JP2015158570A - 合焦方法、計測方法、主点検出方法、合焦装置、計測装置及び主点検出装置 - Google Patents

Abstract

【課題】無色透明で、表面の形状が滑らかになっている標本であっても、標本に合焦することができる合焦方法を提供する。【解決手段】顕微鏡を準備するステップと、表面形状が曲面である標本を顕微鏡に装着するステップと、所定の処理ステップと、を有し、所定の処理ステップは、観察光学系から出射した光を受光するステップと、受光した光のうち、所定の領域からの光に基づく光量を求めるステップと、所定の領域における光量と基準の光量との差又は比を算出するステップと、算出結果と閾値とを比較するステップと、標本と観察光学系との間隔を変化させるステップと、を有し、準備するステップでは、照明光の一部の領域が遮光又は減光されており、所定の領域は、標本の一部の領域であり、算出結果が閾値以下となったときに、所定の処理ステップを終了することを特徴とする。【選択図】図１５

Description

本発明は、合焦方法、計測方法、主点検出方法、合焦装置、計測装置及び主点検出装置に関するものである。

顕微鏡で標本を観察する際に、標本に焦点を合わせる方法として、コントラスト方式の合焦方法が知られている。コントラスト方式の合焦方法は、標本がコントラストを持つ場合に適した合焦方法である。特許文献１では、従来技術の欄に、コントラスト方式の合焦方法が記載されている。

この合焦方法では、現在位置での画像コントラストと、所定時間レンズを移動させた位置でのコントラストとを比較し、このときの傾き（コントラスト変化／移動距離）から次に移動すべき距離を決定し、コントラスト変化が減少して移動すべき距離が一定値以下となったらその位置を合焦位置としている。

顕微鏡で観察する標本として、例えば細胞がある。細胞は無色透明であるが、染色することで細胞はコントラストを持つ。よって、染色された細胞については、コントラスト方式の合焦方法を用いることで、細胞に焦点を合わせることができる。一方、細胞を生きた状態で観察する場合、細胞を染色することは好ましくない。この場合、生きた細胞（以下、適宜、「生細胞」という）は無色透明であるので、コントラストを持たない。そのため、生細胞については、コントラスト方式の合焦方法を用いても、生細胞に焦点を合わせることは困難である。

無色透明な標本を観察する方法として、位相差観察法が知られている。生細胞の中には、位相型の回折格子のように、表面に凹凸を有するものがある。このような生細胞では位相が変化しているので、生細胞を照明すると、生細胞から非回折光と回折光とが生じる。位相差観察法では、非回折光と回折光との干渉を利用して、位相の変化を明るさの変化に変換している。具体的には、位相板を用いて、非回折光の位相と回折光の位相とを一致させている。

位相差観察法では、標本が無色透明であっても、コントラストのある標本像が得られる。そこで、位相差観察法とコントラスト方式の合焦方法とを組み合わせることで、標本が無色透明であっても標本に焦点を合わせることができる。

ただし、位相差観察法では、ハローと呼ばれる明るい縁取りが像の周囲に現れることがある。このハローの明るさは、標本に焦点が合っていない状態でも非常に明るくなることがある。そのため、ハローが生じる場合、コントラスト方式の合焦方法では、標本に焦点を合わせることは困難である。

位相差観察法とは別の方法で、非回折光の位相と回折光の位相を一致させることができる。別の方法では、対物レンズの焦点位置から所定の距離だけ標本の位置をずらす。この場合、標本が対物レンズの焦点位置からずれているときのコントラストＣ_offと、標本が対物レンズの焦点位置と一致しているときのコントラストＣ_onとを比べると、Ｃ_on＜Ｃ_offとなる。特許文献２には、このようなコントラストの違いを利用した合焦方法が開示されている。

特許文献２の合焦方法では、標本と対物レンズの焦点位置とを相対移動させながら、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を行っている。（Ｉ）移動前の画像と移動後の画像を用いた差分画像の取得。（ＩＩ）差分画像のコントラスト値の算出。（ＩＩＩ）差分画像のコントラスト値が最大か否かの判断。そして、差分画像のコントラスト値が最大になったときに、標本に焦点が合っていると判断している。

特許文献２の合焦方法は、位相差観察法と同様に、非回折光と回折光との干渉を利用している。しかしながら、特許文献２の合焦方法では、位相差観察法のようにハローは生じない。そのため、合焦が可能な対象を広げることができる。

特開昭６４−５４４０８号公報 特開２００８−２０４９８号公報

特許文献２の合焦方法では、非回折光と回折光との干渉を利用している。そのため、合焦が可能な標本は、表面に凹凸が存在している標本になる。しかしながら、生細胞の中には、表面の形状がレンズ面のように滑らかになっている生細胞も存在する。また、生細胞が集合した状態、例えば生細胞のコロニーでは、コロニー全体の表面の形状がレンズ面のように滑らかになっている場合がある。また、コロニー全体の表面に凹凸が存在している場合であっても、コロニーの一部には、表面の形状がレンズ面のように滑らかになっている領域がある。

このように、表面の形状が滑らかになっている場合、非回折光の光強度に比べて回折光の光強度が小さくなる。そのため、非回折光と回折光とを干渉させたとしても、干渉によって得られた光強度は、非回折光の光強度とほぼ等しくなる。その結果、特許文献２の合焦方法では、無色透明で、表面の形状が滑らかになっている標本に対して焦点を合わせることは難しい。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、無色透明で、表面の形状が滑らかになっている標本であっても、標本に焦点を合わすことができる合焦方法及び合焦装置を提供することを目的とする。また、無色透明で、表面の形状が滑らかになっている標本であっても、標本の形状を測定できる計測方法及び計測装置を提供することを目的とする。また、無色透明で、表面の形状が滑らかになっている標本であっても、標本の主点位置を検出できる主点検出方法及び主点検出装置を提供することを目的とする。

上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明の合焦方法は、照明光学系と観察光学系を有する顕微鏡を準備するステップと、表面形状が曲面である標本を顕微鏡に装着するステップと、所定の処理ステップと、を有し、所定の処理ステップは、観察光学系から出射した光を受光するステップと、受光した光のうち、所定の領域からの光に基づく光量を求めるステップと、所定の領域における光量と基準の光量との差又は比を算出するステップと、算出結果と閾値とを比較するステップと、標本と観察光学系との間隔を変化させるステップと、を有し、準備するステップでは、照明光の一部の領域が遮光又は減光されており、装着するステップでは、標本の表面形状が変形しない状態で、標本と観察光学系とが対向しており、所定の領域は、標本の一部の領域であり、算出結果が閾値以下となったときに、所定の処理ステップを終了することを特徴とする。

また、本発明の計測方法は、底面にマーカーが設けられた保持容器で標本を保持し、上述の合焦方法を用いて、標本の表面に対して合焦を行うと共に、合焦したときの第１の合焦情報を取得し、コントラストの変化に基づいて合焦を行う合焦方法を用いて、マーカーに対して合焦を行うと共に、合焦したときの第２の合焦情報を取得し、第１の合焦情報と第２の合焦情報の差を取得することを特徴とする。

また、本発明の別の計測方法は、上述の合焦方法を用いて、標本の表面上の第１の位置に対して合焦を行うと共に、合焦したときの第１の合焦情報を取得し、上述の合焦方法を用いて、標本の表面上の第２の位置に対して合焦を行うと共に、合焦したときの第２の合焦情報を取得し、第１の合焦情報と第２の合焦情報の差を取得することを特徴とする。

また、本発明の主点検出方法は、表面形状が曲面である標本の主点を、上述の合焦方法を用いて検出することを特徴とする。

また、本発明の合焦装置は、照明光学系と、観察光学系と、保持部材と、駆動装置と、受光素子と、処理装置と、を備え、照明光学系は、光源と、コンデンサレンズと、開口部材と、を有し、観察光学系は、対物レンズと、結像レンズと、を有し、保持部材は標本を保持すると共に、照明光学系と観察光学系との間に配置され、駆動装置は、保持部材と観察光学系との間隔を変化させ、受光素子は、観察光学系から出射した光を受光する位置に配置され、処理装置は、受光した光のうち、所定の領域からの光について光量を求める手段と、所定の領域における光量と基準の光量との差又は比を算出する手段と、算出結果と閾値とを比較する手段と、間隔の変化を制御する手段と、を有し、開口部材は、遮光部又は減光部と、透過部と、を有し、透過部の少なくとも一部は、遮光部又は減光部よりも外側に位置し、所定の領域は、標本の一部の領域であり、算出結果が閾値以下となったときに、処理装置における処理を終了することを特徴とする。

また、本発明の計測装置は、底面にマーカーが設けられた保持容器で標本を保持し、上述の合焦装置を用いて、標本の表面に対して合焦を行うと共に、合焦したときの第１の合焦情報を取得する手段と、コントラストの変化に基づいて合焦を行う合焦装置を用いて、マーカーに対して合焦を行うと共に、合焦したときの第２の合焦情報を取得する手段と、を有し、第１の合焦情報と第２の合焦情報の差を取得することを特徴とする。

また、本発明の別の計測装置は、上述の合焦装置を用いて、標本の表面に対して合焦を行うと共に、合焦したときの第１の合焦情報を取得する手段と、上述の合焦装置を用いて、標本の表面上の第２の位置に対して合焦を行うと共に、合焦したときの第２の合焦情報を取得し、第１の合焦情報と第２の合焦情報の差を取得することを特徴とする。

また、本発明の主点検出装置は、表面形状が曲面である標本の主点を、上述の合焦装置を用いて検出することを特徴とする。

本発明によれば、無色透明で、表面の形状が滑らかになっている標本であっても、標本に焦点を合わすことができる合焦方法及び合焦装置を提供することができる。また、無色透明で、表面の形状が滑らかになっている標本であっても、標本の形状を測定できる計測方法及び計測装置を提供することができる。また、無色透明で、表面の形状が滑らかになっている標本であっても、標本の主点位置を検出できる主点検出方法及び主点検出装置を提供することができる。

位相差観察法による位相標本の電子画像であって（ａ）は生細胞の電子画像、（ｂ）はコロニーの電子画像である。 位相標本の断面の様子を示す図であって、（ａ）は生細胞の断面図、（ｂ）はコロニーの断面図である。 液中で位相標本を観察する様子を示す図であって、（ａ）は生細胞を示す図、（ｂ）はレンズを示す図である。 顕微鏡の光学系を示す図であって、（ａ）は光学系全体の図、（ｂ）は光学系の瞳の結像の様子を示す図である。 対物レンズの主点位置に対する平凸レンズの主点位置と瞳の像の大きさとの関係を示す図であって、（ａ）は第１の状態を示す図、（ｂ）は第２の状態を示す図、（ｃ）は第３の状態を示す図である。 焦点位置に対する平凸レンズの主点位置のずれ量と瞳投影倍率との関係を示す図である。 照明光の一部の領域が遮光された状態を説明するための図であって、（ａ）はアキシコンプリズムの図、（ｂ）はアキシコンプリズムの配置例を示す図、（ｃ）は照明光の集光状態を示す図、（ｄ）は開口部材の配置例を示す図である。 開口部材を配置した顕微鏡の光学系を示す図であって、（ａ）は光学系全体の図、（ｂ）は開口部材の像の図である。 レンズの主点の位置を示す図であって、（ａ）、（ｂ）は平凸レンズにおける主点位置を示す図、（ｃ）、（ｄ）は平凹レンズにおける主点位置を示す図である。 焦点位置に対する生細胞の面頂位置と開口部材の像の大きさとの関係を示す図であって、（ａ）は第１の状態を示す図、（ｂ）は第２の状態を示す図、（ｃ）は第３の状態を示す図、（ｄ）は第１の状態での開口部材の像の図、（ｅ）は第２の状態での開口部材の像の図、（ｆ）は第３の状態での開口部材の像の図である。 平凸レンズにおける面頂像の明るさの変化を説明する図であって、（ａ）は、焦点位置に対する面頂位置のずれ量と面頂像の明るさとの関係を示すグラフ、（ｂ）はグラフ上の位置Ｐ１における位置関係を示す図、（ｃ）はグラフ上の位置Ｐ２における位置関係を示す図、（ｄ）はグラフ上の位置Ｐ３における位置関係を示す図である。 位相標本の電子画像であって、（ａ）は第１の状態での電子画像、（ｂ）は第２の状態での電子画像、（ｃ）は第３の状態での電子画像である。 球レンズにおける球心像の明るさの変化を説明する図であって、（ａ）は、焦点位置に対する球心位置のずれ量と球心像の明るさとの関係を示すグラフ、（ｂ）はグラフ上の位置Ｐ１’における位置関係を示す図、（ｃ）はグラフ上の位置Ｐ２’における位置関係を示す図、（ｄ）はグラフ上の位置Ｐ３’における位置関係を示す図である。 位相標本の電子画像であって、（ａ）は第１の状態での電子画像、（ｂ）は第２の状態での電子画像、（ｃ）は第３の状態での電子画像である。 第１実施形態の合焦方法のフローチャート示す図である。 第２実施形態の合焦方法のフローチャート示す図である。 第３実施形態の合焦方法のフローチャート示す図である。 第４実施形態の合焦方法のフローチャート示す図である。 第４実施形態におけるステップＳ６０のフローチャートを示す図である。 電子画像に対して複数の領域を設定した様子を示す図である。 標本上の異なる２点での像の明るさの変化の違いを説明するための図であって、（ａ）は、焦点位置に対する標本位置のずれ量と像の明るさとの関係を示すグラフ、（ｂ）は異なる２点を示す図である。 照明光の様子を示す図であって、（ａ）は第１の実施例を示す図、（ｂ）は第２の実施例を示す図、（ｃ）は第３の実施例を示す図、（ｄ）は第４の実施例を示す図、（ｅ）は第５の実施例を示す図、（ｆ）は第６の実施例を示す図である。 照明光の像と対物レンズの瞳との関係を示す図である。 照明光の様子とその像を示す図であって、（ａ）は第７の実施例を示す図、（ｂ）は第８の実施例を示す図、（ｃ）は照明光の像を示す図である。 焦点位置に対する生細胞の面頂位置と開口部材の像の大きさとの関係を示す図であって、（ａ）は第１の状態を示す図、（ｂ）は第２の状態を示す図、（ｃ）は第３の状態を示す図である。 第１実施形態の合焦装置の構成を示す図である。 画像処理装置２１４の構成を示す図であって、（ａ）は基本的な構成を示す図、（ｂ）は好ましい構成を示す図である。 第２実施形態の合焦装置の構成を示す図である。 第３実施形態の合焦装置の構成を示す図である。

本発明のある態様にかかる実施形態の作用効果を説明する。なお、本実施形態の作用効果を具体的に説明するに際しては、具体的な例を示して説明することになる。しかし、それらの例示される態様はあくまでも本発明に含まれる態様のうちの一部に過ぎず、その態様には数多くのバリエーションが存在する。したがって、本発明は例示される態様に限定されるものではない。

本実施形態の合焦方法は、無色透明で、表面の形状が滑らかになっている標本への焦点合わせに適している。本実施形態の合焦方法は、特に、表面の形状がレンズ面のように滑らかで、全体の形状がレンズのような標本への焦点合わせに適している。以下、本実施形態の合焦方法の適用に好ましい標本を、単に「位相標本」という。

なお、表面の形状が滑らかになっている場合、表面は凹凸が少ない形状になっている。このような形状は、非回折光の明るさに比べて回折光の明るさが暗い形状である。非回折光は、例えば０次回折光、回折光は、例えば１次回折光である。また、表面の形状は、球面になっていることが好ましい。あるいは、全体の形状がレンズと同じ形状であることが好ましい。好ましい形状のレンズとしては、平凸レンズ、平凹レンズ、シリンドリカルレンズ及び半球レンズなどがある。

図１に、位相標本の例を示す。図１は位相差観察法による位相標本の電子画像であって（ａ）は生細胞の電子画像、（ｂ）はコロニーの電子画像である。また、図２は位相標本の断面の様子を示す図であって、（ａ）は生細胞の断面図、ｂ）はコロニーの断面図である。

図１（ａ）に示す電子画像は、生細胞の電子画像である。この電子画像では、隣り合う生細胞の境界が明確になっているので、個々の生細胞の様子を認識することができる。一方、図１（ｂ）に示す電子画像は、コロニーの電子画像である。この電子画像では、複数の生細胞が集合して１つの塊、すなわちコロニーを形成している。よって、この電子画像では、個々の生細胞の様子を認識することはできない。

図２（ａ）は、図１（ａ）におけるＡ１−Ａ１の断面図である。図２（ａ）に示すように、生細胞１は保持容器２によって保持されている。保持容器２は、例えばシャーレである。図２では、シャーレの底面の一部が図示されている。生細胞１では、中央で厚みが最も厚く、周辺に向かって徐々に厚みが減少している。また、生細胞１では、表面の形状が滑らかになっている。

図２（ｂ）は、図１（ｂ）におけるＡ２−Ａ２の断面図である。図２（ｂ）に示すように、コロニー３は保持容器２によって保持されている。コロニー３では、厚みが場所によって異なっている。よって、コロニー３の全体としては、表面に凹凸が存在している。しかしながら、例えばコロニー３の一部の領域、例えば凸部４では、中央の厚みが最も厚く、周辺に向かって徐々に厚みが減少している。また、凸部４では、表面の形状が滑らかになっている。なお、図２（ａ）に示すような形状を持つコロニーもある。

位相標本を生きている状態で観察する場合、観察は水や培養液などの液中で行われる。図３は液中で位相標本を観察する様子を示す図であって、（ａ）は生細胞を示す図、（ｂ）はレンズを示す図である。

図３（ａ）に示すように、生細胞１は保持容器２で保持されている。そして、保持容器２の内側は培養液５で満たされている。また、生細胞１の上方には、対物レンズ６が位置している。また、対物レンズ６と生細胞１との間は培養液５で満たされている。

ここで、生細胞１の上方にカバーガラスを載置すると、カバーガラスの重みで生細胞１の表面は平坦な形状になる。しかしながら、液中での観察では、生細胞１と対物レンズ６との間にカバーガラスは配置されない。そのため、生細胞１の表面の形状は変形していない。そして、この状態で、生細胞１と対物レンズ６とが対向している。

図３（ａ）に示すように、生細胞１では、中央で厚みが最も厚く、周辺に向かって徐々に厚みが減少している。また、生細胞１では、表面が滑らかになっている。このように、生細胞１では、表面の形状がレンズ面のように滑らかで、全体の形状が平凸レンズのようになっている。

このようなことから、位相標本はレンズと実質的に同等と見なすことができる。そこで、図３（ａ）において生細胞１を平凸レンズに置き換える。図３（ｂ）は、置き換え後の図である。図３（ｂ）に示すように、培養液５の液中に平凸レンズ７が配置されている。このように、図３（ａ）に示す状態は、図３（ｂ）に示す状態と実質的に同じである。

なお、位相標本を平凹レンズと見なせる場合もある。この場合、培養液５の液中に平凹レンズが配置されていることになるが、実際の例としては、以下のような（例１）〜（例３）がある。（例１）生細胞の断面形状が、中央で厚みが最も薄く、周辺に向かって徐々に厚みが増加している状態。（例２）図３（ａ）において、生細胞１の屈折率が培養液５の屈折率よりも小さい状態。（例３）コロニーにおいて、凹部の表面の形状が滑らかになっている状態。

次に、顕微鏡の光学系について説明する。図４は顕微鏡の光学系を示す図であって、（ａ）は光学系全体の図、（ｂ）は光学系の瞳の結像の様子を示す図である。

図４（ａ）に示すように、顕微鏡の光学系１００は、照明光学系２０と観察光学系２１とを有する。照明光学系２０は、光源２２とコンデンサレンズ２３とを有する。なお、光源２２とコンデンサレンズ２３との間にレンズを配置しても良い。図４（ａ）では、光源２２とコンデンサレンズ２３との間に、レンズ２４とレンズ２５とが配置されている。観察光学系２１は、対物レンズ２６と結像レンズ２７とを有する。

光源２２から出射した照明光はレンズ２４に入射し、レンズ２５で集光される。集光位置はコンデンサレンズ２３の瞳位置Ｐ_con（以下、単に「瞳位置Ｐ_con」という）であるので、瞳位置Ｐ_conに光源２２の像が形成される。

