WO2020071499A1 - フォーカス位置評価装置、方法、及びプログラム - Google Patents

Abstract

フォーカス位置評価装置、方法、及びプログラムにおいて、フォーカス位置の評価の精度を向上させる。観察対象に対して観察域を走査し、各観察域を撮影する撮影装置のフォーカス位置を評価するフォーカス位置評価装置であって、少なくとも１つの走査方向において、異なるフォーカス位置毎に観察対象を撮影することによりフォーカス位置の評価の比較対象となる比較画像を複数取得する比較画像取得部と、撮影装置によって観察対象を撮影することにより取得された観察画像と、観察対象を撮影する際の走査方向に対応する走査方向の比較画像とを照合することにより、フォーカス位置を評価する評価部と、を含む。

Description

フォーカス位置評価装置、方法、及びプログラム

　本開示の技術は、フォーカス位置評価装置、方法、及びプログラムに関する。

　従来、ＥＳ（Embryonic Stem）細胞及びｉＰＳ（Induced Pluripotent Stem）細胞等の多能性幹細胞や分化誘導された細胞等を顕微鏡等で撮影し、その画像の特徴を捉えることで細胞の分化状態などを判定する方法が提案されている。そして、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞は、種々の組織の細胞に分化する能力を備えており、再生医療、薬の開発、病気の解明などにおいて応用が可能な細胞として注目されている。細胞を顕微鏡で撮影する際には、高倍率な広視野画像を取得するため、例えばウェルプレート等の培養容器の範囲内を結像光学系によって走査し、観察位置毎の画像を撮影した後、その観察位置毎の画像を結合する、いわゆるタイリング撮影を行うことが提案されている。

　しかしながら、培養容器として例えば複数のウェルを有するウェルプレートを使用する場合、各ウェルの底部の厚さは、製造上の誤差等に起因してウェル毎に異なる。そのため、ウェルプレート全体を結像光学系によって走査することによりタイリング撮影を行う場合には、観察対象を明瞭に撮影するために各観察位置についてフォーカス位置を調整するオートフォーカス制御を行なう必要がある。オートフォーカス制御を行なう場合、例えば観察対象が細胞のように高さや形状が安定しないものである場合には、顕微鏡で撮影する際に観察対象が変化したのか、顕微鏡の状態が変化したのかを判別するのが困難である。そこで、例えば特許文献１において、透過光に対して位相変化及び振幅変化の少なくとも一方を与えるマークを有する透光性部材により、撮影対象となる試料を固定し、試料の像とマークの像とが混在した撮像画像を取得し、この撮影画像について算出した評価値と、予め取得した試料の像を含まない基準画像について算出した評価値とに基づいて、フォーカス位置を評価する方法が提案されている。

　また、特許文献２には、例えば位相差光学系利用したオートフォーカス装置においては、デフォーカス量が大きくなり過ぎると、一組の位相差像から得られる位相差（視差）を特定するための局所領域が位相差像から逸脱してしまうため、位相差像における観測面がデフォーカス量の検出可能範囲内に収まっている必要があることが記載されている。特許文献２においては、デフォーカス量の検出可能範囲内に収まっているか否かを評価するために、異なるフォーカス位置において取得された基準画像（以下、比較画像ともいう）と、観察対象画像とを照会することによりフォーカス位置を評価する方法が開示されている。

特開２０１３－２５４１０８号公報 特開２０１２－０５８６６５号公報

　一方、フォーカス位置を安定して評価するためには、例えば球体を有する微細ビーズをマーカとして使用することが考えられる。しかしながら、撮影時に微細ビーズが静止している場合は、撮影画像において微細ビーズは円形状であるが、上記タイリング撮影をする場合には、微細ビーズが収容された容器及び撮影光学系の少なくとも一方を動かすため、撮影時に微細ビーズが動いた状態となり、微細ビーズ像の焦点の光像が流れてしまい、取得された撮影画像においては、微細ビーズは円形状ではなく、円形状の像が尾引きされた画像となってしまう。従って、単にフォーカス位置毎に微細ビーズを撮影して取得した撮影画像を比較画像として使用する場合には、タイリング撮影によって取得された撮影画像と比較画像とを照合することによりフォーカス位置を評価する際の評価の精度が低下してしまう可能性がある。

　本開示は上記事情に鑑みなされたものであり、フォーカス位置の評価の精度を向上させることを目的とする。

　本開示のフォーカス位置評価装置は、被写体が収容された容器が設置されるステージと容器内の被写体の像を結像させる結像光学系との少なくとも一方を走査方向に移動することで容器に対して観察域を走査し、各観察域を撮影する撮影装置のフォーカス位置を評価するフォーカス位置評価装置であって、

　容器に対して少なくとも１つの走査方向に観察域を走査し、撮影装置によって異なるフォーカス位置毎に被写体を撮影することによりフォーカス位置の評価の比較対象となる比較画像を複数取得する比較画像取得部と、

　容器に対して観察域を走査し、撮影装置によって被写体を撮影することにより取得された観察画像と、被写体を撮影する際の走査方向に対応する走査方向の前記比較画像とを照合することにより、フォーカス位置を評価する評価部と、

　を含む。

　また、本開示のフォーカス位置評価装置においては、比較画像取得部は、一走査方向及びこの一走査方向とは逆向きの走査方向の少なくとも一方において被写体を撮影することにより比較画像を複数取得することができる。

　また、本開示のフォーカス位置評価装置においては、比較画像取得部は、一走査方向において被写体を撮影することにより一走査方向の比較画像を複数取得し、かつ、取得した複数の一走査方向の比較画像の各々の画素位置を反転させることにより、一走査方向とは逆向きの走査方向の比較画像を複数取得することができる。

　本開示の他のフォーカス位置評価装置は、被写体が収容された容器が設置されるステージと容器内の被写体の像を結像させる結像光学系との少なくとも一方を走査方向に移動することで容器に対して観察域を走査し、各観察域を撮影する撮影装置のフォーカス位置を評価するフォーカス位置評価装置であって、

　観察域において、異なるフォーカス位置毎に被写体を撮影することにより複数の撮影画像を取得する画像取得部と、

　複数の撮影画像に基づいて、走査方向毎にフォーカス位置の評価の比較対象となる比較画像を生成し、生成された比較画像を複数取得する比較画像取得部と、

　撮影装置によって被写体を撮影することにより取得された観察画像と、被写体を撮影する際の走査方向に対応する走査方向の比較画像とを照合することにより、フォーカス位置を評価する評価部と、

　を含む。

　なお、本開示の上述したフォーカス位置評価装置においては、複数の比較画像は、異なる走査速度毎に取得されてもよい。

　また、本開示の上述したフォーカス位置評価装置においては、被写体がマーカであってもよい。

　また、本開示の上述したフォーカス位置評価装置においては、マーカが、細胞の微細構造を備えていてもよく、また、本開示の上述したフォーカス位置評価装置においては、マーカが、微細ビーズであってもよい。

　また、本開示の上述したフォーカス位置評価装置においては、被写体が、細胞であってもよい。

　また、本開示の上述したフォーカス位置評価装置においては、撮影装置が、顕微鏡装置であってもよい。

　本開示のフォーカス位置評価方法は、被写体が収容された容器が設置されるステージと容器内の被写体の像を結像させる結像光学系との少なくとも一方を走査方向に移動することで容器に対して観察域を走査し、各観察域を撮影する撮影装置のフォーカス位置を評価するフォーカス位置評価方法であって、

　容器に対して少なくとも１つの走査方向に観察域を走査し、撮影装置によって異なるフォーカス位置毎に被写体を撮影することによりフォーカス位置の評価の比較対象となる比較画像を複数取得し、

　容器に対して観察域を走査し、撮影装置によって被写体を撮影することにより取得された観察画像と、被写体を撮影する際の走査方向に対応する走査方向の前記比較画像とを照合することにより、フォーカス位置を評価する。

また、本開示の上述したフォーカス位置評価装置においては、比較画像取得部は、撮影画像から走査方向に基づく特徴を有する比較画像を作成してもよい。

　また、本開示の別のフォーカス位置評価方法は、被写体が収容された容器が設置されるステージと容器内の被写体の像を結像させる結像光学系との少なくとも一方を走査方向に移動することで容器に対して観察域を走査し、各観察域を撮影する撮影装置のフォーカス位置を評価するフォーカス位置評価方法であって、

　観察域において、異なるフォーカス位置毎に被写体を撮影することにより複数の撮影画像を取得し、

　複数の撮影画像に基づいて、走査方向毎にフォーカス位置の評価の比較対象となる比較画像を生成し、生成された比較画像を複数取得し、

　撮影装置によって被写体を撮影することにより取得された観察画像と、被写体を撮影する際の走査方向に対応する走査方向の比較画像とを照合することにより、フォーカス位置を評価する。

　なお、本開示によるフォーカス位置評価方法をコンピュータに実行させるためのプログラムとして提供してもよい。

　本開示による他のフォーカス位置評価装置は、被写体が収容された容器が設置されるステージと容器内の被写体の像を結像させる結像光学系との少なくとも一方を走査方向に移動することで容器に対して観察域を走査し、各観察域を撮影する撮影装置のフォーカス位置を評価するフォーカス位置評価装置であって、コンピュータに実行させるための命令を記憶するメモリと、

　記憶された命令を実行するよう構成されたプロセッサとを備え、プロセッサは、

　容器に対して少なくとも１つの走査方向に観察域を走査し、撮影装置によって異なるフォーカス位置毎に被写体を撮影することによりフォーカス位置の評価の比較対象となる比較画像を複数取得し、

　容器に対して観察域を走査し、撮影装置によって被写体を撮影することにより取得された観察画像と、被写体を撮影する際の走査方向に対応する走査方向の比較画像とを照合することにより、フォーカス位置を評価する処理を実行する。

