JP6386071B2 - 標本観察装置及び標本観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、標本観察装置及び標本観察方法に関するものである。

無色透明な標本を観察する方法として、変調コントラスト法がある。変調コントラスト法を行う観察装置では、照明光学系に開口板が配置され、観察光学系に変調器が配置されている。ここで、開口板と変調器とは共役な関係になっている。また、開口板には、光軸（開口板の中心）から離れた位置に透過部が矩形状に形成されている。一方、変調器には、互いに異なる透過率を持つ領域が複数形成されている。これらの領域は、隣接して形成されている。また、これらの領域は、いずれも透過部の像を含み得る大きさ（幅）になっている。
上述のように、透過部は光軸から離れた位置に形成されている。そのため、透過部を通過した照明光は、標本を斜め方向から照明するように、コンデンサレンズから出射する。コンデンサレンズを出射した照明光は標本を透過して、変調器に到達する。ここで、変調器には、例えば、３つの領域Ａ（透過率１００％）、領域Ｂ（透過率２０％）及び領域Ｃ（透過率０％）が形成されているとする。
標本の表面が平坦な場合、標本を透過した光束は変調器の領域Ｂに到達する。その結果、領域Ｂの透過率に応じた明るさの標本像が形成される。また、標本の表面が右肩上がりの斜面となっていると、標本を透過するとき光束は右方へ屈折する。この場合、標本を透過した光束は変調器の領域Ｃに到達する。その結果、領域Ｃの透過率に応じた明るさの標本像が形成される。また、標本の表面が左肩上がりの斜面となっていると、標本を透過するとき光束は左方へ屈折する。この場合、標本を透過した光束は変調器の領域Ａに到達する。その結果、領域Ａの透過率に応じた明るさの標本像が形成される。このように、標本が無色透明で、平坦面と斜面とを有する場合、標本像は、平坦面部分が灰色に、斜面部分が黒又は白く見える。
このように、変調コントラスト法では、標本が無色透明であっても、陰影（明暗）を持つ立体感のある像として観察することが可能となる。このような変調コントラスト法を用いた観察装置として、特許文献１や特許文献２に記載の観察装置がある。

特開昭５１−２９１４９号公報 特開２００４−１２６５９０号公報

特許文献１や特許文献２の観察装置では、変調器に、互いに透過率が異なる複数の領域が形成されている。この変調器は、対物レンズの内部に配置されている。さらに、変調器に形成された複数の領域は、矩形状（短冊状）に形成されている。一方、開口板の透過部も矩形状に形成されている。
ここで、対物レンズを顕微鏡本体に固定すると、対物レンズの瞳面内での複数の領域の位置が決まる。特許文献１や特許文献２の装置では、領域と透過部とが共役な関係となるように、開口板の調整を行わなくてはならない。具体的には、領域の長軸方向と透過部の長軸方向とを一致させなくてはならない。そのため、特許文献１や特許文献２の装置では、開口板の位置調整が煩雑になる。
また、特許文献１や特許文献２の装置では、対物レンズを装置に固定した時点で、対物レンズの瞳面内での複数の領域の位置が決まる。そのため、陰影が発生する方向は、複数の領域の位置に対応する方向に限られてしまう。
また、特許文献１や特許文献２の装置では、変調器が対物レンズの内部に配置されている。そのため、変調コントラスト法以外の観察法を行う場合には、変調器を取り除くか、対物レンズを取り替える必要がある。
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、陰影の発生方向が限定されない標本観察装置及び標本観察方法を提供することを目的とする。また、開口部材の位置調整が簡素な標本観察装置及び標本観察方法を提供することを目的とする。

上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明の標本観察装置は、
照明光学系と、観察光学系と、を備え、
照明光学系は、光源と、コンデンサレンズと、開口部材と、を有し、
観察光学系は、対物レンズと、結像レンズと、を有し、
開口部材は、遮光部又は減光部と、透過部と、を有し、
開口部材は、遮光部又は減光部が照明光学系の光軸を含むように配置され、
透過部は、遮光部又は減光部の外縁よりも外側に位置し、
対物レンズの瞳の外縁よりも内側に、透過部の内縁の像が形成され、
対物レンズの瞳の外縁よりも外側に、透過部の外縁の像が形成され、
以下の条件式を満足することを特徴とする。
０．００５≦Ｒａｔｉｏ≦０．９
ここで、
Ｒａｔｉｏ＝（Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×β）／（Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂ）、
Ｒ_０は、照明光学系の光軸から透過部の内縁までの長さ、
Ｒ_１は、照明光学系の光軸から透過部の外縁までの長さ、
Ｒ_ｏｂは、対物レンズの瞳の半径、
βは、対物レンズの焦点距離をコンデンサレンズの焦点距離で割った値、
である。
また、本発明の標本観察装置は、
光源と、光学系と、物体を保持する保持部材と、を有し、
光学系は、第１の光学系と、第２の光学系と、を有し、
第１の光学系と第２の光学系は、保持部材を挟んで対向して配置され、
第１の光学系は開口部材を有し、
開口部材の透過部の像が、第２の光学系の瞳位置に形成されるように、光学系は構成され、
以下の条件式（３）を満足することを特徴とする。
１．１≦Ｉ_０．１／Ｉ_０ （３）
ここで、
Ｉ_０．１は、△ｄ＝０．１×Ｒ_ｏｂのときに、第２の光学系の瞳を通過する光量、
Ｉ_０は、△ｄ＝０のときに、第２の光学系の瞳を通過する光量、
△ｄは、第２の光学系の瞳に対する開口部材の透過部の像のずれ量、
Ｒ_ｏｂは、第２の光学系の瞳の半径、
である。
また、本発明の標本観察方法は、
対物レンズの光軸と交差するように、所定の幅の光束を標本に照射して標本を観察する方法であって、
対物レンズの瞳位置に到達した所定の幅の光束が、標本が無い状態のときに以下の条件（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を満足することを特徴とする。
（Ａ）所定の幅の光束のうち、最も内側の光は対物レンズの瞳の内側に位置する。
（Ｂ）所定の幅の光束のうち、最も外側の光は対物レンズの瞳の外側に位置する。
（Ｃ）対物レンズの瞳の内側に位置する光束の幅は、対物レンズの瞳の外側に位置する光束の幅の０．００５倍以上、０．９倍以下である。

本発明によれば、陰影の発生方向が限定されない標本観察装置及び標本観察方法を提供できる。また、開口部材の位置調整が簡素な標本観察装置及び標本観察方法を提供できる。

図１は実施形態の標本観察装置の構成を示す図である。
図２は開口部材の構成を示す図であって、（ａ）は不透明な部材で構成された開口部材を示す図、（ｂ）は透明な部材で構成された開口部材を示す図である。
図３は標本が存在しない場合の対物レンズの瞳と開口部材の像との関係を示す図であって、（ａ）は標本位置における光の屈折の様子を示す図、（ｂ）は対物レンズの瞳と開口部材の像との関係を示す図、（ｃ）は対物レンズの瞳を通過する光束の様子を示す図である。
図４は標本が存在する場合の対物レンズの瞳と開口部材の像との関係を示す図であって、（ａ）は標本位置における光の屈折の様子を示す図、（ｂ）は対物レンズの瞳と開口部材の像との関係を示す図、（ｃ）は対物レンズの瞳を通過する光束の様子を示す図である。
図５は本実施形態の標本観察装置で得られた標本の電子画像である。
図６は対物レンズの瞳と開口部材の像との関係を示す図であって、（ａ）は、光軸から透過部の内縁までの長さ、光軸から透過部の外縁での長さ及び対物レンズの瞳の半径の関係を示す図、（ｂ）は対物レンズの瞳に対する開口部材の像のずれを示す図である。
図７（ａ）は対物レンズの瞳に対する開口部材の像のずれ量と、対物レンズの瞳を通過する光束の量との関係を示すグラフ、（ｂ）〜（ｄ）は、対物レンズの瞳に対する開口部材の像のずれを示す図であって、（ｂ）はずれがない場合、（ｃ）はずれが少ない場合、（ｄ）はずれが多い場合、を示す。
図８は、透過部の像と対物レンズの瞳の関係を示す図である。
図９は、ずれ量Δと光束の量Ｉ（像の明るさ）の変化の関係を示す図である。
図１０は、ずれ量Δと光束の量Ｉ（像の明るさ）の変化の関係を示す図である。
図１１は、Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂとＲａｔｉｏについて好ましい範囲を示す図である。
図１２は対物レンズの瞳と開口部材の像との関係を示す図あって、（ａ）は標本が存在しない場合の図、（ｂ）は標本が存在する場合の図である。
図１３（ａ）は対物レンズの瞳に対する開口部材の像のずれ量と、対物レンズの瞳を通過する光束の量との関係を示すグラフ、（ｂ）〜（ｄ）は、対物レンズの瞳に対する開口部材の像のずれを示す図であって、（ｂ）はずれがない場合、（ｃ）はずれが少ない場合、（ｄ）はずれが多い場合、を示す。
図１４は実施形態の別の標本観察装置の構成を示す図である。
図１５は開口部材の構成を示す図であって、透明な部材に減光部を設けた開口部材を示す図である。
図１６は画像処理装置を備えた標本観察装置の構成を示す図である。

本発明のある態様にかかる実施形態の作用効果を説明する。なお、本実施形態の作用効果を具体的に説明するに際しては、具体的な例を示して説明することになる。しかし、それらの例示される態様はあくまでも本発明に含まれる態様のうちの一部に過ぎず、その態様には数多くのバリエーションが存在する。したがって、本発明は例示される態様に限定されるものではない。