瞳位置Ｐ_conに集光した照明光は、コンデンサレンズ２３に入射する。ここで、瞳位置Ｐ_conはコンデンサレンズ２３の焦点位置と一致している。よって、照明光は平行光となって、コンデンサレンズ２３から出射する。この平行光によって標本が照明される。なお、図４（ａ）では、標本は図示されていないが、照明光学系２０と観察光学系２１との間、具体的には、コンデンサレンズ２３と対物レンズ２６との間に標本が配置されている。

標本の結像について説明する。標本からの光（以下、適宜、「物体光」という）は、対物レンズ２６の焦点位置２８から出射する。物体光は対物レンズ２６に入射する。物体光は対物レンズ２６で平行光になり、結像レンズ２７に入射する。続いて、物体光は結像レンズ２７で集光され、集光位置に標本の像２９が形成される。

次に、瞳の結像について説明する。瞳位置Ｐ_conから出射した光は、図４（ｂ）の破線で示すように、コンデンサレンズ２３によって平行光になる。この平行光は、対物レンズ２６の焦点位置２８を通過して、対物レンズ２６に入射する。対物レンズ２６に入射した平行光は、対物レンズ２６で集光される。この集光位置は、対物レンズ２６の瞳位置Ｐ_ob（以下、単に「瞳位置Ｐ_ob」という）である。よって、瞳位置Ｐ_conと瞳位置Ｐ_obとは共役になる。瞳位置Ｐ_conにはコンデンサレンズの瞳３０があるので、瞳位置Ｐ_obにコンデンサレンズの瞳の像３１が形成される。

瞳の結像について、更に説明する。以下の説明では、レンズを薄肉レンズとみなしている。照明光学系２０と観察光学系２１との間に何も存在していない場合、コンデンサレンズ２３と対物レンズ２６とで構成される光学系の倍率、すなわち、瞳投影倍率β_pは以下の式（Ａ）で表される。
β_p＝ｆ_ob／ｆ_c （Ａ）
ここで、
ｆ_obは対物レンズの焦点距離、
ｆ_cはコンデンサレンズの焦点距離、
である。

次に、照明光学系２０と観察光学系２１との間に平凸レンズが存在する場合について説明する。この場合、対物レンズ２６と平凸レンズとの合成焦点距離ｆ_len-obは、以下の式（Ｂ）で表される。
ｆ_len-ob＝（ｆ_len×ｆ_ob）／（ｆ_len＋ｆ_ob-ｄ） （Ｂ）
ここで、
ｆ_lenは平凸レンズの焦点距離、
ｆ_obは対物レンズの焦点距離、
ｄは対物レンズと平凸レンズとの間隔、
である。

また、このときの瞳投影倍率β_p’は以下の式（Ｃ）で表される。
β_p’＝ｆ_len-ob／ｆ_c
＝｛（ｆ_len×ｆ_ob）／（ｆ_len＋ｆ_ob-ｄ）｝／ｆ_c
＝（ｆ_len×ｆ_ob）／｛ｆ_c×（ｆ_len＋ｆ_ob-ｄ）｝
＝（β_p×ｆ_len）／（ｆ_len＋ｆ_ob-ｄ） （Ｃ）

上述のように、対物レンズや平凸レンズを薄肉レンズとみなしているので、レンズの厚みは無いものとなる。そうすると、間隔ｄは、対物レンズの主点と平凸レンズの主点との間隔になる。

ここで、対物レンズの位置を基準にすると、間隔ｄは、対物レンズの主点位置に対する平凸レンズの主点位置を示していることになる。一方、平凸レンズの位置を基準にすると、間隔ｄは、平凸レンズの主点位置に対する対物レンズの主点位置を示していることになる。以下の説明では、対物レンズの位置を基準にしている。

式（Ｃ）は、対物レンズの主点位置に対して平凸レンズの主点位置が変化すると、瞳投影倍率β_p’が変化することを示している。そして、瞳投影倍率β_p’が変化するということは、コンデンサレンズの瞳の像３１の大きさが変化するということである。

図５は、対物レンズの主点位置に対する平凸レンズの主点位置と瞳の像の大きさとの関係を示す図であって、（ａ）は第１の状態を示す図、（ｂ）は第２の状態を示す図、（ｃ）は第３の状態を示す図である。なお、図５では、コンデンサレンズ、対物レンズ及び平凸レンズはいずれも薄肉レンズであるが、平凸レンズのみを矢印で示している。また、矢印の位置が平凸レンズの主点位置になる。また、以下の説明では、対物レンズの焦点位置を、単に「焦点位置」という。

第１の状態、第２の状態及び第３の状態のいずれにおいても、コンデンサレンズ２３と対物レンズ２６との間に、平凸レンズ７が存在する。よって、コンデンサレンズの瞳３０は、コンデンサレンズ２３、平凸レンズ７及び対物レンズ２６によって観察光学系側に投影される。その結果、観察光学系の光路中、例えば瞳位置Ｐ_obに、コンデンサレンズの瞳の像３１が形成される。

図５（ａ）は第１の状態を示している。第１の状態では、平凸レンズ７の主点と焦点位置２８とは一致していない。平凸レンズ７の主点は、焦点位置２８よりもコンデンサレンズ２３側に位置している。第１の状態での瞳投影倍率β_p’₁は以下の式（Ｃ１）で表される。
β_p’₁＝（β_p×ｆ_len）／（ｆ_len＋ｆ_ob-ｄ₁） （Ｃ１）

図５（ｂ）は第２の状態を示している。第２の状態では、平凸レンズ７の主点と焦点位置２８とが一致している。第２の状態での瞳投影倍率β_p’₂は以下の式（Ｃ２）で表される。
β_p’₂＝（β_p×ｆ_len）／（ｆ_len＋ｆ_ob-ｄ₂） （Ｃ２）

図５（ｃ）は第３の状態を示している。第３の状態では、平凸レンズ７の主点と焦点位置２８とは一致していない。平凸レンズ７の主点は、焦点位置２８よりも対物レンズ２６側に位置している。第３の状態での瞳投影倍率β_p’₃は、以下の式（Ｃ３）で表される。
β_p’₃＝（β_p×ｆ_len）／（ｆ_len＋ｆ_ob-ｄ₃） （Ｃ３）

ここで、 ｄ₁＞ｄ₂＞ｄ₃なので、式（Ｃ１）〜（Ｃ３）の分母の大小関係は、以下のようになる。
（ｆ_len＋ｆ_ob-ｄ₁）＜（ｆ_len＋ｆ_ob-ｄ₂）＜（ｆ_len＋ｆ_ob-ｄ₃）

その結果、瞳投影倍率β_p’の大小関係はβ_p’₁＞β_p’₂＞β_p’₃になる。このように、対物レンズ２６の主点位置に対して平凸レンズ７の主点位置が変化すると、瞳投影倍率が変化する。

また、β_p’₁＞β_p’₂＞β_p’₃なので、第１の状態での像高ＩＨ₁、第２の状態での像高ＩＨ₂及び第３の状態での像高ＩＨ₃の大小関係は、ＩＨ₁＞ＩＨ₂＞ＩＨ₃になる。ここで、各状態における像高は、コンデンサレンズの瞳の像３１の像高である。このように、対物レンズ２６の主点位置に対して平凸レンズ７の主点位置が変化すると、コンデンサレンズの瞳の像３１の大きさが変化する。

なお、焦点位置２８は、対物レンズ２６の主点位置を基準にして決まる。よって、平凸レンズ７の主点位置の変化は、焦点位置２８を基準にして表すことができる。そうすると、焦点位置２８に対して平凸レンズ７の主点位置が変化すると、瞳投影倍率β_p’やコンデンサレンズの瞳の像３１の大きさが変化することになる。

また、ｄ₂＝ｆ_obなので、（ｆ_len＋ｆ_ob-ｄ₂）＝ｆ_lenとなる。その結果、β_p’₂は以下のようになる。
β_p’₂＝（β_p×ｆ_len）／（ｆ_len＋ｆ_ob-ｄ₂）＝（β_p×ｆ_len）／ｆ_len＝β_p

以下、平凸レンズの主点を、単に「主点」といい、平凸レンズの主点位置を、単に「主点位置」という。また、主点と焦点位置とが一致している状態を、単に「一致状態」といい、照明光学系と観察光学系との間に何も存在していない状態を、単に「未配置状態」という。未配置状態では、標本は照明光学系と観察光学系との間に配置されていない。また、一致状態と未配置状態のいずれにおいても、照明光の一部の領域は遮光または減光されている。

β_p’₂＝β_pは、一致状態と未配置状態とが、実質的に同じ状態であることを示している。よって、コンデンサレンズの瞳の像３１の大きさは、一致状態と未配置状態とで同じになる。

図６は、焦点位置に対する主点位置のずれ量と瞳投影倍率との関係を示す図である。図６において、縦軸は瞳投影倍率を示し、縦軸は焦点位置に対する主点位置のずれ量を示している。また、実線は、ｆ_c＝８０ｍｍ、ｆ_ob＝１８ｍｍ、ｆ_len＝０．２ｍｍで計算した結果を示し、破線は、ｆ_c＝８０ｍｍ、ｆ_ob＝１８ｍｍ、ｆ_len＝０．５ｍｍで計算した結果を示している。

図６に示すように、焦点位置に対して主点位置が変化すると、瞳投影倍率が変化する。図６は、主点が焦点位置よりもコンデンサレンズ側に位置するほど瞳投影倍率は大きくなり、主点が焦点位置よりも対物レンズ側に位置するほど瞳投影倍率は小さくなることを示している。

また、上述のように、実線ではｆ_len＝０．２ｍｍ、破線ではｆ_len＝０．５ｍｍで計算している。よって、平凸レンズの厚みは、実線における平凸レンズの方が、破線における平凸レンズよりも厚い。図６のグラフは、平凸レンズの厚みが厚いほど、ずれ量に対する瞳投影倍率の変化が大きくなることを示している。また、平凸レンズを位相標本に置き換えると、図６のグラフは、位相標本の厚みが厚いほど、ずれ量に対する瞳投影倍率の変化が大きくなることを示している。

上述のように、焦点位置に対して主点位置が変化すると、瞳投影倍率やコンデンサレンズの瞳の像の大きさが変化する。そこで、瞳位置Ｐ_conで照明光の一部の領域を遮光する。この場合、焦点位置に対して主点位置が変化すると、遮光された照明光の一部の領域の像の大きさが変化する。なお、照明光の一部の領域は遮光された領域なので、以下の説明では、照明光の一部の領域を、適宜「遮光領域」という。

図７は、照明光の一部の領域が遮光された状態を説明するための図であって、（ａ）はアキシコンプリズムの図、（ｂ）はアキシコンプリズムの配置例を示す図、（ｃ）は照明光の集光状態を示す図、（ｄ）は開口部材の配置例を示す図である。

アキシコンプリズム３２は、図７（ａ）に示すように、二つの光学面を有する。一方の光学面は円錐面３２ａで、他方の光学面は平面３２ｂである。平面３２ｂは、円錐面３２ａに対向している。また、平面３２ｂは、その光学面が円錐の中心軸に対して垂直になるように設けられている。

図７（ｂ）に示すように、アキシコンプリズム３２は、照明光学系２０’の光路中に配置されている。具体的には、アキシコンプリズム３２は、レンズ２４とレンズ２５との間に配置されている。光源３３から出射した照明光は、レンズ２４で平行光に変換され、アキシコンプリズム３２に入射する。平面３２ｂに対して垂直に入射した平行光は、円錐面３２ａで光軸方向に屈折される。

円錐面３２ａから出射した照明光は、アキシコンプリズム３２からある程度離れた位置で光軸と交差する。光軸と交差した後は、照明光は光軸から離れるように進む。その結果、レンズ２５には、略円環状又は円環状（以下、単に「円環状」という）の照明光が入射する。円環状の照明光はレンズ２５によって、例えば瞳位置Ｐ_conに集光される。

図７（ｂ）に示すように、瞳位置Ｐ_conでは、円環状の照明光は光軸から離れた位置に集光するが、光軸の近傍には集光しない。この場合、図７（ｃ）に示すように、観察光学系の光軸と直交する面内では、コンデンサレンズの瞳の外縁３５よりも内側に、領域３４ａが形成されている。領域３４ａでは照明光は集光していない。よって、領域３４ａは遮光領域になる。このように、アキシコンプリズム３２を用いることで、照明光の一部の領域が遮光される。一方、円環状の照明光は、コンデンサレンズの瞳の外縁３５の内側と外側に集光する。領域３４ｂは、照明光を透過する領域（以下、単に「透過領域」という）である。

なお、アキシコンプリズム３２を用いた場合、光源から出射した光は全て屈折されるので、照明光は物理的に遮光されていない。しかしながら、コンデンサレンズの瞳全体を照明光が透過している状態を基準にすると、図７（ｃ）に示すように、コンデンサレンズの瞳の中心部に照明光が存在しない領域３４ａが形成される。よって、アキシコンプリズム３２を用いた場合においても、照明光の一部の領域が遮光されている、と言うことができる。

また、アキシコンプリズム３２を使用せずに、照明光の一部の領域を遮光することができる。例えば、領域３４ａの位置に、不透明な部材を配置する。図７（ｃ）は照明光の集光状態を示す図であるが、領域３４ａを不透明な部材と見なすと、図７（ｃ）は不透明な部材を示す図になる。以下、開口部材を用いた例として図７（ｃ）の説明を行う。開口部材は遮光部を有し、この遮光部に不透明な部材が用いられている。

開口部材３４は、図７（ｃ）に示すように、遮光部３４ａと透過部３４ｂとを有する。遮光部３４ａと透過部３４ｂは透明な部材、例えば、ガラス板や樹脂板で構成されている。遮光部３４ａは、例えば、遮光塗料をガラス板上に塗布することで形成されている。一方、透過部３４ｂには何も塗布されていない。よって、透過部３４ｂはガラス板そのものである。なお、遮光塗料に代えて、減光膜をガラス板上に形成しても良い。このようにすることで、遮光部３４ａは減光部に置き換わる。

また、開口部材３４では、遮光部３４ａは透過部３４ｂの内側に設けられている。ここで、透過部３４ｂは、コンデンサレンズの瞳の外縁３５を含むように設けられている。よって、遮光部３４ａは、コンデンサレンズの瞳の外縁３５よりも内側に位置する。また、遮光部３４ａの大きさは、コンデンサレンズ２３の瞳の大きさよりも小さい。

図７（ｄ）に示すように、開口部材３４は照明光学系２０”の光路中、例えば、瞳位置Ｐ_conに配置されている。光源２２の周辺部から出射した照明光はレンズ２４に入射し、レンズ２５によって瞳位置Ｐ_conに集光される。ここで、集光位置には透過部３４ｂが位置している。よって、照明光は透過部３４ｂを通過して、コンデンサレンズ２３に入射する。

一方、光源２２の中心から出射した照明光も、レンズ２５によって瞳位置Ｐ_conに集光される。ただし、集光位置には遮光部３４ａが位置している。照明光は遮光部３４ａで遮光されるので、コンデンサレンズ２３に入射しない。このように、開口部材３４を用いることで、照明光の一部の領域を遮光することができる。

図８は、開口部材を配置した顕微鏡の光学系を示す図であって、（ａ）は光学系全体の図、（ｂ）は開口部材の像の図である。図４（ａ）と同じ構成部材については同じ番号を付し、説明は省略する。また、平凸レンズのみを矢印で示している。矢印の位置が平凸レンズの主点位置になる。

顕微鏡の光学系１００’では、照明光学系２０と観察光学系２１との間に、平凸レンズ７が配置されている。また、顕微鏡の光学系１００’では、照明光学系２０の光路中に開口部材３４が配置されている。開口部材３４には、図７（ｃ）に示すように、遮光部３４ａが設けられている。この遮光部３４ａによって、照明光の一部の領域が遮光されている。

開口部材３４は瞳位置Ｐ_conに配置されている。開口部材３４の像は、コンデンサレンズ２３、平凸レンズ７及び対物レンズ２６によって、観察光学系２１側に投影される。そして、例えば瞳位置Ｐ_obに、開口部材の像３６が形成される。

図８（ｂ）に示すように、開口部材の像３６は、遮光部の像３６ａと透過部の像３６ｂとに分けられる。透過部の像３６ｂは、対物レンズの瞳の外縁３７を含むように形成されている。透過部の像３６ｂは、外側像３６ｂ１と内側像３６ｂ２とに分けられる。外側像３６ｂ１は、対物レンズの瞳の外縁３７の外側に位置している。内側像３６ｂ２は、対物レンズの瞳の外縁３７の内側に位置している。

一方、遮光部の像３６ａは透過部の像３６ｂの内側に形成されている。よって、遮光部の像３６ａは、対物レンズの瞳の外縁３７よりも内側に位置している。また、遮光部の像３６ａの大きさは、対物レンズの瞳の大きさよりも小さい。なお、遮光部は遮光領域に相当するので、遮光部の像３６ａは遮光領域の像を示している。また、透過部は透過領域に相当するので、透過部の像３６ｂは遮光領域の像を示している。

上述のように、焦点位置に対して主点位置が変化すると、瞳投影倍率が変化する。また、瞳投影倍率が変化するため、コンデンサレンズの瞳の像の大きさも変化する。顕微鏡の光学系１００’では、瞳位置Ｐ_conに開口部材３４が配置されている。よって、焦点位置２８に対して主点位置が変化すると、開口部材の像３６の大きさが変化する。また、開口部材の像３６の大きさが変化するので、遮光部の像３６ａの大きさや内側像３６ｂ２の大きさが変化する。

内側像３６ｂ２の大きさは、観察光学系２１から出射する光の光量を表している。そして、この光量は、像の明るさを表している。よって、焦点位置２８に対して主点位置が変化すると、平凸レンズ７の像の明るさが変化することになる。なお、内側像３６ｂ２は、対物レンズの瞳から遮光部の像３６ａを除いた部分なので、遮光部の像３６ａの大きさも、間接的に観察光学系２１から出射する光の光量を表していることになる。

なお、未配置状態では、照明光学系と観察光学系との間には何も存在していない。この場合、像は形成されないので、像の明るさを求めることはできない。しかしながら、未配置状態であっても観察光学系から光が出射するので、この出射した光に基づく明るさを、便宜上、「未配置状態での像の明るさ」とする。また、像の各点での明るさは略同じであるものとする。

上述のように、一致状態は未配置状態と実質的に同じ状態である。そして、一致状態では、平凸レンズ７の主点と共役な像の明るさは、未配置状態での像の各点での明るさと略同じになる。よって、未配置状態での像の明るさに基づいて、一致状態を検出することができる。これは、未配置状態での像の明るさに基づいて、平凸レンズの主点位置を検出できるということである。

以上、平凸レンズを薄肉レンズと見なして説明した。しかしながら、実際の平凸レンズは厚みを持っている。そこで、厚みを持つレンズの主点について説明する。主点は、光学系やレンズにおいて横倍率が１倍になる光軸上の共役点である。主点は二つ存在し、物体空間における主点が物体主点、像空間における主点が像主点である。

図９はレンズの主点の位置を示す図であって、（ａ）、（ｂ）は平凸レンズにおける主点位置を示す図、（ｃ）、（ｄ）は平凹レンズにおける主点位置を示す図である。図９において、紙面の左方向が物体空間、右方向が像空間である。また、Ｈは物体主点を示し、Ｈ’は像主点を示している。

図９（ａ）では、レンズは、像空間側に凸面を向けた平凸レンズＬ₁である。平凸レンズＬ₁では、物体主点Ｈはレンズ内に位置し、像主点Ｈ’は凸面の面頂と一致している。図９（ｂ）では、レンズは、物体空間側に凸面を向けた平凸レンズＬ₂である。平凸レンズＬ₂では、物体主点Ｈは凸面の面頂と一致し、像主点Ｈ’はレンズ内に位置している。

図９（ｃ）では、レンズは、物体空間側に凹面を向けた平凹レンズＬ₃である。平凹レンズＬ₃では、物体主点Ｈは凹面の面頂と一致し、像主点Ｈ’はレンズ内に位置している。図９（ｄ）では、レンズは、像空間側に凹面を向けた平凹レンズＬ₄である。平凹レンズＬ₄では、物体主点Ｈはレンズ内に位置し、像主点Ｈ’は凹面の面頂と一致している。