　また、本開示によるさらに他のフォーカス位置評価装置は、被写体が収容された容器が設置されるステージと容器内の被写体の像を結像させる結像光学系との少なくとも一方を走査方向に移動することで容器に対して観察域を走査し、各観察域を撮影する撮影装置のフォーカス位置を評価するフォーカス位置評価装置であって、コンピュータに実行させるための命令を記憶するメモリと、

　記憶された命令を実行するよう構成されたプロセッサとを備え、プロセッサは、

　観察域に対して、異なるフォーカス位置毎に被写体を撮影することにより複数の撮影画像を取得し、

　複数の撮影画像に基づいて、走査方向毎にフォーカス位置の評価の比較対象となる比較画像を生成し、生成された比較画像を複数取得し、

　撮影装置によって被写体を撮影することにより取得された観察画像と、被写体を撮影する際の走査方向に対応する走査方向の前記比較画像とを照合することにより、フォーカス位置を評価する処理を実行する。

　本開示の一実施形態によれば、フォーカス位置の評価の精度を向上させることができる。

本開示の第１の実施形態のフォーカス位置評価装置を適用した顕微鏡撮影システムにおける顕微鏡装置の概略構成を示す模式図 結像光学系の構成を示す模式図 ステージの構成を示す斜視図 焦点距離変更光学系の構成を示す模式図 本開示の第１の実施形態のフォーカス位置評価装置を適用した顕微鏡観察システムの概略構成を示すブロック図 培養容器内における観察域の走査位置を示す図 判別器の学習に用いる教師用マーカ像を取得するためのマーカの撮影を説明するための図 教師用マーカ像の例を示す図 走査方向の異なる教師用マーカ像を示す図 図９の教師用マーカ像においてコントラストを強めた図 右方向から左方向へ走査させた場合の教師用マーカ像における中心の高さのプロファイル 左方向から右方向へ走査させた場合の教師用マーカ像における中心の高さのプロファイル フォーカス位置の判別結果を示す図 比較画像取得部において行われる処理を示すフローチャート 第１の実施形態において行われる処理を示すフローチャート 第２の実施形態において行われる処理を示すフローチャート オートフォーカス制御を説明するための図 本開示の第３の実施形態のフォーカス位置評価装置を適用した顕微鏡観察システムの概略構成を示すブロック図 パルス光源のプロファイルを示すグラフ

　以下、本発明の実施形態によるフォーカス位置評価装置、方法及びプログラムの一実施形態を適用した顕微鏡撮影システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、本開示の第１の実施形態のフォーカス位置評価装置を適用した顕微鏡撮影システムにおける顕微鏡装置の概略構成を示す模式図である。

　顕微鏡装置１０は、観察対象である培養された細胞の位相差画像を撮影する。具体的には、顕微鏡装置１０は、図１に示すように、白色光を出射する白色光源１１、コンデンサレンズ１２、スリット板１３、結像光学系１４、動作部１５、及び撮影部１６を備える。また、顕微鏡装置１０は、焦点距離変更光学系７０を備える。

　動作部１５は、第１の動作部１５Ａ、第２の動作部１５Ｂ、第３の動作部１５Ｃ、第４の動作部１５Ｄ、第５の動作部１５Ｅ、第６の動作部１５Ｆ及び第７の動作部１５Ｇを備える。第１～第７の動作部１５Ａ～１５Ｇの動作は後述する。

　スリット板１３は、白色光源１１から出射された白色光を遮光する遮光板に対して白色光を透過するリング形状のスリットが設けられたものであり、白色光がスリットを通過することによってリング状の照明光Ｌが形成される。

　結像光学系１４は、培養容器５０の範囲内を分割した観察域毎の位相差像を撮影部１６に結像する。図２は、結像光学系１４の詳細な構成を示す図である。図２に示すように、結像光学系１４は、位相差レンズ１４ａ及び結像レンズ１４ｄを備える。また、位相差レンズ１４ａは、対物レンズ１４ｂ及び位相板１４ｃを備える。位相板１４ｃは、照明光Ｌの波長に対して透明な透明板に対して位相リングを形成したものである。なお、上述したスリット板１３のスリットの大きさは、位相板１４ｃの位相リングと共役な関係にある。

　位相リングは、入射された光の位相を１／４波長ずらす位相膜と、入射された光を減光する減光フィルタとがリング状に形成されたものである。位相リングに入射された直接光は、位相リングを通過することによって位相が１／４波長ずれ、かつその明るさが弱められる。一方、観察対象によって回折された回折光は大部分が位相板１４ｃの透明板を通過し、その位相及び明るさは変化しない。

　対物レンズ１４ｂを有する位相差レンズ１４ａは、図１に示す動作部１５の第５の動作部１５Ｅによって、対物レンズ１４ｂの光軸方向に移動される。本実施形態においては、対物レンズ１４ｂの光軸方向とＺ方向（鉛直方向）とは同じ方向である。対物レンズ１４ｂのＺ方向への移動によってオートフォーカス制御が行われ、撮影部１６によって取得される位相差画像のコントラストが調整される。

　また、位相差レンズ１４ａの倍率を変更可能な構成としてもよい。具体的には、異なる倍率を有する位相差レンズ１４ａ又は結像光学系１４を交換可能に構成するようにしてもよい。位相差レンズ１４ａ又は結像光学系１４の交換は、自動的に行うようにしてもよいし、ユーザが手動で行うようにしてもよい。

　また、対物レンズ１４ｂは、焦点距離を変更可能な液体レンズからなる。なお、焦点距離を変更可能であれば、液体レンズに限定されるものではなく、液晶レンズ及び形状変形レンズ等、任意のレンズを用いることができる。対物レンズ１４ｂは、図１に示す動作部１５における第６の動作部１５Ｆによって、印加される電圧が変更されて、焦点距離が変更される。これにより、結像光学系１４の焦点距離が変更される。対物レンズ１４ｂの焦点距離の変更によってもオートフォーカス制御が行われ、撮影部１６によって取得される位相差画像のコントラストが調整される。

　結像レンズ１４ｄは、位相差レンズ１４ａを通過した位相差像が入射され、これを撮影部１６に結像する。本実施形態において、結像レンズ１４ｄは、焦点距離を変更可能な液体レンズからなる。なお、焦点距離を変更可能であれば、液体レンズに限定されるものではなく、液晶レンズ及び形状変形レンズ等、任意のレンズを用いることができる。結像レンズ１４ｄは、図１に示す動作部１５における第１の動作部１５Ａによって、印加する電圧が変更されて、焦点距離が変更される。これにより、結像光学系１４の焦点距離が変更される。結像レンズ１４ｄの焦点距離の変更によってオートフォーカス制御が行われ、撮影部１６によって取得される位相差画像のコントラストが調整される。

　また、結像レンズ１４ｄは、図１に示す動作部１５における第２の動作部１５Ｂによって結像レンズ１４ｄの光軸方向に移動される。なお、本実施形態においては、結像レンズ１４ｄの光軸方向とＺ方向（鉛直方向）とは同じ方向である。結像レンズ１４ｄのＺ方向への移動によってオートフォーカス制御が行われ、撮影部１６によって取得される位相差画像のコントラストが調整される。

　撮影部１６は、結像レンズ１４ｄによって結像された位相差画像を取得する。撮影部１６は、ＣＣＤ（Charge-Coupled Device）イメージセンサ又はＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサ等の撮像素子を備える。撮像素子は、ＲＧＢ（Red Green Blue）のカラーフィルタが設けられた撮像素子を用いてもよいし、モノクロの撮像素子を用いるようにしてもよい。

　また、撮影部１６は、図１に示す動作部１５における第３の動作部１５ＣによってＺ方向に移動される。なお、本実施形態においては、撮影部１６の撮像面に垂直な方向とＺ方向とは同じ方向である。撮影部１６のＺ方向への移動によってオートフォーカス制御が行われ、撮影部１６によって取得される位相差画像のコントラストが調整される。

　スリット板１３と結像光学系１４との間には、ステージ５１が設けられている。ステージ５１上には、観察対象である細胞が収容される培養容器５０が設置される。

　培養容器５０としては、観察対象を収容することができればどのような形態を有するものであってもよい。例えば、シャーレ、ディッシュ、フラスコ又はウェルプレート等のように、底部及び底部に連続する壁部を有する形態を有するものを容器として用いることができる。また、板状の部材に微細な流路が形成されたマイクロ流路デバイス等を容器として用いることもできる。さらに、スライドガラスのように、板状の形態を有するものも容器として用いることができる。また、培養容器５０に収容される細胞としては、ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞といった多能性幹細胞、幹細胞から分化誘導された神経、皮膚、心筋及び肝臓の細胞、並びに人体から取り出された皮膚、網膜、心筋、血球、神経及び臓器の細胞等がある。

　ステージ５１は、後述する水平方向駆動部１７（図５参照）によって互いに直交するＸ方向及びＹ方向に移動するものである。Ｘ方向及びＹ方向は、Ｚ方向に直交する方向であり、水平面内において互いに直交する方向である。本実施形態においては、Ｘ方向を主走査方向とし、Ｙ方向を副走査方向とする。

　図３は、ステージ５１の一例を示す図である。ステージ５１の中央には、矩形の開口５１ａが形成されている。この開口５１ａを形成する部材の上に培養容器５０が設置され、培養容器５０内の細胞の位相差画像が開口５１ａを通過するように構成されている。

　また、ステージ５１は、第４の動作部１５ＤによってＺ方向に移動され、これにより、培養容器５０がＺ方向に移動される。第４の動作部１５Ｄは、例えば圧電素子等のアクチュエータを備える。本実施形態においては、ステージ５１における培養容器５０が設置される面に垂直な方向とＺ方向とは同じ方向である。ステージ５１のＺ方向への移動によってもオートフォーカス制御が行われ、撮影部１６によって取得される位相差画像のコントラストが調整される。

