WO2020105554A1 - 顕微鏡装置 - Google Patents

顕微鏡装置

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WO2020105554A1
WO2020105554A1 PCT/JP2019/044855 JP2019044855W WO2020105554A1 WO 2020105554 A1 WO2020105554 A1 WO 2020105554A1 JP 2019044855 W JP2019044855 W JP 2019044855W WO 2020105554 A1 WO2020105554 A1 WO 2020105554A1
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WO
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microscope apparatus
pupil
image
optical system
intensity
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Application number
PCT/JP2019/044855
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French (fr)
Inventor
真市 林
Original Assignee
オリンパス株式会社
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Publication date
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    • G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G02B21/08—Condensers
    • G02B21/14—Condensers affording illumination for phase-contrast observation
    • G—PHYSICS
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    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
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    • H04N23/00—Cameras or camera modules comprising electronic image sensors; Control thereof
    • H04N23/80—Camera processing pipelines; Components thereof
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    • H04N9/00—Details of colour television systems
    • H04N9/64—Circuits for processing colour signals
    • H04N9/646—Circuits for processing colour signals for image enhancement, e.g. vertical detail restoration, cross-colour elimination, contour correction, chrominance trapping filters
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    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04N—PICTORIAL COMMUNICATION, e.g. TELEVISION
    • H04N9/00—Details of colour television systems
    • H04N9/64—Circuits for processing colour signals
    • H04N9/68—Circuits for processing colour signals for controlling the amplitude of colour signals, e.g. automatic chroma control circuits

Definitions

  • the disclosure of the present specification relates to a microscope device.
  • DIC method Differential interference observation method (Differential Interference Contrast microscopy, hereinafter referred to as DIC method) is known as one of the methods for observing living cells without staining.
  • the DIC method is an observation method that visualizes a sample with a contrast of brightness and darkness caused by interference of polarized light, and is described in Patent Document 1, for example.
  • the DIC method can obtain an image having a stereoscopic effect (hereinafter referred to as a phase gradient image) due to the brightness according to the phase gradient, and is therefore advantageous in that it is easy to grasp the growth state of living cells. ..
  • an object of one aspect of the present invention is to provide a technique that makes it possible to obtain a phase gradient image of a sample even if the sample is still contained in a plastic container. ..
  • a microscope apparatus includes an illumination optical system that illuminates a sample, an observation optical system that guides light from the sample, a pupil of the observation optical system, or a position optically conjugate with the pupil.
  • An intensity modulation unit provided in the intensity modulation unit, which diminishes incident light that has entered the intensity modulation unit, and the intensity of the intensity modulation unit in the pupil or in the image of the pupil.
  • the light utilization rate distribution which is the transmittance distribution, monotonically increases or monotonically decreases in the first direction.
  • a microscope apparatus includes an illumination optical system that illuminates a sample, an observation optical system that guides light from the sample, a pupil of the observation optical system, or an optical conjugate that is not optically conjugate to the pupil.
  • An intensity modulation unit provided at a position, the intensity modulation unit dimming incident light incident on the intensity modulation unit, and the intensity modulation unit in the pupil or in an image of the pupil.
  • the light utilization rate distribution which is the intensity reflectance distribution, monotonically increases or monotonically decreases in the first direction.
  • the phase gradient image of the sample can be obtained even when the sample is still contained in the plastic container.
  • FIG. 6 is a diagram for explaining the operation of the intensity modulator 15. It is the figure which illustrated the structure of the microscope apparatus 2. 6 is a diagram illustrating an intensity transmittance distribution of the intensity modulator 15. FIG. It is the figure which illustrated the structure of the microscope apparatus 3. It is a figure which illustrated the structure of the microscope apparatus 100 which concerns on 1st Embodiment. It is a figure which illustrated the effect of contrast emphasis processing. It is the figure which illustrated the range of the illumination luminous flux in a pupil surface.
  • FIG. 6 is a diagram showing an example of the relationship between the numerical aperture of an illumination optical system limited by an aperture stop and the contrast of an image.