図９（ａ）〜（ｄ）に示すように、平凸レンズＬ₁、Ｌ₂や平凹レンズＬ_3、Ｌ₄では、二つの主点のうちの一つの主点がレンズ面の面頂と一致している。上述のように、未配置状態での像の明るさに基づいて、平凸レンズの主点位置を検出することができる。よって、未配置状態での像の明るさに基づいて、平凸レンズの面頂位置も検出することができる。

上述のように、位相標本はレンズと実質的に同等と見なすことができる。そこで、レンズを位相標本に置き換えて説明する。ここでは、位相標本として、生細胞を例にして説明する。図１０は、焦点位置に対する生細胞の面頂位置と開口部材の像の大きさとの関係を示す図であって、（ａ）は第１の状態を示す図、（ｂ）は第２の状態を示す図、（ｃ）は第３の状態を示す図、（ｄ）は第１の状態での開口部材の像の図、（ｅ）は第２の状態での開口部材の像の図、（ｆ）は第３の状態での開口部材の像の図である。

上述のように、第１の状態〜第３の状態は、平凸レンズの主点と焦点位置との関係を示している。ここで、生細胞と平凸レンズとは実質的に同じなので、平凸レンズ７の主点は生細胞１の面頂に該当する。よって、面頂と焦点位置との関係についても、第１〜第３の状態を使って説明する。

また、上述のように、「一致状態」とは、主点と焦点位置とが一致している状態であるが、面頂と焦点位置とが一致している状態も、「一致状態」に含まれるものとする。

図１０（ａ）は第１の状態を示している。第１の状態では、生細胞１の面頂と焦点位置２８とは一致していない。生細胞１の面頂は、焦点位置２８よりもコンデンサレンズ側に位置している。図１０（ｂ）は第２の状態を示している。第２の状態では、生細胞１の面頂と焦点位置２８とは一致している。図１０（ｃ）は第３の状態を示している。第３の状態では、生細胞１の面頂と焦点位置２８とは一致していない。生細胞１の面頂は、焦点位置２８よりも対物レンズ２６側に位置している。

第１の状態、第２の状態及び第３の状態のいずれにおいても、瞳位置Ｐ_obには、開口部材の像３６が形成される。そして、図１０（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）に示すように、開口部材の像３６は、遮光部の像３６ａと透過部の像３６ｂとに分けられる。

また、何れの状態においても、透過部の像３６ｂは、対物レンズの瞳の外縁３７を含むように形成されている。一方、遮光部の像３６ａは、透過部の像３６ｂの内側に形成されている。よって、遮光部の像３６ａは、対物レンズの瞳の外縁３７よりも内側に位置している。また、遮光部の像３６ａの大きさは、対物レンズの瞳の大きさよりも小さい。

上述のように、瞳投影倍率の大小関係はβ_p’₁＞β_p’₂＞β_p’₃になり、像高の大小関係はＩＨ₁＞ＩＨ₂＞ＩＨ₃になる。ここで、図１０（ａ）の第１の状態は、図５（ａ）の第１の状態と等しい。図１０（ｂ）の第２の状態は、図５（ｂ）の第２の状態と等しい。図１０（ｃ）の第３の状態は、図５（ｃ）の第３の状態と等しい。よって、瞳投影倍率の大小関係や像高の大小関係は、図１０においても成立する。

遮光部の像３６ａの面積については、第１の状態での面積Ｓ₁₁、第２の状態での面積Ｓ₁₂及び第３の状態Ｓ₁₃の大小関係は、Ｓ₁₁＞Ｓ₁₂＞Ｓ₁₃になる。一方、透過部の像３６ｂは、外側像３６ｂ１と内側像３６ｂ２とに分かれる。このうち、内側像３６ｂ２の面積については、第１の状態での面積Ｓ₂₁、は第２の状態での面積Ｓ₂₂及び第３の状態での面積Ｓ₂₃の大小関係は、Ｓ₂₁＜Ｓ₂₂＜Ｓ₂₃になる。

内側像３６ｂ２の面積Ｓ₂₁、Ｓ₂₂及びＳ₂₃は、観察光学系から出射する光の光量を表している。ここで、生細胞１の各点からの光は、いずれも内側像３６ｂ２を通過して、観察光学系から出射する。よって、内側像３６ｂ２の面積の変化は、生細胞１の像の各点において、明るさが変化することを意味している。また、内側像３６ｂ２の面積は遮光部の像３６ａの面積よって変化している。よって、遮光部の像３６ａの面積の変化も、生細胞１の像の各点において、明るさが変化することを意味している。

このように、照明光の一部の領域を遮光した状態で、焦点位置２８に対して生細胞１の面頂位置がずれると、生細胞１の像の各点において明るさが変化する。特に、一致状態では、生細胞１の面頂と共役な像の明るさは、未配置状態での像の各点での明るさと略同じになる。よって、未配置状態での像の明るさに基づいて、一致状態を検出することができる。これは、未配置状態での像の明るさに基づいて、生細胞１の面頂位置を検出できるということである。

また、一致状態では、生細胞１の面頂と焦点位置２８とが一致しているので、生細胞１の面頂に焦点が合っている。よって、未配置状態での像の明るさに基づいて、生細胞１の表面に焦点を合わせることができる。

位相標本の像の明るさが変化する様子について説明する。以下に例示する平凸レンズやビーズを位相標本と見なしている。以下の説明では、位相標本の面頂を、単に「面頂」といい、面頂に対応する部分の像を、単に「面頂像」という。また、位相標本の球心を、単に「球心」といい、球心に対応する部分の像を、単に「球心像」という。

図１１は、平凸レンズにおける面頂像の明るさの変化を説明する図であって、（ａ）は、焦点位置に対する面頂位置のずれ量と面頂像の明るさとの関係を示すグラフ、（ｂ）はグラフ上の位置Ｐ１における位置関係を示す図、（ｃ）はグラフ上の位置Ｐ２における位置関係を示す図、（ｄ）はグラフ上の位置Ｐ３における位置関係を示す図である。

図１１（ａ）において、縦軸は面頂像の明るさを示し、縦軸は焦点位置に対する面頂位置のずれ量を示す。グラフにおける３本の線の各々は、面頂像の明るさの変化を示している。また、図１１（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）に示すように、焦点位置２８に対して、面頂位置Ｐ１、Ｐ２及びＰ３は各図で異なる。

また、３本の線は、いずれもｆ_c＝８０ｍｍ、ｆ_ob＝１８ｍｍ、ｆ_len＝０．２ｍｍで計算した結果を示している。ここで、実線は遮蔽率が９７％の場合を示し、破線は遮蔽率が９５％の場合を示し、一点鎖線は遮蔽率が８０％の場合を示している。遮蔽率は、図８（ｂ）における遮光部３６ａと対物レンズの瞳の外縁３７を用いて、以下のように表される。
遮蔽率＝遮光部３６ａの面積／対物レンズの瞳の面積

図１１（ａ）のＰ１における面頂像の明るさは、第１の状態での面頂像の明るさである。第１の状態では、面頂と焦点位置２８とは一致していない。面頂は、焦点位置２８よりもコンデンサレンズ側に位置している。第１の状態では、面頂位置は、図１１（ｂ）におけるＰ１の位置である。

図１１（ａ）のＰ２における面頂像の明るさは、第２の状態での面頂像の明るさである。第２の状態では、面頂と焦点位置２８とが一致している。第２の状態では、面頂位置は、図１１（ｃ）におけるＰ２の位置である。

図１１（ａ）のＰ３における面頂像の明るさは、第３の状態での面頂像の明るさである。第３の状態では、面頂と焦点位置２８とは一致していない。面頂は、焦点位置２８よりも対物レンズ２６側に位置している。第３の状態では、面頂位置は、図１１（ｄ）におけるＰ３の位置である。

位相標本３８が存在する場合、図１１（ａ）に示すように、焦点位置２８に対して面頂位置Ｐ１、Ｐ２及びＰ３が変化すると、面頂像の明るさが変化する。また、面頂像の明るさは単調に変化する。

図１２は位相標本の電子画像であって、（ａ）は第１の状態での電子画像、（ｂ）は第２の状態での電子画像、（ｃ）は第３の状態での電子画像である。位相標本はコロニーであって、全体の形状は平凸レンズのようになっている。各電子画像の中央の円形の部分がコロニーで、円の中心がコロニーの面頂である。また、遮蔽率は９５％である。

円の中心に着目すると、第１の状態では円の中心は黒色で、第２の状態では円の中心は灰色で、第３の状態では円の中心は白色になっている。ここで、第１の状態、第２の状態及び第３の状態は、各々、図１１（ａ）におけるＰ１の位置、Ｐ２の位置及びＰ３の位置に対応する。このように、面頂像の明るさの変化は、実際の標本の像を用いた測定結果とシミュレーションとで一致している。

ここで、第２の状態は、面頂と焦点位置とが一致している。よって、図１２（ｃ）に示す電子画像は、位相標本の表面に焦点が合ったときの画像になる。図１２（ｃ）に示す電子画像の明るさ（円の中心の明るさ）は、未配置状態で予め求めておくことができる。よって、未配置状態での像の明るさに基づいて、位相標本の表面に焦点を合わせることができる。

このように、焦点位置に対して面頂位置が変化すると、面頂像の明るさが変化する。よって、未配置状態での像の明るさに基づいて、位相標本の表面に焦点を合わせることができる。

なお、図１１（ａ）のグラフにおける３本の線は、いずれも面頂像の明るさの変化を示している。面頂は、位相標本全体のうちの一部の領域である。よって、位相標本に対して合焦を行う場合は、位相標本の一部の領域からの光に基づく光量を用いることになる。

図１３は、球レンズにおける球心像の明るさの変化を説明する図であって、（ａ）は焦点位置に対する球心位置のずれ量と球心像の明るさとの関係を示すグラフ、（ｂ）はグラフ上の位置Ｐ１’における位置関係を示す図、（ｃ）はグラフ上の位置Ｐ２’における位置関係を示す図、（ｄ）はグラフ上の位置Ｐ３’における位置関係を示す図である。

図１３（ａ）において、縦軸は球心像の明るさを示し、縦軸は焦点位置に対する球心位置のずれ量を示す。グラフにおける３本の線の各々は、球心像の明るさの変化を示している。また、図１３（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）に示すように、焦点位置２８に対して、球心位置Ｐ１’、Ｐ２’及びＰ３’は各図で異なる。

また、３本の線は、いずれもｆ_c＝８０ｍｍ、ｆ_ob＝１８ｍｍ、ｆ_len＝０．１ｍｍで計算した結果を示している。ここで、実線は遮蔽率が９７％の場合を示し、破線は遮蔽率が９５％の場合を示し、一点鎖線は遮蔽率が８０％の場合を示している。遮蔽率は、既に説明したとおりである。

図１３（ａ）のＰ１’における球心像の明るさは、第１の状態での球心像の明るさである。第１の状態では、球心と焦点位置２８とは一致していない。球心は、焦点位置２８よりもコンデンサレンズ側に位置している。第１の状態では、球心位置は、図１３（ｂ）におけるＰ１’の位置である。

図１３（ａ）のＰ２’における球心像の明るさは、第２の状態での球心像の明るさである。第２の状態では、球心と焦点位置２８とが一致している。第２の状態では、球心位置は、図１３（ｃ）におけるＰ２’の位置である。

図１３（ａ）のＰ３’における球心像の明るさは、第３の状態での球心像の明るさである。第３の状態では、球心と焦点位置２８とは一致していない。球心は、焦点位置２８よりも対物レンズ２６側に位置している。第３の状態では、球心位置は、図１３（ｄ）におけるＰ３’の位置である。

位相標本３９が存在する場合、図１３（ａ）に示すように、焦点位置２８に対して球心位置Ｐ１’、Ｐ２’及びＰ３’が変化すると、球心像の明るさが変化する。また、球心像明るさは単調に変化する。

図１４は位相標本の電子画像であって、（ａ）は第１の状態での電子画像、（ｂ）は第２の状態での電子画像、（ｃ）は第３の状態での電子画像である。位相標本はビーズであって、全体の形状は球レンズのようになっている。各電子画像の中央の円形の部分がビーズで、円の中心がビーズの球心である。また、遮蔽率は９５％である。

円の中心に着目すると、第１の状態では円の中心は黒色で、第２の状態では円の中心は灰色で、第３の状態では円の中心は白色になっている。ここで、第１の状態、第２の状態及び第３の状態は、各々、図１３（ａ）におけるＰ１’の位置、Ｐ２’の位置及びＰ３’の位置に対応する。このように、球心像の明るさの変化は、実際の標本の像を用いた測定結果とシミュレーションとで一致している。

このように、焦点位置に対して球心位置が変化すると、球心像の明るさが変化する。よって、未配置状態での像の明るさに基づいて、位相標本の球心に焦点を合わせることができる。

以上説明したように、照明光の一部の領域を遮光した状態で、主点位置や、球心位置や面頂位置が焦点位置に対して変化すると、位相標本の像の明るさが変化する。そして、面頂位置と焦点位置とが一致した状態では、位相標本の面頂像の明るさは、照明光学系と観察光学系との間に何も存在していない状態での像の各点での明るさと略同じになる。そこで、照明光学系と観察光学系との間に何も存在していない状態での像の明るさに基づいて、主点位置や、球心位置や面頂位置を検出することができる。また、検出主点位置や、球心位置や面頂位置に基づいて、位相標本に焦点を合わせることができる。

本実施形態の合焦方法、計測方法、主点検出方法、合焦装置、計測装置及び主点検出装置について説明する。これらの方法や装置では、遮光された領域の像の大きさが、焦点位置に対する主点位置等のずれ量に応じて変化することを利用している。まず、本実施形態の合焦方法について説明する。

本実施形態の合焦方法は、照明光学系と観察光学系を有する顕微鏡を準備するステップと、表面形状が曲面である標本を顕微鏡に装着するステップと、所定の処理ステップと、を有し、所定の処理ステップは、観察光学系から出射した光を受光するステップと、受光した光のうち、所定の領域からの光に基づく光量を求めるステップと、所定の領域における光量と基準の光量との差又は比を算出するステップと、算出結果と閾値とを比較するステップと、標本と観察光学系との間隔を変化させるステップと、を有し、準備するステップでは、照明光の一部の領域が遮光又は減光されており、装着するステップでは、標本の表面形状が変形しない状態で、標本と観察光学系とが対向しており、所定の領域は、標本の一部の領域であり、算出結果が閾値以下となったときに、所定の処理ステップを終了することを特徴とする。

上述のように、「面頂」とは位相標本の面頂であるが、以下の説明では、標本の面頂も「面頂」に含まれるものとする。また、標本像の明るさを、単に「像の明るさ」という。

本実施形態の合焦方法を、図１５を用いて説明する。図１５は第１実施形態の合焦方法のフローチャートを示す図である。本実施形態の合焦方法は、ステップＳ１０と、ステップＳ２０と、ステップ３０と、を有する。

最初に、ステップＳ１０が実行される。ステップＳ１０は、顕微鏡を準備するステップである。ステップＳ１０では、顕微鏡を使用可能な状態にする作業が行われる。顕微鏡は、照明光学系と観察光学系を有する。ステップＳ１０では、照明光学系の準備や観察光学系の準備が行われる。

照明光学系の準備では、照明光の波長の選択や、照明光の光量の調節や、コンデンサレンズの倍率の選択が行われる。また、照明光学系の準備では、照明光の一部の領域の遮光又は減光が行われる。遮光を行うには、図７（ａ）示すアキシコンプリズム３２や図７（ｃ）に示す開口部材３４を、照明光学系の光路中に配置すれば良い。また、減光を行うには、遮光部を減光部に置き換えた開口部材を用いれば良い。この開口部材を照明光学系の光路中に配置することで、照明光の一部の領域を減光できる。

観察光学系の準備では、対物レンズの倍率の選択や、観察方法の選択が行われる。なお、本実施形態の合焦方法では、明視野観察用の対物レンズを用いることが好ましい。

ステップＳ１０では、標本は保持部材、例えばステージ上に載置されていない。よって、ステップＳ１０が終了した時点では、照明光学系と観察光学系と間に標本は存在していない。

ステップＳ１０が終了すると、ステップＳ２０が実行される。ステップＳ２０は、標本を顕微鏡に装着するステップである。ステップ２０では、標本の観察が可能な状態にする作業が行われる。この状態にするために、標本のステージへの載置が行われる。なお、上述のように、標本は、無色透明で、表面の形状が滑らかになっている標本、特に、レンズのように中央部が周辺部に対して盛り上がっている標本である。よって、標本の表面の形状は曲面になっている。

また、標本の観察は液体を介して行われる。この場合、標本と対物レンズとの間には液体しか存在しない。よって、標本と観察光学系は、標本の表面形状が変形しない状態で対向している。

標本は位相標本であって、例えば生細胞である。生細胞は、培養液で満たされたシャーレに保持されている。このシャーレをステージ上に載置する。そして、対物レンズを培養液に浸す。このように、ステップＳ２０が終了すると、照明光学系と観察光学系と間に標本が存在することになる。このとき、図３（ａ）に示すように、生細胞１と対物レンズ６は、生細胞１の表面形状が変形しない状態で対向している。

ステップＳ１０が終了すると、ステップＳ３０が実行される。ステップＳ３０は所定の処理を行うステップである。ステップＳ３０は、ステップＳ３１と、ステップＳ３２と、ステップＳ３３と、ステップＳ３４と、ステップＳ３５と、を有する。

ステップＳ３０では、最初に、ステップＳ３１が実行される。ステップＳ３１は、観察光学系から出射した光を受光するステップである。ステップＳ３１では、受光素子を用いて、観察光学系から出射した光の受光が行われる。受光素子は、観察光学系の像位置に配置されている。

なお、観察光学系の光路中には、図８（ｂ）に示すように、遮光部の像３６ａと透過部の像３６ｂが形成されている。透過部の像３６ｂは、外側像３６ｂ１と内側像３６ｂ２とに分かれている。このうち、内側像３６ｂ２の領域を通過した光だけが、受光されることになる。遮光部の像３６ａは遮光領域の像である。

ステップＳ３１が終了すると、ステップＳ３２が実行される。ステップＳ３２は、所定の領域における光量Ｑ_Aを求めるステップである。所定の領域における光量Ｑ_Aは、ステップＳ３１で受光した光のうち、所定の領域からの光に基づく光量である。

観察光学系の像位置には、実視野の像が形成される。ステップＳ３１では実視野内の全ての領域からの光を受光するが、受光した光全てを焦点合わせために用いるわけではない。実視野内の標本に対して焦点合わせを行うために、標本の一部の領域からの光を少なくとも用いる。

上述のように、照明光の一部の領域を遮光した状態で、焦点位置に対して標本位置を変化させると、像の明るさが変化する。ここで、像の明るさは、受光素子で受光した光の光量と等価である。そこで、ステップＳ３２を実行することで、所定の領域における光量Ｑ_A、すなわち、受光した光のうち、所定の領域からの光に基づく光量が求まる。

ステップＳ３２が終了すると、ステップＳ３３が実行される。ステップＳ３３は、光量Ｑ_Aと基準の光量との差を算出するステップである。光量Ｑ_Aは、所定の領域における光量である。

上述のように、未配置状態での像の明るさに基づいて、一致状態を検出することができる。特に、一致状態では、面頂像の明るさは、未配置状態での像の各点での明るさと略同じになる。そこで、未配置状態のときの光量を、基準の光量にしておく。光量Ｑ_Aは焦点位置に対する面頂位置のずれ量に応じて変化する。よって、光量Ｑ_Aと基準の光量との差は、焦点位置に対する面頂位置のずれ量を示していることになる。

なお、焦点位置に対する面頂位置のずれ量は、光量Ｑ_Aと基準の光量との比からも求めることができる。よって、ステップＳ３３では、光量Ｑ_Aと基準の光量との比を算出しても良い。

ステップＳ３３が終了すると、ステップＳ３４が実行される。ステップＳ３４は、算出結果と閾値とを比較するステップである。一致状態でない場合は、所定の領域における光量Ｑ_Aと基準の光量とは一致しない。この場合、ステップＳ３３で算出した結果は０にならない。逆に、算出結果が０になれば、面頂と焦点位置とが一致したと判断できる。すなわち、標本の表面に焦点が合ったことになる。

