる状態になる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。

以上のように、第２実施形態の標本観察装置によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。

第３実施形態の標本観察装置の構成を図１３に示す。図１３（ａ）は、観察装置の概略構成を示す図、図１３（ｂ）は、光学系の構成を示す図である。

標本観察装置３００は、電子内視鏡を用いた観察システムである。標本観察装置３００は、電子内視鏡１００と画像処理装置２００とから構成されている。電子内視鏡１００は、スコープ部１００ａと接続コード部１００ｂとを備えている。また、画像処理装置２００には、表示ユニット２０４が接続されている。

スコープ部１００ａは、操作部１４０と挿入部１４１に大別される。挿入部１４１は、細長で患者の体腔内へ挿入可能になっている。また、挿入部１４１は、可撓性を有する部材で構成されている。観察者は、操作部１４０に設けられているアングルノブ等により、諸操作を行うことができる。

また、操作部１４０からは、接続コード部１００ｂが延設されている。接続コード部１００ｂは、ユニバーサルコード１５０を備えている。ユニバーサルコード１５０は、コネクタ２５０を介して画像処理装置２００に接続されている。

ユニバーサルコード１５０は、各種の信号等の送受信に用いられる。各種の信号としては、電源電圧信号及びＣＣＤ駆動信号等がある。これらの信号は、電源装置やビデオプロセッサからスコープ部１００ａに送信される。また、各種の信号として映像信号がある。この信号は、スコープ部１００ａからビデオプロセッサに送信される。なお、画像処理装置２００内のビデオプロセッサには、図示しないＶＴＲデッキ、ビデオプリンタ等の周辺機器が接続可能である。ビデオプロセッサは、スコープ部１００ａからの映像信号に対して信号処理を施す。映像信号に基づいて、表示ユニット２０４の表示画面上に内視鏡画像が表示される。

挿入部１４１の先端部１４２には、光学系が配置されている。ここで、電子内視鏡１００は拡大内視鏡である。そのため、光学系は、標本Ｓの拡大像を形成するようになっている。内視鏡における観察対象としては、体内の組織がある。以下の説明では、体内の組織も標本Ｓに含まれるものとする。

照明部は、光源と照明光学系とを有する。光源からの光は光ファイバ４０１から出射する。照明光学系は、レンズ４０２と、ミラー４０３と、レンズ４０４と、ハーフプリズム４０５と、対物レンズ４０６とを備える。観察部は、結像光学系と撮像装置とを有する。結像光学系は、対物レンズ４０６と、ハーフプリズム４０５と、結像レンズ４０７と、光学フィルタ４０９とを有する。撮像装置は撮像素子４０８を有する。この光学系では、標本Ｓは落射照明で照明される。

標本観察装置３００を用いて、実施形態の標本観察方法を実施する手順について説明する。ここでは、第３実施形態の標本観察方法を例に説明する。なお、光源として、白色光源を用いる。

まず、観察者は、照明光学系と結像光学系を、明視野観察の状態となるようにする。続いて、観察者は、合焦位置と思われる位置まで、目測で挿入部１４１を移動させる。そして、画像処理装置２００を作動させる。なお、これらの作業は、順不同で行って良い。

画像処理装置２００が作動することで、標本Ｓの像が撮像可能になるので、取得ステップＳ１０が実行される。取得ステップＳ１０が実行されることで、電子画像の取得が行われる。取得ステップＳ１０で取得された電子画像は、画像処理装置２００内の一時記憶部（不図示）に保存される。

続いて、減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０では、Ａ₁ ²の値を小さくすることで、２Ａ₁Ａ₂cosψの値がＡ₁ ²＋Ａ₂ ²の値に対して相対的に大きくなる。

減算ステップＳ２０の終了後、増幅ステップＳ３０−２が実行される。増幅ステップＳ３０−２では、２Ａ₁Ａ₂cosψの値を大きくする（増幅する）。これにより、Ａ₁ ²＋Ａ₂ ²の値に対して２Ａ₁Ａ₂cosψの値が相対的により大きくなる。増幅ステップＳ３０−２の実行結果は、例えば、表示ユニット２０４に表示される。

挿入部１４１を移動させている間、撮像は常に行われている。よって、取得ステップＳ１０、減算ステップＳ２０及び増幅ステップＳ３０−２も、常に実行されている。そこで、観察者は、表示ユニット２０４で電子画像を観察しながら挿入部１４１を移動させ、標本Ｓの位置を合焦位置に一致させる。このとき、照明光学系２２の光路中には光学フィルタは配置されていないので、標本Ｓは白色光（第１の波長帯域の光）で照明されている。このときの合焦位置は、緑色の光（波長が５００ｎｍ〜５６０ｎｍの光）で合焦した時の位置とみなせる。