  • FIG. 7 is a diagram showing another example of the relationship between the numerical aperture of the illumination optical system limited by the aperture stop and the contrast of an image. It is a figure for explaining a three-dimensional shape display method. It is a figure which illustrated the structure of the microscope apparatus 300 which concerns on 2nd Embodiment. It is a figure showing an example of a relation of a setup of an intensity modulation part, and an image.
  • FIG. 9 is a diagram showing another example of the relationship between the setting of the intensity modulator and the image. It is a figure for explaining a three-dimensional shape display method. It is the figure which showed the example which arranged the some gradation filter from which a direction differs. It is the figure which showed the example which changes the angle of a gradation filter.
  • FIG. 6 is a diagram showing a relationship between an aperture position of an aperture stop and movement of an image due to defocus.
  • FIG. 8 is another diagram showing the relationship between the aperture position of the aperture stop and the movement of the image due to defocusing.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating the configuration of the microscope apparatus 1.
  • the microscope apparatus 1 shown in FIG. 1 is an apparatus for obtaining a phase gradient image similar to the image obtained by a differential interference microscope.
  • the microscope apparatus 1 includes an illumination optical system 12 that illuminates the sample 13, an observation optical system 14 that guides the light from the sample 13 to the image sensor 16, and an intensity modulator 15 that diminishes incident light.
  • the microscope apparatus 1 may further include a light source 11 that emits illumination light, an image sensor 16, and a display device 17 that displays an image of the sample 13.
  • the illumination optical system 12 illuminates the sample 13 with the illumination light emitted from the light source 11.
  • the illumination optical system 12 includes one or more lenses.
  • the sample 13 is a phase object that causes a phase change in incident light.
  • the sample 13 is, for example, an unstained biological sample.
  • the observation optical system 14 guides the light transmitted through the sample 13 to the image sensor 16 and forms an optical image of the sample 13 on the light receiving surface of the image sensor 16.
  • the observation optical system 14 includes a lens 14a and a lens 14b.
  • the intensity modulator 15 is provided in the pupil of the observation optical system 14 and attenuates the incident light entering the intensity modulator 15.
  • the intensity transmittance distribution of the intensity modulator 15 in the pupil of the observation optical system 14 monotonically increases or monotonically decreases in a specific direction (hereinafter referred to as the first direction). It is desirable that this monotonous increase or monotonic decrease be achieved in the pupil plane of the observation optical system 14 at least within the range of the region through which the illumination light flux passes.
  • direction is defined by a straight line
  • direction is defined by an arrow. That is, for example, the north-south direction is one direction, but the north-facing direction is different from the south-facing direction.
  • one of two directions defined by a certain direction is expressed as a positive direction of a certain direction
  • the other of the two directions is expressed as a negative direction of a certain direction. That is, for example, the north direction is expressed as a north-south positive direction
  • the south direction is expressed as a north-south negative direction. Note that the positive and negative values have no meaning. Therefore, the north direction may be expressed as the negative direction in the north-south direction and the south direction may be expressed as the positive direction in the north-south direction.
  • “monotonically increasing” or “monotonically decreasing” means not only a case of continuously and monotonically increasing or decreasing, but also a step of monotonically increasing or monotonically decreasing in steps of at least three steps or more. Including. That is, that the intensity transmittance monotonously increases in the first direction means that the differential value of the intensity transmittance distribution with respect to the position in the first direction is 0 or more regardless of the position in the first direction. Further, that the intensity transmittance monotonously decreases in the first direction means that the differential value of the intensity transmittance distribution with respect to the position in the first direction is 0 or less regardless of the position in the first direction.
  • the intensity modulator 15 may include, for example, a transmission type neutral density filter having an intensity transmittance distribution. In that case, the intensity transmittance distribution in the pupil monotonically increases or monotonically decreases in the first direction.
  • the neutral density filter is, for example, a gradation filter or an ND (Neutral Density) filter.
  • the light source 11 emits illumination light that illuminates the sample 13.
  • the light source 11 is, for example, a halogen lamp.
  • the image sensor 16 is an example of an image acquisition unit that acquires image data of the sample 13 based on the light from the sample 13 guided by the observation optical system 14.
  • the image sensor 16 is, for example, a CCD (Charge-Coupled Device) image sensor or a CMOS (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor) image sensor.