また、ステップＳ３３で比を算出した場合、一致状態でない場合は、算出結果は１にならない。逆に、算出結果が１になれば、面頂と焦点位置とが一致したと判断できる。すなわち、標本の表面に焦点が合ったことになる。

ただし、電気的なノイズや光学的なノイズの影響のため、一致状態であっても、差の算出結果は０と一致しないことがある。そこで、一致状態と見なせる範囲、すなわち閾値を設定し、算出結果と閾値とを比較する。なお、比を用いる場合も、閾値を設定すればよい。

算出結果が閾値より大きい場合、一致状態ではないので、ステップＳ３５が実行される。

ステップＳ３５は、間隔ｄを変化させるステップである。間隔ｄは、標本と観察光学系との間隔である。例えば、図１１（ａ）や（ｃ）に示すように、生細胞１の面頂は焦点位置２８と一致していない。そこで、図１１（ａ）の場合であれば、生細胞１と対物レンズ２６との間隔を狭くする。一方、図１１（ｃ）の場合であれば、生細胞１と対物レンズ２６との間隔を広くする。ステップＳ３５が終わるとステップＳ３１に戻る。

一方、算出結果が閾値以下の場合、一致状態になっているので処理を終了する。この場合、面頂と焦点位置とが一致しているので、標本の表面に焦点が合っている。

本実施形態の合焦方法では、照明光の一部の領域が遮光されている。よって、焦点位置に対して面頂位置が変化すると、像の明るさが変化する。そして、面頂位置と焦点位置とが一致した状態では、面頂像の明るさは、照明光学系と観察光学系との間に何も存在していない状態での像の各点での明るさと略同じになる。そこで、照明光学系と観察光学系との間に何も存在していない状態での像の明るさに基づいて、面頂と焦点位置とが一致した状態を検出することができる。このように、本実施形態の合焦方法によれば、無色透明で、位相が滑らかに変化している標本であっても、標本に焦点を合わせることができる。

また、本実施形態の合焦方法は、装着するステップよりも前に、基準の光量を設定するステップを有することが好ましい。

本実施形態の合焦方法によれば、標本を顕微鏡に装着しなくても基準の光量を設定できるので、基準の光量の設定が簡単に行える。

また、本実施形態の合焦方法では、設定するステップは、照明光学系から出射した光を観察光学系に入射させて光量を測定するステップを有し、測定した光量に基づいて基準の光量を設定することが好ましい。

本実施形態の合焦方法を、図１６を用いて説明する。図１６は第２実施形態の合焦方法のフローチャートを示す図である。第１実施形態と同じステップについては同じ番号を付し、説明は省略する。本実施形態の合焦方法はステップＳ４０を有する。ステップＳ４０は、ステップＳ４１を有し、ステップＳ４１で測定した光量に基づいて基準の光量を設定する。

ステップＳ４１は、光量Ｑ_Bを測定するステップである。ステップＳ４１では、受光素子を用いて光量Ｑ_Bの測定が行われる。光量Ｑ_Bの測定は、照明光学系から出射した光を観察光学系に入射させて行う。ここで、ステップＳ２０では標本を顕微鏡に装着するが、ステップＳ４１はステップＳ２０よりも前に実行される。よって、光量Ｑ_Bの測定は、照明光学系と観察光学系との間に何も存在していない状態、すなわち未配置状態で行われる。

上述のように、一致状態と未配置状態とは、実質的に同じ状態である。よって、一致状態での光量を基準の光量にすると、未配置状態で測定した光量Ｑ_Bに基づいて基準の光量を設定することができる。ここで、未配置状態での光量の測定では、標本が顕微鏡に装着されていない。この場合、光量Ｑ_Bの測定は、実視野内のどの領域で行っても良い。よって、光量Ｑ_Bの測定が容易に行える。

なお、光量Ｑ_Bを測定する場合、測定する領域の数は、一つでも良く、複数でも良い。複数の領域で光量を測定した場合は、平均の光量を光量Ｑ_Bに設定すれば良い。また、複数の領域で光量を測定する場合、各領域の面積は同じであっても、異なっていても良い。なお、実視野の中心と周辺で光量に差が生じる場合は、実視野の中心に測定領域を設定することが好ましい。

また、光量Ｑ_Bを測定する場合、測定する領域の面積は、所定の領域の面積と同じであっても、異なっていても良い。光量Ｑ_Bを測定する領域の面積と所定の領域の面積とが同じ場合は、光量Ｑ_Bを基準の光量にすれば良い。一方、光量Ｑ_Bを測定する領域の面積と所定の領域の面積とが異なる場合、両者の面積比と光量Ｑ_Bとから基準の光量を求めれば良い。

また、設定した基準の光量を記憶しておいても良い。

本実施形態の合焦方法によれば、標本を顕微鏡に装着しなくても基準の光量を設定できるので、基準の光量の設定が簡単に行える。

また、本実施形態の合焦方法は、装着するステップよりも後に、基準の光量を設定するステップを有することが好ましい。

本実施形態の合焦方法によれば、標本の観察と同じ条件で基準の光量の設定ができるので、基準の光量の精度を高めることができる。

また、本実施形態の合焦方法では、設定するステップは、照明光学系から出射した光を観察光学系に入射させ、実視野内の標本が存在しない領域における光量を測定するステップを有し、測定した光量に基づいて基準の光量を設定することが好ましい。

本実施形態の合焦方法を、図１７を用いて説明する。図１７は第３実施形態の合焦方法のフローチャートを示す図である。第１実施形態と同じステップについては同じ番号を付し、説明は省略する。本実施形態の合焦方法はステップＳ５０を有する。ステップＳ５０は、ステップＳ５１を有し、ステップＳ５１で測定した光量に基づいて基準の光量を設定する。

ステップＳ５１は、光量Ｑ_Cを測定するステップである。ステップＳ５１では、受光素子を用いて光量Ｑ_Cの測定が行われる。光量Ｑ_Cの測定は、照明光学系から出射した光を観察光学系に入射させて行う。ここで、ステップＳ５１はステップＳ２０の後に実行される。ステップＳ２０では標本を顕微鏡に装着するので、光量Ｑ_Cの測定は、照明光学系と観察光学系との間に標本が存在する状態で行われる。また、ステップＳ５１では、実視野内の標本が存在しない領域における光量を測定する。

例えば図３（ａ）に示すように、生細胞１の周囲には培養液５のみが存在している。この場合、実視野内には、生細胞１が存在する領域と、生細胞１が存在しない領域とが存在する。生細胞１が存在しない領域は、培養液５のみが存在する領域である。以下、培養液のみが存在する領域を、単に「液体領域」という。

液体領域では、照明光学系と観察光学系との間に培養液５のみが存在している。ここで、培養液５と空気は屈折率が異なるだけなので、照明光学系と観察光学系との間に培養液５のみが存在している状態は、実質的に、照明光学系と観察光学系との間に何も存在していない状態、すなわち未配置状態と同じである。

そのため、液体領域における光量Ｑ_Cは、未配置状態で測定した光量Ｑ_Bと実質的に同じになる。よって、液体領域における光量Ｑ_Cに基づいて基準の光量を設定することができる。なお、光量Ｑ_Cを測定する領域は、液体領域に限られない。標本が存在せず、未配置状態と実質的に同じ状態の領域であれば、この領域で光量Ｑ_Cを測定することができる。

なお、光量Ｑ_Cを測定する場合、測定する領域の数や面積は、光量Ｑ_Bの測定と同じようすることができる。

本実施形態の合焦方法によれば、標本の観察と同じ条件で基準の光量の設定ができるので、基準の光量の精度を高めることができる。

また、本実施形態の合焦方法は、処理ステップよりも前に、所定の領域を指定するステップを有することが好ましい。

本実施形態の合焦方法を、図１８を用いて説明する。図１８は第４実施形態の合焦方法のフローチャートである。第１実施形態と同じステップについては同じ番号を付し、説明は省略する。本実施形態の合焦方法は、ステップＳ３０よりも前に、ステップＳ６０を有する。ステップＳ６０は、所定の領域を指定するステップである。

本実施形態の合焦方法によれば、例えば、容易に、面頂を所定の領域に指定することができる。

また、本実施形態の合焦方法は、指定するステップでは、所定の領域を使用者が指定することが好ましい。

本実施形態の合焦方法によれば、所定の領域の設定を自由にすることができる。

また、本実施形態の合焦方法では、指定するステップは、検知するステップを有し、検知するステップは、標本と観察光学系との間隔を変化させながら、実視野内の複数の領域からの光を受光し、間隔と該間隔における光量とを、複数の領域の各々について記録し、光量が単調に変化する範囲を、複数の領域の各々について求め、複数の領域のうち、範囲が最も長い領域を検知することが好ましい。

本実施形態の合焦方法を、図１９を用いて説明する。図１９は第４実施形態におけるステップＳ６０のフローチャートを示す図である。ステップＳ６０はステップＳ６４を有する。なお、ステップＳ６４の前には、ステップＳ６１、ステップＳ６２及びステップＳ６３がある。

ステップＳ６４の実行に先立って、ステップＳ６１が実行される。ステップＳ６１は、複数の領域を設定するステップである。ステップＳ６１では、実視野内において複数の領域が設定されるが、実際には電子画像に対して領域の設定が行われる。

実視野の像は、観察光学系の像位置に形成される。この観察光学系の像位置には、受光素子が配置されている。よって、実視野の像は、受光素子によって電子画像に変換される。ここで、実視野の像の各点と電子画像の各画素とは、一対一で対応する。また、実視野の像は、実視野と共役である。よって、実視野の像の各点と実視野の各点も、一対一で対応する。その結果、電子画像の各画素と実視野の各点とが、一対一で対応する。

このように、電子画像の各画素と実視野の各点とが一対一で対応するので、電子画像に対して領域を設定することで、実視野において領域を設定することができる。

図２０は、電子画像に対して複数の領域を設定した様子を示す図である。図２０では、標本の電子画像に対して５つの領域、すなわち、領域Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５が設定されている。

ステップＳ６１は、ステップＳ２０の終了後に実行される。ここで、ステップＳ２０が終了した時点では、標本位置は焦点位置から大きくずれている。この場合、標本の像にはコントラストがほとんど生じていないので、電子画像のコントラストもほとんど無い。図２０では、領域と標本との位置関係を把握し易くするために、標本の様子がある程度把握できるような電子画像を用いている。

ステップＳ６１が終了すると、ステップＳ６２が実行される。ステップＳ６２は、記録回数ｎを設定するステップである。

記録回数ｎは、後述のステップＳ６６を実行する回数である。標本と対物レンズとの間隔、対物レンズの作動距離、測定時間等を考慮して設定すれば良い。

ステップＳ６２が終了すると、ステップＳ６３が実行される。ステップＳ６３は、現在の記録回数Ｎを初期化するステップである。ステップＳ６３では、初期値として１が設定される。

ステップＳ６３が終了すると、ステップＳ６４が実行される。ステップＳ６４は、ステップＳ６５と、ステップＳ６６と、ステップＳ６７と、ステップＳ６８と、ステップＳ６９と、ステップＳ７０と、ステップＳ７１と、を有する。

ステップＳ６４では、最初にステップＳ６５が実施される。ステップＳ６５は、複数の領域からの光を受光するステップである。ステップＳ３１で説明したように、複数の領域は、実視野内における複数の領域である。また、受光は、受光素子を用いて行われる。

受光素子としては、例えば、ＣＣＤやＣＭＯＳがある。ＣＣＤやＣＭＯＳの受光面では、微小な受光部が２次元に配列されている。ここで、電子画像は、受光素子によって取得されたものである。よって、電子画像における各画素と受光面における各受光部とは、一対一で対応する。

そのため、例えば、電子画像に対して領域Ｘ_EIを設定すると、領域Ｘ_EIに対応する受光領域Ｘ_PDが一義的に決まる。また、電子画像に対して領域Ｘ_EIを設定すると、実視野における領域Ｘ_FVが一義的に決まる。よって、受光領域Ｘ_PDは、実視野における領域Ｘ_FVからの光を受光することになる。

実視野において領域が複数設定されると、各々の領域に対して受光領域が一義的に決まる。よって、実視野内の複数の領域からの光を、個別に受光することができる。

ステップＳ６５が終了すると、ステップＳ６６が実行される。ステップＳ６６は、間隔ｄと光量Ｑ_Dとを記録するステップである。間隔ｄは、標本と観察光学系との間隔である。光量Ｑ_Dは、間隔ｄにおける光量である。また、記録は、複数の領域の各々について行われる。

ステップＳ６５では、複数の領域からの光を、各領域に対応した受光領域で受光している。よって、ステップＳ６６で記録する光量Ｑ_Dの数は、設定された領域の数と同じになる。図２０では、５つの領域が設定されている。この場合、ステップＳ６６では、５つの光量が個別に記録される。すなわち、領域Ｘ１からの光に基づく光量Ｑ_DX1、領域Ｘ２からの光に基づく光量Ｑ_DX2、領域Ｘ３からの光に基づく光量Ｑ_DX3、領域Ｘ４からの光に基づく光量Ｑ_DX4及び領域Ｘ５からの光に基づく光量Ｑ_DX5が、個別に記録される。

ステップＳ６６が終了すると、ステップＳ６７が実行される。ステップＳ６７は、ステップＳ６６の実施回数が予め設定した回数になったかを判断するステップである。この判断は、現在の記録回数Ｎが記録回数ｎと一致しているか否かで行う。

現在の記録回数Ｎと記録回数ｎとが一致しない場合、ステップＳ６８が実行される。ステップＳ６８は、間隔ｄを変化させるステップである。間隔ｄは、標本と観察光学系との間隔である。間隔ｄを変化させるために、あらかじめ設定された移動量で、標本と観察光学系とを相対的に移動させる。

ステップＳ６８が終了すると、ステップＳ６９が実行される。ステップＳ６９は、現在の記録回数を更新するステップである。

このように、ステップＳ６５〜Ｓ６９を実行することで、標本と観察光学系との間隔を変化させながら、実視野内の複数の領域からの光を受光し、間隔と該間隔における光量とを、複数の領域の各々について記録することができる。

現在の記録回数Ｎと記録回数ｎとが一致する場合、ステップＳ７０が実行される。ステップＳ７０は、光量Ｑ_Dが単調に変化する範囲Ｒ_Mを求めるステップである。範囲Ｒ_Mは、複数の領域の各々について求める。

図２１は、標本上の異なる２点での像の明るさの変化の違いを説明するための図であって、（ａ）は、焦点位置に対する標本位置のずれ量と像の明るさとの関係を示すグラフ、（ｂ）は異なる２点を示す図である。

図２１（ａ）において、実線は、図２０（ｂ）に示す位置Ｘ１での像の明るさの変化を示している。位置Ｘ１は、標本の面頂である。一方、破線は、図２０（ｂ）に示す位置Ｘ３での像の明るさの変化を示している。位置Ｘ３は、標本の面頂以外の部分である。

２本の線を比較すると、像の明るさが単調に変化する範囲は、実線の方が破線よりも長い。このように、面頂と面頂以外の部分とでは、像の明るさが単調に変化する範囲に違いが生じる。そこで、複数の測定領域の各々について、像の明るさが単調に変化する範囲を求める。

なお、標本に焦点を合わせるためには、所定の領域が標本の面頂を含んでいることが好ましい。しかしながら、ステップＳ２０が終了した時点では、標本位置は焦点位置からずれていることが多い。そのため、ステップＳ２０が終了した時点で、標本の面頂を所定の領域に設定することは難しい。

ただし、実視野内に標本は存在しているので、標本の面頂に対応する部分の光量を得ることはできる。上述のように、受光領域Ｘ_PDは、実視野における領域Ｘ_FVからの光を受光している。ここで、受光素子としてＣＣＤやＣＭＯＳを用いた場合、受光領域Ｘ_PDの最小は一つの受光部になる。そうすると、実視野内に標本が存在していれば、１つの受光部は標本の面頂からの光を受光することになる。

そこで、全ての受光部について、間隔ｄと光量Ｑ_Dとを記録し、各受光部について、明るさが単調に変化する範囲を求めれば良い。

ステップＳ７０が終了すると、ステップＳ７１が実行される。ステップＳ７１は、範囲Ｒ_Mが最も長い領域Ｘ_Lを検知するステップである。領域Ｘ_Lは、複数の領域の中から検知される。

ステップＳ７０では、光量Ｑ_Dが単調に変化する範囲Ｒ_Mが、複数の領域の各々について求まる。そこで、各領域における範囲Ｒ_Mを比較し、範囲Ｒ_Mが最も長い領域を領域Ｘ_Lにすれば良い。

なお、図２０では、領域の数は５であるがこれに限られない。また、領域の面積は各領域で同じでなくても良い。

また、標本の種類が予め分かっている場合、標本の大きさや観察光学系の結像倍率から、標本の像の大きさを大雑把に把握することができる。そうすると、ステップＳ３１における所定の領域の面積や、ステップＳ６１における複数の領域の面積を適切に設定することができる。

ここで、これらの領域の面積は、標本の面積の３０％以下であることが好ましい。また、これらの領域の面積は、標本の面積の２０％以下、更には、１０％以下であることが好ましい。

また、以上の説明では、受光領域Ｘ_PDを一つの受光部にしたが、これに限られない。受光領域Ｘ_PDを複数の受光部で構成すると、測定対象となる領域の数を減らすことができるので、処理時間の短縮ができる。また、測定対象となる領域における光量を増やすことができるのでＳ／Ｎが向上する。

本実施形態の合焦方法によれば、複数の領域のうち、範囲が最も長い領域を、容易に検知することができる。

また、本実施形態の合焦方法では、光量の変化が最も単調な領域を所定の領域に指定することが好ましい。

ステップＳ７１が終了すると領域Ｘ_Lが検知される。ここで、領域Ｘ_Lは光量の変化が最も単調な領域である。そこで、領域Ｘ_Lを所定の領域に指定すれば良い。

所定の領域が指定されるとステップＳ６０が終了し、ステップＳ３０が実行される。ステップＳ６０では、領域Ｘ_Lが所定の領域に指定されている。ここで、領域Ｘ_Lは、光量の変化が最も単調な領域である。そのため、領域Ｘ_L、すなわち所定の領域は、実視野内における標本の面頂の位置を示していることになる。

そこで、ステップＳ６０で指定した所定の領域に基づいて、ステップＳ３０が実行されることで、面頂と焦点位置とを一致させることができる。その結果、標本の表面に焦点を合わせることができる。

なお、ステップＳ３０では、ステップＳ３５で間隔ｄを変化させながら、ステップＳ３２で所定の領域における光量Ｑ_Aを求めている。一方、ステップＳ６４でも、ステップＳ６８で間隔ｄを変化させながら、ステップＳ６６で複数の領域について光量Ｑ_Dを記録している。

上述のように、複数の領域のうちの一つの領域が、所定の領域に指定される。よって、所定の領域に指定された領域Ｘ_Lの光量Ｑ_Dは、光量Ｑ_Aと見なすこともできる。ここで、領域Ｘ_Lの光量データは、間隔ｄを変化させながら記録した光量である。よって、この光量データには、基準の光量と一致する値、或いは基準の光量に近い値（以下、単に「基準値」という）が含まれている。そこで、光量データから基準値を抽出し、この基準値に対応する間隔ｄを求める。そして、その間隔ｄとなるように、標本と観察光学系との間隔を調整すれば良い。このようにすることで、標本の表面に焦点を合わせることができる。この場合、ステップＳ３０の実行を省略することができる。

本実施形態の合焦方法によれば、所定の領域を容易に、効率良く、指定することができる。また、所定の領域は、標本の面頂を含んでいるので、より確実に、標本の表面に焦点を合わせることができる。

また、本実施形態の合焦方法では、照明光の一部の領域は、観察光学系の瞳位置に投影されていることが好ましい。

図８（ａ）に示すように、瞳位置Ｐ_conの位置で照明光の一部の領域が遮光される。瞳位置Ｐ_conと瞳位置Ｐ_obは共役なので、遮光領域は瞳位置Ｐ_obに投影され、瞳位置Ｐ_obに遮光領域の像が形成される。瞳位置Ｐ_obでは、軸上光束と軸外光束とがほぼ重なっている。よって、全ての光束に対して、遮光率を略同じにすることができる。その結果、実視野の像の明るさを、中心と周辺で略同じにすることができる。