実施形態の標本観察装置及び標本観察方法について説明する。以下の各実施形態の標本観察装置及び標本観察方法は、明視野観察の状態で用いられるものである。本実施形態における明視野観察では、蛍光観察のように、励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタからなる蛍光ミラーユニットは用いられない。よって、明視野観察の状態では、標本が無色透明の場合、標本像を形成する光（以下、適宜、「結像光」という）の波長帯域は、標本を照明する光（以下、適宜、「照明光」という）の波長帯域のうちの一部と一致しているか、又は結像光の波長帯域と照明光の波長帯域とは一致している。
また、本実施形態の標本観察装置及び標本観察方法における明視野観察では、位相差観察における位相膜や、微分干渉観察における微分干渉プリズムは用いられない。また、本実施形態における明視野観察では、変調コントラスト観察における変調器は用いられない。
本実施形態の標本観察装置は、照明光学系と、観察光学系と、を備え、照明光学系は、光源と、コンデンサレンズと、開口部材と、を有し、観察光学系は、対物レンズと、結像レンズと、を有し、開口部材は、遮光部又は減光部と、透過部と、を有し、開口部材は、遮光部又は減光部が照明光学系の光軸を含むように配置され、透過部は、遮光部又は減光部の外縁よりも外側に位置し、対物レンズの瞳の外縁よりも内側に、透過部の内縁の像が形成され、対物レンズの瞳の外縁よりも外側に、透過部の外縁の像が形成され、以下の条件式（１）を満足することを特徴とする。
０．００５≦Ｒａｔｉｏ≦０．９ （１）
ここで、
Ｒａｔｉｏ＝（Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×β）／（Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂ）、
Ｒ_０は、照明光学系の光軸から透過部の内縁までの長さ、
Ｒ_１は、照明光学系の光軸から透過部の外縁までの長さ、
Ｒ_ｏｂは、対物レンズの瞳の半径、
βは、対物レンズの焦点距離をコンデンサレンズの焦点距離で割った値、
である。
本実施形態の標本観察装置について説明する。なお、以下の説明では、まず、開口部材が遮光部を有する場合について説明し、次に、開口部材が減光部を有する場合について説明する。
本実施形態の標本観察装置は、照明光学系と、観察光学系と、を備え、照明光学系は、光源と、コンデンサレンズと、開口部材と、を有し、観察光学系は、対物レンズと、結像レンズと、を有し、開口部材は、遮光部と、透過部と、を有し、開口部材は、遮光部が照明光学系の光軸を含むように配置され、透過部は、遮光部の外縁よりも外側に位置し、対物レンズの瞳の外縁よりも内側に、透過部の内縁の像が形成され、対物レンズの瞳の外縁よりも外側に、透過部の外縁の像が形成されることを特徴とする。
本実施形態の標本観察装置について、図１を用いて説明する。図１は本実施形態の標本観察装置の構成を示す図である。
標本観察装置１００は、例えば、正立型顕微鏡であって、照明光学系と観察光学系とを備える。照明光学系は、光源１と、コンデンサレンズ４と、開口部材５とを有する。なお、必要に応じて、照明光学系は、レンズ２やレンズ３を有する。一方、観察光学系は、対物レンズ８と結像レンズ１０とを有する。
光源１から出射した光は、レンズ２とレンズ３を通過して、コンデンサレンズ４に到達する。コンデンサレンズ４には、開口部材５が設けられている。ここでは、コンデンサレンズ４と開口部材５とが、一体で構成されている。しかしながら、開口部材５とコンデンサレンズ４とを、それぞれ別体で構成しても良い。
開口部材５について説明する。開口部材の構成を図２に示す。（ａ）は不透明な部材で構成された開口部材を示し、（ｂ）は透明な部材で構成された開口部材を示している。
図２（ａ）に示すように、開口部材５は、遮光部５ａ１と透過部５ｂとを有する。更に、開口部材５は遮光部５ａ２を有する。遮光部５ａ１と５ａ２は不透明な部材、例えば、金属板で構成されている。透過部５ｂは金属板に形成された空隙（孔）である。
開口部材５では、遮光部５ａ１を保持するために、遮光部５ａ１と遮光部５ａ２との間に接続部５ａ３が３つ形成されている。そのため、透過部５ｂは３つに分かれている。透過部５ｂの各々形状は略扇状（離散的な輪帯形状）になっている。なお、接続部５ａ３の数は３つに限定されない。
開口部材５は、遮光部５ａ１が照明光学系の光軸を含むように配置されている。また、遮光部５ａ１の外縁５ｃは、照明光学系の光軸から所定の距離だけ離れた位置にある。よって、開口部材５に入射した照明光は、光束の中心が遮光部５ａ１によって遮光される。ここで、遮光部５ａ１と透過部５ｂとの境が、遮光部５ａ１の外縁５ｃになる。
遮光部５ａ２は、遮光部５ａ１や透過部５ｂよりも外側（光軸から離れる方向）に位置している。ここで、透過部５ｂと遮光部５ａ２との境が、遮光部５ａ２の内縁５ｄになる。
透過部５ｂは、遮光部５ａ１の外縁５ｃよりも外側に位置している。ここで、遮光部５ａ１と透過部５ｂとの境が、透過部５ｂの内縁になる。また、透過部５ｂと遮光部５ａ２との境が、透過部５ｂの外縁になる。よって、５ｃは、遮光部５ａ１の外縁と透過部５ｂの内縁とを示し、５ｄは、遮光部５ａ２の内縁と透過部５ｂの外縁とを示している。
また、図２（ｂ）に示すように、開口部材５’は、遮光部５’ａ１と透過部５’ｂとを有する。更に、開口部材５’は遮光部５’ａ２を有する。遮光部５’ａ１、５’ａ２及び透過部５’ｂは透明な部材、例えば、ガラス板や樹脂板で構成されている。遮光部５’ａ１と５’ａ２は、例えば、遮光塗料をガラス板上に塗布することで形成されている。一方、透過部５’ｂには何も塗布されていない。よって、透過部５’ｂはガラス板そのものである。
開口部材５’では、透過部５’ｂの形状は円環になっている。これは、遮光部５’ａ２を保持する必要が無いからである。そのため、開口部材５’では、遮光部５’ａ１と遮光部５’ａ２との間に接続部は形成されていない。
なお、開口部材５’と開口部材５との主な違いは、材料と接続部の有無である。よって、遮光部５’ａ１、５’ａ２及び透過部５’ｂについての詳細な説明は省略する。
なお、開口部材５の遮光部５ａ２と接続部５ａ３や開口部材５’の遮光部５’ａ２は、必ずしも必要ではない。例えば、照明光の光束径（直径）を、透過部５ｂの外縁や透過部５’ｂの外縁と一致させるようにすれば良い。
以上のように、開口部材５、５’は遮光部５ａ１、５’ａ１と透過部５ｂ、５’ｂとを備えている。よって、開口部材５、５’からは、略円環状又は円環状（以下、適宜、「円環状」という）の照明光が出射する。
図１に戻って説明を続ける。開口部材５と光源１とは共役な関係になっている。よって、光源１から出射した照明光は、開口部材５の位置で集光する。すなわち、開口部材５の位置に光源１の像が形成される。
開口部材５から出射した照明光は、コンデンサレンズ４に入射する。ここで、開口部材５の位置は、コンデンサレンズ４の焦点位置（あるいは、コンデンサレンズ４の瞳位置）と一致している。そのため、コンデンサレンズ４から出射する照明光は、平行光になる。また、透過部の形状が円環状になっているので、照明光の形状も円環状になる。そのため、コンデンサレンズ４から出射する照明光は、観察光学系の光軸（照明光学系の光軸）と交差するように出射する。
コンデンサレンズ４から出射した照明光は、標本７に到達する。標本７は保持部材６上に載置されている。標本７は、例えば細胞であって、無色透明である。
標本７を透過した光、すなわち、結像光は顕微鏡対物レンズ８（以下、適宜、「対物レンズ」という）に入射する。この対物レンズ８は、例えば、明視野観察用の顕微鏡対物レンズである。よって、対物レンズ８の光路中にはレンズが存在するだけで、位相板や変調板のように光の強度や位相を変化させる光学部材は存在していない。
対物レンズ８から出射した結像光は、結像レンズ１０に入射する。そして、結像レンズ１０を出射した結像光によって、像位置１１に標本７の像が形成される。
図１に示すように、標本７を透過した平行光は、対物レンズの瞳９に集光する。このように、対物レンズの瞳９と開口部材５とは共役な関係になっている。よって、対物レンズの瞳９の位置に開口部材５の像が形成される。
対物レンズの瞳９と開口部材５の像との関係について説明する。なお、以下の説明では、開口部材として、図２（ｂ）に示す開口部材５’が用いられているものとする。
図３は、対物レンズの瞳と開口部材の像との関係を示す図であって、標本が存在しない場合を示している。（ａ）は標本位置における光の屈折の様子を示す図、（ｂ）は対物レンズの瞳と開口部材の像との関係を示す図、（ｃ）は対物レンズの瞳を通過する光束の様子を示す図である。なお、標本が存在しない場合には、標本は存在するものの、その表面が平坦になっている場合が含まれる。
また、図４は、対物レンズの瞳と開口部材の像との関係を示す図であって、標本が存在する場合を示している。（ａ）は標本位置における光の屈折の様子を示す図、（ｂ）は対物レンズの瞳と開口部材の像との関係を示す図、（ｃ）は対物レンズの瞳を通過する光束の様子を示す図である。なお、標本が存在する場合とは、標本の表面が傾斜している（非平坦になっている）場合である。よって、標本は存在するものの、その表面が平坦になっている場合は、標本が存在する場合に含まれない。
標本が存在しない場合、図３（ａ）に示すように、保持部材６へ入射する光と保持部材６から出射する光とは、光の進行方向が同じになる。その結果、対物レンズの瞳位置に形成される開口部材の像は、図３（ｂ）に示すようになる。なお、符号９で示す円（円周）は対物レンズの瞳の外縁で、円（円周）の内側が対物レンズの瞳になる。
図３（ｂ）に示すように、透過部の像２０の形状は円環で、遮光部の像２１の形状は円で、対物レンズの瞳９の形状は円である。そして、透過部の像２０と、遮光部の像２１と、対物レンズの瞳９とが同心状になっている。また、透過部の像２０の中心と、遮光部の像２１の中心と、対物レンズの瞳９の中心とは一致している。遮光部の像２１は、例えば、図２における遮光部５ａ１や５’ａ１の像である。