  • the display device 17 displays a phase gradient image of the sample 13 similar to the image obtained by the differential interference microscope.
  • the display device 17 is, for example, a liquid crystal display, an organic EL (OLED) display, a CRT (Cathode Ray Tube) display, or the like.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining the operation of the intensity modulator 15.
  • the light transmitted through the sample 13 is dimmed by the intensity modulator 15 with an intensity transmittance corresponding to the phase gradient of the sample 13.
  • FIG. 2 shows a luminous flux emitted from the optical axis of the illumination luminous flux emitted from the light source 11.
  • the light flux emitted from the optical axis is converted into a parallel light flux parallel to the optical axis by the illumination optical system 12 and applied to the sample 13. Therefore, when the sample 13 has no phase gradient, the parallel light flux parallel to the optical axis is emitted from the sample 13 and condensed at the pupil position. Therefore, the entire light flux is dimmed with the same intensity transmittance in the intensity modulator 15 regardless of the area of the sample 13 that has passed through.
  • FIG. 2 when the sample 13 has a phase gradient, the light flux incident on the sample 13 is refracted by the phase gradient of the sample 13.
  • the light rays forming the light flux will pass through different positions on the pupil plane according to the phase gradient generated in the passed region in the sample 13, and as a result, the intensity modulation unit arranged on the pupil plane.
  • the light is dimmed at 15 with different intensity transmittances.
  • the sample 13 does not have a local phase gradient with respect to the rays passing through the points S1, S3, and S5. Therefore, these light rays are not refracted by the sample 13, enter the observation optical system 14 as light rays parallel to the optical axis, and all pass through the point F2 on the intensity modulation section 15. As a result, the light rays passing through the points S1, S3, and S5 are all dimmed by the intensity modulator 15 with a medium intensity transmittance, and the points P5, P3, and P1 on the image sensor 16 are respectively reduced. Incident on.
  • the shade of the intensity modulator 15 shown in FIG. 2 indicates the intensity transmittance
  • the shade of the image sensor 16 shown in FIG. 2 indicates the light intensity on the light receiving surface of the image sensor 16.
  • the sample 13 has a local phase gradient with respect to the ray passing through the point S2. Therefore, the light ray passing through the point S2 is refracted by the sample 13, enters the observation optical system 14 as a light ray inclined with respect to the optical axis, and passes through a point F3 different from the point F2 on the intensity modulator 15. .. As a result, the light ray passing through the point S2 is dimmed with a low intensity transmittance in the intensity modulator 15 and enters the point P4 on the image sensor 16.
  • the sample 13 has a local phase gradient of a sign opposite to that of the ray passing through the point S4 with respect to the ray passing through the point S4. Therefore, the light ray passing through the point S4 is refracted in the sample 13 in the opposite direction to the light ray passing through the point S2 and is observed as a light ray inclined in the opposite direction to the light ray passing through the point S2 with respect to the optical axis. It is incident on the system 14. As a result, the light ray that passes through the point S4 passes through the point F1 on the intensity modulator 15 that is located on the opposite side of the point F3 with respect to the point F2. Therefore, the light ray passing through the point S4 is dimmed with high intensity transmittance in the intensity modulator 15 and is incident on the point P2 on the image sensor 16.
  • the microscope apparatus 1 As described above, in the microscope apparatus 1, the light beam passing through the sample 13 passes through different positions on the pupil plane according to the local phase gradient of the sample 13. Furthermore, in the microscope apparatus 1, since the intensity transmittance that monotonously increases or decreases is assigned to the pupil plane, the light intensity is modulated with the intensity transmittance according to the local phase gradient on the pupil plane. Therefore, according to the microscope apparatus 1, it is possible to form an optical image having a light intensity corresponding to the phase gradient on the image sensor 16, and obtain a phase gradient image similar to the image obtained by the differential interference microscope. You can
  • the microscope apparatus 1 a phase gradient image can be obtained only by providing the intensity modulator 15 on the pupil plane. Therefore, it is not necessary to use an expensive Nomarski prism, which was necessary in the differential interference microscope. Further, unlike the differential interference microscope, it is not necessary to use a dedicated objective lens and a dedicated condenser lens. Therefore, the microscope apparatus 1 can be easily expanded from the existing microscope and can be constructed at a lower cost than the differential interference microscope.