また、面頂位置が実視野の中心から外れていても、面頂像の明るさの変化は、面頂が実視野の中心に位置しているときと略同じになる。よって、面頂が実視野内のどこに位置していても、標本の表面に焦点を合わせることができる。

また、本実施形態の合焦方法では、投影像は、観察光学系の瞳位置における照明光の一部の領域の像であって、投影像の大きさは、観察光学系の瞳の大きさよりも小さいことが好ましい。

上述のように、遮光領域の像は、遮光領域が投影されたときの像である。この投影像の大きさは、遮光領域の大きさと瞳投影倍率とで決まる。そこで、遮光領域の大きさや瞳投影倍率を適切に選択することで、投影像の大きさを、観察光学系の瞳の大きさよりも小さくする。

このようにすると、投影像の大きさが変化しても、投影像が観察光学系の瞳の外縁を越えてしまわないようにすることができる。よって、焦点位置に対する標本位置の変化に応じて、像の明るさが変化する。

また、本実施形態の合焦方法では、投影像は、観察光学系の瞳位置における照明光の一部の領域の像であって、投影像の面積は、観察光学系の瞳の面積の５０％以上であることことが好ましい。

上述のように、焦点位置に対して標本位置が変化すると、像の明るさが変化する。投影像の面積が観察光学系の瞳の面積の５０％以上だと、像の明るさの変化を大きくすることができる。特に、面頂像の明るさの変化を大きくすることができる。

投影像の面積が観察光学系の瞳の面積の５０％未満だと、投影像が小さくなりすぎる。そのため、焦点位置に対して標本位置を変化させても、像の明るさの変化が小さくなる。また、像の明るさの変化が小さくなるので、一致状態の検出精度が悪くなってしまう。その結果、標本の表面に高い精度で焦点を合わせることが困難になる。

なお、投影像は遮光領域の像なので、投影像が小さいと、透過領域が大きくなりすぎる。この場合も、焦点位置に対して標本位置を変化させても、像の明るさの変化が小さくなる。

なお、投影像の面積は、観察光学系の瞳の面積の７０％以上であることが好ましい。あるいは、投影像の面積は、観察光学系の瞳の面積の８５％以上であることが好ましい。

また、本実施形態の合焦方法では、照明光の一部の領域は、照明光学系の光軸を含むように形成されていることが好ましい。

図２２は、照明光の様子を示す図であって、（ａ）は第１の実施例を示す図、（ｂ）は第２の実施例を示す図、（ｃ）は第３の実施例を示す図、（ｄ）は第４の実施例を示す図、（ｅ）は第５の実施例を示す図、（ｆ）は第６の実施例を示す図である。なお、以下では、遮光について説明するが、減光については「遮光領域」を「減光領域」と読み替えれば良い。

第１の実施例では、図２２（ａ）に示すように、照明光４０は、遮光領域４０ａと透過領域４０ｂとに分けられる。遮光領域４０ａの形状は円である。遮光領域４０ａの中心４０ｃは、照明光学系の光軸と一致している。また、第２の実施例では、図２２（ｂ）に示すように、照明光４１は、遮光領域４１ａと透過領域４１ｂとに分けられる。遮光領域４１ａの形状は円である。遮光領域４１ａの中心４１ｃは、照明光学系の光軸と一致していない。

第３の実施例では、図２２（ｃ）に示すように、照明光４２は、遮光領域４２ａと透過領域４２ｂとに分けられる。遮光領域４２ａの形状は楕円である。遮光領域４２ａの中心４２ｃは、照明光学系の光軸と一致している。また、第４の実施例では、図２２（ｄ）に示すように、照明光４３は、遮光領域４３ａと透過領域４３ｂとに分けられる。遮光領域４３ａの形状は楕円である。遮光領域４３ａの中心４３ｃは、照明光学系の光軸と一致していない。

各実施例では、遮光領域が照明光学系の光軸を含むように形成されている。このようにすると、遮光領域は照明光束の中心部に位置する。観察光学系の瞳面では、投影像が観察光学系の瞳の中心部に位置する。この場合、投影像の大きさは、観察光学系の光軸を中心にして変化する。よって、変化量はどの方向にも略均等になる。

そうすると、投影像の一部が観察光学系の瞳の外縁を越えることを少なくすることができる。よって、焦点位置に対して標本位置が変化したときに、明確に像の明るさが変化する。また、全ての光束に対して、遮光率の変化の割合を略同じにすることができる。その結果、実視野の像の明るさを、中心と周辺とで略同じにすることができる。

なお、遮光領域の中心は、照明光学系の光軸と一致していることが好ましい。このようにすると、像の明るさの変化がより明確になると共に、実視野の像の明るさを中心と周辺とで更に同じにすることができる。

なお、本実施形態の合焦方法では、照明光の一部の領域は、照明光学系の光軸を含まないように形成されていても良い。

第５の実施例では、図２２（ｅ）に示すように、照明光４４は、遮光領域４４ａと透過領域４４ｂとに分けられる。遮光領域４４ａの形状は円である。遮光領域４４ａは、照明光学系の光軸を含んでいない。照明光学系の光軸は、遮光領域４４ａの外側に位置している。

また、第６の実施例では、図２２（ｆ）に示すように、照明光４５は、遮光領域４５ａと透過領域４５ｂとに分けられる。遮光領域４５ａの形状は半円である。遮光領域４５ａは、照明光学系の光軸を含んでいない。

また、本実施形態の合焦方法では、照明光の一部の領域の形状は、点対称な形状であることが好ましい。

図２２（ａ）、（ｂ）及び（ｅ）に示すように、遮光領域４０ａ、遮光領域４１ａ及び遮光領域４４ａの形状は、何れも円であるので、点対称な形状になっている。

このようにすることで、遮光領域を容易に形成できる。また、遮光領域が照明光学系の光軸を含むように形成されている場合、遮光領域の像は観察光学系の瞳を中心にして変化するので、変化量はどの方向にも略均等になる。よって、全ての光束に対して、遮光率の変化の割合を略同じにすることができる。その結果、実視野の像の明るさを、中心と周辺で略同じにすることができる。

また、本実施形態の合焦方法では、照明光学系はコンデンサレンズを有し、観察光学系は対物レンズを有し、以下の条件式（１Ａ）を満足することが好ましい。
０．６≦（Ｒ₀×β）／Ｒ_ob＜０．９９５ （１Ａ）
ここで、
Ｒ₀は、照明光学系の光軸から照明光の一部の領域の外縁までの長さ、
Ｒ_obは、対物レンズの瞳の半径、
βは、対物レンズの焦点距離をコンデンサレンズの焦点距離で割った値、
である。

図２３は、照明光の像と対物レンズの瞳との関係を示す図である。照明光は、コンデンサレンズと対物レンズとによって、観察光学系側に投影される。そして、例えば瞳位置Ｐ_obに、照明光の像３６が形成される。照明光の像３６は、遮光領域の像３６ａと透過領域の像３６ｂとに分けられる。図２３に示すように、対物レンズの瞳の外縁３７の内側に、遮光領域の像３６ａは形成されている。よって、Ｒ₀×β＜Ｒ_obになる。

条件式（１Ａ）を満足することで、焦点位置に対する標本位置の変化を、面頂像の明るさの変化として検出できる。その結果、無色透明で、位相が滑らかに変化している標本であっても、標本に焦点を合わせることができる。

条件式（１Ａ）の下限値を下回ると、遮光領域の像３６ａの面積が小さくなりすぎる。そのため、焦点位置に対して標本位置を変化させても、像の明るさの変化が小さくなる。また、像の明るさの変化が小さくなるので、一致状態の検出精度が悪くなってしまう。その結果、標本の表面に高い精度で焦点を合わせることが困難になる。

条件式（１Ａ）の上限値を上回ると、遮光領域の像３６ａの面積が大きくなりすぎる。そのため、遮光領域の像３６ａの大きさが変化したときに、遮光領域の像３６ａが観察光学系の瞳の外縁を越えやすくなる。

なお、条件式（１Ａ）に代えて、以下の条件式（１Ａ’）を満足すると良い。
０．７５≦（Ｒ₀×β）／Ｒ_ob＜０．９９ （１Ａ’）
さらに、条件式（１Ａ）に代えて、以下の条件式（１Ａ”）を満足するとなお良い。
０．８≦（Ｒ₀×β）／Ｒ_ob＜０．９８ （１Ａ”）

また、本実施形態の合焦方法では、第１の領域は、照明光の一部の領域であって、第１の領域よりも外側に、照明光を透過する領域を挟んで、照明光の一部を遮光又は減光する第２の領域が形成され、観察光学系の瞳の外縁よりも内側に、第１の領域の外縁の像が形成され、観察光学系の瞳の外縁よりも外側に、第２の領域の内縁の像が形成されることが好ましい。

図２４は、照明光の様子とその像を示す図であって、（ａ）は第７の実施例を示す図、（ｂ）は第８の実施例を示す図、（ｃ）は照明光の像を示す図である。

第７実施例では、図２４（ａ）に示すように、照明光５０は、第１の領域５０ａ１と、透過領域５０ｂと、第２の領域５０ａ２と、に分けられる。第１の領域５０ａ１は遮光領域であって、形状は円である。第２の領域５０ａ２は第１の領域５０ａ１とは別の遮光領域であって、形状は円環状である。

第２の領域５０ａ２は、透過領域５０ｂを挟んで、第１の領域５０ａ１よりも外側に形成されている。また、第１の領域５０ａ１は、コンデンサレンズの瞳の外縁３５よりも内側に形成されている。透過領域５０ｂは、コンデンサレンズの瞳の外縁３５を含むように形成されている。第２の領域５０ａ２は、コンデンサレンズの瞳の外縁３５よりも外側に形成されている。

第８実施例では、図２４（ｂ）に示すように、照明光５１は、第１の領域５１ａ１と、透過領域５１ｂと、第２の領域５１ａ２と、接続領域５１ａ３と、に分けられる。第１の領域５１ａ１は遮光領域であって、形状は円である。第２の領域５１ａ２は第１の領域５１ａ１とは別の遮光領域であって、形状は円環状である。第１の領域５１ａ１は、透過領域５１ｂを挟んで、第１の領域５１ａ１よりも外側に形成されている。また、第１の領域５１ａ１と第２の領域５１ａ２との間には、接続領域５１ａ３が形成されている。

第２の領域５１ａ２は、透過領域５１ｂを挟んで、第１の領域５１ａ１よりも外側に形成されている。また、第１の領域５１ａ１は、コンデンサレンズの瞳の外縁３５よりも内側に形成されている。透過領域５１ｂは、コンデンサレンズの瞳の外縁３５を含むように形成されている。第２の領域５１ａ２は、コンデンサレンズの瞳の外縁３５よりも外側に形成されている。

照明光の像について説明する。照明光５０は、コンデンサレンズと対物レンズによって観察光学系側に投影される。そして、図２４（ｃ）に示すように、例えば瞳位置Ｐ_obに、照明光の像６０が形成される。

観察光学系の瞳の外縁３７よりも内側に、第１の領域の像６０ａ１が形成される。よって、第１の領域５０ａ１の外縁の像は、観察光学系の瞳の外縁３７の内側に形成される。また、観察光学系の瞳の外縁３７よりも外側に、第２の領域の像６０ａ２が形成される。よって、第２の領域５０ａ２の内縁の像は、観察光学系の瞳の外縁３７の外側に形成される。観察光学系の瞳は、例えば、対物レンズの瞳である。

また、透過領域の像６０ｂは、第１の領域の像６０ａ１と第２の領域の像６０ａ２との間に形成される。透過領域の像６０ｂは、観察光学系の瞳の外縁３７を含んでいる。

また、本実施形態の合焦方法では、照明光学系はコンデンサレンズを有し、観察光学系は対物レンズを有し、以下の条件式（２Ａ）を満足することが好ましい。
１．０１＜（Ｒ₁×β）／Ｒ_ob≦２ （２Ａ）
ここで、
Ｒ₁は、照明光学系の光軸から第２の領域の内縁までの長さ、
Ｒ_obは、対物レンズの瞳の半径、
βは、対物レンズの焦点距離をコンデンサレンズの焦点距離で割った値、
である。

上述のように、第２の領域の像６０ａ２は、対物レンズの瞳の外縁３７の外側に形成されている。よって、Ｒ₁×β＞Ｒ_obになる。条件式（２Ａ）を満足することで、焦点位置に対する標本位置の変化を、面頂像の明るさの変化として検出できる。その結果、無色透明で、位相が滑らかに変化している標本であっても、標本に焦点を合わせることができる。

条件式（２Ａ）の下限値を下回ると、第２の領域の像６０ａ２が、対物レンズの瞳の外縁３７よりも内側に位置する。そのため、焦点位置に対して標本位置を変化させても、像の明るさの変化が小さくなる。また、像の明るさの変化が小さくなるので、一致状態の検出精度が悪くなってしまう。その結果、標本の表面に高い精度で焦点を合わせることが困難になる。

条件式（２Ａ）の上限値を上回ると、透過領域の像６０ｂが大きくなるので、対物レンズの瞳を通過する光量のロスが多くなる。

なお、条件式（２Ａ）に代えて、以下の条件式（２Ａ’）を満足すると良い。
１．０２＜（Ｒ₁×β）／Ｒ_ob≦１．５ （２Ａ’）
さらに、条件式（２Ａ）に代えて、以下の条件式（２Ａ”）を満足するとなお良い。
１．０３＜（Ｒ₁×β）／Ｒ_ob≦１．３ （２Ａ”）

また、本実施形態の合焦方法では、照明光は、単波長の光又は狭帯域の光であることが好ましい。

このようにすると、照明光の波長域を狭くできるので、瞳の色収差の発生を抑制できる。そのため、標本像のコントラストを良くすることができる。

また、本実施形態の合焦方法では、観察光学系の瞳を通過する光束の面積を変化させることが好ましい。

このようにすることで、遮光領域の像に対して、対物レンズの瞳の大きさを変化させることができる。

また、本実施形態の合焦方法では、照明光の一部の領域の大きさを変化させることが好ましい。

このようにすることで、遮光領域の像の大きさや位置を変化させることができる。

また、本実施形態の計測方法は、底面にマーカーが設けられた保持容器で標本を保持し、上述の合焦方法を用いて、標本の表面に対して合焦を行うと共に、合焦したときの第１の合焦情報を取得し、コントラストの変化に基づいて合焦を行う合焦方法を用いて、マーカーに対して合焦を行うと共に、合焦したときの第２の合焦情報を取得し、第１の合焦情報と第２の合焦情報の差を取得することを特徴とする。

このようにすることで、保持容器の底面を基準にして標本の高さを定量的に把握することができる。

また、本実施形態の別の計測方法は、上述の合焦方法を用いて、標本の表面上の第１の位置に対して合焦を行うと共に、合焦したときの第１の合焦情報を取得し、上述の合焦方法を用いて、標本の表面上の第２の位置に対して合焦を行うと共に、合焦したときの第２の合焦情報を取得し、第１の合焦情報と第２の合焦情報の差を取得することを特徴とする。

このようにすると、実視野内に複数の標本が存在する場合、２つの標本の高さの差を定量的に把握することができる。

また、本実施形態の計測方法では、第１の合焦情報と第２の合焦情報は、標本位置、観察光学系の位置及び標本と観察光学系との間隔のいずれか一つであることことが好ましい。

また、本実施形態の計測方法では、観察光学系の光軸と直交する面内における距離を測定することが好ましい。

このようにすることで、標本に関する３次元の情報が得られる。そこで、例えば、標本の高さと、面内での標本の大きさとの比を評価値とすると、評価値の大きさから標本の膨らみ具合が分かる。この膨らみ具合は、標本の活性を表しているので、標本の評価方法に応用できる。

また、本実施形態の主点検出方法は、表面形状が曲面である標本の主点を、上述の合焦方法を用いて検出することを特徴とする。なお、表面形状は曲面であるほうがより好ましい。

本実施形態の合焦装置は、照明光学系と、観察光学系と、保持部材と、駆動装置と、受光素子と、処理装置と、を備え、照明光学系は、光源と、コンデンサレンズと、開口部材と、を有し、観察光学系は、対物レンズと、結像レンズと、を有し、保持部材は標本を保持すると共に、照明光学系と観察光学系との間に配置され、駆動装置は、保持部材と観察光学系との間隔を変化させ、受光素子は、観察光学系から出射した光を受光する位置に配置され、処理装置は、受光した光のうち、所定の領域からの光について光量を求める手段と、所定の領域における光量と基準の光量との差又は比を算出する手段と、算出結果と閾値とを比較する手段と、間隔の変化を制御する手段と、を有し、開口部材は、遮光部又は減光部と、透過部と、を有し、透過部の少なくとも一部は、遮光部又は減光部よりも外側に位置し、所定の領域は、標本の一部の領域であり、算出結果が閾値以下となったときに、処理装置における処理を終了することを特徴とする。

本実施形態の合焦装置について、図２６を用いて説明する。図２６は第１実施形態の合焦装置の構成を示す図である。以下、遮光部を用いて説明するが、減光部についても技術的意義は同様である。

合焦装置２００は、例えば、正立型顕微鏡であって、照明光学系と観察光学系とを備える。照明光学系は、光源２０１と、コンデンサレンズ２０４と、開口部材２０５とを有する。なお、必要に応じて、照明光学系は、レンズ２０２やレンズ２０３を有する。一方、観察光学系は、対物レンズ２０８と結像レンズ２１０とを有する。

光源２０１から出射した光は、レンズ２０２とレンズ２０３を通過して、コンデンサレンズ２０４に到達する。コンデンサレンズ２０４には、開口部材２０５が設けられている。ここでは、コンデンサレンズ２０４と開口部材２０５とが、一体で構成されている。しかしながら、開口部材２０５とコンデンサレンズ２０４とを、それぞれ別体で構成しても良い。

開口部材２０５は、例えば、図７（ｃ）に示すように、遮光部３４ａと透過部３４ｂとを有する。開口部材２０５では、遮光部３４ａが照明光学系の光軸を含むように配置されている。また、遮光部３４ａの外縁は、照明光学系の光軸から所定の距離だけ離れた位置にある。よって、開口部材２０５に入射した照明光は、光束の中心が遮光部３４ａによって遮光される。これにより、照明光の一部の領域が遮光される。また、透過部３４ｂは、遮光部３４ａよりも外側に位置している。開口部材２０５では、透過部３４ｂの形状は円環状になっている。なお、開口部材２０５として、例えば、図２４（ａ）に示す開口部材５０を用いても良い。

以上のように、開口部材２０５は、遮光部３４ａと透過部３４ｂとを備えている。よって、開口部材２０５からは、照明光の一部の領域が遮光された照明光が出射する。より具体的には、円環状の照明光が、開口部材２０５から出射する。

開口部材２０５と光源２０１とは共役な関係になっている。よって、光源２０１から出射した照明光は、開口部材２０５の位置で集光する。すなわち、開口部材２０５の位置に光源２０１の像が形成される。

開口部材２０５から出射した照明光は、コンデンサレンズ２０４に入射する。ここで、開口部材２０５の位置は、コンデンサレンズ２０４の焦点位置（あるいは、コンデンサレンズ２０４の瞳位置）と一致している。そのため、コンデンサレンズ２０４から出射する照明光は、平行光になる。また、透過部の形状が円環状になっているので、照明光の形状も円環状になる。そのため、コンデンサレンズ２０４から出射する照明光は、観察光学系の光軸（照明光学系の光軸）と交差するように出射する。

コンデンサレンズ２０４から出射した照明光は、標本２０７に到達する。標本２０７は保持部材２０６上に載置されている。標本２０７は、例えば生細胞であって、無色透明で、表面の形状が滑らかになっている。

標本２０７を透過した光、すなわち、物体光は顕微鏡対物レンズ２０８（以下、適宜、「対物レンズ」という）に入射する。この対物レンズ２０８は、例えば、明視野観察用の顕微鏡対物レンズである。よって、対物レンズ２０８の光路中にはレンズが存在するだけで、位相板や変調板のように光の強度や位相を変化させる光学部材は存在していない。