ここで、透過部の像２０の中心とは、透過部の外縁の像２０ａを形作る円の中心のことである（透過部の像２０は円環なので、透過部の像２０の中心は、透過部の内縁の像２０ｂを形作る円の中心でもある）。
そして、透過部の内縁の像２０ｂは、対物レンズの瞳９の外縁よりも内側（光軸に近づく方向）に位置している。また、透過部の外縁の像２０ａは、対物レンズの瞳９の外縁よりも外側（光軸から離れる方向）に位置している。このように、本実施形態の標本観察装置では、対物レンズの瞳９の外縁よりも内側に、透過部の内縁の像２０ｂが形成され、対物レンズの瞳９の外縁よりも外側に、透過部の外縁の像２０ａが形成される。
ここで、対物レンズの瞳９の外縁よりも外側の光は、対物レンズの瞳９を通過しない（対物レンズ８から出射しない）。よって、対物レンズの瞳９を通過する光束の領域は、図３（ｃ）に示すように、透過部の内縁の像２０ｂから対物レンズの瞳９の外縁までの間の領域になる。そして、この領域全体の面積が、標本像の明るさに対応する。
一方、標本が存在する場合、図４（ａ）に示すように、保持部材６へ入射する光と標本から出射する光とは、光の進行方向が異なる。その結果、対物レンズの瞳位置に形成される開口部材の像は、図４（ｂ）に示すようになる。なお、図４（ｂ）においても、符号９で示す円（円周）は対物レンズの瞳の外縁で、円（円周）の内側が対物レンズの瞳になる。
図４（ｂ）に示すように、透過部の像２０の形状は円環で、遮光部の像２１の形状は円で、対物レンズの瞳９の形状は円である。ただし、透過部の像２０及び遮光部の像２１と、対物レンズの瞳９とは同心状になっていない。また、透過部の像２０の中心及び遮光部の像２１の中心と、対物レンズの瞳９の中心とは一致していない。すなわち対物レンズの瞳９の中心に対して、透過部の像２０の中心及び遮光部の像２１の中心は紙面内の左方向にずれている。
また、対物レンズの瞳９を通過する光束の領域は、図４（ｃ）に示すように、透過部の内縁の像２０ｂから対物レンズの瞳９の外縁までの間の領域になる。そして、この領域全体の面積が、標本像の明るさに対応する。
ここで、図４（ｂ）では、透過部の内縁の像２０ｂは、対物レンズの瞳９の外縁の内側に位置している。言い換えると、図４（ｂ）では、遮光部の像２１は、対物レンズの瞳９の外縁の内側に位置している。これは、標本の表面の傾斜が小さいからである。一方、標本が存在しない場合でも、遮光部の像２１は、対物レンズの瞳９の外縁の内側に位置している。そのため、標本が存在する場合であっても、標本の表面の傾斜が小さいと、標本像の明るさは、標本が存在しない場合と同じになる。
しかしながら、標本の表面の傾斜が更に大きくなると、対物レンズの瞳９の中心に対する透過部の像２０の中心のずれ（以下、適宜、「透過部の像のずれ」という）が更に大きくなる。この場合、後述（図７）するように、透過部の内縁の像２０ｂの一部が、対物レンズの瞳９の外縁よりも外側に位置するようになる。また、透過部の外縁の像２０ａの一部が、対物レンズの瞳９の外縁よりも内側に位置するようになる。言い換えると、遮光部の像２１の一部が、対物レンズの瞳９の外縁の外側に位置する。その結果、対物レンズの瞳９を通過する光束の領域は大きく変化する。すなわち、標本像の明るさが、標本が存在しない場合と異なる。
このように、本実施形態の標本観察装置では、標本における形状の変化（傾斜の変化）が、透過部の像のずれの変化に変換される。そして、透過部の像のずれの変化によって、対物レンズの瞳を通過する光束の量に変化が生じる。すなわち、標本における形状の変化を明暗の変化として検出できる。その結果、標本が無色透明であっても、陰影のある標本像を得ることができる。
しかも、本実施形態の標本観察装置では、変調コントラスト法のように変調器を用いる必要がない。そのため、変調器に対する開口部材の位置調整が不要になる。その結果、開口部材の位置調整が簡素になる。更に、変調器を用いないことで、対物レンズは明視野観察法の対物レンズを使用できる。よって、同じ対物レンズで、様々な観察方法（例えば、明視野観察や、蛍光観察や、偏光観察等の観察方法）が手軽に行える。
また、陰影の発生方向は、対物レンズの瞳９に対する透過部の像２０のずれの方向で決まるが、透過部の像のずれの方向は制限されない。そのため、本実施形態の標本観察装置では、陰影の発生方向が限定されない。
本実施形態の標本観察装置における観察結果の例を図５に示す。図５は、細胞の電子画像である。図５に示すように、本実施形態の標本観察装置によれば、無色透明な細胞の輪郭や内部構造を明瞭に観察できる。
このようにすることで、標本における形状の変化を明暗の変化として検出できる。
対物レンズの瞳と透過部の像の関係について更に説明する。図６は、対物レンズの瞳と開口部材の像との関係を示す図である。ここで、図６（ａ）に、光軸から透過部の内縁までの長さＲ_０、光軸から透過部の外縁までの長さＲ_１及び対物レンズの瞳の半径Ｒ_ｏｂの関係を示している。
図６（ａ）に示すように、Ｒ_０、Ｒ_１及びＲ_ｏｂの関係は、Ｒ_０×β＜Ｒ_ｏｂ、Ｒ_ｏｂ＜Ｒ_１×βになっている。Ｒ_０×β＜Ｒ_ｏｂとなるようにすることで、対物レンズの瞳の外縁よりも内側に、透過部の内縁の像が形成される。また、Ｒ_ｏｂ＜Ｒ_１×βとなるようにすることで、対物レンズの瞳の外縁よりも外側に、透過部の外縁の像が形成される。その結果、標本における形状の変化を明暗の変化として検出できる。
なお、開口部材の形状は、軸対称な形状であることが好ましい。このようにすることで、陰影の発生方向が限定されない。
なお、軸対称な形状としては、例えば、円や多角形がある。遮光部の形状を円とし、透過部の形状を円環とすると、Ｒ_０は円環の内縁の半径、Ｒ_１は円環の外縁の半径である。また、遮光部の形状を多角形とし、透過部の形状を環状の多角形とすると、Ｒ_０は透過部の内側の多角形に内接する円の半径、Ｒ_１は透過部の外側の多角形に外接する円の半径である。
また、本実施形態の標本観察装置では、対物レンズの瞳位置において、透過部の像の中心は、対物レンズの瞳の中心と一致することが好ましい。
このようにすることで、陰影の発生方向が限定されない。
図６（ｂ）は対物レンズの瞳に対する開口部材の像のずれを示す図である。図６（ｂ）では、対物レンズの瞳の中心に対して、開口部材の像の中心がずれている。このずれ量をΔ、対物レンズの瞳を通過する光束の領域（面積）をＳで示している。なお、図６（ｂ）では、遮光部の像（例えば、図３に示す遮光部の像２１）の形状が円で、透過部の像の形状が円環で、しかも両者が同心状になっている。このような場合、透過部の像のずれは、対物レンズの瞳の中心に対する開口部材の像の中心のずれと等しい。よって、図６（ｂ）におけるずれ量Δは、透過部の像のずれ量でもある。
図６（ｂ）において、ずれ量Δを変化させると、面積Ｓも変化する。そこで、ずれ量Δを変化させて、そのときの面積Ｓを求めた結果を図７に示す。図７において（ａ）は、対物レンズの瞳に対する開口部材の像のずれ量と、対物レンズの瞳を通過する光束の量との関係を示すグラフ、（ｂ）〜（ｄ）は、対物レンズの瞳に対する開口部材の像のずれを示す図である。ここで、（ｂ）はずれがない場合、（ｃ）はずれが少ない場合、（ｄ）はずれが多い場合、を示す。
図７（ａ）では、Ｒ_０×β＝０．９７×Ｒ_ｏｂ、Ｒ_１×β＝１．１５×Ｒ_ｏｂで、計算を行っている。また、透過部の透過率は１００％にしている。また、図７（ａ）において、横軸の数値は、ずれ量Δを対物レンズの瞳の半径Ｒ_ｏｂで規格化している。また、縦軸の数値は、ずれ量Δが０のときの面積（π（Ｒ_ｏｂ ^２−（Ｒ_０×β）^２））で規格化している。
なお、面積Ｓは対物レンズの瞳を通過する光束の範囲を示している。よって、面積Ｓは光束の量Ｉに置き換えることができる。そこで、図７（ａ）では、縦軸の変数としてＩを用いている。
標本が存在しない場合（あるいは、標本の表面が平坦な場合）、ずれ量Δは０である。この場合、対物レンズの瞳と開口部材の像との関係はＡのようになる（図７（ｂ））。よって、矢印Ａで示すように、光束の量Ｉは１になる。
次に、標本が存在する場合、ずれ量Δは０でない。ここで、標本の表面の傾斜が小さいと、対物レンズの瞳と開口部材の像との関係はＢのようになる（図７（ｃ））。しかしながら、ＡとＢとでは、遮光部の像の位置は対物レンズの瞳内において異なっているものの、どちらも、対物レンズの瞳の外縁の内側に遮光部の像が位置している。そのため、矢印Ｂで示すように、光束の量Ｉは１になる。
一方、標本の表面の傾斜が大きいと、対物レンズの瞳と開口部材の像との関係はＣのようになる。この場合、遮光部の像の一部が対物レンズの瞳の外側に位置する状態になる（図７（ｄ））。そのため、矢印Ｃで示すように、光束の量Ｉは１よりも大きくなる。
このように、本実施形態の標本観察装置では、矢印Ｂから矢印Ｃまでの間で、ずれ量Δの変化に応じて光束の量Ｉが変化する。そのため、本実施形態の標本観察装置によれば、標本における形状の変化を明暗の変化として検出できる。その結果、標本が無色透明であっても、陰影のある標本像を得ることができる。
なお、本実施形態において、「対物レンズの瞳の外縁よりも内側に、透過部の内縁の像が形成される」には、対物レンズの瞳の外縁よりも内側に、図７（ｂ）が示すように、透過部の内縁の像が全部含まれる場合のみならず、図７（ｃ）が示すように、透過部の内縁の像が一部含まれる場合も含まれる。
そして、本実施形態の標本観察装置では、以下の条件式（１）を満足する。
０．００５≦Ｒａｔｉｏ≦０．９ （１）
ここで、
Ｒａｔｉｏ＝（Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×β）／（Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂ）、
Ｒ_０は、照明光学系の光軸から透過部の内縁までの長さ、
Ｒ_１は、照明光学系の光軸から透過部の外縁までの長さ、
Ｒ_ｏｂは、対物レンズの瞳の半径、
βは、対物レンズの焦点距離をコンデンサレンズの焦点距離で割った値、