  • the image is contrasted by utilizing the refraction of light caused by the phase gradient without using the polarization characteristic. Therefore, even if plastic that disturbs the plane of vibration of polarized light is placed on the optical path, it does not affect the observation. Therefore, according to the microscope apparatus 1, unlike the differential interference microscope, a plastic container can be used, and a phase gradient image of the sample 13 can be obtained even when the sample 13 is still contained in the plastic container. it can.
  • the intensity modulator 15 is arranged in the pupil of the observation optical system 14
  • the location of the intensity modulator 15 is not limited to the pupil of the observation optical system 14.
  • it may be arranged at the pupil of the illumination optical system 12.
  • the lenses 12a and 12b are lenses that constitute the illumination optical system 12. Also in this case, since the pupil of the observation optical system 14 and the pupil of the illumination optical system 12 are optically conjugate, the same effect can be obtained.
  • the intensity modulator 15 may be provided at the pupil of the observation optical system 14 or at a position optically conjugate with the pupil of the observation optical system 14. Then, when the intensity modulator 15 is provided at a position optically conjugate with the pupil of the observation optical system 14, within the image of the pupil of the observation optical system 14 projected at a position optically conjugate with the pupil.
  • the intensity transmissivity distribution of the intensity modulator 15 in 1 may be monotonically increasing or monotonically decreasing in the first direction.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating the intensity transmittance distribution of the intensity modulator 15.
  • the intensity modulator 15 has an intensity transmittance distribution represented by the following equation (1), for example.
  • T represents the intensity transmittance distribution
  • ⁇ represents the position in the first direction in the pupil plane.
  • the second-order differential value of the intensity transmittance distribution shown in equation (1) with respect to the position in the first direction is positive. If the second-order differential value of the intensity transmittance distribution in the pupil with respect to the position in the first direction is positive, the contrast of the phase gradient image can be improved more than when the intensity transmittance changes linearly with respect to the position. it can. Therefore, it is desirable that the second-order differential value of the intensity transmittance distribution in the pupil with respect to the position in the first direction be positive.
  • the intensity transmittance distribution shown in equation (1) is an exponential function of the position in the first direction. If the intensity transmittance distribution in the pupil is an exponential function of the position in the first direction, the intensity transmittance acting on the light ray passing through the flat portion of the sample 13 and the intensity transmission acting on the light ray passing through the inclined portion of the sample 13 The ratio with the ratio is constant regardless of the angle of the light beam incident on the sample 13.
  • the illumination light flux emitted from the optical axis of the light source 11 and incident on the sample 13 in parallel with the optical axis is illustrated, but the illumination light flux emitted from outside the optical axis of the light source 11 is oblique to the sample 13. Incident on.
  • the obliquely incident illumination light flux passes through the intensity modulation unit 15 at a position parallel to the illumination light flux incident in parallel by a predetermined distance. If the intensity transmittance distribution is an exponential function, the ratio of two intensity transmittances at positions separated by a certain distance on the pupil plane is maintained at a constant value regardless of the position. Therefore, the illumination light flux incident in parallel and the illumination light flux incident obliquely form an optical image with the same contrast ratio.
  • the light incident on the image pickup device 16 is a set of illumination light fluxes from each point on the light source 11. Therefore, by realizing the same contrast ratio among the respective illumination light fluxes, it is possible to realize a high contrast without canceling the contrasts with each other. Therefore, it is desirable that the intensity transmittance distribution in the pupil is an exponential function of the position in the first direction.
  • the microscope apparatus 3 shown in FIG. 5 has an aperture stop arranged at a position optically conjugate with the intensity modulator 15.
  • the observation optical system 14 uses the light beams emitted from the observation optical system 14 and corresponding to the apertures smaller than the aperture of the intensity modulation unit 15 to optically reflect the sample 13.
  • An image can be formed. This makes it possible to obtain an optical image having a higher contrast than in the case where an optical image is formed by a light beam that passes through all the openings of the intensity modulator 15.