　第１の動作部１５Ａ及び第６の動作部１５Ｆは、例えば電圧可変回路を備えたものである。第１の動作部１５Ａは、後述するフォーカス位置評価装置３０から出力された制御信号に基づいて、結像レンズ１４ｄに印加する電圧を変更する。第６の動作部１５Ｆは、後述するフォーカス位置評価装置３０から出力された制御信号に基づいて、対物レンズ１４ｂに印加する電圧を変更する。

　第２の動作部１５Ｂ、第３の動作部１５Ｃ、第４の動作部１５Ｄ及び第５の動作部１５Ｅは、例えば圧電素子等のアクチュエータを備えたものであり、後述するフォーカス位置評価装置３０から出力された制御信号に基づいて駆動する。なお、動作部１５は、位相差レンズ１４ａ及び結像レンズ１４ｄを通過した位相差像をそのまま通過させる構成となっている。また、第２の動作部１５Ｂ、第３の動作部１５Ｃ、第４の動作部１５Ｄ及び第５の動作部１５Ｅの構成は圧電素子に限らず、結像レンズ１４ｄ、撮影部１６、ステージ５１及び対物レンズ１４ｂ（位相差レンズ１４ａ）をＺ方向に移動可能なものであればよく、その他の公知な構成を用いることができる。

　図４は焦点距離変更光学系の構成を示す概略図である。図４に示すように、焦点距離変更光学系７０は、円形の第１のウェッジプリズム７１及び円形の第２のウェッジプリズム７２を備える。第７の動作部１５Ｇは、第１のウェッジプリズム７１及び第２のウェッジプリズム７２を、互いに反対方向に同期させて移動させる。これにより、結像光学系１４の焦点位置が変更される。焦点位置が変更されることは、焦点距離が長くなったり短くなったりすることと同義である。このため、結像光学系１４の焦点位置が変更されることにより、結像光学系の１４の焦点距離が変更される。本実施形態においては、結像光学系１４の焦点距離を変更することは、第１の動作部１５Ａにより結像レンズ１４ｄの焦点距離を変更すること、及び第６の動作部１５Ｆにより対物レンズ１４ｂの焦点距離を変更することのみならず、第７の動作部１５Ｇにより結像光学系１４の焦点位置を変更することにより、結像光学系１４の焦点距離を変更することも含む。

　第１及び第２のウェッジプリズム７１，７２は、光の入射面及び出射面となり得る２つの面が平行でない、すなわち一方の面に対して他方の面が傾斜しているプリズムである。なお、以降の説明においては、光軸に対して垂直に配置される面を直角面、光軸に対して傾斜して配置される面をウェッジ面と称する。ウェッジプリズム７１，７２は、直角面に垂直に入射した光を偏向させるプリズムである。第７の動作部１５Ｇは、例えば圧電素子等のアクチュエータを備え、後述するフォーカス位置評価装置３０から出力された制御信号に基づいて、第１のウェッジプリズム７１及び第２のウェッジプリズム７２を、直角面を平行に維持しつつ、互いに反対方向に同期させて移動させる。すなわち、第１のウェッジプリズム７１を図４における右方向に移動させる場合には、第２のウェッジプリズム７２を左方向に移動させる。逆に、第１のウェッジプリズム７１を図４における左方向に移動させる場合には、第２のウェッジプリズム７２を右方向に移動させる。このように、第１及び第２のウェッジプリズム７１，７２を移動させることにより、結像光学系１４から出射された光の光路長が変更され、これにより、結像光学系１４の焦点位置を変更して焦点距離を変更することができる。これにより、オートフォーカス制御が行われ、撮影部１６によって取得される位相差画像のコントラストが調整される。

　次に、顕微鏡装置１０を制御する顕微鏡制御装置２０の構成について説明する。図５は、第１の実施形態の顕微鏡観察システムの構成を示すブロック図である。なお、顕微鏡装置１０については、顕微鏡制御装置２０の各部により制御される一部の構成のブロック図を示している。

　顕微鏡制御装置２０は、顕微鏡装置１０全体を制御するものであり、第１の実施形態によるフォーカス位置評価装置３０、走査制御部２１及び表示制御部２２を備える。また、フォーカス位置評価装置３０は、比較画像取得部３１、判別器３２、フォーカス位置決定部３３、動作制御部３４及び判別器３２の学習部３５を備える。なお、判別器３２が本開示の評価部に対応し、顕微鏡装置１０が本開示の撮影装置に対応する。

　顕微鏡制御装置２０は、中央処理装置としてのＣＰＵ（Central Processing Unit）、半導体メモリ及びハードディスクドライブ等を備えたコンピュータから構成されるものであり、ハードディスクドライブに本開示のフォーカス位置評価プログラムの一実施形態及び顕微鏡制御プログラムがインストールされている。そして、このフォーカス位置評価プログラム及び顕微鏡制御プログラムがＣＰＵによって実行されることによって、図５に示す比較画像取得部３１、判別器３２、フォーカス位置決定部３３、動作制御部３４、学習部３５、走査制御部２１及び表示制御部２２が機能する。

　なお、本実施形態においては、ＣＰＵがフォーカス位置評価プログラム及び顕微鏡制御プログラムによって、各部の機能を実行するようにしたが、ソフトウェアを実行して各種の処理部として機能する汎用的なプロセッサとしては、ＣＰＵの他、ＦＰＧＡ (Field Programmable Gate Array)等の製造後に回路構成を変更可能なプロセッサであるプログラマブルロジックデバイス（Programmable Logic Device:ＰＬＤ）を用いることができる。また、ＡＳＩＣ（Application Specific Integrated Circuit）等の特定の処理を実行させるために専用に設計された回路構成を有するプロセッサである専用電気回路等により、各部の処理を実行するようにしてもよい。

　１つの処理部は、これら各種のプロセッサのうちの１つで構成されてもよいし、同種または異種の２つ以上のプロセッサの組み合わせ（例えば、複数のＦＰＧＡ、またはＣＰＵとＦＰＧＡの組み合わせ等）で構成されてもよい。また、複数の処理部を１つのプロセッサで構成してもよい。複数の処理部を１つのプロセッサで構成する例としては、第１に、クライアント及びサーバ等のコンピュータに代表されるように、１つ以上のＣＰＵとソフトウェアの組み合わせで１つのプロセッサを構成し、このプロセッサが複数の処理部として機能する形態がある。第２に、システムオンチップ（System On Chip:ＳｏＣ）等に代表されるように、複数の処理部を含むシステム全体の機能を１つのＩＣ（Integrated Circuit）チップで実現するプロセッサを使用する形態がある。このように、各種の処理部は、ハードウェア的な構造として、上記各種のプロセッサを１つ以上用いて構成される。

　さらに、これらの各種のプロセッサのハードウェア的な構造は、より具体的には、半導体素子等の回路素子を組み合わせた電気回路（Circuitry）である。

　走査制御部２１は、水平方向駆動部１７を駆動制御し、これによりステージ５１をＸ方向及びＹ方向に移動させて、培養容器５０をＸ方向及びＹ方向に移動させる。水平方向駆動部１７は、圧電素子等のアクチュエータから構成される。

　以下、走査制御部２１によるステージ５１の移動制御について、詳細に説明する。本実施形態においては、走査制御部２１による制御によってステージ５１をＸ方向及びＹ方向に移動させ、結像光学系１４の観察域を培養容器５０内において２次元状に移動して培養容器５０を走査し、各観察域を撮像して位相差画像を取得する。図６は、培養容器５０内における観察域による走査位置を実線Ｊで示した図である。なお、本実施形態においては、培養容器５０として６つのウェルＷを有するウェルプレートを用いる。

　図６に示すように、結像光学系１４の観察域は、走査開始点Ｓから走査終了点Ｅまで実線Ｊに沿って移動する。すなわち、観察域Ｒは、Ｘ方向の正方向（図６の右方向）に移動された後、Ｙ方向（図６の下方向）に移動し、逆の負方向（図６の左方向）に移動される。次いで、観察域Ｒは、再びＹ方向に移動し、再び正方向に移動される。このように、観察域ＲのＸ方向についての往復移動とＹ方向への移動を繰り返し行うことによって、培養容器５０は２次元状に走査される。

なお、本実施形態では、ステージ５１をＸ方向及びＹ方向に移動させ、結像光学系１４の観察域を培養容器５０内において２次元状に移動して培養容器５０を走査したが、これに限定されず、結像光学系１４をＸ方向及びＹ方向に移動させ、結像光学系１４の観察域を培養容器５０内において２次元状に移動して培養容器５０を走査するようにしてもよい。

　また、本実施形態においては、フォーカス位置を評価するために、位相差画像の取得に先立って、撮影部１６によりフォーカス位置を評価するための観察画像Ｇ０が取得され、フォーカス位置が評価され、フォーカス位置に基づいたオートフォーカス制御が行われ、その観察域Ｒが撮像されて位相差画像が取得される。位相差画像が取得されると、ステージ５１が移動し、次の観察域Ｒにおいてオートフォーカス制御が行われて位相差画像が取得される。この動作を繰り返すことにより、培養容器５０の全体を表す複数の位相差画像が取得され、複数の位相差画像を結合され合成位相差画像が生成される。

　ここで、本実施形態においては、オートフォーカス制御を行うためのフォーカス位置を評価するために、培養容器５０にはマーカ（被写体）が含まれる。本実施形態においてマーカは、培養容器５０内に投入された微細ビーズとする。微細ビーズは、例えば直径が１～２μｍのポリエステル等の樹脂製の球体からなる。なお、本開示においてマーカは微細ビーズに限られず、マーカとしては、例えば培養容器５０の表面に形成される加工時のパターン、及び培養容器５０に収容される観察対象である細胞の微細構造（例えば核小体）等を用いることができる。ここで、培養容器５０は樹脂材料の射出成形により製造され、その表面に金型表面に形成された金型の切削加工時のパターンが存在する。　

このような培養容器５０の表面に形成されたパターンをマーカとして用いることができる。また、核小体等の細胞の微細構造は球状をなしているため、このような細胞の微細構造をマーカとして用いることができる。