である。
条件式（１）は、対物レンズの瞳９の外縁よりも内側に形成された透過部の像の大きさと、対物レンズの瞳９の外縁よりも外側に形成された透過部の像の大きさについて、適切な比率を表する条件式である。
条件式（１）の技術的意義を説明する前に、Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×βとＲ_１×β−Ｒ_ｏｂの各々について、技術的意義を説明する。
図８は、透過部の像と対物レンズの瞳との関係を示す図である。図８に示すように、Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×βは、対物レンズの瞳９の外縁と透過部の内縁の像２０ｂとの間隔を表している。また、Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂは、対物レンズの瞳９の外縁と透過部の外縁の像２０ａとの間隔を表している。
まず、Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×βについて説明する。なお、Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂは一定とする。
図８において、面積Ｓは対物レンズの瞳を通過する光束の範囲を示している。対物レンズの瞳を通過する光束の範囲は、像の明るさを表している。よって、面積Ｓの大きさは、像の明るさを表している。ここで、Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×βと面積Ｓは比例関係になっている。よって、Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×βが大きくなると像の明るさが明るくなる。
また、図７（ｃ）、（ｄ）に示したように、標本の表面の傾斜が大きくなるほど、遮光部の像２１が対物レンズの瞳９の中心からずれていく。ただし、図７（ｃ）に示したように、透過部の内縁の像２０ｂの位置が対物レンズの瞳９の外縁と一致するまでの間は、遮光部の像２１は対物レンズの瞳の外縁の内側に位置している。この間（図７（ａ）のＡＢ間）では、面積Ｓの値は変化しないので、像の明るさは変化しない。
図９は、ずれ量Δと光束の量Ｉ（像の明るさ）の変化の関係を示す図である。ここでは、異なるＲ_ｏｂ−Ｒ_０×βの値について、明るさの変化を示している。Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×βの値は、Ｇ_１＜Ｇ_２＜Ｇ_３＜Ｇ_４である、また、Δ_ｃ１〜Δ_ｃ４は像の明るさが変化しないときの最大ずれ量Δ（以下、「最大ずれ量Δ_ｃ」という）を示している。
Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×βは、透過部の内縁の像２０ｂの位置が対物レンズの瞳９の外縁と一致するまでの間隔を表している。上述のように、透過部の内縁の像２０ｂの位置が対物レンズの瞳９の外縁と一致するまでは、像の明るさは変化しない。よって、図９に示すように、Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×βが小さくなると最大ずれ量Δ_ｃも小さくなる。
最大ずれ量Δ_ｃが小さくなると、より小さなずれ量Δを検出することができる。ここで、ずれ量Δと標本の表面における傾斜の大きさは比例関係になっている。よって、最大ずれ量Δ_ｃが小さくなると、より小さな傾斜を検出することができる。
上述のように、Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×βが小さくなるほど、最大ずれ量Δ_ｃが小さくなる。よって、Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×βが小さくなるほど、小さな傾斜を検出することができる。
また、図７（ｄ）に示すように、標本の表面の傾斜が大きくなると、遮光部の像の一部が対物レンズの瞳９の外側に位置する状態になる。この時、対物レンズの瞳９の外縁よりも外側に形成された透過部の像が、対物レンズの瞳９の内側に移動してくる。その結果、標本の表面が平坦な場合（表面の傾斜がゼロの場合）に比べて面積Ｓが大きくなるので、像の明るさが増大する。また、対物レンズの瞳９の外縁よりも外側に形成された透過部の像が、対物レンズの瞳９の内側に移動してくる間、像の明るさの増大が続く。
傾斜の変化に対する面積Ｓの増加割合、すなわち傾斜の変化に対する検出感度は、図９に示す各曲線における傾きで表される。図９に示すように、各曲線における傾きは、Ｇ_４＜Ｇ_３＜Ｇ_２＜Ｇ_１になっている。よって、Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×βが小さくなるほど、傾斜の変化に対する検出感度がより高くなる。
次に、Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂについて説明する。なお、Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×βは一定とする。
上述のように、標本の表面の傾斜が大きくなると、遮光部の像の一部が対物レンズの瞳９の外側に位置すると共に、対物レンズの瞳９の外縁よりも外側に形成された透過部の像が、対物レンズの瞳９の内側に移動してくる。その結果、標本の表面が平坦な場合に比べて面積Ｓが大きくなるので、像の明るさが増大する。また、対物レンズの瞳９の外縁よりも外側に形成された透過部の像が、対物レンズの瞳９の内側に移動してくる間、像の明るさの増大が続く。
図１０は、ずれ量Δと光束の量Ｉ（像の明るさ）の変化の関係を示す図である。ここでは、異なるＲ_１×β−Ｒ_ｏｂの値について、明るさの変化を示している。Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂの値は、ｇ_１＜ｇ_２＜ｇ_３＜ｇ_４である、また、Δ_ｍａｘ１〜Δ_ｍａｘ４は像の明るさが最大になるときの最大ずれ量Δ（以下、「最大ずれ量Δ_ｍａｘ」という）を示している。
Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂは、透過部の外縁の像２０ａの位置が対物レンズの瞳９の外縁と一致するまでの間隔を表している。よって、図１０に示すように、Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂが大きくなると最大ずれ量Δ_ｍａｘも大きくなる。
最大ずれ量Δ_ｍａｘも大きくなると、より大きなずれ量Δを検出することができる。ここで、ずれ量Δと標本の表面における傾斜量は比例関係になっている。よって、最大ずれ量Δ_ｍａｘが大きくなると、より大きな傾斜を検出することができる。傾斜量は、例えば面の法線と光軸とのなす角度で表すことができる。
ここで、上述のように、Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂが大きくなるほど、最大ずれ量Δ_ｍａｘが大きくなる。よって、Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂが大きくなるほど、大きな傾斜を検出することができる。
なお、Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂは、対物レンズの瞳９の外縁よりも外側に形成された透過部の像の大きさを示している。よって、Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂが大きくなるほど、単位面積あたりの照明光の光量が低下する。すなわち、Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂが大きくなるほど、照明光の利用効率が低下する。
以上のように、Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×βは像の明るさ、検出可能な最小傾斜量、傾斜の変化に対する検出感度に影響を及ぼし、Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂは検出可能な最大傾斜量、照明光の利用効率に影響を及ぼす。よって、Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×βとＲ_１×β−Ｒ_ｏｂについて、適切な比率を設定することが重要となる。
条件式（１）を満足することで、効率良く標本を照明することができ、しかも、標本における様々な角度の傾斜を、適切な明るさでコントラスト良く観察することができる。
条件式（１）の下限値を下回ると、対物レンズの瞳９の外縁と透過部の内縁の像２０ｂとの間隔が狭くなり過ぎる。そのため、標本が存在しない場合（標本の表面が平坦になっている場合を含む）の像が暗くなる。
あるいは、対物レンズの瞳９の外縁と透過部の外縁の像２０ａとの間隔が広くなり過ぎる。そのため、照明光の利用効率が低下する。
条件式（１）の上限値を上回ると、対物レンズの瞳９の外縁と透過部の内縁の像２０ｂとの間隔が広くなり過ぎる。この場合、遮光部の像が移動する範囲が広くなる。そのため、標本の表面の傾斜が大きい場合であっても、標本の表面の傾斜の変化（細やかな形状の変化）を、明暗の変化として検出することが難しくなる。このように、検出可能な最小傾斜量が大きくなるので、小さな傾斜を検出することが困難になる。
また、傾斜の変化に対する検出感度が低くなるので、例えば、標本が存在しない場合と標本が存在する場合とで、対物レンズの瞳９を通過する光量に差がつきにくくなくなる。その結果、標本像のコントラストが悪くなる。
また、表面に様々な傾斜を持つ標本では、表面の傾斜の変化をコントラスト良く観察することが難しくなる。