対物レンズ２０８から出射した物体光は、結像レンズ２１０に入射する。そして、結像レンズ２１０を出射した物体光によって、像位置２１１に標本２０７の像が形成される。像位置２１１には、受光素子２１３が配置されている。受光素子２１３は、例えば、ＣＣＤやＣＭＯＳである。

受光素子２１３の出力信号は画像処理装置２１４に入力される。また、画像処理装置２１４には、駆動装置２１２が接続されている。駆動装置２１２は、例えばモータである。図２８では、駆動装置２１２は、保持部材２０６や対物レンズ２０８と分離しているが、実際には、駆動装置２１２は、保持部材２０６や対物レンズ２０８と機械的に接続している。なお、駆動装置２１２は、保持部材２０６と対物レンズ２０８のどちらか一方と機械的に接続していても良い。

駆動装置２１２は、画像処理装置２１４からの信号によって、保持部材２０６と対物レンズ２０８の少なくとも一方を、光軸に沿って移動させる。このようにすることで、保持部材２０６と観察光学系との間隔を変化させることができる。

図２６に示すように、標本２０７を透過した平行光は、対物レンズの瞳２０９に集光する。このように、対物レンズの瞳２０９と開口部材２０５とは共役な関係になっている。よって、対物レンズの瞳２０９の位置に開口部材２０５の像が形成される。

図２７は、画像処理装置２１４の構成を示す図であって、（ａ）は基本的な構成を示す図、（ｂ）は好ましい構成を示す図である。

図２７（ａ）に示すように、画像処理装置２１４は、光量を求める手段２２０と、差又は比を算出する手段２２１と、算出結果と閾値とを比較する手段２２２と、間隔を変化させる手段２２３と、を備える。

光量を求める手段２２０では、受光素子２１３で受光した光のうち、所定の領域からの光について光量を求める。差又は比を算出する手段２２１では、所定の領域における光量と基準の光量との差又は比を算出する。算出結果と閾値とを比較する手段２２２では、手段２２１で算出した差又は比と閾値とを比較する。間隔を変化させる手段２２３では、間隔の変化を制御する。具体的には、手段２２３では、標本と観察光学系との間隔を変化させるための指令を、駆動装置２１２に向けて出力する。

このように、画像処理装置２１４は手段２２０〜手段２２３を備えているので、図１５〜図１９に示すフローチャートに従って、処理を実行することができる。

本実施形態の合焦装置では、照明光の一部の領域が遮光されている。よって、焦点位置に対して面頂位置が変化すると像の明るさが変化する。そして、面頂位置と焦点位置とが一致した状態では、面頂像の明るさは、照明光学系と観察光学系との間に何も存在していない状態での像の各点での明るさと略同じになる。そこで、照明光学系と観察光学系との間に何も存在していない状態での像の明るさに基づいて、面頂と焦点位置とが一致した状態を検出することができる。このように、本実施形態の合焦装置によれば、標本が無色透明で位相が滑らかに変化している場合であっても、標本に焦点を合わせることができる。

また、本実施形態の合焦装置は、基準の光量を記憶する手段を有し、保持部材に標本を載置しない状態で、照明光学系から出射した光を観察光学系に入射させた光に基づいて、基準の光量を求めることが好ましい。

図２７（ｂ）に示すように、画像処理装置２１４は、基準の光量を記憶する手段２２４を備える。ステップＳ４０において基準の光量が設定されるので、設定された基準の光量を手段２２４に記憶させておけば良い。手段２２４に記憶された基準の光量は、ステップＳ３３で用いられる。このように、画像処理装置２１４は手段２２４を備えているので、図１６に示すフローチャートに従って、処理を実行することができる。

また、本実施形態の合焦装置は、基準の光量を記憶する手段を有し、保持部材に標本を載置した状態で、照明光学系から出射した光を観察光学系に入射させ、実視野内の標本が存在しない領域からの光に基づいて、基準の光量を求めることが好ましい。

図２７（ｂ）に示すように、画像処理装置２１４は、基準の光量を記憶する手段２２４を備える。ステップＳ５０において基準の光量が設定されるので、設定された基準の光量を手段２２４に記憶させておけば良い。手段２２４に記憶された基準の光量は、ステップＳ３３で用いられる。このように、画像処理装置２１４は手段２２４を備えているので、図１７に示すフローチャートに従って、処理を実行することができる。

また、本実施形態の合焦装置は、所定の領域を記憶する手段を有し、所定の領域は、使用者が指定することが好ましい。

図２７（ｂ）に示すように、画像処理装置２１４は、所定の領域を記憶する手段２２５を備える。使用者によって所定の領域が指定された場合、指定された所定の領域を、手段２２５に記憶させておけば良い。手段２２５に記憶された所定の領域は、ステップＳ３２で用いられる。このように、画像処理装置２１４は手段２２４を備えているので、図１８に示すフローチャートに従って、処理を実行することができる。

また、本実施形態の合焦装置は、所定の領域を検知する手段と、所定の領域を記憶する手段と、を有し、検知する手段は、間隔と該間隔における光量とを、複数の領域の各々について記録する手段と、光量が単調に変化する範囲を、複数の領域の各々について求める手段と、複数の領域のうち、範囲が最も長い領域を特定する手段と、を有することが好ましい。

図２７（ｂ）に示すように、画像処理装置２１４は、所定の領域を検知する手段２２７と、所定の領域を記憶する手段２２５を備える。また、所定の領域を検知する手段２２７は、間隔ｄと光量Ｑ_Dとを記録する手段２２８と、光量Ｑ_Dが単調に変化する範囲Ｒ_Mを求める手段２２９と、範囲Ｒ_Mが最も長い領域Ｘ_Lを検知する手段２３０と、を有する。

手段２２８における間隔ｄは、標本と観察光学系との間隔である。また、光量Ｑ_Dは、間隔ｄにおける光量である。また、記録は、複数の領域の各々について行う。手段２２９における範囲Ｒ_Mは、複数の領域の各々について求める。手段２３０における領域Ｘ_Lは、複数の領域の中から検知される。また、複数の領域の各々について記録を行うために、複数の領域を記憶する手段２２６を備えることが好ましい。

このように、画像処理装置２１４は、手段２２７〜手段２３０を備えているので、図１９におけるステップＳ６４を実行することができる。

また、本実施形態の合焦装置では、光量の変化が最も単調な領域が、所定の領域であることが好ましい。

手段２３０で領域Ｘ_Lが検知される。ここで、領域Ｘ_Lは光量の変化が最も単調な領域である。そこで、領域Ｘ_Lを所定の領域に指定すれば良い。

また、本実施形態の合焦装置では、開口部材は、対物レンズの瞳位置に投影されていることが好ましい。

図８（ａ）に示すように、瞳位置Ｐ_conの位置に開口部材３４を配置する。瞳位置Ｐ_conと瞳位置Ｐ_obは共役なので、開口部材３４は瞳位置Ｐ_obに投影され、瞳位置Ｐ_obに開口部材の像３６が形成される。瞳位置Ｐ_obでは、軸上光束と軸外光束とが略一致する。よって、全ての光束に対して、遮光率を略同じにすることができる。その結果、実視野の像の明るさを、中心と周辺で略同じにすることができる。

また、面頂位置が実視野の中心から外れていても、面頂像の明るさの変化は、面頂が実視野の中心に位置しているときと略同じになる。よって、面頂が実視野内のどこに位置していても、標本の表面に焦点を合わせることができる。

また、本実施形態の合焦装置では、遮光部又は減光部の像の大きさは、対物レンズの瞳の大きさよりも小さいことが好ましい。

上述のように、遮光部の像は、遮光部が投影されたときの像である。この投影像の大きさは、遮光部の大きさと瞳投影倍率とで決まる。そこで、遮光部の大きさや瞳投影倍率を適切に選択することで、投影像の大きさを、観察光学系の瞳の大きさよりも小さくする。

このようにすると、投影像の大きさが変化しても、投影像が観察光学系の瞳の外縁を越えてしまわないようにすることができる。よって、焦点位置に対する標本位置の変化に応じて、像の明るさが変化する。

また、本実施形態の合焦装置では、遮光部又は減光部の像の面積は、対物レンズの瞳の面積の５０％以上であることが好ましい。

上述のように、焦点位置に対して標本位置が変化すると、像の明るさが変化する。遮光部の面積が観察光学系の瞳の面積の５０％以上だと、像の明るさの変化を大きくすることができる。特に、面頂像の明るさの変化を大きくすることができる。

遮光部の面積が観察光学系の瞳の面積の５０％未満だと、遮光部の像が小さくなりすぎる。また、遮光部の像が小さいと、透過部の像が大きくなりすぎる。そのため、焦点位置に対して標本位置を変化させても、像の明るさの変化が小さくなる。また、像の明るさの変化が小さくなるので、一致状態の検出精度が悪くなってしまう。その結果、標本の表面に高い精度で焦点を合わせることが困難になる。

なお、遮光部の像の面積は、観察光学系の瞳の面積の７０％以上であることが好ましい。あるいは、遮光部の像の面積は、観察光学系の瞳の面積の８５％以上であることが好ましい。

また、本実施形態の合焦装置では、開口部材は、光部又は減光部が、照明光学系の光軸を含むように配置されていることが好ましい。

上述のように、図２２（ａ）〜（ｄ）は照明光の様子を示す図である。ここで、遮光領域を不透明な部材と見なすと、図２２（ａ）〜（ｄ）は不透明な部材の配置を示す図になる。なお、以下の説明では、「照明光」、「遮光領域」及び「透過領域」を、各々「開口部材」、「遮光部」及び「透過部」に置き換えている。

以下、開口部材を用いた例として図２２（ａ）〜（ｄ）の説明を行う。開口部材は遮光部を有し、この遮光部に不透明な部材が用いられている。また、以下では、遮光部について説明するが、減光部については「遮光部」を「減光部」に読み替えれば良い。

第１の実施例では、図２２（ａ）に示すように、開口部材４０は、遮光部４０ａと透過部４０ｂとを有する。遮光部４０ａは透過部４０ｂの内側に設けられている。ここで、透過部４０ｂは、コンデンサレンズの瞳の外縁３５を含むように設けられている。よって、遮光部４０ａは、コンデンサレンズの瞳の外縁３５よりも内側に位置する。

遮光部４０ａの形状は円形で、透過部４０ｂの形状は円環状である。遮光部４０ａは、照明光学系の光軸を含むように位置している。また、遮光部４０ａの中心４０ｃは、照明光学系の光軸と一致している。

第２の実施例では、図２２（ｂ）に示すように、開口部材４１は、遮光部４１ａと透過部４１ｂとを有する。遮光部４１ａは透過部４１ｂの内側に設けられている。ここで、透過部４１ｂは、コンデンサレンズの瞳の外縁３５を含むように設けられている。よって、遮光部４１ａは、コンデンサレンズの瞳の外縁３５よりも内側に位置する。

遮光部４１ａの形状は円形で、透過部４１ｂの形状は円環状である。遮光部４１ａは、照明光学系の光軸を含むように位置している。また、遮光部４１ａの中心４１ｃは、照明光学系の光軸と一致していない。

第３の実施例では、図２２（ｃ）に示すように、開口部材４２は、遮光部４２ａと透過部４２ｂとを有する。遮光部４２ａは透過部４２ｂの内側に設けられている。ここで、透過部４２ｂは、コンデンサレンズの瞳の外縁３５を含むように設けられている。よって、遮光部４２ａは、コンデンサレンズの瞳の外縁３５よりも内側に位置する。

遮光部４２ａの形状は楕円形で、透過部４２ｂの形状は環状である。遮光部４２ａは、照明光学系の光軸を含むように位置している。また、遮光部４２ａの中心４２ｃは、照明光学系の光軸と一致している。

第４の実施例では、図２２（ｄ）に示すように、開口部材４３は、遮光部４３ａと透過部４３ｂとを有する。遮光部４３ａは透過部４３ｂの内側に設けられている。ここで、透過部４３ｂは、コンデンサレンズの瞳の外縁３５を含むように設けられている。よって、遮光部４３ａは、コンデンサレンズの瞳の外縁３５よりも内側に位置する。

遮光部４３ａの形状は楕円形で、透過部４３ｂの形状は環状である。遮光部４３ａは、照明光学系の光軸を含むように位置している。また、遮光部４３ａの中心４３ｃは、照明光学系の光軸と一致していない。

各実施例の開口部材では、遮光部が照明光学系の光軸を含むように配置されている。このようにすると、遮光部は照明光束の中心部に位置する。観察光学系の瞳面では、遮光部の像が観察光学系の瞳の中心部に位置する。この場合、遮光部の像の大きさは、観察光学系の光軸を中心にして変化する。よって、変化量はどの方向にも略均等になる。

この場合、遮光部の像の一部が観察光学系の瞳の外縁を越えることを少なくすることができる。よって、焦点位置に対して標本位置が変化したときに、明確に像の明るさが変化する。また、全ての光束に対して、遮光率の変化の割合を略同じにすることができる。その結果、像の明るさを、中心と周辺とで略同じにすることができる。

なお、遮光部の中心は、照明光学系の光軸と一致していることが好ましい。このようにすると、像の明るさの変化がより明確になると共に、像の明るさを中心と周辺とで更に同じにすることができる。

なお、本実施形態の合焦装置では、遮光部又は減光部は、照明光学系の光軸を含まないように配置されていても良い。

図２２（ｅ）、（ｆ）は照明光の集光状態を示す図であるが、遮光された領域を不透明な部材と見なすと、図２２（ｅ）、（ｆ）は不透明な部材を示す図になる。以下、開口部材を用いた例として図２２（ｅ）、（ｆ）の説明を行う。開口部材は遮光部を有し、この遮光部に不透明な部材が用いられている。また、以下では、遮光部について説明するが、減光部についても同様である。

第５の実施例では、図２２（ｅ）に示すように、開口部材４４は、遮光部４４ａと透過部４４ｂとを有する。遮光部４４ａは透過部４４ｂの内側に設けられている。ここで、透過部４４ｂは、コンデンサレンズの瞳の外縁３５を含むように設けられている。よって、遮光部４４ａは、コンデンサレンズの瞳の外縁３５よりも内側に位置する。

遮光部４４ａの形状は円形で、透過部４４ｂの形状は環状である。遮光部４４ａは、照明光学系の光軸を含まないように位置している。照明光学系の光軸は、遮光部４４ａの外側に位置している。

第６の実施例では、図２２（ｆ）に示すように、開口部材４５は、遮光部４５ａと透過部４５ｂとを有する。遮光部４５ａは透過部４５ｂの内側に設けられている。ここで、透過部４５ｂは、コンデンサレンズの瞳の外縁３５を含むように設けられている。よって、遮光部４５ａは、コンデンサレンズの瞳の外縁３５よりも内側に位置する。

遮光部４５ａの形状は半円形で、透過部４５ｂの形状は環状である。遮光部４５ａは、照明光学系の光軸を含まないように位置している。

また、本実施形態の合焦装置では、遮光部又は減光部の形状は、点対称な形状であることが好ましい。

図２２（ａ）、（ｂ）及び（ｅ）に示すように、遮光部４０ａ、遮光部４１ａ及び遮光部４４ａの形状は、何れも円形であるので、点対称な形状になっている。

このようにすることで、遮光部を容易に形成できる。また、遮光部が照明光学系の光軸を含むように配置されている場合、遮光部の像は観察光学系の瞳を中心にして変化するので、変化量はどの方向にも略均等になる。よって、全ての光束に対して、遮光率の変化の割合を略同じにすることができる。その結果、実視野の像の明るさを、中心と周辺で略同じにすることができる。

また、本実施形態の合焦装置は、以下の条件式（１Ｂ）を満足することが好ましい。
０．６≦（Ｒ₀’×β）／Ｒ_ob＜０．９９５ （１Ｂ）
ここで、
Ｒ₀’は、照明光学系の光軸から遮光部又は減光部の外縁までの長さ、
Ｒ_obは、対物レンズの瞳の半径、
βは、対物レンズの焦点距離をコンデンサレンズの焦点距離で割った値、
である。

上述のように、図２３は、照明光の像と対物レンズの瞳との関係を示す図である。ここで、遮光領域を不透明な部材と見なすと、図２３は不透明な部材の像と対物レンズの瞳との関係を示す図になる。なお、以下の説明では、「照明光」、「遮光領域」及び「透過領域」を、各々「開口部材」、「遮光部」及び「透過部」に置き換えている。

以下、開口部材を用いた例として図２３の説明を行う。開口部材は遮光部を有し、この遮光部に不透明な部材が用いられている。

開口部材は、コンデンサレンズと対物レンズとによって、観察光学系側に投影される。そして、例えば瞳位置Ｐ_ob、開口部材の像３６が形成される。開口部材の像３６は、遮光部の像３６ａと透過部の像３６ｂとに分かれる。図２３に示すように、対物レンズの瞳の外縁３７の内側に、遮光部の像３６ａは形成されている。よって、Ｒ₀’×β＜Ｒ_obになる。

条件式（１Ｂ）の技術的意義は、条件式（１Ａ）の技術的意義と同じである。条件式（１Ａ）の説明における「遮光領域」を「遮光部」に読み替えて、技術的意義の解釈を行えば良い。

なお、条件式（１Ｂ）に代えて、以下の条件式（１Ｂ’）を満足すると良い。
０．７５≦（Ｒ₀’×β）／Ｒ_ob＜０．９９ （１Ｂ’）
さらに、条件式（１Ｂ）に代えて、以下の条件式（１Ｂ”）を満足するとなお良い。
０．８≦（Ｒ₀’×β）／Ｒ_ob＜０．９８ （１Ｂ”）

また、本実施形態の合焦装置では、透過部よりも外側に、別の遮光部又は減光部を更に有し、対物レンズの瞳の外縁よりも内側に、遮光部又は減光部の外縁の像が形成され、対物レンズの瞳の外縁よりも外側に、別の遮光部又は減光部の内縁の像が形成されることが好ましい。

上述のように、図２４は、照明光の様子とその像を示す図である。ここで、遮光領域を不透明な部材と見なすと、図２４は不透明な部材の配置とその像を示す図になる。なお、以下の説明では、「照明光」、「第１の領域」、「第２の領域」及び「透過領域」を、各々「開口部材」、「遮光部」及び「透過部」に置き換えている。

以下、開口部材を用いた例として図２４の説明を行う。開口部材は遮光部を有し、この遮光部に不透明な部材が用いられている。

第７実施例では、図２４（ａ）に示すように、開口部材５０は、遮光部５０ａ１と透過部５０ｂとを有する。更に、開口部材５０は遮光部５０ａ２を有する。遮光部５０ａ２は、遮光部５０ａ１とは別の遮光部である。

遮光部５０ａ１、遮光部５０ａ２及び透過部５０ｂは透明な部材、例えば、ガラス板や樹脂板で構成されている。遮光部５０ａ１と遮光部５０ａ２は、例えば、遮光塗料をガラス板上に塗布することで形成されている。一方、透過部５０ｂには何も塗布されていない。よって、透過部５０ｂはガラス板そのものである。

開口部材５０では、遮光部５０ａ１の形状は円で、遮光部５０ａ２の形状は円環状である。また、透過部５０ｂの形状は円環状になっている。これは、遮光部５０ａ２を保持する必要が無いからである。そのため、開口部材５０では、遮光部５０ａ１と遮光部５０ａ２との間に接続部は形成されていない。

遮光部５０ａ２は、透過部５０ｂを挟んで、遮光部５０ａ１よりも外側に位置している。また、遮光部５０ａ１は、コンデンサレンズの瞳の外縁３５よりも内側に位置している。透過部５０ｂは、コンデンサレンズの瞳の外縁３５を含むように位置している。遮光部５０ａ２は、コンデンサレンズの瞳の外縁３５よりも外側に位置している。

照明光は、遮光部５０ａ１と遮光部５０ａ２とによって遮光される。遮光部５０ａ１によって遮光された照明光の一部の領域が第１の領域である。また、遮光部５０ａ２よって遮光された照明光の一部の領域が第２の領域である。