　比較画像取得部３１は、少なくとも１つの走査方向において、異なるフォーカス位置毎にマーカを顕微鏡装置１０に撮影させることにより、フォーカス位置の評価の比較対象となる比較画像を複数取得する。本実施形態においては、比較画像取得部３１は、結像光学系１４の観察域Ｒをマーカを収容した培養容器５０に対して１つの走査方向に走査し、観察画像を取得する。そして、比較画像取得部３１は、取得した観察画像からマーカ像を検出することで、フォーカス位置の評価の比較対象となる比較画像を取得する。本実施形態においては、観察画像は位相差画像であり、上述したマーカは、位相差画像において背景の画像と異なるコントラストにより表される。このため、比較画像取得部３１は、しきい値処理を行うことにより、観察画像からマーカ像を検出して比較画像を取得する。また、本実施形態においては、比較画像取得部３１は、撮影部１６が取得したフォーカス位置評価用の観察画像Ｇ０からマーカ像を取得する処理も行う。なお、比較画像およびフォーカス位置評価用の観察画像Ｇ０を取得するための具体的な撮影方法については後で詳細に説明する。

　判別器３２は、顕微鏡装置１０によってマーカＭを撮影することにより取得されたフォーカス位置評価用の観察画像Ｇ０から比較画像取得部３１により検出したマーカ像と、マーカＭを撮影する際の走査方向に対応する走査方向で予め撮影された観察画像から検出した比較画像としてのマーカ像とを照合することにより、フォーカス位置を評価する評価部として機能する。具体的には、判別器３２は、比較画像取得部３１が取得した比較画像としてのマーカ像を教師用マーカ像とし、この教師用マーカ像に関する特徴量を用いて学習がなされ、判別器３２に入力されたマーカ像のフォーカス位置を判別することにより、フォーカス位置を評価する。以下、比較画像を教師用マーカ像という。

　ここで、判別器３２の学習について説明する。判別器３２の学習は学習部３５が行う。図７は判別器３２の学習に用いる教師用マーカ像を取得するためのマーカの撮影を説明するための図である。なお、図７においては、微細ビーズをマーカとし、１つのマーカＭの撮影について説明する。図７に示すように、教師用マーカ像を取得するためには、顕微鏡装置１０が複数のフォーカス位置において、マーカＭの撮影を行う。すなわち、まず、ユーザは、結像光学系１４を調整し、マーカＭの位置Ｐ０に合焦させるようにフォーカス制御を行い、マーカＭに合焦した画像を取得する。この際、走査制御部２１による制御によってステージ５１を移動させることにより、図６に示すように、観察域ＲをＸ方向の正方向（図６の右方向）に移動させた場合と、観察域ＲをＸ方向の負方向（図６の左方向）に移動させた場合において、マーカＭの観察画像を取得する。

　同様にして、ユーザは、マーカＭの手前の位置Ｐ１及び位置Ｐ２に合焦させるようにフォーカス制御を行い、観察域ＲをＸ方向の正方向（図６の右方向）に移動させた場合と、観察域ＲをＸ方向の負方向（図６の左方向）に移動させた場合において、プラス方向にデフォーカスされた観察画像を取得する。また、マーカＭの後方の位置Ｐ３及び位置Ｐ４に合焦させるようにフォーカス制御を行い、観察域ＲをＸ方向の正方向（図６の右方向）に移動させた場合と、観察域ＲをＸ方向の負方向（図６の左方向）に移動させた場合において、マイナス方向にデフォーカスされた観察画像を取得する。なお、図７においては５つのフォーカス位置Ｐ０～Ｐ４によりマーカＭの撮影を行っているが、これに限定されるものではなく、より多くのフォーカス位置又はより少ないフォーカス位置おいてマーカＭの撮影を行うようにしてもよい。

　そして、比較画像取得部３１は、上述したように複数のフォーカス位置においてマーカＭを撮影することにより取得した観察画像からマーカを含む領域を検出し、教師用マーカ像を生成して取得する。図８は教師用マーカ像の例を示す図である。なお、図８においては、位置Ｐ０，Ｐ１，Ｐ２に合焦させることにより取得した観察画像から生成した教師用マーカ像Ｔ０ｌ，Ｔ１ｌ，Ｔ２ｌ，Ｔ０ｒ，Ｔ１ｒ，Ｔ２ｒを示す。

　本実施形態においては、マーカＭを撮影する際に、観察域ＲをＸ方向の正方向（図６の右方向）及びＸ方向の負方向（図６の左方向）に移動させている。そのため、各フォーカス位置において、走査方向が異なる２枚の教師用マーカ像が取得される。図９は、走査方向の異なる教師用マーカ像を示す図である。図９において、教師用マーカ像Ｔ０ｌは、観察域Ｒを図６の右方向から左方向すなわちＸ方向の負方向へ移動させた場合の観察画像から検出されたマーカ像、教師用マーカ像Ｔ０ｒは、観察域Ｒを図６の左方向から右方向すなわちＸ方向の正方向へ移動させた場合の観察画像から検出されたマーカ像である。

　図１０は図９の教師用マーカ像においてコントラストを強めた図である。図１０において、図９の教師用マーカ像Ｔ０ｌのコントラストを強めた画像を教師用マーカ像Ｔ０ｃｌとし、図９の教師用マーカ像Ｔ０ｒのコントラストを強めた画像を教師用マーカ像Ｔ０ｃｒとする。図１０に示すように、教師用マーカ像Ｔ０ｃｌは、中心付近のマーカとしての微細ビーズを表す円形状の白色領域（濃淡値が大きい領域）が、図１０中の矢印Ａで示す付近、すなわち円形状の白色領域の右側において、円形からはみ出した白色領域を有している。本開示においては、このはみ出した白色領域、つまり白色の像が尾引いた領域を尾引き領域という。また、教師用マーカ像Ｔ０ｃｒは、中心付近のマーカとしての微細ビーズを表す円形状の白色領域が、図１０中の矢印Ｂで示す付近、すなわち円形状の白色領域の左側において、尾引き領域を有している。

　図１１は右方向から左方向へ走査させた場合の教師用マーカ像Ｔ０ｌにおける中心の高さのプロファイル、図１２は左方向から右方向へ走査させた場合の教師用マーカ像Ｔ０ｒにおける中心の高さのプロファイルである。なお、図１１及び図１２は、それぞれ横軸が教師用マーカ像Ｔ０ｌ，Ｔ０ｒのDistance(pixels)を示し、縦軸がGray Value(濃淡値)を示す。縦軸のGray Valueは明るさを示す値である。なお、濃淡値は、値が大きい方がより白色を示す。

　図１１に示すように、右方向から左方向へ走査させた場合の教師用マーカ像Ｔ０ｌにおいては、図１１中矢印Ｃ１で示す左側の裾に比べて、矢印Ｃ２で示す右側の裾の方が、濃淡値が大きい。すなわち右側において、尾引きが生じている。また、図１２に示すように、左方向から右方向へ走査させた場合の教師用マーカ像Ｔ０ｒにおいては、図１２中矢印Ｄ１で示す左側の裾の方が、矢印Ｄ２で示す右側の裾と比べて、濃淡値が大きい。すなわち左側において、尾引きが生じている。

　以上のように、走査方向を異ならせて撮影した観察画像及び観察画像Ｇ０においては、尾引きが生じる位置や尾引きの方向が異なっている。そのため、走査せずに固定した位置において取得した観察画像から教師用マーカ像を取得した場合には、教師用マーカ像において尾引きが生じていないため、観察画像Ｇ０から検出したマーカ像と教師用マーカ像とを照合することにより、フォーカス位置を評価する際に、評価の精度が低下してしまう。そこで、本実施形態のように、左方向へ走査させた場合と右方向へ走査させた場合、すなわち走査方向を異ならせて撮影した観察画像を使用して教師用マーカ像を取得することにより、教師用マーカ像においても尾引きが生じた画像とすることができる。これにより、観察画像Ｇ０から検出したマーカ像と教師用マーカ像とを照合する場合に、走査方向が一致した画像を照合することができるので、フォーカス位置を評価する際の精度を向上させることができる。

　なお、教師用マーカ像は、それぞれのフォーカス位置において多数(例えば１０００個)用意する。

　また、本実施形態において、比較画像取得部３１は、左方向と右方向の走査方向において撮影を行い、教師用マーカ像を取得したが、本開示の技術はこれに限られない。例えば、図５において観察域ＲをＹ方向の正方向（図６の下方向）に移動させた場合について、教師用マーカ像を取得してもよい。

　また、例えば左方向のみ、及び左方向のみ等の一走査方向のみにおいて撮影を行ってもよい。この場合、比較画像取得部３１は、例えば一走査方向の教師用マーカ像を取得し、取得した教師用マーカ像の画素位置を反転させることにより、一走査方向とは逆向きの走査方向の教師用マーカ像を取得するようにしてもよい。なお、ここで「反転」は、教師用マーカ像の中心を通る直線を中心としてミラー反転させる処理、及び教師用マーカ像を１８０°回転させる処理を含む。

　次に、図５に戻り、学習部３５は、教師用マーカ像に対してフォーカス位置を対応づける。例えば、フォーカス位置Ｐ０において取得した教師用マーカ像にはフォーカス位置として０を対応づけ、フォーカス位置Ｐ１において取得した教師用マーカ像にはフォーカス位置として＋６μｍを対応づけ、フォーカス位置Ｐ２において取得した教師用マーカ像にはフォーカス位置として＋１２μｍを対応づける。また、フォーカス位置Ｐ３において取得した教師用マーカ像にはフォーカス位置として－６μｍを対応づけ、フォーカス位置Ｐ４において取得した教師用マーカ像にはフォーカス位置として－１２μｍを対応づける。