なお、Ｒａｔｉｏ≦０の場合、Ｒ_ｏｂ≦Ｒ_０×βになる。Ｒ_ｏｂ≦Ｒ_０×βの状態は、対物レンズの瞳９を遮光部２１の像が覆った状態である。この場合の観察は、暗視野観察になる。
また、１≦Ｒａｔｉｏの場合、Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂ≦Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×βになる。この場合、遮光部２１の像の一部が対物レンズの瞳９の外側に位置する前に、透過部の外縁の像２０ａが対物レンズの瞳９の内側に位置する。透過部の外縁の像２０ａよりも外側には照明光がないので、対物レンズの瞳９内の照明光は減少する。そのため、標本で光線の屈折が発生すると、像の明るさが暗くなる。その結果、標本面における凸状の部分を観察すると、その部分の像は凹状に見えてしまう。
標本の観察では、目視による観察と撮像素子を用いた観察がある。また、撮像素子としては、電子増倍を行う撮像素子と、電子増倍を行わない撮像素子がある。
電子増倍を行う撮像素子としては、例えば、電子増倍型ＣＣＤがある。電子増倍型ＣＣＤでは、信号の増幅を行う増倍レジスタを出力部に設け、光検出部で検出され電荷を増倍レジスタで増倍している。このようにすることで、電子増倍型ＣＣＤでは、標本からの光が微弱であっても、標本を画像化することができる。
条件式（１）を満足する標本観察装置では、電子増倍を行う撮像素子を用いることが好ましい。
なお、目視による観察を行う場合や、電子増倍を行わない撮像素子を用いる場合、本実施形態の標本観察装置では、以下の条件式（１’）を満足することが好ましい。
０．０１５≦Ｒａｔｉｏ≦０．９ （１’）
ここで、
Ｒａｔｉｏ＝（Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×β）／（Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂ）、
Ｒ_０は、照明光学系の光軸から透過部の内縁までの長さ、
Ｒ_１は、照明光学系の光軸から透過部の外縁までの長さ、
Ｒ_ｏｂは、対物レンズの瞳の半径、
βは、対物レンズの焦点距離をコンデンサレンズの焦点距離で割った値、
である。
条件式（１’）の技術的意義は、条件式（１）の技術的意義と同じである。
なお、条件式（１’）に代えて、以下の条件式（１’’）を満足すると良い。
０．０３≦Ｒａｔｉｏ＜０．８ （１’’）
また、条件式（１’）に代えて、以下の条件式（１’’’）を満足すると良い。
０．０５≦Ｒａｔｉｏ≦０．６ （１’’’）
さらに、条件式（１’）に代えて、以下の条件式（１’’’’）を満足するとより良い。
０．１≦Ｒａｔｉｏ≦０．４ （１−１’’’’）
上述のように、Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×βは像の明るさ、検出可能な最小傾斜量、傾斜の変化に対する検出感度に影響を及ぼし、Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂは検出可能な最大傾斜量、照明光の利用効率に影響を及ぼす。そこで、Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂの大きさに応じて、適切なＲａｔｉｏの範囲を設定することが好ましい。
図１１は、Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂとＲａｔｉｏについて好ましい範囲を示す図である。図１１において、斜線部以外の領域が好ましい範囲を示している。
図１１の左上の斜線部の領域では、Ｒ_１×β／Ｒ_ｏｂの値とＲａｔｉｏの値が小さい。Ｒ_１×β／Ｒ_ｏｂの値が小さいということは、Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂの値が小さいということである。そのため、Ｒａｔｉｏの値も小さいと、Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×βが小さくなる。Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×βの大きさは、標本に傾斜が無いときの像の明るさを示している。よって、この領域では、標本に傾斜が無いときの像の明るさが暗くなりすぎる。
また、図１１において、右下の斜線部の領域では、Ｒ_１×β／Ｒ_ｏｂの値とＲａｔｉｏの値が大きい。Ｒ_１×β／Ｒ_ｏｂの値が大きいということは、Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂの値が大きいということである。そのため、Ｒａｔｉｏの値も大きいと、Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×βが大きくなる。この場合、標本に傾斜が無いときの像の明るさは十分であるが、検出可能な最小傾斜量が大きくなってしまう。また、傾斜の変化に対する検出感度が低下してしまう。
このようなことから、本実施形態の標本観察装置では、１．０２≦Ｒ_１×β／Ｒ_ｏｂ＜１．０５のとき、以下の条件式（１−１）を満足することが好ましい。
０．１≦Ｒａｔｉｏ≦０．９ （１−１）
また、本実施形態の標本観察装置では、１．０５≦Ｒ_１×β／Ｒ_ｏｂ＜１．１５のとき、以下の条件式（１−２）を満足することが好ましい。
０．０５≦Ｒａｔｉｏ≦０．８ （１−２）
また、本実施形態の標本観察装置では、１．１５≦Ｒ_１×β／Ｒ_ｏｂ＜１．３のとき、以下の条件式（１−３）を満足することが好ましい。
０．０２５≦Ｒａｔｉｏ≦０．７ （１−３）
また、本実施形態の標本観察装置では、１．３≦Ｒ_１×β／Ｒ_ｏｂ＜１．６のとき、以下の条件式（１−４）を満足することが好ましい。
０．０１５≦Ｒａｔｉｏ≦０．６ （１−４）
また、本実施形態の標本観察装置では、１．６≦Ｒ_１×β／Ｒ_ｏｂ＜２のとき、以下の条件式（１−５）を満足することが好ましい。
０．０１５≦Ｒａｔｉｏ≦０．５ （１−５）
このように、Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂの大きさに応じて、適切なＲａｔｉｏの選択することで、本実施形態の標本観察装置では、効率良く標本を照明することができ、しかも、標本における様々な角度の傾斜を、適切な明るさでコントラスト良く観察することができる。
また、本実施形態の標本観察装置は、光源と、光学系と、物体を保持する保持部材と、を有し、光学系は、第１の光学系と、第２の光学系と、を有し、第１の光学系と第２の光学系は、保持部材を挟んで対向して配置され、第１の光学系は開口部材を有し、開口部材の透過部の像が、第２の光学系の瞳位置に形成されるように、光学系は構成され、以下の条件式（２）を満足することを特徴とする。
１．１≦Ｉ_０．１／Ｉ_０ （２）
ここで、
Ｉ_０．１は、△ｄ＝０．１×Ｒ_ｏｂのときに、第２の光学系の瞳を通過する光量、
Ｉ_０は、△ｄ＝０のときに、第２の光学系の瞳を通過する光量、
Δｄは、第２の光学系の瞳に対する開口部材の透過部の像のずれ量、
Ｒ_ｏｂは、第２の光学系の瞳の半径、
である。
条件式（２）を満足することで、効率良く標本を照明することができ、しかも、標本における様々な角度の傾斜を、適切な明るさでコントラスト良く観察することができる。
なお、条件式（２）に代えて、以下の条件式（２’）を満足すると良い。
１．３≦Ｉ_０．１／Ｉ_０ （２’）
また、条件式（２）に代えて、以下の条件式（２’’）を満足すると良い。
１．５≦Ｉ_０．１／Ｉ_０ （２’’）
また、本発明の標本観察方法は、対物レンズの光軸と交差するように、所定の幅の光束を標本に照射して標本を観察する方法であって、対物レンズの瞳位置に到達した所定の幅の光束が、標本が無い状態のときに以下の条件（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を満足することを特徴とする。
（Ａ）所定の幅の光束のうち、最も内側の光は対物レンズの瞳の内側に位置する。
（Ｂ）所定の幅の光束のうち、最も外側の光は対物レンズの瞳の外側に位置する。
（Ｃ）対物レンズの瞳の内側に位置する光束の幅は、対物レンズの瞳の外側に位置する光束の幅の０．００５倍以上、０．９倍以下である。
このようにすることで、効率良く標本を照明することができ、しかも、標本における様々な角度の傾斜を、適切な明るさでコントラスト良く観察することができる。
開口部材の変形例について説明する。上述のように、透過部の全ての場所で透過率が同じ場合、ずれ量Δが変化しても光束の量Ｉが変化しない状態（図７、矢印Ａから矢印Ｂまでの間）が生じる。そこで、透過部における透過率を場所によって異ならせることが好ましい。
このようにすることで、ずれ量Δが変化しても光束の量Ｉが変化しない状態を少なくすることができる。その結果、標本におけるより細やかな形状の変化（傾斜の変化）を、明暗の変化として検出することができる。
図１２は、対物レンズの瞳と開口部材の像の関係を示す図であって、（ａ）は標本が存在しない場合、（ｂ）は標本が存在する場合を示している。
図１２（ａ）に示すように、透過部の像３０の形状は円環で、対物レンズの瞳９の形状は円である。標本が存在しない場合、透過部の像３０と対物レンズの瞳９とが同心状になっている。また、透過部の像３０の中心と対物レンズの瞳９の中心とは一致している。
透過部の像３０は、領域３１と領域３２とからなる。領域３１は、対物レンズの瞳９の外縁から透過部の外縁の像３０ａまでの間の領域である。また、領域３２は、透過部の内縁の像３０ｂから対物レンズの瞳９の外縁までの間の領域である。そして、領域３１を形成する開口部材５の透過部の透過率が、領域３２を形成する開口部材５の透過部の透過率よりも高くなっている。