第８実施例では、図２４（ｂ）に示すように、開口部材５１は、遮光部５１ａ１と透過部５１ｂとを有する。更に、開口部材５１は遮光部５１ａ２を有する。遮光部５１ａ２は、透過部５１ｂを挟んで、遮光部５１ａ１よりも外側に位置している。

遮光部５１ａ１と５１ａ２は不透明な部材、例えば、金属板で構成されている。透過部５１ｂは金属板に形成された空隙（孔）である。

開口部材５１では、遮光部５１ａ１を保持するために、遮光部５１ａ１と遮光部５１ａ２との間に接続部５１ａ３が３つ形成されている。そのため、透過部５１ｂは３つに分かれている。透過部５１ｂの各々形状は略扇状（離散的な輪帯形状）になっている。なお、接続部５１ａ３の数は３つに限定されない。

遮光部５１ａ２は、透過部５１ｂを挟んで、遮光部５１ａ１よりも外側に位置している。また、遮光部５１ａ１は、コンデンサレンズの瞳の外縁３５よりも内側に位置している。透過部５１ｂは、コンデンサレンズの瞳の外縁３５を含むように位置している。遮光部５１ａ２は、コンデンサレンズの瞳の外縁３５よりも外側に位置している。

照明光は、遮光部５１ａ１と遮光部５１ａ２とによって遮光される。遮光部５１ａ１によって遮光された照明光の一部の領域が第１の領域である。また、遮光部５１ａ２よって遮光された照明光の一部の領域が第２の領域である。

開口部材の像について説明する。開口部材５０は、コンデンサレンズと対物レンズによって観察光学系側に投影される。そして、図２４（ｃ）に示すように、例えば瞳位置Ｐ_obに、開口部材の像６０が形成される。以下の説明では、遮光部５０ａ１の像は第１の遮光部の像６０ａ１で、遮光部５０ａ２の像は第２の遮光部の像６０ａ２である。

観察光学系の瞳の外縁３７よりも内側に、第１の遮光部の像６０ａ１が形成される。よって、遮光部５０ａ１の外縁の像は、観察光学系の瞳の外縁３７の内側に形成される。また、観察光学系の瞳の外縁３７よりも外側に、第２の遮光部の像６０ａ２が形成される。よって、遮光部５０ａ２の内縁の像は、観察光学系の瞳の外縁３７の外側に形成される。観察光学系の瞳は、例えば、対物レンズの瞳である。

また、透過部の像６０ｂは、第１の遮光部の像６０ａ１と第２の遮光部の像６０ａ２との間に形成される。透過領部の像６０ｂは、観察光学系の瞳の外縁３７を含んでいる。

また、本実施形態の合焦装置では、以下の条件式（２Ｂ）を満足することが好ましい。
１．０１＜（Ｒ₁’×β）／Ｒ_ob≦２ （２Ｂ）
ここで、
Ｒ₁’は、照明光学系の光軸から別の遮光部又は減光部の内縁までの長さ、
Ｒ_obは、対物レンズの瞳の半径、
βは、対物レンズの焦点距離をコンデンサレンズの焦点距離で割った値、
である。

上述のように、第２の遮光部の像６０ａ２は、対物レンズの瞳の外縁３７の外側に形成されている。第２の遮光部の像６０ａ２は、別の遮光部の像である。よって、Ｒ₁’×β＞Ｒ_obになる。

条件式（２Ｂ）の技術的意義は、条件式（２Ａ）の技術的意義と同じである。条件式（２Ａ）の説明における「第２の領域」と「透過領域」を、各々「別の遮光部」と「透過部」に読み替えて、技術的意義の解釈を行えば良い。

なお、条件式（２Ｂ）に代えて、以下の条件式（２Ｂ’）を満足すると良い。
１．０２＜（Ｒ₁×β）／Ｒ_ob≦１．５ （２Ｂ’）
さらに、条件式（２Ｂ）に代えて、以下の条件式（２Ｂ”）を満足するとなお良い。
１．０３＜（Ｒ₁×β）／Ｒ_ob≦１．３ （２Ｂ”）

図２５は、焦点位置に対する生細胞の面頂位置と開口部材の像の大きさとの関係を示す図であって、（ａ）は第１の状態を示す図、（ｂ）は第２の状態を示す図、（ｃ）は第３の状態を示す図である。ここでは、図２４（ｃ）に示す開口部材の像６０の様子が示されている。

図２５では、瞳位置Ｐ_obの位置に、開口部材の像６０が形成されている。開口部材の像６０以外は、図１０と同じなので、詳細な説明は省略する。

第１の状態、第２の状態及び第３の状態のいずれにおいても、瞳位置Ｐ_obには、開口部材の像６０が形成される。図２５（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）に示すように、開口部材の像６０は、第１の遮光部の像６０ａ１、第２の遮光部の像６０ａ２及び透過部の像６０ｂに分かれる。

また、何れの状態においても、透過部の像６０ｂは、対物レンズの瞳の外縁３７を含むように形成されている。一方、第１の遮光部の像６０ａ１は、透過部の像６０ｂの内側に形成されている。よって、第１の遮光部の像６０ａ１は、対物レンズの瞳の外縁３７よりも内側に位置している。また、第１の遮光部の像６０ａ１の大きさは、対物レンズの瞳の大きさよりも小さい。

一方、第２の遮光部の像６０ａ２は、いずれの状態においても、対物レンズの瞳の外縁３７よりも外側に位置している。図２５（ｃ）に示すように、第３の状態では、開口部材の像６０の大きさは、他の状態に比べて小さくなる。

第１の遮光部の像６０ａ１が小さくなると、対物レンズの瞳内における透過部の像６０の領域が大きくなる。しかしならが、第２の遮光部の像６０ａ２が対物レンズの瞳の外縁３７よりも内側に位置すると、透過部の像６０ｂの領域を減少させてしまう。この場合、焦点位置に対して標本位置を変化させても、像の明るさの変化が小さくなる。よって、第２の遮光部の像６０ａ２は、常に、対物レンズの瞳の外縁３７よりも外側に位置するようにするのが好ましい。

図２５（ｃ）では、第１の遮光部の像６０ａ１の大きさを変化させて、対物レンズの瞳内における透過部の像６０ｂの領域の大きさを変化させている。しかしながら、第２の遮光部の像６０ａ２の大きさを変化させて、対物レンズの瞳内における透過部の像６０ｂの領域の大きさを変化させても良い。この場合、対物レンズの瞳内に第１の遮光部の像６０ａ１が形成されないようにする。

また、本実施形態の合焦装置では、遮光部又は減光部とコンデンサレンズの瞳位置とのずれの許容範囲は、コンデンサレンズの焦点距離の２０％以内であることが好ましい。

顕微鏡対物レンズはテレセントリック光学系である。そのため、コンデンサレンズもテレセントリック光学系になっている。従って、コンデンサレンズの瞳位置は、コンデンサレンズの前側焦点位置になる。ここで、上述のように、本実施形態の合焦装置では、コンデンサレンズの焦点位置（前側焦点位置）に開口部材を配置している。これにより、コンデンサレンズの瞳位置において、照明光の中心部を遮光している。しかしながら、照明光の中心部を遮光する位置は、厳密にコンデンサレンズの瞳位置である必要は無く、コンデンサレンズの瞳位置近傍であれば良い。

ここで、開口部材とコンデンサレンズの瞳位置とのずれ（光軸方向のずれ）が大きくなると、透過部の像も対物レンズの瞳からずれていく。例えば、開口部材がコンデンサレンズの瞳位置と一致している場合、遮光部の最も外側を通過する光線（以下、単に「光線Ｌin」という）は、対物レンズの瞳の内側に到達する。ところが、開口部材がコンデンサレンズの瞳位置からずれていくと、光線Ｌinは、対物レンズの瞳の内側から外側に向かうようになる。すなわち、遮光部の像が対物レンズの瞳からずれていく。

また、対物レンズを変えると、観察範囲が変化する。観察範囲が変化すると、光線Ｌinの光軸に対する角度も変化する。この角度が変化すると、対物レンズの瞳に到達する光線Ｌinの位置が変化する。すなわち、遮光部の像が対物レンズの瞳からずれていく。

この場合、焦点位置に対して標本位置が変化に伴って像の明るさが変化するが、像の明るさの変化の程度は、実視野の中心に比べて周辺の方が小さくなる。そのため、実視野の周辺では、標本の表面に高い精度で焦点を合わせることが困難になる。

そこで、開口部材とコンデンサレンズの瞳位置とのずれの許容範囲は、観察範囲の変化を考慮して設定することになる。本実施形態の合焦装置では、瞳位置近傍の範囲（許容範囲）は、コンデンサレンズの焦点距離の２０％以内であることが望ましい。この範囲であれば、標本の中心と周辺とで、陰影の発生方向や発生量の違いを小さくできる。なお、瞳位置近傍の範囲は、コンデンサレンズの焦点距離の１０％以内であればなお良い。

また、本実施形態の合焦装置では、開口部材とは別の開口部材を有し、開口部材と別の開口部材とを移動させる移動機構を有することが好ましい。

図２８は、第２実施形態の合焦装置の構成を示す図である。なお、図２６と同じ構成については同じ番号を付し、説明は省略する。

合焦装置３００は、開口部材２０５と開口部材３０４とを備えている。開口部材２０５と開口部材３０４は、移動機構３０５に保持されている。移動機構３０５としては、例えば、スライダーやターレットがある。移動機構３０５がスライダーの場合、開口部材２０５と開口部材３０４は、観察光学系の光軸と直交する方向に移動する。移動機構３０５がターレットの場合、開口部材２０５と開口部材３０４は、観察光学系の光軸と平行な軸を中心に回転する。

このようにすることで、遮光部の像の大きさや位置を変化させることができる。すなわち、開口部材を異なる開口部材に変更することで、Ｒ₀、Ｒ₀’、Ｒ₁及びＲ₁’を、自由に変化させることができる。そのため、標本に応じて、像の明るさの変化が最大となるようにすることができる。

さらに、位相差用対物レンズを使用する場合は以下の効果がある。照明開口に位相差観察用のリングスリットを用いれば位相差観察ができ、図７（ｃ）に示す開口部材を用いることで、本実施形態の合焦装置による合焦ができる。つまり、対物レンズを交換することなく、本実施形態の合焦装置による合焦と位相差観察とができる。なお、微分干渉観察やホフマンモジュレーションコントラスト観察などの方法でも、同様に対物レンズを交換することなく、本実施形態の合焦装置による合焦とこれらの観察ができる。

また、本実施形態の合焦装置では、観察光学系は開口部材を有し、開口部材は対物レンズの瞳位置、あるいは対物レンズの瞳位置と共役な位置に配置されていることが好ましい。

合焦装置３００では、対物レンズの瞳２０９の位置に、開口部材３０３が設けられている。なお、図２８では、見易さのために、対物レンズの瞳２０９の位置と開口部材３０３の位置を離して描いている。

このようにすることで、透過部の像に対して、対物レンズの瞳の大きさを変化させることができる。これにより、観察光学系の瞳を通過する光束の面積を変化させることができる。

また、ビネッティング（口径食）が生じると、標本の中心から出射して標本像の中心に到達する光束（以下、適宜、「軸上光束」という）と、標本の周辺から出射して標本像の周辺に到達する光束（以下、適宜、「軸外光束」という）とで、光束の大きさに違いが生じる。通常、ビネッティングが生じると、軸上光束の形状が円であるのに対して、軸外光束の形状は略楕円になる。

そのため、軸外光束において、対物レンズの瞳の外縁よりも内側に透過部の像が形成される、という状態が生じる。そうすると、焦点位置に対する面頂位置のずれ量と面頂像の明るさの関係は、実視野の中心と周辺とで異なる。

そこで、観察光学系に開口部材を配置することで、ビネッティングを小さくすることができる。このようにすると、軸外光束の形状を円にすることができる。そのため、軸外光束においても、開口部材よりも内側に遮光部の像が形成される。その結果、焦点位置に対する面頂位置のずれ量と面頂像の明るさの関係は、実視野の周辺においても中心と同じ関係になる。よって、実視野の中心から周辺にわたって明るさのむらがない標本像が得られる。

また、面頂位置が実視野の中心から外れていても、面頂像の明るさの変化は、面頂が実視野の中心に位置しているときと略同じになる。よって、面頂が実視野内のどこに位置していても、標本の表面に焦点を合わせることができる。

なお、ビネッティングの小さい対物レンズを用いても同様の効果が得られる。ビネッティングの小さい対物レンズでは、ビネッティングの大きい対物レンズに比べて、レンズの外径が大きいレンズが用いられる。この場合、軸外光束の径と軸上光束の径との差が、少なくなる。その結果、中心から周辺にわたって明るさのむらがない標本像が得られる。このようなことから、ビネッティングの小さい対物レンズを用いることが好ましい。

また、本実施形態の合焦装置では、光源は単色光源であるか、又は照明光学系は波長選択手段を有することが好ましい。

また、標本観察装置３００では、照明光学系の光路、例えば、光源２０１とレンズ２０２との間に波長選択素子３０２が挿脱可能になっていても良い。光源２０１が白色光の場合、波長範囲の広い光が光源２０１から出射する。そこで、波長選択素子３０２を光路中に挿入することで、白色光よりも波長範囲の狭い光を照明光として取り出すことができる。なお、光源２０１を単色光源３０１にしても良い。

このようにすると、照明光の波長域を狭くできるので、瞳の色収差の発生を抑制できる。そのため、標本像のコントラストを良くすることができる。

また、使用目的に応じて照明光の波長の切り替えが可能になる。例えば、照明光の波長を短波長にすると、標本面（レンズ面）の屈折力が大きくなる。この場合、焦点位置に対して標本位置が変化したときに、像の明るさが変化するが、その変化量が大きくなる。その結果、標本の表面に高い精度で焦点を合わせることが困難になる。

一方、照明光の波長を長波長にすると、例えば細胞内部での光の散乱を抑制できる。所定の領域における光量をより正確に求めることができる。その結果、標本の表面に高い精度で焦点を合わせることが困難になる。

図２９は、第３実施形態の合焦装置の構成を示す図である。合焦装置４００は、本体部４１０と、照明光学系４２０と、観察光学系４３０と、撮像装置４４０と、画像処理装置４５０と、を備える。

本体部４１０は、光源４１１と、ステージ４１２と、レボルバ４１３と、を備える。照明光学系４２０は、各種の光学フィルタ４２１と、視野絞り４２２と、ミラー４２３と、レンズ４２４と、開口部材４２５と、コンデンサレンズ４２６と、を備える。観察光学系４３０は、対物レンズ４３１と、結像レンズ４３３と、接眼レンズ４３４と、を備える。また、対物レンズ４３１の近傍には、対物レンズの瞳４３２が位置している。

本体部４１０には、光源４１１が接続されている。光源４１１を出射した照明光は、照明光学系４２０に入射してコンデンサレンズ４２６に到達する。ここで、開口部材４２５は、コンデンサレンズ４２６の瞳位置に配置されている。また、開口部材４２５には、例えば、図７（ｃ）に示した開口部材３４が用いられている。これにより、照明光の一部の領域が遮光される。

コンデンサレンズ４２６の上方には、ステージ４１２が配置されている。また、ステージ４１２上に標本４６０が載置されている。更に、ステージ４１２の上方にはレボルバ４１３が位置し、レボルバ４１３に対物レンズ４３１が保持されている。

コンデンサレンズ４２６から出射した照明光は、標本４６０に照射される。標本４６０からの光は、対物レンズ４３１に入射する。ここで、対物レンズの瞳４３２と開口部材４２５は共役な関係になっている。よって、対物レンズの瞳４３２の位置に、開口部材４２５の像が形成される。

対物レンズ４３１を出射した結像光は、結像レンズ４３３によって集光され、集光位置に標本４６０の像が形成される。合焦装置４００では、結像レンズ４３３に続いてプリズムが配置されている。このプリズムによって、結像光の一部は接眼レンズ４３４側に反射される。その結果、接眼レンズ４３４の近傍に、標本の光学像４３５が形成される。なお、接眼レンズ４３４による観察を行わない場合は、プリズムを光路外に移動させても良い。

一方、プリズムを通過した結像光は、撮像装置４４０に入射する。撮像装置４４０は撮像素子４４１を備えている。結像レンズ４３３によって、撮像素子４４１上に標本４６０の光学像が形成され、これにより標本４６０の光学像の撮像が行われる。なお、結像レンズ４３３と撮像素子４４１との間に、光学系を配置しても良い。この場合、結像レンズ４３３とこの光学系によって、撮像素子４４１上に標本４６０の光学像が形成される。

また、撮像装置４４０には、カメラコントローラ４４２と、ビデオボード４４３と、が接続されている。また、カメラコントローラ４４２とビデオボード４４３は、共に画像処理装置４５０に接続されている。

撮像の制御は、カメラコントローラ４４２によって行われる。また、カメラコントローラ４４２の制御は、画像処理装置４５０によって行われる。なお、カメラコントローラ４４２の制御を、他の機器、例えばコンピュータによって行っても良い。また、撮像装置４４０から出力された画像信号は、ビデオボード４４３を介して画像処理装置４５０に入力される。画像処理装置４５０では、様々な電気的な処理が行われる。処理結果は、表示装置４５１に表示される。

ステージ４１２は、移動機構に接続されている。移動機構によって、ステージ４１２は光軸方向に沿って移動する。駆動装置４７０は、移動機構を介してステージ４１２と機械的に接続されている。駆動装置４７０は、例えばモータである。駆動装置４７０によって移動機構を作動させることで、ステージ４１２を光軸方向に沿って移動させることができる。このようにすることで、ステージ４１２と対物レンズ４３１との間隔を変化させることができる。

なお、駆動装置４７０は画像処理装置４５０と接続されている。画像処理装置４５０には、間隔を変化させる手段２２３を有する。よって、手段２２３によって、駆動装置４７０を制御することができる。

画像処理装置４５０は手段２２０〜手段２２３を備えているので、図１５〜図１９に示すフローチャートに従って、処理を実行することができる。

本実施形態の合焦装置では、照明光の一部の領域が遮光されている。よって、焦点位置に対して面頂位置が変化すると像の明るさが変化する。そして、面頂位置と焦点位置とが一致した状態では、面頂像の明るさは、照明光学系と観察光学系との間に何も存在していない状態での像の各点での明るさと略同じになる。そこで、照明光学系と観察光学系との間に何も存在していない状態での像の明るさに基づいて、面頂と焦点位置とが一致した状態を検出することができる。このように、本実施形態の合焦装置によれば、標本が無色透明で位相が滑らかに変化している場合であっても、標本に焦点を合わせることができる。

また、本実施形態の計測装置は、底面にマーカーが設けられた保持容器で標本を保持し、上述の合焦装置を用いて、標本の表面に対して合焦を行うと共に、合焦したときの第１の合焦情報を取得する手段と、コントラストの変化に基づいて合焦を行う合焦装置を用いて、マーカーに対して合焦を行うと共に、合焦したときの第２の合焦情報を取得する手段と、を有し、第１の合焦情報と第２の合焦情報の差を取得することを特徴とする。

保持容器の底面の位置と標本の面頂とを検出できるので、保持容器の底面を基準にして標本の高さを定量的に把握することができる。

なお、平凸レンズでは、一方の主点は凸面の面頂と一致し、他方の主点は平面と一致している。よって、標本の形状が平凸レンズ状の場合、一方の主点は標本の表面（面頂）と一致し、他方の主点は標本の底面と一致している。

上述のように、本実施形態の合焦装置では、主点位置を検出することができる。そこで、標本と観察光学系との間隔を十分に広げた状態から、間隔を狭めていくと、最初に標本の底面の主点位置と焦点位置とが一致する。そして、続いて、標本の表面の主点位置と焦点位置とが一致する。このように、主点位置と焦点置が一致するときの間隔が、２つ得られる。よって、２つの間隔の差から、標本の高さを定量的に把握することができる。また、保持容器の底面にマーカーを設けなくても良い。

また、本実施形態の別の計測装置は、上述の合焦装置を用いて、標本の表面に対して合焦を行うと共に、合焦したときの第１の合焦情報を取得する手段と、上述の合焦装置を用いて、標本の表面上の第２の位置に対して合焦を行うと共に、合焦したときの第２の合焦情報を取得し、第１の合焦情報と第２の合焦情報の差を取得することを特徴とする。