　学習部３５は、教師用マーカ像を用いて、入力されたマーカ像のフォーカス位置を判別するように判別器３２を学習する。本実施形態においては、判別器３２は、判別対象となるマーカ像が入力されると、そのマーカ像のフォーカス位置を判別するものとする。具体的には、判別器３２は、判別対象となるマーカ像について、複数のフォーカス位置について、そのフォーカス位置となる確率を算出し、そのうちの最も高い確率となったフォーカス位置を入力されたマーカ像のフォーカス位置と判別する。このため、学習部３５は、教師用マーカ像から、あらかじめ定められたサイズ（例えば３×３等）の領域内の特徴量を取得し、取得した特徴量を判別器３２に入力し、入力した教師用マーカ像に対応するフォーカス位置となる判別結果を出力するように、判別器３２の学習、すなわち機械学習を行う。

　なお、判別器３２は、サポートベクタマシン（ＳＶＭ(Support Vector Machine)）、ディープニューラルネットワーク（ＤＮＮ(Deep Neural Network)）、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ(Convolutional Neural Network)）、及びリカレントニューラルネットワーク（ＲＮＮ(Recurrent Neural Network)）等により構成することができる。

　また、教師用マーカ像の特徴量としては、教師用マーカ像に関する同時生起行列を用いてもよい。同時生起行列は、画像における画素の信号値の分布を示す行列であり、ある信号値を有する画素に隣接する画素が有する信号値の頻度を行列として表したものである。ここで、マーカ像のフォーカス位置が０の場合、すなわちマーカ像が合焦している場合、マーカ像のコントラストが高いため、高輝度（すなわち低濃度）の画素に隣接する画素は低輝度（すなわち高濃度）となる。このため、マーカ像のフォーカス位置が０の場合、高輝度の画素については信号値が高い画素が隣接する頻度が高くなる。一方、マーカ像がボケている場合、高輝度の画素に隣接する画素はそれほど低輝度とはならない。このため、マーカ像がボケている場合、マーカ像のコントラストが低いため、高輝度の画素については類似する輝度となる信号値の画素が隣接する頻度が高くなる。このため、教師用マーカ像に関する同時生起行列は、マーカ像のボケの程度に応じて特徴的な行列となる。従って、同時生起行列を特徴量として用いることにより、フォーカス位置を精度よく判別可能なように、判別器３２を学習することができる。

　このように学習がなされた判別器３２により、顕微鏡装置１０が取得した観察画像Ｇ０に含まれるマーカ像のフォーカス位置が判別される。図１３はデフォーカス量の判別結果を示す図である。なお、図１３に示す観察画像Ｇ０においては、マーカ像を白丸により示す。判別器３２は、図１３に示すように観察画像Ｇ０に含まれる複数のマーカ像のそれぞれについてフォーカス位置を判別する。図１３においては、説明のために各マーカ像の近傍に、各マーカ像に対するフォーカス位置を表す数値（μｍ）を示している。

　フォーカス位置決定部３３は、１つの観察画像Ｇ０について、判別器３２が判別した複数のマーカ像のフォーカス位置の統計値をその観察画像Ｇ０のフォーカス位置に決定する。なお、統計値としては、複数のマーカ像のフォーカス位置の平均値、中央値及び最頻値等を用いることができる。例えば、統計値を最頻値とした場合、図１３に示すようにフォーカス位置が判別された観察画像Ｇ０については、フォーカス位置の統計値は７μｍに決定される。

　動作制御部３４は、上述したようにフォーカス位置決定部３３が決定したフォーカス位置に基づいて、動作部１５を動作させてオートフォーカス制御を行う。具体的には、フォーカス位置に基づいて、第１の動作部１５Ａ～第７の動作部１５Ｇのそれぞれに対して制御信号を出力する。これにより、第１の動作部１５Ａにより結像レンズ１４ｄの焦点距離が変更されて結像光学系１４の焦点距離が変更される。また、第２の動作部１５Ｂにより結像レンズ１４ｄが光軸方向に移動する。また、第３の動作部１５Ｃにより撮影部１６が光軸方向に移動する。また、第４の動作部１５Ｄによりステージ５１が光軸方向に移動する。また、第５の動作部１５Ｅにより対物レンズ１４ｂが光軸方向に移動する。第６の動作部１５Ｆにより対物レンズ１４ｂの焦点距離が変更されて結像光学系１４の焦点距離が変更される。さらに、第７の動作部１５Ｇにより結像光学系１４の焦点位置が変更されて、結像光学系１４の焦点距離が変更される。これらの７つの動作により、オートフォーカス制御が行われる。

　すなわち、動作制御部３４は、観察域Ｒにおいて決定されたフォーカス位置に基づいて、動作部１５を駆動制御することによってオートフォーカス制御を行う。具体的には、動作制御部３４には、フォーカス位置と、結像レンズ１４ｄの焦点距離を変更するための結像レンズ１４ｄへの印加電圧、結像レンズ１４ｄの光軸方向の移動量、撮影部１６の光軸方向の移動量、ステージ５１の光軸方向の移動量、対物レンズ１４ｂの光軸方向の移動量、対物レンズ１４ｂの焦点距離を変更するための対物レンズ１４ｂへの印加電圧、及び焦点距離変更光学系７０の移動量との関係が、予めテーブルとして記憶されている。このテーブルを第１のテーブルと称する。

　動作制御部３４は、決定されたフォーカス位置に基づいて、第１のテーブルを参照して、結像レンズ１４ｄの焦点距離を変更するための結像レンズ１４ｄへの印加電圧、結像レンズ１４ｄの光軸方向の移動量、撮影部１６の光軸方向の移動量、ステージ５１の光軸方向の移動量、対物レンズ１４ｂの光軸方向の移動量、対物レンズ１４ｂの焦点距離を変更するための対物レンズ１４ｂへの印加電圧、及び焦点距離変更光学系７０の移動量をそれぞれ求める。なお、以降の説明においては、結像レンズ１４ｄの焦点距離を変更するための結像レンズ１４ｄへの印加電圧、結像レンズ１４ｄの光軸方向の移動量、撮影部１６の光軸方向の移動量、ステージ５１の光軸方向の移動量、対物レンズ１４ｂの光軸方向の移動量、対物レンズ１４ｂの焦点距離を変更するための対物レンズ１４ｂへの印加電圧、及び焦点距離変更光学系７０の移動量をフォーカス制御量と称する。

　そして、動作制御部３４は、動作部１５を制御するために、フォーカス制御量に応じた制御信号を、第１の動作部１５Ａ～第７の動作部１５Ｇに出力する。具体的には、動作制御部３４は、フォーカス位置に基づいて第１のテーブルを参照し、フォーカス制御量を取得し、第１の動作部１５Ａ～第７の動作部１５Ｇに出力する。

　動作部１５、すなわち第１の動作部１５Ａ～第７の動作部１５Ｇは、入力された制御信号に基づいて駆動する。これにより、観察域Ｒのフォーカス位置に応じたフォーカス制御が行われる。

　図５に戻り、表示制御部２２は、顕微鏡装置１０によって撮像された各観察域Ｒの位相差画像を結合することによって、１枚の合成位相差画像を生成し、その合成位相差画像を表示装置２３に表示させる。

　表示装置２３は、上述したように表示制御部２２によって生成された合成位相差画像を表示するものであり、例えば液晶ディスプレイ等を備える。また、表示装置２３をタッチパネルによって構成し、入力装置２４と兼用するようにしてもよい。

　入力装置２４は、マウス及びキーボード等を備え、ユーザによる種々の設定入力を受け付けるものである。本実施形態の入力装置２４は、例えば位相差レンズ１４ａの倍率の変更指示及びステージ５１の移動速度の変更指示等の設定入力を受け付ける。

　次に、第１の実施形態のフォーカス位置評価装置における比較画像の取得動作について、図１４に示すフローチャートを参照しながら説明する。まず、ユーザによりフォーカス位置が設定され（ステップＳＴ１）、次に、ステージ５１が移動して結像光学系１４の観察域Ｒが、図６に示す走査開始点Ｓの位置に設定され、観察域Ｒによる走査が開始される（ステップＳＴ２）。比較画像取得部３１は、顕微鏡装置１０により一走査方向において、マーカを撮影させ（ステップＳＴ３）、取得した観察画像から一走査方向の教師用マーカ像を取得する（ステップＳＴ４）。　

　次に、比較画像取得部３１は、観察域の走査方向が一走査方向とは逆向きの走査方向となった場合に、撮影顕微鏡装置１０により一走査方向とは逆向きの走査方向において、マーカを撮影させ（ステップＳＴ５）、取得した観察画像から上記逆向きの走査方向の教師用マーカ像を取得する（ステップＳＴ６）。そして、比較画像取得部３１は、全てのフォーカス位置において撮影されていない場合（ステップＳＴ７；ＮＯ）、ステップＳＴ１へ処理を移行し、全てのフォーカス位置においての撮影が終了するまで、移行の処理を繰り返し行う。一方、ステップＳＴ７にて、全てのフォーカス位置においての撮影が終了している場合（ステップＳＴ７；ＹＥＳ）、一連の処理を終了する。

　以上のようにして、比較画像取得部３１は比較画像としての教師用マーカ像を取得する。

　次に、顕微鏡観察システムの一連の動作について、図１５に示すフローチャートを参照しながら説明する。まず、観察対象である細胞が収容された培養容器５０が、ステージ５１上に設置される（ステップＳＴ１０）。ここで、本実施形態においては、細胞は観察対象であり、かつ、マーカである。次に、ステージ５１が移動して結像光学系１４の観察域Ｒが、図６に示す走査開始点Ｓの位置に設定され、観察域Ｒによる走査が開始される（ステップＳＴ１２）。