  • the contrast can be adjusted by adjusting the aperture diameter of the aperture stop 18.
  • FIG. 5 shows an example in which the intensity modulator 15 is provided on the illumination optical path from the light source 11 to the sample 13 and the aperture stop 18 is provided on the detection optical path from the sample 13 to the image sensor 16.
  • the section 15 may be arranged on the detection optical path, and the aperture stop 18 may be arranged on the illumination optical path. This is because the aperture stop 18 can narrow the luminous flux incident on the image pickup device 16 regardless of whether it is arranged on the illumination optical path or the detection optical path, and it is possible to obtain the same effect. ..
  • the numerical aperture of the illumination optical system 12 is preferably smaller than the numerical aperture of the observation optical system 14 on the object side.
  • the numerical aperture of the illumination optical system 12 is preferably, for example, 90% or less of the numerical aperture of the observation optical system 14 on the object side.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating the configuration of the microscope apparatus 100 according to this embodiment.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating the effect of the contrast enhancement process.
  • FIG. 8 is a diagram exemplifying the range of the illumination light flux on the pupil plane.
  • 9 and 10 are diagrams illustrating the relationship between the numerical aperture of the illumination optical system limited by the aperture stop and the image contrast.
  • FIG. 11 is a diagram for explaining the three-dimensional shape display method.
  • the microscope device 100 includes an inverted microscope including an adapter 130 between a mirror base 110 and a lens barrel 120, a camera 140, a control device 150, and a display device 160.
  • the mirror base 110 includes a light source 111, a condenser 113 having an aperture stop 112, a stage 114, an objective lens 115, a nosepiece 116, and an imaging lens 117.
  • the lens barrel 120 is a monocular or binocular lens barrel and includes an eyepiece lens 121.
  • the aperture stop 112 is composed of a blade stop or the like, and the aperture diameter can be adjusted.
  • the adapter 130 includes an optical path switching mirror 136.
  • the optical path switching mirror 136 By changing the position of the optical path switching mirror 136, the visual observation state in which the optical image formed by the imaging lens 117 is projected to the front focal position of the eyepiece lens 121, and the optical image formed by the imaging lens 117 is displayed on the camera 140. It is possible to switch between the shooting state for projection.
  • the adapter 130 further includes a relay lens 131, a gradation filter 132, a slider 133, a dial 134, and a relay lens 135.
  • the slider 133 on which the gradation filter 132 is installed is provided between the relay lens 131 and the relay lens 135. By inserting the slider 133 to a predetermined position, the image of the aperture stop 112 is displayed on the gradation filter 132. Projected.
  • the gradation filter 132 is an example of the intensity modulator described above, and has an intensity transmittance that monotonically increases or decreases in a specific direction. Further, the gradation filter 132 changes its orientation in conjunction with the rotation of the dial 134 provided on the slider 133. Therefore, the user can adjust the direction in which the intensity transmittance monotonously increases or decreases by operating the dial 134.
  • the camera 140 is an image acquisition unit that acquires image data of the sample based on the light from the sample guided by the observation optical system.
  • the camera 140 may perform enhancement processing for enhancing the contrast of the image of the sample displayed on the display device 160, based on the image data. That is, the camera 140 is an image acquisition unit and may be a contrast enhancement unit.
  • the control device 150 is a control device that controls the camera 140 and includes a dial 151.
  • the microscope apparatus 100 can adjust the amount of contrast enhancement in the enhancement processing.
  • the control device 150 may be a control device that controls the display device 160.
  • the display device 160 may perform an enhancement process for enhancing the contrast of the image of the sample displayed on the display device 160 based on the image data.
  • the display device 160 includes a contrast enhancement unit 161 that enhances the contrast of the image of the sample based on the image data.
  • an optical image having a light intensity corresponding to the phase gradient of the sample can be formed on the camera 140 by the intensity transmittance distribution of the gradation filter 132. Therefore, as shown in FIG. 7, an image 202 and an image 203, which are phase gradient images similar to the image 201 obtained by the differential interference microscope, can be obtained.
  • the images 201, 202, and 203 are images of two large and small hemispherical specimens.
  • the image 202 is an image before the contrast is enhanced by the camera 140
  • the image 203 is an image after the contrast is enhanced by the camera 140.