続いて、照明光学系２２の光路中に光学フィルタＦＬを挿入する。ここで、光学フィルタＦＬの波長帯域（透過率特性）を、中心波長が６５０ｎｍ、波長幅が±２０ｎｍとする。この場合、光学フィルタＦＬの波長帯域は、白色光の波長帯域のうちの一部と一致している。

光学フィルタＦＬを光路中に挿入すると、第２の波長帯域の光で標本の光学像が形成された状態になる。そこで、第２の波長帯域の光で、電子画像の取得が行われる。これにより、電子画像を取得する前と電子画像を取得する時（瞬間）とで、光の波長帯域が異なる状態になる。その結果、標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。

なお、対物レンズ４０６、結像レンズ４０７及び撮像素子４０８の少なくとも１つを、光軸に沿って移動させても良い。これらの移動には、例えば、マイクロアクチュエータ（不図示）やボイスコイルモータ（不図示）を用いれば良い。このようにすれば、合焦状態の調整を細かにできる。よって、挿入部１４１の移動は、ある程度のコントラストを持つ電子画像が取得できたところまでで済む。

以上のように、第３実施形態の標本観察装置によれば、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。

また、上述の各実施形態の標本観察装置では、以下の条件式（１）を満足することが好ましい。
１０μｍ＜ｄ／ＮＡ_ob ²＜１０００μｍ （１）
ここで、
ｄは、第１の波長帯域に対する第２の波長帯域における軸上色収差の量、
ＮＡ_obは、結像光学系の標本側の開口数、
である。

条件式（１）を満足することで、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。

条件式（１）の下限値を下回ると、第１の波長帯域における波面収差量と第２の波長帯域における波面収差量との差が小さくなりすぎる。この場合、回折光に加わる波面収差量が小さくなる。特に、１次回折光に加わる波面収差量がλ／４よりも小さくなる。そのため、コントラストの良い電子画像を得るのが難しくなる。

条件式（１）の上限値を上回ると、第１の波長帯域における波面収差量と第２の波長帯域における波面収差量との差が大きくなりすぎる。この場合、回折光に加わる波面収差量が大きくなる。特に、１次回折光に加わる波面収差量がλ／４よりも大きくなる。また、収差量が大きくなりすぎるので、光学像が大きくぼやけてしまう。その結果、解像度の高い電子画像を得るのが難しくなる。

また、上述の各実施形態の標本観察装置では、結像光学系は対物レンズを有し、対物レンズにおける軸上色収差は、波長変化に対して単調に変化することが好ましい。

このようにすることで、コントラストの良い電子画像が得られる。対物レンズにおける軸上色収差が波長変化に対して単調に変化すると、波長による波面収差のカーブの変化が分かりやすい。そのため、第２の波長帯域の選択において、コントラストと解像度が高くなる波長帯域を容易に選択できる。

また、上述の各実施形態の標本観察装置では、撮像装置は撮像素子を有し、撮像素子では、波長帯域が異なる微小な光学フィルタが画素ごとに配置されていることが好ましい。

このようにすることで、コントラストの良い電子画像が容易に得られる。撮像素子には、光学フィルタが配置されている。この光学フィルタは、微小な光学フィルタを複数備えている。微小な光学フィルタには、例えば、赤色フィルタ、緑色フィルタ、青フィルタがある。そして、色フィルタの各々は、複数個配置されている。

そこで、色フィルタごとに画像信号を取り出せば、容易に、第２の波長帯域の光で形成された光学像を撮像できる。すなわち、照明光学系の光路中や結像光学系の光路中に、光学フィルタを配置させる必要が無い。なお、撮像素子はモノクロの撮像素子であっても良い。

なお、本発明は、その趣旨を逸脱しない範囲で様々な変形例をとることができる。

以上のように、本発明は、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本、例えば、細胞を観察できる標本観察方法及び標本観察装置に適している。

ＡＸ 光軸
ＦＬ、ＦＬ’ 光学フィルタ
ＨＭ ハーフミラー
Ｌ_C 光線（０次回折光）
Ｌ_P 光線（１次回折光）
Ｍ ミラー
Ｐ_S 標本Ｓの位置
Ｓ 標本
１、１’ 標本観察装置
１０ 本体部
１１ ステージ
１２ モータ
２０、２０’ 照明部
２１、２１’ 光源
２２、２２’ 照明光学系
２３ コンデンサレンズ
２４ 開口絞り
２５、２５’ レンズ
２６ ミラー
２７、２７’ レンズ
３０ 観察部
３１ 結像光学系
３２ 撮像装置
３３ レボルバ
３４ 観察鏡筒
３５ 顕微鏡対物レンズ
３６ 撮像レンズ
３７ 結像レンズ
３８ プリズム
３９ 撮像素子
４０ 画像処理装置
５０ 表示装置
１００ 電子内視鏡
１００ａ スコープ部
１００ｂ 接続コード部
１４０ 操作部
１４１ 挿入部
１４２ 先端部
１５０ ユニバーサルコード
２００ 画像処理装置
２０４ 表示ユニット
２５０ コネクタ
３００ 標本観察装置
４０１ 光ファイバ
４０２、４０４ レンズ
４０３ ミラー
４０５ ハーフプリズム
４０６ 対物レンズ
４０７ 結像レンズ
４０８ 撮像素子
４０９ 光学フィルタ