　ここで、本実施形態においては、上述したように各観察域Ｒについて、フォーカス位置評価用の観察画像Ｇ０が取得され、マーカ像が検出され、フォーカス位置が判別され、フォーカス位置が決定され、フォーカス制御量が算出され、オートフォーカス制御が行われて観察対象の位相差画像が取得される。これらの動作は、観察域Ｒを移動しながら行われ、ある位置の観察域Ｒについての観察画像Ｇ０の取得、マーカ像の検出、フォーカス位置の判別、フォーカス位置の決定、フォーカス制御量の算出、オートフォーカス制御、及び観察対象の位相差画像の取得が行われた後、次の観察域Ｒにおいて、観察画像Ｇ０の取得、マーカ像の検出、フォーカス位置の判別、フォーカス位置の決定、フォーカス制御量の算出、オートフォーカス制御、及び観察対象の位相差画像の取得が行われる。

　このため、最初の観察域Ｒにおいて、フォーカス位置評価用の観察画像Ｇ０が撮影部１６により取得され（ステップＳＴ１４）、比較画像取得部３１が、観察画像Ｇ０からマーカ像を検出する（ステップＳＴ１６）。次いで、判別器３２が観察画像Ｇ０に含まれるマーカ像のフォーカス位置を判別し（ステップＳＴ１８）、フォーカス位置決定部３３が、その観察域Ｒにおけるフォーカス位置を決定する（ステップＳＴ２０）。そして、動作制御部３４が、決定されたフォーカス位置に基づいてフォーカス制御量を算出し（ステップＳＴ２２）、フォーカス制御量に基づいてオートフォーカス制御を行う（ステップＳＴ２４）。すなわち、動作制御部３４は、予め記憶された移動量に基づいて動作部１５を駆動制御し、結像レンズ１４ｄの焦点距離を変更し、結像レンズ１４ｄ、撮影部１６及び対物レンズ１４ｂをＺ方向に移動させる。そして、オートフォーカス制御後、撮影部１６が観察域Ｒを撮像して、その観察域Ｒの観察対象の位相差画像を取得する（ステップＳＴ２６）。取得された位相差画像は、撮影部１６から表示制御部２２に出力されて記憶される。

　そして、全ての走査が終了していない場合には（ステップＳＴ２８；ＮＯ）、観察域ＲがＸ方向又はＹ方向に移動し、すべての走査が終了するまで、上述した観察画像Ｇ０の取得、マーカ像の検出、フォーカス位置の判別、フォーカス位置の決定、フォーカス制御量の算出、オートフォーカス制御及び観察対象の位相差画像の取得が繰り返し行われる（ステップＳＴ１４～ステップＳＴ２６）。そして、観察域Ｒが、図６に示す走査終了点Ｅの位置に到達した時点において全ての走査が終了する（ステップＳＴ２８；ＹＥＳ）。

　全ての走査が終了した後、表示制御部２２は、各観察域Ｒの位相差画像を結合して合成位相差画像を生成し（ステップＳＴ３０）、生成した合成位相差画像を表示装置２３に表示する（ステップＳＴ３２）。

　このように、本実施形態においては、フォーカス位置の評価対象であるマーカを含む、フォーカス位置評価用の観察画像Ｇ０を取得し、観察画像Ｇ０からマーカ像を検出し、各種デフォーカス量により撮影された複数の教師用マーカ像に関する特徴量を用いて学習がなされ、入力されたマーカ像のフォーカス位置を判別する判別器３２によりフォーカス位置を判別するようにした。このため、少ない演算量により、高速にフォーカス位置を評価することができる。

　また、観察画像Ｇ０に含まれる複数のマーカ像のそれぞれについてのフォーカス位置を判別し、複数のフォーカス位置の統計値を観察画像Ｇ０を取得した観察域Ｒのフォーカス位置に決定することにより、判別器３２による判別結果のばらつきを吸収して、精度よくフォーカス位置を決定することができる。また、フォーカス位置に基づいて、培養容器５０内の観察対象の像を撮影部１６に合焦させることにより、フォーカス位置を高速に決定することができるため、オートフォーカス制御を高速に行うことができる。

　また、本実施形態においては、教師用マーカ像を少なくとも１つの走査方向において、異なるフォーカス位置毎にマーカを撮影することにより取得しているので、教師用マーカ像においても尾引きが生じた画像とすることができる。これにより、観察画像Ｇ０から検出したマーカ像と教師用マーカ像とを照合する場合に、走査方向が一致した画像を照合することができるので、フォーカス位置を評価する際の精度を向上させることができる。

　なお、上記第１の実施形態においては、第１の実施形態によるフォーカス位置評価装置３０を顕微鏡撮影システムに適用し、観察対象の細胞をマーカとして用い、観察域Ｒを移動させつつ、各観察域Ｒにおいて観察画像Ｇ０の取得、マーカ像の検出、フォーカス位置の判別、フォーカス位置の決定、フォーカス制御量の算出、オートフォーカス制御、及び観察対象の位相差画像の取得を行っているが、これに限定されるものではない。例えば、ある培養容器５０について、細胞を収容せず、細胞とは別のマーカを収容し、培養容器５０における各観察域Ｒにおいて、観察画像Ｇ０の取得、マーカ像の検出、フォーカス位置の判別、フォーカス位置の決定、及びフォーカス制御量の算出を行うようにしてもよい。この場合、培養容器５０すべての観察域Ｒにおいてフォーカス位置が決定された後に、デフォーカス量を決定した培養容器５０と同一種類の培養容器５０に収容された細胞を観察対象として、位相差画像の取得が行われる。なお、このように位相差画像の取得に先立ってフォーカス位置を決定する場合、マーカとしては微細ビーズを用いることが好ましい。以下、これを第２の実施形態として説明する。

　図１６は位相差画像の取得に先立って、フォーカス位置を決定する、第２の実施形態において行われる処理を示すフローチャートである。まず、マーカである微細ビーズが収容された培養容器５０がステージ５１上に設置される（ステップＳＴ４０）。次に、ステージ５１が移動して結像光学系１４の観察域Ｒが、図６に示す走査開始点Ｓの位置に設定され、観察域Ｒによる走査が開始される（ステップＳＴ４２）。

　そして、最初の観察域Ｒにおいて、フォーカス位置評価用の観察画像Ｇ０が撮影部１６により取得され（ステップＳＴ４４）、比較画像取得部３１が、観察画像Ｇ０からマーカ像を検出する（ステップＳＴ４６）。次いで、判別器３２が観察画像Ｇ０に含まれるマーカ像のフォーカス位置を判別し（ステップＳＴ４８）、フォーカス位置決定部３３が、その観察域Ｒにおけるフォーカス位置を決定する（ステップＳＴ５０）。そして、動作制御部３４が、決定されたフォーカス位置に基づいてフォーカス制御量を算出し（ステップＳＴ５２）、フォーカス制御量を培養容器５０の検出位置のＸ－Ｙ座標上の位置と対応づけて記憶する（ステップＳＴ５４）。

　そして、全ての走査が終了していない場合には（ステップＳＴ５６；ＮＯ）、観察域ＲがＸ方向又はＹ方向に移動し、すべての走査が終了するまで、上述した観察画像Ｇ０の取得、マーカ像の検出、フォーカス位置の判別、フォーカス位置の決定、フォーカス制御量の算出、及びフォーカス制御量の記憶が繰り返し行われる（ステップＳＴ４４～ステップＳＴ５４）。そして、観察域Ｒが、図６に示す走査終了点Ｅの位置に到達した時点において全ての走査が終了する（ステップＳＴ５６；ＹＥＳ）。

　なお、第２の実施形態において、観察対象の位相差画像の取得時においては、フォーカス位置を決定する場合と同様に、培養容器５０の走査が行われ、各観察域Ｒにおいて位相差画像を取得する際に、その観察域Ｒに対応する培養容器５０のＸ－Ｙ座標と対応づけて記憶されたフォーカス制御量を用いて、動作制御部３４がオートフォーカス制御を行う。これにより、各観察域Ｒにおいてフォーカス制御を行いつつ、位相差画像の取得が行われる。この場合、フォーカス制御量を記憶するための培養容器５０の走査を事前に行う必要はあるが、同一種類の培養容器５０を使用する場合、位相差画像を取得する際に、各観察域Ｒにおいて観察画像Ｇ０の取得、マーカ像の検出、フォーカス位置の判別、フォーカス位置の決定、フォーカス制御量の算出、オートフォーカス制御、及び位相差画像の取得を行う必要がなくなる。これにより、培養容器５０上において観察域Ｒを連続して操作させることができるため、より高速に位相差画像を取得することができる。

　なお、第２の実施形態においては、動作制御部３４は、各観察域Ｒでのフォーカス制御量を記憶しているが、決定したフォーカス位置を記憶するようにしてもよい。この場合、各観察域Ｒにおいて位相差画像を取得する際に、記憶されたフォーカス位置に基づいてフォーカス制御量が算出されて、観察域Ｒの撮影及び位相差画像の取得が行われる。

　また、第２の実施形態において、ステップＳ５０にて決定されたフォーカス位置が、顕微鏡装置１０において設定不可能なフォーカス位置、すなわちフォーカス制御量が算出できない場合には、例えば表示装置２３にエラー表示を出すようにしてもよいし、図示しない報知部によってフォーカス制御量が算出できないことを報知するようにしてもよい。ここで、報知部は、本開示において、「報知部」は、メッセージ等を可視表示させるディスプレイ、音声が出力されることにより可聴表示させる音声再生装置、用紙等の記録媒体に記録して永久可視表示させるプリンタ、メールや電話等の通信手段及び表示灯等を意味し、上記ディスプレイ、上記音声再生装置、上記プリンタ、上記通信手段及び上記表示灯のうちの少なくとも２つ以上を組み合わせてもよい。

　ところで、判別器３２の学習の際に使用する教師用マーカ像としては、プラス方向にデフォーカスされた画像及びマイナス方向にデフォーカスされた画像の双方を用いている。しかしながら、プラス方向にデフォーカスされた画像及びマイナス方向にデフォーカスされた画像が類似している場合、そのような教師用マーカ像を用いて学習を行った判別器３２を用いても、フォーカス位置がプラス側のフォーカス位置であるのかマイナス側のフォーカス位置であるのか判別することが困難となる場合がある。