標本が存在しない場合、対物レンズの瞳９の外縁よりも内側には、領域３２のみが位置する状態になる。よって、この領域全体の面積が、標本像の明るさに対応する。
一方、標本が存在する場合、図１２（ｂ）に示すように、透過部の像３０と対物レンズの瞳９とは同心状になっていない。また、透過部の像３０の中心と対物レンズの瞳９の中心は一致していない。すなわち、対物レンズの瞳９の中心に対して、透過部の像３０の中心が紙面内の左方向にずれている。
この場合、領域３２の一部は、対物レンズの瞳９の外縁よりも外側に位置する。一方、領域３１の一部が、対物レンズの瞳９の外縁よりも内側に位置する。その結果、対物レンズの瞳９の外縁よりも内側には、領域３１と領域３２とが位置する。よって、この領域全体の面積が、標本像の明るさに対応する。
上述のように、標本が存在しない場合は、対物レンズの瞳９の外縁よりも内側に、領域３２のみが位置する。一方、標本が存在する場合は、対物レンズの瞳９の外縁よりも内側に、領域３１と領域３２とが位置する。そのため、標本が存在しない場合と標本が存在する場合とで、標本像の明るさに差が生じる。
標本が存在する場合、対物レンズの瞳９の外縁よりも内側では、領域３１の占める割合が増え、領域３２の占める割合が減る。よって、標本像の明るさは、標本が存在する場合の方が、標本が存在しない場合よりも明るくなる。
また、標本が存在しない場合と標本が存在する場合のいずれにおいても、遮光部の像は、対物レンズの瞳９の外縁よりも内側に位置している。それにもかかわらず、上述のように、標本が存在しない場合と標本が存在する場合とで、標本像の明るさに差が生じる。
ずれ量Δを変化させて、そのときの面積Ｓを求めた結果を図１３に示す。図１３において（ａ）は、対物レンズの瞳に対する開口部材の像のずれ量と、対物レンズの瞳を通過する光束の量との関係を示すグラフ、（ｂ）〜（ｄ）は、対物レンズの瞳に対する開口部材の像のずれを示す図である。ここで、（ｂ）はずれがない場合、（ｃ）はずれが少ない場合、（ｄ）はずれが多い場合、を示す。
図１３（ａ）では、Ｒ_０×β＝０．９７×Ｒ_ｏｂ、Ｒ_１×β＝１．１５×Ｒ_ｏｂで、計算を行っている。この場合、Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×β＝０．０３、Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂ＝０．１５なので、Ｒａｔｉｏ＝０．２である。
また、透過部は２つの領域に分かれており、内側の領域（透過率が低い領域３２、図１２）の透過率を５０％、外側の領域（透過率が高い領域３１、図１２）の透過率を１００％にしている。また、図１３（ａ）において、横軸と縦軸の数値は規格化されている。
また、図１３においても、対物レンズの瞳と開口部材の像の関係を示す図をＡ（図１３（ｂ））、Ｂ（図１３（ｃ））、Ｃ（図１３（ｄ））で示している。これらの図は、図７における対物レンズの瞳と開口部材の像の関係を示す図（Ａ、Ｂ、Ｃ）に対応するものなので、詳細な説明は省略する。
図７（ａ）と図１３（ａ）とを比較すると分かるように、透過部における透過率が場所によって異なる開口部材では、矢印Ａから矢印Ｂまでの間においても、ずれ量Δの変化に応じて光束の量Ｉが変化する。したがって、本実施形態の観察装置によれば、標本における細やかな形状の変化（傾斜の変化）を、明暗の変化として検出することができる。
なお、標本が存在しない場合、対物レンズの瞳９の内側に位置する透過部（透過率が低い領域３２、図１２）の透過率は、図１３（ｂ）〜（ｄ）では５０％で、図７（ｂ）〜（ｄ）では１００％である。このように、ずれがない場合の透過率は、図１３（ｂ）の方が図７（ｂ）よりも小さい。そのため、標本像の明るさは、図１３（ｂ）の方が図７（ｂ）よりも暗くなる。
なお、本実施形態の標本観察装置では、開口部材とは別の開口部材と、開口部材と別の開口部材とを移動させる移動機構を有していても良い。
このようにすることで、透過部の像の大きさや位置を変化させることができる。すなわち、開口部材を異なる開口部材に変更することで、光軸から透過部の内縁までの長さＲ_０や光軸から透過部の外縁までの長さＲ_１を、自由に変化させることができる。そのため、標本に応じて、陰影が最も良く発生するような照明状態を作り出すことができる。
さらに、位相差用対物レンズを使用する場合は以下の効果がある。照明開口に位相差観察用のリングスリットを用いれば位相差観察ができ、図２に示す開口部材を用いることで、本実施形態の標本観察装置による観察ができる。つまり、対物レンズを交換することなく、本実施形態の標本観察装置による観察と位相差観察とができる。なお、微分干渉観察やホフマンモジュレーションコントラスト観察などの方法でも、同様に対物レンズを交換することなく、本実施形態の標本観察装置による観察とこれらの観察ができる。
また、本実施形態の標本観察装置では、観察光学系は開口部材を有し、開口部材は対物レンズの瞳位置、あるいは対物レンズの瞳位置と共役な位置に配置されていても良い。
このようにすることで、透過部の像に対して、対物レンズの瞳の大きさを変化させることができる。そのため、標本に応じて、陰影を最も良く発生するようにできる。
また、ビネッティング（口径食）が生じると、標本の中心から出射して標本像の中心に到達する光束（以下、適宜、「軸上光束」という）と、標本の周辺から出射して標本像の周辺に到達する光束（以下、適宜、「軸外光束」という）とで、光束の大きさに違いが生じる。通常、ビネッティングが生じると、軸上光束の形状が円であるのに対して、軸外光束の形状は略楕円になる。
そのため、軸外光束において、対物レンズの瞳の外縁よりも内側に透過部の像が形成される、という状態が生じる。そうすると、ズレ量△と光束の量Ｉの関係は、標本像の中心と周辺とで異なる。
そこで、観察光学系に開口部材を配置することで、ビネッティングを小さくすることができる。このようにすると、軸外光束の形状を円にすることができる。そのため、軸外光束においても、対物レンズの瞳の外縁よりも内側に、透過部の内縁の像が形成され、対物レンズの瞳の外縁よりも外側に、透過部の外縁の像が形成される。その結果、ズレ量△と光束の量Ｉの関係は、標本像の周辺においても中心と同じ関係になる。よって、中心から周辺にわたって明るさのむらがない標本像が得られる。
なお、ビネッティングの小さい対物レンズを用いても同様の効果が得られる。ビネッティングの小さい対物レンズでは、ビネッティングの大きい対物レンズに比べて、レンズの外径が大きいレンズが用いられる。この場合、軸外光束の径と軸上光束の径との差が、少なくなる。その結果、中心から周辺にわたって明るさのむらがない標本像が得られる。このようなことから、ビネッティングの小さい対物レンズを用いることが好ましい。
図１４は、本実施形態の別の標本観察装置の構成を示す図である。なお、図１と同じ構成については同じ番号を付し、説明は省略する。
標本観察装置１１０は、開口部材５と開口部材５４とを備えている。開口部材５と開口部材５４は、移動機構５５に保持されている。移動機構５５としては、例えば、スライダーやターレットがある。移動機構５５がスライダーの場合、開口部材５と開口部材５４は、観察光学系の光軸と直交する方向に移動する。移動機構５５がターレットの場合、開口部材５と開口部材５４は、観察光学系の光軸と平行な軸を中心に回転する。
図１４では、１つの対物レンズしか図示されていないが、標本観察装置１１０は、複数の対物レンズを同時に保持することができる。例えば、対物レンズ８を第１の対物レンズとすると、標本観察装置１１０は、第２の対物レンズ、第３の対物レンズを保持することができる。３つの対物レンズは、互いに光学性能、例えば、倍率やＮＡが異なっている。
また、開口部材５と開口部材５４は、異なる開口であることが好ましい。そして、開口部材５の透過部は、第１の対物レンズの瞳の外縁よりも内側に透過部の内縁の像が形成され、かつ、第１の対物レンズの瞳の外縁よりも外側に、開口部材５の透過部の外縁の像が形成できるように形成されていることが好ましい。なお、開口部材５と開口部材５４とで開口が異なるとは、透過部の位置や大きさが、開口部材５と開口部材５４とで異なるということである。
また、開口部材５４は、第２の対物レンズに対応する透過部を有してもよい。すなわち、開口部材５４の透過部は、第２の対物レンズの瞳の外縁よりも内側に透過部の内縁の像が形成され、かつ、第２の対物レンズの瞳の外縁よりも外側に、開口部材５４の透過部の外縁の像が形成できるように形成されていることが好ましい。
また、開口部材５４により明視野観察する場合には、開口部材５４は、中央に透過部を有する構成であってもよい。また、開口部材５４により第１の対物レンズを用いて位相差観察する場合には、開口部材５４は、開口部材５の透過部の直径よりも小さい直径を有する透過部を備える構成であってもよい。
また、本実施形態の標本観察装置では、開口部材５と開口部材５４とは別に開口部材を備え、開口部材５４が位相差観察用の透過部を有し、別の開口部材が明視野観察用の透過部を有してもよい。
このように、本実施形態の標本観察装置では、様々な観察方法に応じた照明光を対物レンズに照射することができる。これにより、開口部材５や開口部材５４を用いて観察する際、標本の注目すべき領域があった場合に、開口部材を変更することで、当該領域について、位相差観察することや、明視野観察することが容易となる。
なお、開口部材は、透過部の透過領域を可変にする透過領域可変部を備えてもよい。透過領域可変部は、例えば、液晶シャッターで構成しても良い。このようにすれば、１つの開口で、開口部材５と開口部材５４とを実現できる。また、この場合、移動機構が不要になる。
また、標本観察装置１１０では、対物レンズの瞳９の位置に、開口部材５６が設けられている。なお、図１４では、見易さのために、対物レンズの瞳９の位置と開口部材５６の位置を離して描いている。