受光素子として、例えばＣＣＤやＣＭＯＳを用いると、ひとつ一つの受光部が所定の領域になる。よって、実視野内に複数の標本が存在する場合、各標本における面頂位置を検出することができる。よって、２つの標本の高さの差を定量的に把握することができる。

また、本実施形態の計測装置では、第１の合焦情報と第２の合焦情報は、標本位置、観察光学系の位置及び標本と観察光学系との間隔のいずれか一つであることが好ましい。

また、本実施形態の計測装置は、観察光学系の光軸と直交する面内における距離を測定する手段を有することが好ましい。

このようにすることで、標本に関する３次元の情報が得られる。そこで、例えば、標本の高さと、面内での標本大きさとの比を評価値とすると、評価値の大きさから標本の膨らみ具合が分かる。この膨らみ具合は、標本の活性を表しているので、標本の評価方法に応用できる。

また、本実施形態の主点検出装置は、表面形状が曲面である標本の主点を、上述の合焦装置を用いて検出することを特徴とする。なお、表面形状は曲面であるほうがより好ましい。

なお、本発明は、その趣旨を逸脱しない範囲で様々な変形例をとることができる。例えば、図２６、図２８及び図２９では、正立型顕微鏡を用いて本発明の合焦装置を説明した。しかしながら、本発明の合焦装置は倒立型顕微鏡であっても良い。すなわち、本発明は倒立型顕微鏡にも適用できる。

以上のように、本発明は、無色透明で、位相が滑らかに変化している標本であっても、標本に標本に焦点を合わすことができる合焦方法及び合焦装置に適している。また、無色透明で、位相が滑らかに変化している標本であっても、標本の形状を測定できる計測方法及び計測装置に適している。また、無色透明で、表面の形状が滑らかになっている標本であっても、標本の主点位置を検出できる主点検出方法及び主点検出装置に適している。

１ 生細胞
２ 保持容器
３ コロニー
４ コロニーの凸部
５ 培養液
６ 対物レンズ
７ 平凸レンズ
２０、２０’、２０” 照明光学系
２１ 観察光学系
２２、３３ 光源
２３ コンデンサレンズ
２４、２５ レンズ
２６ 対物レンズ
２７ 結像レンズ
２８ 対物レンズの焦点位置
２９ 標本の像
３０ コンデンサレンズの瞳
３１ コンデンサレンズの瞳の像
３２ アキシコンプリズム
３２ａ 円錐面
３２ｂ 平面
３４ 開口部材
３４ａ 遮光領域、遮光部
３４ｂ 透過領域、透過部
３５ コンデンサレンズの瞳の外縁
３６ 開口部材の像、照明光の像
３６ａ 遮光領域の像、遮光部の像
３６ｂ 透過領域の像、透過部の像
３６ｂ１ 外側像
３６ｂ２ 内側像
３７ 対物レンズの瞳の外縁、観察光学系の瞳の外縁
３８ 位相標本（平凸レンズ）
３９ 位相標本（球レンズ）
４０、４１、４２、４３、４４、４５ 照明光、開口部材
４０ａ、４１ａ、４２ａ、４３ａ、４４ａ、４５ａ 遮光領域、遮光部
４０ｂ、４１ｂ、４２ｂ、４３ｂ、４４ｂ、４５ｂ 透過領域、透過部
４０ｃ、４１ｃ、４２ｃ、４３ｃ、４４ｃ、４５ｃ 遮光領域、遮光部の中心
５０、５１ 開口部材、照明光
５０ａ１、５１ａ１ 第１の領域（遮光領域）、遮光部
５０ａ２、５１ａ２ 第２の領域（別の遮光領域）、別の遮光部
５１ａ３ 接続領域、接続部
５０ｂ、５１ｂ 透過領域、透過部
６０ 開口部材の像、照明光の像
６０ａ１ 第１の領域の像、遮光部の像
６０ａ２ 第２の領域の像、別の遮光部の像
６０ｂ 透過領域の像、透過部の像
１００、１００’ 顕微鏡の光学系
２００、３００ 合焦装置
２０１、３０１ 光源
２０２、２０３ レンズ
２０４ コンデンサレンズ
２０５ 開口部材
２０６ 保持部材
２０７ 標本
２０８ 対物レンズ
２０９ 対物レンズの瞳
２１０ 結像レンズ
２１１ 像位置
２１２ 駆動装置
２１３ 受光素子
２１４ 画像処理装置
２２０ 光量を求める手段
２２１ 差又は比を算出する手段
２２２ 算出結果と閾値とを比較する手段
２２３ 間隔を変化させる手段
２２４ 基準の光量を記憶する手段
２２５ 所定の領域を記憶する手段
２２６ 複数の領域を記憶する手段
２２７ 所定の領域を検知する手段
２２８ 間隔ｄと光量Ｑ_Dとを記録する手段
２２９ 光量Ｑ_Dが単調に変化する範囲Ｒ_Mを求める手段
２３０ 範囲Ｒ_Mが最も長い領域Ｘ_Lを検知する手段
３０２ 波長選択素子
３０３ 開口部材（対物レンズ側）
３０４ 開口部材（コンデンサレンズ側）
３０５ 移動機構
４００ 合焦装置
４１０ 本体部
４１１ 光源
４１２ ステージ
４１３ レボルバ
４２０ 照明光学系
４２１ 光学フィルタ
４２２ 視野絞り
４２３ ミラー
４２４ レンズ
４２５ 開口部材
４２６ コンデンサレンズ
４３０ 観察光学系
４３１ 対物レンズ
４３２ 対物レンズの瞳
４３３ 結像レンズ
４３４ 接眼レンズ
４３５ 標本の光学像
４４０ 撮像装置
４４１ 撮像素子
４４２ カメラコントローラ
４４３ ビデオボード
４５０ 画像処理装置
４５１ 表示装置
４６０ 標本
４７０ 駆動装置
Ｒ₀ 照明光学系の光軸から照明光の一部の領域の外縁までの長さ
Ｒ₁ 照明光学系の光軸から第２の領域の内縁までの長さ
β 瞳投影倍率
Ｒ_ob 対物レンズの瞳の半径
Ｐ_ob 対物レンズの瞳位置
Ｐ_con コンデンサレンズの瞳位置
Ｈ、Ｈ’ 主点
Ｌ₁、Ｌ₂、Ｌ₃、Ｌ₄ レンズ
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３ 面頂位置
Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’ 球心位置
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５ 領域

Claims (48)

1. 照明光学系と観察光学系を有する顕微鏡を準備するステップと、
   表面形状が曲面である標本を前記顕微鏡に装着するステップと、
   所定の処理ステップと、を有し、
   前記所定の処理ステップは、
   前記観察光学系から出射した光を受光するステップと、
   前記受光した光のうち、所定の領域からの光に基づく光量を求めるステップと、
   前記所定の領域における光量と基準の光量との差又は比を算出するステップと、
   前記算出結果と閾値とを比較するステップと、
   前記標本と前記観察光学系との間隔を変化させるステップと、を有し、
   前記準備するステップでは、照明光の一部の領域が遮光又は減光されており、
   前記装着するステップでは、前記標本の表面形状が変形しない状態で、前記標本と前記観察光学系とが対向しており、
   前記所定の領域は、前記標本の一部の領域であり、
   前記算出結果が前記閾値以下となったときに、前記所定の処理ステップを終了することを特徴とする合焦方法。
2. 前記装着するステップよりも前に、前記基準の光量を設定するステップを有することを特徴とする請求項１に記載の合焦方法。
3. 前記設定するステップは、前記照明光学系から出射した光を前記観察光学系に入射させて光量を測定するステップを有し、
   測定した前記光量に基づいて前記基準の光量を設定することを特徴とする請求項２に記載の合焦方法。
4. 前記装着するステップよりも後に、前記基準の光量を設定するステップを有することを特徴とする請求項１に記載の合焦方法。
5. 前記設定するステップは、前記照明光学系から出射した光を前記観察光学系に入射させ、実視野内の前記標本が存在しない領域における光量を測定するステップを有し、
   測定した前記光量に基づいて前記基準の光量を設定することを特徴とする請求項４に記載の合焦方法。
6. 前記処理ステップよりも前に、前記所定の領域を指定するステップを有することを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の合焦方法。
7. 前記指定するステップでは、前記所定の領域を使用者が指定することを特徴とする請求項６に記載の合焦方法。
8. 前記指定するステップは、検知するステップを有し、
   前記検知するステップは、前記標本と前記観察光学系との間隔を変化させながら、実視野内の複数の領域からの光を受光し、
   前記間隔と前記間隔における光量とを、前記複数の領域の各々について記録し、
   前記光量が単調に変化する範囲を、前記複数の領域の各々について求め、
   前記複数の領域のうち、前記範囲が最も長い領域を検知することを特徴とする請求項６に記載の合焦方法。
9. 前記光量の変化が最も単調な領域を前記所定の領域に指定することを特徴とする請求項８に記載の合焦方法。
10. 前記照明光の一部の領域は、前記観察光学系の瞳位置に投影されていることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の合焦方法。
11. 投影像は、前記観察光学系の瞳位置における前記照明光の一部の領域の像であって、
    前記投影像の大きさは、前記観察光学系の瞳の大きさよりも小さいことを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の合焦方法。
12. 投影像は、前記観察光学系の瞳位置における前記照明光の一部の領域の像であって、
    前記投影像の面積は、前記観察光学系の瞳の面積の５０％以上であることを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の合焦方法。
13. 前記照明光の一部の領域は、前記照明光学系の光軸を含むように形成されていることを特徴とする請求項１から１２のいずれか一項に記載の合焦方法。
14. 前記照明光の一部の領域の形状は、点対称な形状であることを特徴とする請求項１から１３のいずれか一項に記載の合焦方法。
15. 前記照明光学系はコンデンサレンズを有し、
    前記観察光学系は対物レンズを有し、
    以下の条件式を満足することを特徴とする請求項１から１４のいずれか一項に記載の合焦方法。
    ０．６≦（Ｒ₀×β）／Ｒ_ob＜０．９９５
    ここで、
    Ｒ₀は、前記照明光学系の光軸から前記照明光の一部の領域の外縁までの長さ、
    Ｒ_obは、前記対物レンズの瞳の半径、
    βは、前記対物レンズの焦点距離を前記コンデンサレンズの焦点距離で割った値、
    である。
16. 第１の領域は、前記照明光の一部の領域であって、
    前記第１の領域よりも外側に、前記照明光を透過する領域を挟んで、前記照明光の一部を遮光又は減光する第２の領域が形成され、
    前記観察光学系の瞳の外縁よりも内側に、前記第１の領域の外縁の像が形成され、
    前記観察光学系の瞳の外縁よりも外側に、前記第２の領域の内縁の像が形成されることを特徴とする請求項１から１５のいずれか一項に記載の合焦方法。
17. 前記照明光学系はコンデンサレンズを有し、
    前記観察光学系は対物レンズを有し、
    以下の条件式を満足することを特徴とする請求項１６に記載の合焦方法。
    １．０１＜（Ｒ₁×β）／Ｒ_ob≦２
    ここで、
    Ｒ₁は、前記照明光学系の光軸から前記第２の領域の内縁までの長さ、
    Ｒ_obは、前記対物レンズの瞳の半径、
    βは、前記対物レンズの焦点距離を前記コンデンサレンズの焦点距離で割った値、
    である。
18. 前記照明光は、単波長の光又は狭帯域の光であることを特徴とする請求項１から１７のいずれか一項に記載の合焦方法。
19. 前記観察光学系の瞳を通過する光束の面積を変化させることを特徴とする請求項１から１８のいずれか一項に記載の合焦方法。
20. 前記照明光の一部の領域の大きさを変化させることを特徴とする請求項１から１９のいずれか一項に記載の合焦方法。
21. 底面にマーカーが設けられた保持容器で標本を保持し、
    請求項１から２０のいずれか一項に記載の合焦方法を用いて、前記標本の表面に対して合焦を行うと共に、合焦したときの第１の合焦情報を取得し、
    コントラストの変化に基づいて合焦を行う合焦方法を用いて、前記マーカーに対して合焦を行うと共に、合焦したときの第２の合焦情報を取得し、
    前記第１の合焦情報と前記第２の合焦情報の差を取得することを特徴とする計測方法。
22. 請求項１から２０のいずれか一項に記載の合焦方法を用いて、前記標本の表面上の第１の位置に対して合焦を行うと共に、合焦したときの第１の合焦情報を取得し、
    前記合焦方法を用いて、前記標本の表面上の第２の位置に対して合焦を行うと共に、合焦したときの第２の合焦情報を取得し、
    前記第１の合焦情報と前記第２の合焦情報の差を取得することを特徴とする計測方法。
23. 前記第１の合焦情報と前記第２の合焦情報は、前記標本位置、前記観察光学系の位置及び前記標本と前記観察光学系との間隔のいずれか一つであることを特徴とする請求項２１又は２２に記載の計測方法。
24. 前記観察光学系の光軸と直交する面内における距離を測定することを特徴とする請求項２１から２３のいずれか一項に記載の計測方法。
25. 表面形状が曲面である標本の主点を、請求項１から２０のいずれか一項に記載の合焦方法を用いて検出することを特徴とする主点検出方法。
26. 照明光学系と、観察光学系と、保持部材と、駆動装置と、受光素子と、処理装置と、を備え、
    前記照明光学系は、光源と、コンデンサレンズと、開口部材と、を有し、
    前記観察光学系は、対物レンズと、結像レンズと、を有し、
    前記保持部材は標本を保持すると共に、前記照明光学系と前記観察光学系との間に配置され、
    前記駆動装置は、前記保持部材と前記観察光学系との間隔を変化させ、
    前記受光素子は、前記観察光学系から出射した光を受光する位置に配置され、
    前記処理装置は、
    前記受光した光のうち、所定の領域からの光について光量を求める手段と、
    前記所定の領域における光量と基準の光量との差又は比を算出する手段と、
    前記算出結果と閾値とを比較する手段と、
    前記間隔の変化を制御する手段と、を有し、
    前記開口部材は、遮光部又は減光部と、透過部と、を有し、
    前記透過部の少なくとも一部は、前記遮光部又は前記減光部よりも外側に位置し、
    前記所定の領域は、前記標本の一部の領域であり、
    前記算出結果が前記閾値以下となったときに、前記処理装置における処理を終了することを特徴とする合焦装置。
27. 前記基準の光量を記憶する手段を有し、
    前記保持部材に前記標本を載置しない状態で、前記照明光学系から出射した光を前記観察光学系に入射させた光に基づいて、前記基準の光量を求めることを特徴とする請求項２６に記載の合焦装置。
28. 前記基準の光量を記憶する手段を有し、
    前記保持部材に前記標本を載置した状態で、前記照明光学系から出射した光を前記観察光学系に入射させ、実視野内の標本が存在しない領域からの光に基づいて、前記基準の光量を求めることを特徴とする請求項２６に記載の合焦装置。
29. 前記所定の領域を記憶する手段を有し、
    前記所定の領域は、使用者が指定することを特徴とする請求項２６から２８のいずれか一項に記載の合焦装置。
30. 前記所定の領域を検知する手段と、前記所定の領域を記憶する手段と、を有し、
    前記検知する手段は、
    前記間隔と前記間隔における光量とを、前記複数の領域の各々について記録する手段と、
    前記光量が単調に変化する範囲を、前記複数の領域の各々について求める手段と、
    前記複数の領域のうち、前記範囲が最も長い領域を特定する手段と、を有することを特徴とする請求項２６から２８のいずれか一項に記載の合焦装置。
31. 前記光量の変化が最も単調な領域が、前記所定の領域であることを特徴とする請求項３０に記載の合焦装置。
32. 前記開口部材は、前記対物レンズの瞳位置に投影されていることを特徴とする請求項２６から３１のいずれか一項に記載の合焦装置。
33. 前記遮光部又は前記減光部の像の大きさは、前記対物レンズの瞳の大きさよりも小さいことを特徴とする請求項２６から３２のいずれか一項に記載の合焦装置。
34. 前記遮光部又は前記減光部の像の面積は、前記対物レンズの瞳の面積の５０％以上であることを特徴とする請求項２６から３３のいずれか一項に記載の合焦装置。
35. 前記開口部材は、前記遮光部又は前記減光部が、前記照明光学系の光軸を含むように配置されていることを特徴とする請求項２６から３４のいずれか一項に記載の合焦装置。
36. 前記遮光部又は前記減光部の形状は、点対称な形状であることを特徴とする請求項２６から３５のいずれか一項に記載の合焦装置。
37. 以下の条件式を満足することを特徴とする請求項２６から３６のいずれか一項に記載の合焦装置。
    ０．６≦（Ｒ₀’×β）／Ｒ_ob＜０．９９５
    ここで、
    Ｒ₀’は、前記照明光学系の光軸から前記遮光部又は前記減光部の外縁までの長さ、
    Ｒ_obは、前記対物レンズの瞳の半径、
    βは、前記対物レンズの焦点距離を前記コンデンサレンズの焦点距離で割った値、
    である。
38. 前記透過部よりも外側に、別の遮光部又は減光部を更に有し、
    前記対物レンズの瞳の外縁よりも内側に、前記遮光部又は前記減光部の外縁の像が形成され、
    前記対物レンズの瞳の外縁よりも外側に、前記別の遮光部又は減光部の内縁の像が形成されることを特徴とする請求項２６から３７のいずれか一項に記載の合焦装置。
39. 以下の条件式を満足することを特徴とする請求項３８に記載の合焦装置。
    １．０１＜（Ｒ₁’×β）／Ｒ_ob≦２
    ここで、
    Ｒ₁’は、前記照明光学系の光軸から前記別の遮光部又は減光部の内縁までの長さ、
    Ｒ_obは、前記対物レンズの瞳の半径、
    βは、前記対物レンズの焦点距離を前記コンデンサレンズの焦点距離で割った値、
    である。
40. 前記遮光部又は前記減光部と前記コンデンサレンズの瞳位置とのずれの許容範囲は、前記コンデンサレンズの焦点距離の２０％以内であることを特徴とする請求項２６から３９のいずれか一項に記載の合焦装置。
41. 前記光源は単色光源であるか、又は前記照明光学系は波長選択手段を有することを特徴とする請求項２６から４０のいずれか一項に記載の合焦装置。
42. 前記観察光学系は開口部材を有し、
    前記開口部材は前記対物レンズの瞳位置、あるいは前記対物レンズの瞳位置と共役な位置に配置されていることを特徴とする請求項２６から４１のいずれか一項に記載の合焦装置。
43. 前記開口部材とは別の開口部材を有し、
    前記開口部材と前記別の開口部材とを移動させる移動機構を有することを特徴とする請求項２６から４２のいずれか一項に記載の合焦装置。
44. 底面にマーカーが設けられた保持容器で標本を保持し、
    請求項２６から４３のいずれか一項に記載の合焦装置を用いて、前記標本の表面に対して合焦を行うと共に、合焦したときの第１の合焦情報を取得する手段と、
    コントラストの変化に基づいて合焦を行う合焦装置を用いて、前記マーカーに対して合焦を行うと共に、合焦したときの第２の合焦情報を取得する手段と、を有し、
    前記第１の合焦情報と前記第２の合焦情報の差を取得することを特徴とする計測装置。
45. 請求項２６から４３のいずれか一項に記載の合焦装置を用いて、前記標本の表面に対して合焦を行うと共に、合焦したときの第１の合焦情報を取得する手段と、
    前記合焦装置を用いて、前記標本の表面上の第２の位置に対して合焦を行うと共に、合焦したときの第２の合焦情報を取得し、
    前記第１の合焦情報と前記第２の合焦情報の差を取得することを特徴とする計測装置。
46. 前記第１の合焦情報と前記第２の合焦情報は、前記標本位置、前記観察光学系の位置及び前記標本と前記観察光学系との間隔のいずれか一つであることを特徴とする請求項４４又は４５に記載の計測装置。
47. 前記観察光学系の光軸と直交する面内における距離を測定する手段を有することを特徴とする請求項４４から４６のいずれか一項に記載の計測装置
48. 表面形状が曲面である標本の主点を、請求項２６から４３のいずれか一項に記載の合焦装置を用いて検出することを特徴とする主点検出装置。