　しかしながら、本実施形態においては、フォーカス位置のプラス及びマイナスを誤って判別したとしても、オートフォーカス制御を高速に行うことができる。図１７はオートフォーカス制御を説明するための図である。なお、図１７においては、結像レンズ１４ｄをＺ方向に移動する場合のオートフォーカス制御を示す。図１７に示すように、結像レンズ１４ｄが位置Ｐ１０にあるときのフォーカス位置が＋αに決定されたとする。この場合、実際のフォーカス位置がプラス（すなわち結像レンズ１４ｄに対して観察対象よりも遠くに合焦している状態）であれば、結像レンズ１４ｄを観察対象から離れる方向、例えば位置Ｐ１１に移動させることにより、観察対象に合焦させることができる。しかしながら、実際には結像レンズ１４ｄに対して観察対象よりも近くに合焦した状態にあり、フォーカス位置が－αの場合、結像レンズ１４ｄを位置Ｐ１１に移動させると、よりフォーカスが合わなくなってしまう。

　この場合、結像レンズ１４ｄを位置Ｐ１１に移動させた時点において、再度フォーカス位置評価用の観察画像Ｇ０を取得し、フォーカス位置を決定するようにする。そして、決定したフォーカス位置が０でない場合には、フォーカス位置のプラス及びマイナスが間違っていることから、動作制御部３４は、結像レンズ１４ｄを観察対象に近づく方向、例えば位置Ｐ１１から位置Ｐ１２に移動させるようにフォーカス制御量を決定する。

　ここで、従来のように画像のコントラストを判断してオートフォーカス制御を行う場合、観察対象に合焦されるまで観察画像Ｇ０の取得及びフォーカス制御量の決定を繰り返す必要がある。これに対して、本実施形態においては、フォーカス制御量のプラス及びマイナスの判別を誤ったとしても、フォーカス位置の決定の動作をもう一度行うのみで、正確なフォーカス制御量を決定することができる。従って、本実施形態においては、フォーカス制御量のプラス及びマイナスの判別を誤ったとしても、オートフォーカス制御を高速に行うことができる。

　なお、プラス方向にデフォーカスされた画像及びマイナス方向にデフォーカスされた画像が類似している場合、プラス方向にデフォーカスされた画像及びマイナス方向にデフォーカスされた画像のいずれか一方のみを教師用マーカ像として使用して、判別器３２の学習を行うようにしてもよい。例えば、プラス方向にデフォーカスされた画像のみを教師用マーカ像として判別器３２の学習を行った場合、判別されるフォーカス位置はプラスの値となる。この場合、実際のフォーカス位置がマイナスの場合、上記図１７に示すように、フォーカス位置がプラスの場合のように結像レンズ１４ｄを位置Ｐ１１に移動させると、よりフォーカスが合わなくなってしまう。

　この場合、結像レンズ１４ｄを位置Ｐ１１に移動させた時点において、再度フォーカス位置評価用の観察画像Ｇ０を取得し、フォーカス位置を決定するようにする。そして、決定したフォーカス位置が０でない場合には、フォーカス位置が実際にはマイナスであると判定し、動作制御部３４は、結像レンズ１４ｄを位置Ｐ１１からＰ１２に移動させるようにフォーカス制御量を決定する。これにより、フォーカス位置のプラス及びマイナスを間違えた場合と同様に、フォーカス位置の決定の動作をもう一度行うのみで、正確なフォーカス制御量を決定することができる。従って、プラス方向にデフォーカスされた画像及びマイナス方向にデフォーカスされた画像のいずれか一方のみを教師用マーカ像として使用して、判別器３２の学習を行っても、オートフォーカス制御を高速に行うことができる。

　なお、上記各実施形態においては、判別器３２を学習するための教師用マーカ像として、フォーカス位置が既知のマーカ像を用いているが、これに限定されるものではない。例えば、フォーカス位置が不明であるマーカ像を教師用マーカ像として用いてもよい。この場合、フォーカス位置が不明であるマーカ像については、学習部３５は、フォーカス位置が不明であるとの判別を行うように、判別器３２の学習を行う。なお、フォーカス位置が不明であるマーカ像としては、判別器３２に入力した結果、フォーカス位置を誤って判別したマーカ像を用いることができる。このため、学習部３５はまず判別器３２に対して、フォーカス位置が不明である旨の判別を行わないように学習を行う。そして、ある程度学習が進んだ段階で、判別器３２によるフォーカス位置の判別を行った際に、フォーカス位置を誤って判別したマーカ像を、フォーカス位置が不明であるマーカ像に決定する。そして、改めてそのようなマーカ像を用いて、フォーカス位置が不明であるとの判別を行うように判別器３２の学習を行う。これにより、フォーカス位置が不明であるとの判別を行うことが可能な判別器３２を生成することができる。従って、誤ったフォーカス位置の判別結果が取得される可能性を低減することができる。

　なお、上記各実施形態においては、動作部１５が第１～第７の動作部１５Ａ～１５Ｇによりオートフォーカス制御を行っているが、第１～第７の動作部１５Ａ～１５Ｇのうちのいずれか１つのみ又はこれらのうちの複数を用いてオートフォーカス制御を行うようにしてもよい。また、第１～第７の動作部１５Ａ～１５Ｇのうちのいずれか１つのみ又はこれらのうちの複数を備えるものとしてもよい。

　また、上記各実施形態においては、焦点距離変更光学系７０を、結像光学系１４と撮影部１６との間に配置しているが、結像光学系１４とステージ５１との間に配置してもよい。

　また、上記各実施形態においては、第４の動作部１５Ｄによりステージ５１を光軸方向に移動させることにより、培養容器５０を光軸方向に移動させている。しかしながら、ステージ５１を光軸方向に移動させることに代えて、培養容器５０を光軸方向に移動させる機構を設け、培養容器５０のみを光軸方向に移動させるようにしてもよい。

　なお、上記各実施形態においては、比較画像取得部３１により観察画像Ｇ０から検出されたマーカ像のフォーカス位置を判別器３２により判別している。しかしながら、判別器のみにより、観察画像Ｇ０におけるマーカ像の有無を判別し、かつマーカ像が含まれる場合にマーカ像のフォーカス位置を判別するようにしてもよい。

　また、上述した各実施形態においては、比較画像取得部３１は、少なくとも１つの走査方向において、異なるフォーカス位置毎にマーカを撮影することにより教師用マーカ像を取得しているが、教師用マーカ像は、さらに走査速度毎に取得してもよい。この場合、フォーカス位置の評価精度をさらに向上させることができる。

　また、上記各実施形態においては、比較画像取得部３１は少なくとも１つの走査方向において、異なるフォーカス位置毎にマーカを撮影することにより教師用マーカ像を取得しているが、本開示の技術はこれに限られない。ここで、第３の実施形態について説明する。図１８は、本開示の第３の実施形態のフォーカス位置評価装置を適用した顕微鏡観察システムの概略構成を示すブロック図である。第３の実施形態の顕微鏡観察システムは、図５に示す構成図に、さらに異なるフォーカス位置毎にマーカを撮影することにより、複数の撮影画像を取得する画像取得部３６を備える。ここで画像取得部３６は、観察域の走査を行うことなく、固定した位置において撮影画像を取得する。第３の実施形態においては、画像取得部３６は、例えば一例として、－５０μｍから＋５０μｍの間において、１μｍの間隔でフォーカス位置を設定し、各フォーカス位置において撮影された撮影画像を取得する。

　第３の実施形態における比較画像取得部３１Ａは、画像取得部３６により取得された撮影画像に基づいて、走査方向に基づく特徴を有する比較画像としての教師用マーカ像を作成する。比較画像取得部３１Ａは、複数の撮影画像に基づいて、走査方向毎にフォーカス位置の評価の比較対象となる比較画像を生成し、生成された比較画像を複数取得する。比較画像は、複数の撮影画像各々に対して、ぼけ関数を畳み込み処理することにより生成する。ここで「ぼけ関数」について説明する。本開示の「ぼけ関数」は上述した尾引き領域を定量化するための関数であり、尾引き関数ともいう。

　観察対象である細胞を走査しながら撮影するときに、白色光源１１が光を照射している時間が長いほど細胞が流れた像になってしまう。そのため、第３の実施形態において、白色光源１１は、できるだけ光が照射される時間の短いパルス光源を使用する。図１９はパルス光源のプロファイルを示すグラフである。図１９において縦軸は白色光源１１の光強度、横軸は時間である。尾引き関数は、図１９に示すパルス光源のプロファイル、すなわち白色光源１１の時間経過に対する強度変化の関数に相関する。ここで、図１９に示す光源プロファイルは時間の関数であるため、この時間を、細胞の走査を開始した時点からの時間経過に基づく位置に変換することにより、時間の関数を位置の関数に変換する。比較画像取得部３１Ａは、画像取得部３６により取得された各フォーカス位置毎の撮影画像においてマーカ画像を検出し、検出したマーカ画像に対して各々、上記位置の関数を畳み込み処理することにより、一走査方向の比較画像を生成する。また、さらに図１９のパルス波形の方向を反対方向にしたパルス波形を、上記と同様に位置の関数に変換して、上記検出したマーカ画像に対して各々、畳み込み処理することにより、一走査方向とは逆の走査方向の比較画像を生成する。

　なお、本開示において、逆の走査方向の比較画像は、上記生成方法に限られず、例えば、生成した一走査方向の比較画像を反転することにより生成してもよい。

　なお、第３の実施形態のように尾引き領域を数値計算により生成した比較画像よりも、第１及び第２の実施形態のように実際に走査することにより撮影した画像を比較画像とする方が、尾引き領域の精度が高いため好ましい。