また、標本観察装置１１０では、照明光学系の光路、例えば、光源１とレンズ２と間に波長選択素子５７が挿脱可能になっていても良い。光源１が白色光の場合、波長範囲の広い光が光源１から出射する。そこで、波長選択素子５７を光路中に挿入することで、白色光よりも波長範囲の狭い光を照明光として取り出すことができる。なお、光源１を単色光源１’にしても良い。
また、標本観察装置１１０は、撮像素子５８と画像処理装置５９を備えていても良い。撮像素子５８は、例えば、ＣＣＤやＣＭＯＳである。撮像素子５８は像位置１１に配置される。撮像素子５８で撮像した標本像は、画像処理装置５９に送られる。画像処理装置５９では、コントラスト強調、ノイズ除去、色変換等の処理が行えるようになっている。
ところで、顕微鏡対物レンズはテレセントリック光学系である。そのため、コンデンサレンズもテレセントリック光学系になっている。従って、コンデンサレンズの瞳位置は、コンデンサレンズの前側焦点位置になる。ここで、上述のように、本実施形態の標本観察装置では、コンデンサレンズ４の焦点位置（前側焦点位置）に開口部材を配置している。これにより、コンデンサレンズの瞳位置において、照明光の中心部を遮光している。しかしながら、照明光の中心部を遮光する位置は、厳密にコンデンサレンズの瞳位置である必要は無く、コンデンサレンズの瞳位置近傍であれば良い。
ここで、開口部材とコンデンサレンズの瞳位置とのずれ（光軸方向のずれ）が大きくなると、透過部の像も対物レンズの瞳からずれていく。例えば、開口部材がコンデンサレンズの瞳位置と一致している場合、透過部の最も内側を通過する光線（以下、適宜、「光線Ｌ_ｉｎ」という）は、対物レンズの瞳の内側に到達する。ところが、開口部材がコンデンサレンズの瞳位置からずれていくと、光線Ｌ_ｉｎは、対物レンズの瞳の内側から外側に向かうようになる。すなわち、透過部の像が対物レンズの瞳からずれていく。
また、対物レンズを変えると、観察範囲が変化する。観察範囲が変化すると、光線Ｌ_ｉｎの光軸に対する角度も変化する。この角度が変化すると、対物レンズの瞳に到達する光線Ｌ_ｉｎの位置が変化する。すなわち、透過部の像が対物レンズの瞳からずれていく。その結果、陰影の発生が変化してしまう。
そこで、開口部材とコンデンサレンズの瞳位置とのずれの許容範囲は、観察範囲の変化を考慮して設定することになる。本実施形態の標本観察装置では、瞳位置近傍の範囲（許容範囲）は、コンデンサレンズの焦点距離の２０％以内であることが望ましい。この範囲であれば、標本の中心と周辺とで、陰影の発生方向や発生量の違いを小さくできる。なお、瞳位置近傍の範囲は、コンデンサレンズの焦点距離の１０％以内であればなお良い。
上述のように、図２（ａ）に示す開口部材５や図２（ｂ）に示す開口部材５’を用いた標本観察装置では、標本が無色透明であっても、陰影のある標本像を得ることができる。しかしながら、例えば、無色透明な標本と染色された標本とを、同時に（同一視野内で）観察しなければならない場合もある。
このような場合、染色された標本では、染色に応じた色や濃淡によって照明光が減衰されてしまう。そのため開口部材５や開口部材５’を用いた標本観察装置では、染色された標本の標本像が暗くなってしまい、染色された標本を明瞭に観察できない可能性がある。そのため、無色透明な標本と染色された標本の両方を良好に観察できるようにすることが好ましい。
このようなことから、本実施形態の標本観察装置では、開口部材は、減光部と、透過部と、を有しする。
図１５は開口部材の構成を示す図であって、透明な部材に減光部を設けた開口部材を示す図である。
図１５に示すように、開口部材２３０は、減光部２３１、遮光部２３２及び透過部２３３を有する。なお、遮光部２３２は、必ずしも必要ではない。開口部材２３０では、減光部２３１が照明光学系の光軸を含むように配置されている。また、透過部２３３は、減光部２３１の外縁よりも外側に位置している。
減光部２３１、遮光部２３２及び透過部２３３は透明な部材、例えば、ガラス板や樹脂板で構成されている。減光部２３１では、例えば、減光膜（薄膜）がガラス板上に形成されている。また、遮光部２３２は、例えば、遮光塗料をガラス板上に塗布することで形成されている。一方、透過部２３３には何も塗布されていない。よって、透過部２３３はガラス板そのものである。なお、開口部材２３０では、減光部２３１と透過部２３３とが接しているが、両者の間に遮光部を設けても良い。
開口部材２３０に入射した照明光は、透過部２３３では減光されないが、減光部２３１で減光される。開口部材２３０からは、円環状の照明光と円形の照明光とが出射する。ここで、円形の照明光は円環状の照明光よりも暗くなっている。開口部材２３０を用いると、無色透明な標本にも染色された標本にも、円環状の照明光と円形の照明光が照射される。なお、円形の照明光は、明視野観察時の照明光と同じである。
無色透明な標本では、円環状の照明光によって、陰影のある標本像（以下、適宜、陰影像とする）が形成される。一方、円形の照明光では、陰影像は形成されず、一定の明るさの光が像位置に到達する。その結果、標本像は、一定の明るさの光と陰影像とが重なったものになる。ただし、円形の照明光は、円環状の照明光よりも暗くなっている。よって、一定の明るさの光が陰影像に重なっても、陰影像のコントラストはそれほど低下しない。このようなことから、無色透明な標本については、陰影のある標本像を得ることができる。
一方、染色された標本では、円環状の照明光によって、陰影像が形成される。このとき、陰影像には、陰影が付くだけではなく、染色に応じた色や濃淡も加わる。一方、円形の照明光では、陰影像は形成されず、染色に応じた色や濃淡を持つ標本像（以下、適宜、濃淡像という）が形成される。その結果、標本像は、陰影像と濃淡像とが重なったものになる。ただし、円環状の照明光は、染色に応じた色や濃淡によって減衰される。よって、陰影像が濃淡像に重なっても、濃淡像のコントラストはそれほど低下しない。このようなことから、染色された標本については、染色に応じた色や濃淡を持つ標本像を得ることができる。
以上のように、開口部材２３０を用いることで、無色透明な標本と染色された標本の両方を良好に観察することができる。
また、本実施形態の標本観察装置は、画像処理装置を備えることが好ましい。図１６は、画像処理装置を備えた標本観察装置の構成を示す図である。
標本観察装置４００は、本体部４１０と、照明光学系４２０と、観察光学系４３０と、撮像装置４４０と、画像処理装置４５０と、を備える。
本体部４１０は、光源４１１と、ステージ４１２と、レボルバ４１３と、を備える。照明光学系４２０は、各種の光学フィルタ４２１と、視野絞り４２２と、ミラー４２３と、レンズ４２４と、開口部材４２５と、コンデンサレンズ４２６と、を備える。観察光学系４３０は、対物レンズ４３１と、結像レンズ４３３と、接眼レンズ４３４と、を備える。また、対物レンズ４３１の近傍には、対物レンズの瞳４３２が位置している。
本体部４１０には、光源４１１が接続されている。光源４１１を出射した照明光は、照明光学系４２０に入射してコンデンサレンズ４２６に到達する。ここで、開口部材４２５は、コンデンサレンズ４２６の瞳位置に配置されている。また、開口部材４２５には、例えば、図２（ａ）に示した開口部材５が用いられている。
コンデンサレンズ４２６の上方には、ステージ４１２が配置されている。また、ステージ４１２上に標本４６０が載置されている。更に、ステージ４１２の上方にはレボルバ４１３が位置し、レボルバ４１３に対物レンズ４３１が保持されている。
コンデンサレンズ４２６から出射した照明光は、標本４６０に照射される。標本４６０からの光は、対物レンズ４３１に入射する。ここで、対物レンズの瞳４３２と開口部材４２５は共役な関係になっている。よって、対物レンズの瞳４３２の位置に、開口部材４２５の像が形成される。
ここで、標本観察装置４００では、対物レンズ４３１の瞳の外縁よりも内側に、開口部材４２５の透過部の内縁の像が形成され、対物レンズ４３１の瞳の外縁よりも外側に、開口部材４２５透過部の外縁の像が形成されるようになっている。
そのため、標本４６０における形状の変化（傾斜の変化）に応じて、対物レンズ４３１を出射する結像光の光量が変化する。これにより、標本における形状の変化を明暗の変化として検出できる。その結果、標本が無色透明であっても、陰影のある標本像を得ることができる。
対物レンズ４３１を出射した結像光は、結像レンズ４３３によって集光され、集光位置に標本４６０の像が形成される。標本観察装置４００では、結像レンズ４３３に続いてプリズムが配置されている。このプリズムによって、結像光の一部は接眼レンズ４３４側に反射される。その結果、接眼レンズ４３４の近傍に、標本の光学像４３５が形成される。なお、接眼レンズ４３４による観察を行わない場合は、プリズムを光路外に移動させても良い。
一方、プリズムを通過した結像光は、撮像装置４４０に入射する。撮像装置４４０は撮像素子４４１を備えている。結像レンズ４３３によって、撮像素子４４１上に標本４６０の光学像が形成され、これにより標本４６０の光学像の撮像が行われる。このようにして、陰影のある標本画像が得られる。なお、結像レンズ４３３と撮像素子４４１との間に、光学系を配置しても良い。この場合、結像レンズ４３３とこの光学系によって、撮像素子４４１上に標本４６０の光学像が形成される。
また、撮像装置４４０には、カメラコントローラ４４２と、ビデオボード４４３と、が接続されている。また、カメラコントローラ４４２とビデオボード４４３は、共に画像処理装置４５０に接続されている。
撮像の制御は、カメラコントローラ４４２によって行われる。また、カメラコントローラ４４２の制御は、画像処理装置４５０によって行われる。なお、カメラコントローラ４４２の制御を、他の機器、例えばコンピュータによって行っても良い。また、撮像装置４４０から出力された画像信号は、ビデオボード４４３を介して画像処理装置４５０に入力される。画像処理装置４５０では、様々な電気的な処理が行われる。処理結果は、表示装置４５１に表示される。