Claims (12)

1. 標本の電子画像を取得する取得ステップと、
   前記電子画像の信号から直流成分を減算する減算ステップと、を有し、
   前記直流成分の減算は、位相差により変化する成分が相対的に大きくなるように行われ、
   前記取得ステップは明視野観察の状態で行われ、
   前記減算ステップにおける前記電子画像は、所定の状態で取得された画像であって、
   前記所定の状態になる前に、第１の波長帯域の光で前記標本の位置と結像光学系の合焦位置を一致させ、
   該所定の状態では、少なくとも、第２の波長帯域の光で前記標本の光学像が形成されており、
   前記第２の波長帯域は前記第１の波長帯域のうちの一部と一致しているか、又は前記第１の波長帯域とは異なり、
   前記合焦位置とは、前記標本の持つ空間周波数において、０次回折光における波面収差量と１次回折光における波面収差量が、共に０である位置のことであることを特徴とする標本観察方法。
2. 前記減算ステップよりも後に増幅ステップを有し、
   前記増幅ステップでは、前記減算ステップ後の電子画像の信号を増幅することを特徴とする請求項１に記載の標本観察方法。
3. 前記電子画像の信号をフーリエ変換する変換ステップと、
   逆フーリエ変換を行う逆変換ステップと、を有し、
   前記変換ステップは、前記減算ステップよりも前に行われ、
   前記逆変換ステップは、少なくとも前記減算ステップよりも後に行われることを特徴とする請求項１または２に記載の標本観察方法。
4. 事前取得ステップと、
   規格化ステップと、を有し、
   前記事前取得ステップでは、前記標本が無い状態で電子画像を取得し、
   前記規格化ステップでは、該電子画像で前記標本の電子画像を規格化し、
   前記減算ステップの前に、前記規格化ステップを行うことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の標本観察方法。
5. 前記第１の波長帯域に対して前記第２の波長帯域を複数回変化させ、
   変化させた前記第２の波長帯域で、前記取得ステップと前記減算ステップを実行し、
   これにより、前記減算ステップを実行した後の電子画像を複数生成し、
   生成した前記複数の電子画像を加算することを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の標本観察方法。
6. 前記加算の前に、前記複数の電子画像の各々について、前記電子画像のうちでコントラストが最も高い部分を抽出し、
   前記抽出した部分を使って前記加算を行うことを特徴とする請求項５に記載の標本観察方法。
7. 前記第２の波長帯域の変化は、前記所定の状態における波面収差量の符号が同じ状態で行われることを特徴とする請求項５または６に記載の標本観察方法。
8. 光源と、照明光学系と、結像光学系と、撮像装置と、画像処理装置と、を有し、
   前記照明光学系は、前記光源からの照明光を標本に照射するように配置され、
   前記結像光学系は、前記標本からの光が入射するように配置されると共に、前記標本の光学像を形成し、
   前記撮像装置は前記光学像の位置に配置され、
   前記画像処理装置は、請求項１から７のいずれか一項に記載の標本観察方法を行うことを特徴とする標本観察装置。
9. 表示装置を有し、
   前記表示装置は、前記画像処理装置からの出力信号を表示することを特徴とする請求項８に記載の標本観察装置。
10. 以下の条件式（１）を満足することを特徴とする請求項８または９に記載の標本観察装置。
    １０μｍ＜ｄ／ＮＡ_ob ²＜１０００μｍ （１）
    ここで、
    ｄは、前記第１の波長帯域に対する前記第２の波長帯域における軸上色収差の量、
    ＮＡ_obは、前記結像光学系の前記標本側の開口数、
    である。
11. 前記結像光学系は対物レンズを有し、
    該対物レンズにおける軸上色収差は、波長変化に対して単調に変化することを特徴とする請求項８から１０のいずれか一項に記載の標本観察装置。
12. 前記撮像装置は撮像素子を有し、
    前記撮像素子では、波長帯域が異なる微小な光学フィルタが画素ごとに配置されていることを特徴とする請求項８から１１のいずれか一項に記載の標本観察装置。