　また、上述した各実施形態においては、評価部として機械学習を採用、すなわち判別器を使用しているが、本開示の技術はこれに限られず、判別器を使用しなくてもよい。この場合、評価部は、例えばフォーカス位置評価用の観察画像Ｇ０に含まれるマーカ像の画素値と、比較画像として予め取得された複数の観察画像の各々に含まれるマーカ像の画素値を用いて、全ての組合せについて相関値を算出する。そして相関値が予め設定された閾値以上である場合に、評価部は、その相関値を有する観察画像Ｇ０と比較画像の組み合わせが、対応付けられるべき組み合わせであると判定し、その比較画像が取得されたフォーカス位置を観察画像Ｇ０のフォーカス位置として決定する。相関値の算出方法としては、例えば正規化相互相関（ZNCC：Zero-mean Normalized Cross-Correlation）を用いて算出するようにすればよい。ただし、これに限らず、その他の算出方法を用いるようにしてもよい。

　なお、上述した各実施形態においては、比較画像取得部３１及び比較画像取得部３１Ａは、顕微鏡装置１０又は画像取得部３６に画像を取得させ、取得された画像から比較画像を生成しているが、本開示の技術はこれに限定されない。例えば、比較画像取得部３１及び比較画像取得部３１Ａは、比較画像取得部３１又は比較画像取得部３１Ａの制御下にない撮影装置により撮影されてデータベースに保存された画像を、データベースから取得し、この取得した画像から比較画像を生成するようにしてもよい。また、比較画像取得部３１及び比較画像取得部３１Ａは、外部で生成された比較画像を取得するようにしてもよい。

　また、上記各実施形態は、本発明によるフォーカス位置評価装置を位相差顕微鏡に適用したものであるが、本発明は、位相差顕微鏡に限らず、微分干渉顕微鏡及び明視野顕微鏡等のその他の顕微鏡に適用してもよい。

１０　　顕微鏡装置（撮影装置）

１１　　白色光源

１２　　コンデンサレンズ

１３　　スリット板

１４　　結像光学系

１４ａ　位相差レンズ

１４ｂ　対物レンズ

１４ｃ　位相板

１４ｄ　結像レンズ

１５　　動作部

１５Ａ　第１の動作部

１５Ｂ　第２の動作部

１５Ｃ　第３の動作部

１５Ｄ　第４の動作部

１５Ｅ　第５の動作部

１５Ｆ　第６の動作部

１５Ｇ　第７の動作部

１６　　撮影部

１７　　水平方向駆動部

２０　　顕微鏡制御装置

２１　　走査制御部

２２　　表示制御部

２３　　表示装置

２４　　入力装置

３０　　フォーカス位置評価装置

３１，３１Ａ　比較画像取得部

３２　　判別器（評価部）

３３　　フォーカス位置決定部

３４　　動作制御部

３５　　学習部

３６　　画像取得部

５０　　培養容器

５１　　ステージ

５１ａ　開口

７０　　焦点距離変更光学系

７１　　第１のウェッジプリズム

７２　　第２のウェッジプリズム

Ｊ　　　観察域による走査位置

Ｓ　　　走査開始点

Ｅ　　　走査終了点

Ｌ　　　照明光

Ｒ　　　観察域

Ｗ　　　ウェル

Claims (15)

1. 
   　被写体が収容された容器が設置されるステージと前記容器内の前記被写体の像を結像させる結像光学系との少なくとも一方を走査方向に移動することで前記容器に対して観察域を走査し、各観察域を撮影する撮影装置のフォーカス位置を評価するフォーカス位置評価装置であって、
   
   　前記容器に対して少なくとも１つの走査方向に前記観察域を走査し、前記撮影装置によって異なるフォーカス位置毎に被写体を撮影することによりフォーカス位置の評価の比較対象となる比較画像を複数取得する比較画像取得部と、
   
   　前記容器に対して前記観察域を走査し、前記撮影装置によって前記被写体を撮影することにより取得された観察画像と、前記被写体を撮影する際の走査方向に対応する走査方向の前記比較画像とを照合することにより、フォーカス位置を評価する評価部と、
   
   　を含むフォーカス位置評価装置。
   
2. 
   　前記比較画像取得部は、一走査方向及び該一走査方向とは逆向きの走査方向の少なくとも一方において前記被写体を撮影することにより前記比較画像を複数取得する請求項１に記載のフォーカス位置評価装置。
   
3. 
   　前記比較画像取得部は、一走査方向において前記被写体を撮影することにより前記一走査方向の前記比較画像を複数取得し、かつ、取得した複数の前記一走査方向の前記比較画像の各々の画素位置を反転させることにより、前記一走査方向とは逆向きの走査方向の比較画像を複数取得する請求項１に記載のフォーカス位置評価装置。
   
4. 
   　被写体が収容された容器が設置されるステージと前記容器内の前記被写体の像を結像させる結像光学系との少なくとも一方を走査方向に移動することで前記容器に対して観察域を走査し、各観察域を撮影する撮影装置のフォーカス位置を評価するフォーカス位置評価装置であって、
   
   　前記観察域において、異なるフォーカス位置毎に被写体を撮影することにより複数の撮影画像を取得する画像取得部と、
   
   　前記複数の撮影画像に基づいて、走査方向毎にフォーカス位置の評価の比較対象となる比較画像を生成し、生成された比較画像を複数取得する比較画像取得部と、
   
   　前記撮影装置によって前記被写体を撮影することにより取得された観察画像と、前記被写体を撮影する際の走査方向に対応する走査方向の前記比較画像とを照合することにより、フォーカス位置を評価する評価部と、
   
   　を含むフォーカス位置評価装置。
   
5. 
   　複数の前記比較画像は、異なる走査速度毎に取得される請求項１から４の何れか１項に記載のフォーカス位置評価装置。
   
6. 
   　前記被写体がマーカである請求項１から５の何れか１項に記載のフォーカス位置評価装置。
   
7. 
   　前記マーカが、細胞の微細構造を備えている請求項６に記載のフォーカス位置評価装置。
   
8. 
   　前記マーカが、微細ビーズである請求項６に記載のフォーカス位置評価装置。
   
9. 
   　前記被写体が、細胞である請求項１から５の何れか１項に記載のフォーカス位置評価装置。
   
10. 
    　前記撮影装置が、顕微鏡装置である請求項１から９の何れか１項に記載のフォーカス位置評価装置。
    
    
    
11. 
    前記比較画像取得部は、前記撮影画像から走査方向に基づく特徴を有する前記比較画像を作成する請求項４に記載のフォーカス位置評価装置。
    
    
    
12. 
    　被写体が収容された容器が設置されるステージと前記容器内の前記被写体の像を結像させる結像光学系との少なくとも一方を走査方向に移動することで前記容器に対して観察域を走査し、各観察域を撮影する撮影装置のフォーカス位置を評価するフォーカス位置評価方法であって、
    
    　前記容器に対して少なくとも１つの走査方向に前記観察域を走査し、前記撮影装置によって異なるフォーカス位置毎に被写体を撮影することによりフォーカス位置の評価の比較対象となる比較画像を複数取得し、
    
    　前記容器に対して前記観察域を走査し、前記撮影装置によって前記被写体を撮影することにより取得された観察画像と、前記被写体を撮影する際の走査方向に対応する走査方向の前記比較画像とを照合することにより、フォーカス位置を評価するフォーカス位置評価方法。
    
13. 
    　被写体が収容された容器が設置されるステージと前記容器内の前記被写体の像を結像させる結像光学系との少なくとも一方を走査方向に移動することで前記容器観察対象に対して観察域を走査し、各観察域を撮影する撮影装置のフォーカス位置を評価するフォーカス位置評価方法であって、
    
    　前記観察域において、異なるフォーカス位置毎に被写体を撮影することにより複数の撮影画像を取得し、
    
    　前記複数の撮影画像に基づいて、走査方向毎にフォーカス位置の評価の比較対象となる比較画像を生成し、生成された比較画像を複数取得し、
    
    　前記撮影装置によって前記被写体を撮影することにより取得された観察画像と、前記被写体を撮影する際の走査方向に対応する走査方向の前記比較画像とを照合することにより、フォーカス位置を評価するフォーカス位置評価方法。
    
14. 
    　被写体が収容された容器が設置されるステージと前記容器内の前記被写体の像を結像させる結像光学系との少なくとも一方を走査方向に移動することで前記容器に対して観察域を走査し、各観察域を撮影する撮影装置のフォーカス位置を評価するフォーカス位置評価プログラムであって、
    
    　前記容器に対して少なくとも１つの走査方向に前季観察域を走査し、前記撮影装置によって異なるフォーカス位置毎に被写体を撮影することによりフォーカス位置の評価の比較対象となる比較画像を複数取得する手順と、
    
    　前記容器に対して前記観察域を走査し、前記撮影装置によって前記被写体を撮影することにより取得された観察画像と、前記被写体を撮影する際の走査方向に対応する走査方向の前記比較画像とを照合することにより、フォーカス位置を評価する手順と、
    
    　をコンピュータに実行させるフォーカス位置評価プログラム。
    
15. 
    　被写体が収容された容器が設置されるステージと前記容器内の前記被写体の像を結像させる結像光学系との少なくとも一方を走査方向に移動することで前記容器に対して観察域を走査し、各観察域を撮影する撮影装置のフォーカス位置を評価するフォーカス位置評価プログラムであって、
    
    　前記観察域において、異なるフォーカス位置毎に被写体を撮影することにより複数の撮影画像を取得する手順と、
    
    　前記複数の撮影画像に基づいて、走査方向毎にフォーカス位置の評価の比較対象となる比較画像を生成し、生成された比較画像を複数取得する手順と、
    
    　前記撮影装置によって前記被写体を撮影することにより取得された観察画像と、前記被写体を撮影する際の走査方向に対応する走査方向の前記比較画像とを照合することにより、フォーカス位置を評価する手順と、
    
    　をコンピュータに実行させるフォーカス位置評価プログラム。

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