標本観察装置が画像処理装置を備えることで、様々な画像処理を行うことができる。
なお、本発明は、その趣旨を逸脱しない範囲で様々な変形例をとることができる。例えば、図１、図１４及び図１６では、正立型顕微鏡を用いて本発明の標本観察装置を説明した。しかしながら、本発明の標本観察装置は倒立型顕微鏡であっても良い。すなわち、本発明は倒立型顕微鏡にも適用できる。

以上のように、本発明は、陰影の発生方向が限定されない標本観察装置及び標本観察方法に適している。また、本発明は、開口部材の位置調整が簡素な標本観察装置及び標本観察方法に適している。

１、１’ 光源
２、３ レンズ
４ コンデンサレンズ
５、５’ 開口部材
５ａ１、５ａ２、５’ａ１、５’ａ２ 遮光部
５ａ３ 接続部
５ｂ、５’ｂ 透過部
５ｃ 遮光部の外縁
５ｄ 遮光部の内縁
６ 保持部材
７ 標本
８ 対物レンズ
９ 対物レンズの瞳
１０ 結像レンズ
１１ 像位置
２０、３０ 透過部の像
２０ａ、３０ａ 透過部の外縁の像
２０ｂ、３０ｂ 透過部の内縁の像
２１ 遮光部の像
３１、３２ 領域
５４ 開口部材
５５ 移動機構
５６ 開口部材
５７ 波長選択素子
５８ 撮像素子
５９ 画像処理装置
１００、１１０ 標本観察装置
２３０ 開口部材
２３１ 減光部
２３２ 遮光部
２３３ 透過部
４００ 標本観察装置
４１０ 本体部
４１１ 光源
４１２ ステージ
４１３ レボルバ
４２０ 照明光学系
４２１ 光学フィルタ
４２２ 視野絞り
４２３ ミラー
４２４ レンズ
４２５ 開口部材
４２６ コンデンサレンズ
４３０ 観察光学系
４３１ 対物レンズ
４３２ 対物レンズの瞳
４３３ 結像レンズ
４３４ 接眼レンズ
４３５ 標本の光学像
４４０ 撮像装置
４４１ 撮像素子
４４２ カメラコントローラ
４４３ ビデオボード
４５０ 画像処理装置
４５１ 表示装置
４６０ 標本
Ｒ_０ 観察光学系の光軸から透過部の内縁までの長さ
Ｒ_１ 観察光学系の光軸から透過部の外縁までの長さ
Ｒ_ｏｂ 対物レンズの瞳の半径
β 倍率
Ｓ 面積
Δ ずれ量
Ｉ 光束の量

Claims (8)

1. 照明光学系と、観察光学系と、を備え、
   前記照明光学系は、光源と、コンデンサレンズと、開口部材と、を有し、
   前記観察光学系は、対物レンズと、結像レンズと、を有し、
   前記開口部材は、遮光部又は減光部と、透過部と、を有し、
   前記開口部材は、前記遮光部又は前記減光部が前記照明光学系の光軸を含むように配置され、
   前記透過部は、前記遮光部又は前記減光部の外縁よりも外側に位置し、
   前記開口部材の透過部の像が、前記対物レンズの略瞳位置に形成され、
   前記対物レンズの瞳の外縁よりも内側に、前記透過部の内縁の像が形成され、
   前記対物レンズの瞳の外縁よりも外側に、前記透過部の外縁の像が形成され、
   物体で生じた屈折によって、透過部の像が、前記対物レンズの瞳に対して偏心し、
   以下の条件式を満足することを特徴とする標本観察装置。
   ０．００５≦Ｒａｔｉｏ≦０．９
   １．１≦Ｉ_０．１／Ｉ_０
   ここで、
   Ｒａｔｉｏ＝（Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×β）／（Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂ）、
   Ｒ_０は、前記照明光学系の光軸から前記透過部の内縁までの長さ、
   Ｒ_１は、前記照明光学系の光軸から前記透過部の外縁までの長さ、
   Ｒ_ｏｂは、前記対物レンズの瞳の半径、
   βは、前記対物レンズの焦点距離を前記コンデンサレンズの焦点距離で割った値、
   Ｉ_０．１は、△ｄ＝０．１×Ｒ_ｏｂのときに、前記対物レンズの瞳を通過する光量、
   Ｉ_０は、△ｄ＝０のときに、前記対物レンズの瞳を通過する光量、
   △ｄは、前記対物レンズの瞳に対する前記開口部材の透過部の像のずれ量、
   である。
2. 以下の条件式を満足することを特徴とする請求項１に記載の標本観察装置。
   ０．０１５≦Ｒａｔｉｏ≦０．９
   ここで、
   Ｒａｔｉｏ＝（Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×β）／（Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂ）、
   Ｒ_０は、前記照明光学系の光軸から前記透過部の内縁までの長さ、
   Ｒ_１は、前記照明光学系の光軸から前記透過部の外縁までの長さ、
   Ｒ_ｏｂは、前記対物レンズの瞳の半径、
   βは、前記対物レンズの焦点距離を前記コンデンサレンズの焦点距離で割った値、
   である。
3. １．０２≦Ｒ_１×β／Ｒ_ｏｂ＜１．０５のとき、以下の条件式を満足することを特徴とする請求項２に記載の標本観察装置。
   ０．１≦Ｒａｔｉｏ≦０．９
   ここで、
   Ｒａｔｉｏ＝（Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×β）／（Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂ）、
   Ｒ_０は、前記照明光学系の光軸から前記透過部の内縁までの長さ、
   Ｒ_１は、前記照明光学系の光軸から前記透過部の外縁までの長さ、
   Ｒ_ｏｂは、前記対物レンズの瞳の半径、
   βは、前記対物レンズの焦点距離を前記コンデンサレンズの焦点距離で割った値、
   である。
4. １．０５≦Ｒ_１×β／Ｒ_ｏｂ＜１．１５のとき、以下の条件式を満足することを特徴とする請求項２に記載の標本観察装置。
   ０．０５≦Ｒａｔｉｏ≦０．８
   ここで、
   Ｒａｔｉｏ＝（Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×β）／（Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂ）、
   Ｒ_０は、前記照明光学系の光軸から前記透過部の内縁までの長さ、
   Ｒ_１は、前記照明光学系の光軸から前記透過部の外縁までの長さ、
   Ｒ_ｏｂは、前記対物レンズの瞳の半径、
   βは、前記対物レンズの焦点距離を前記コンデンサレンズの焦点距離で割った値、
   である。
5. １．１５≦Ｒ_１×β／Ｒ_ｏｂ＜１．３のとき、以下の条件式を満足することを特徴とする請求項２に記載の標本観察装置。
   ０．０２５≦Ｒａｔｉｏ≦０．７
   ここで、
   Ｒａｔｉｏ＝（Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×β）／（Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂ）、
   Ｒ_０は、前記照明光学系の光軸から前記透過部の内縁までの長さ、
   Ｒ_１は、前記照明光学系の光軸から前記透過部の外縁までの長さ、
   Ｒ_ｏｂは、前記対物レンズの瞳の半径、
   βは、前記対物レンズの焦点距離を前記コンデンサレンズの焦点距離で割った値、
   である。
6. １．３≦Ｒ_１×β／Ｒ_ｏｂ＜１．６のとき、以下の条件式を満足することを特徴とする請求項２に記載の標本観察装置。
   ０．０１５≦Ｒａｔｉｏ≦０．６
   ここで、
   Ｒａｔｉｏ＝（Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×β）／（Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂ）、
   Ｒ_０は、前記照明光学系の光軸から前記透過部の内縁までの長さ、
   Ｒ_１は、前記照明光学系の光軸から前記透過部の外縁までの長さ、
   Ｒ_ｏｂは、前記対物レンズの瞳の半径、
   βは、前記対物レンズの焦点距離を前記コンデンサレンズの焦点距離で割った値、
   である。
7. １．６≦Ｒ_１×β／Ｒ_ｏｂ＜２のとき、以下の条件式を満足することを特徴とする請求項２に記載の標本観察装置。
   ０．０１５≦Ｒａｔｉｏ≦０．５
   ここで、
   Ｒａｔｉｏ＝（Ｒ_ｏｂ−Ｒ_０×β）／（Ｒ_１×β−Ｒ_ｏｂ）、
   Ｒ_０は、前記照明光学系の光軸から前記透過部の内縁までの長さ、
   Ｒ_１は、前記照明光学系の光軸から前記透過部の外縁までの長さ、
   Ｒ_ｏｂは、前記対物レンズの瞳の半径、
   βは、前記対物レンズの焦点距離を前記コンデンサレンズの焦点距離で割った値、
   である。
8. 対物レンズの光軸と交差するように、所定の幅の光束を標本に照射して標本を観察する方法であって、
   前記対物レンズの瞳位置に到達した前記所定の幅の光束が、前記標本が無い状態のときに以下の条件（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）を満足することを特徴とする標本観察方法。
   （Ａ）前記所定の幅の光束のうち、最も内側の光は前記対物レンズの瞳の内側に位置する。
   （Ｂ）前記所定の幅の光束のうち、最も外側の光は前記対物レンズの瞳の外側に位置する。
   （Ｃ）前記光束を制限する開口部材の透過部の像が前記対物レンズの瞳付近に形成され、前記対物レンズの瞳の内側に位置する光束の幅は、前記対物レンズの瞳の外側に位置する光束の幅の０．００５倍以上、０．９倍以下である。
   （Ｄ）物体で生じた屈折によって、前記透過部の像が、前記対物レンズの瞳に対して偏心し、以下の条件式を満足する。
   １．１≦Ｉ_０．１／Ｉ_０
   ここで、
   Ｉ_０．１は、△ｄ＝０．１×Ｒ_ｏｂのときに、前記対物レンズの瞳を通過する光量、
   Ｉ_０は、△ｄ＝０のときに、前記対物レンズの瞳を通過する光量、
   △ｄは、前記対物レンズの瞳に対する前記開口部材の透過部の像のずれ量、
   Ｒ_ｏｂは、前記対物レンズの瞳の半径、
   である。