  • the gradation filter 132 converts the phase gradient into contrast, and further the contrast is emphasized by image processing. Thereby, as shown in the image 203 of FIG. 7, it is possible to obtain an image in which the phase gradient is sufficiently visually recognized as the contrast.
  • a phase gradient image can be obtained by simply adding the adapter 130 to the existing microscope. Moreover, a phase gradient image can be obtained without utilizing the polarization characteristics. Therefore, according to the microscope apparatus 100, the phase gradient image of the sample can be obtained while being housed in the plastic container with an inexpensive configuration.
  • the region D2 where the illumination light flux passes is within the pupil D1 of the objective lens 115. It can fit. For this reason, it is possible to suppress the change in contrast depending on the angle of incident light, and it is possible to obtain high contrast. Also, the contrast can be adjusted.
  • Images 204 to 208 shown in FIG. 9 are images before the contrast is enhanced by the image processing, and the numerical aperture (NA) of the illumination optical system limited by the aperture stop 112 is changed from 0.55 to 0.1. It is an image when it is made small.
  • images 209 to 213 shown in FIG. 10 are images after the contrast is enhanced by image processing, and the numerical aperture (NA) of the illumination optical system limited by the aperture stop 112 is 0.55 to 0.1. It is an image when it is gradually reduced to.
  • the contrast can be enhanced as the numerical aperture of the illumination optical system limited by the aperture stop 112 is reduced.
  • the contrast is emphasized too much, the stereoscopic effect is lost. Therefore, it is desirable to adjust the aperture stop 112 in view of the balance between the contrast and the stereoscopic effect.
  • the defocus characteristic changes according to the contrast. If the contrast is too strong, not only the image becomes blurred but also ringing becomes noticeable as the defocus amount increases. Therefore, it is desirable to adjust the aperture stop 112 in consideration of defocus characteristics in addition to contrast and stereoscopic effect.
  • the numerical aperture of the illumination optical system limited by the aperture stop 112 is preferably 90% or less of the numerical aperture on the object side of the objective lens 115.
  • the direction of the gradation filter 132 can be changed by rotating the dial 134. This makes it possible to adjust the direction in which contrast is provided in the phase gradient image, that is, the direction in which the phase gradient is detected.
  • two phase gradient images image 214 and image 215) may be acquired with the orientation of the gradation filter 132 being different by 90 degrees.
  • image 216 By processing the two phase gradient images having different 90-degree azimuths, it is possible to compensate for the lack of information due to the phase gradient detection direction. Therefore, as shown in image 216, the three-dimensional shape of the sample is more accurate. Can be displayed in.
  • FIG. 12 is a diagram illustrating the configuration of the microscope apparatus 300 according to the present embodiment.
  • 13 and 14 are diagrams illustrating the relationship between the setting of the intensity modulator and the image.
  • FIG. 15 is a diagram for explaining the three-dimensional shape display method.
  • the microscope apparatus 300 is different from the microscope apparatus 100 in that an adapter 330 is provided instead of the adapter 130, a control device 180 is provided instead of the control device 150, and a display device 190 is provided instead of the display device 160. ..
  • the other points are similar to those of the microscope apparatus 100.
  • the control device 180 includes a dial 181 for adjusting the contrast enhancement process performed by the camera 140 or the display device 190, and a dial 182 for adjusting the saturation enhancement process performed by the camera 140 or the display device 190.
  • the display device 190 includes a saturation enhancement unit 192 that performs a saturation enhancement process, in addition to a contrast enhancement unit 191 that performs a contrast enhancement process.
  • the saturation enhancement unit 192 performs processing for enhancing the saturation of the image of the sample displayed on the display device 190 based on the image data.
  • the adapter 330 is different from the adapter 130 in that a slider 333 is provided instead of the slider 133.
  • the slider 333 is arranged on the optical path between the relay lens 131 and the relay lens 135, and is provided with a plurality of gradation color filters (gradation color filter 332a, gradation color filter 332b).
  • gradation color filter 332a gradation color filter 332a
  • gradation color filter 332b gradation color filter
  • the gradation color filter 332a and the gradation color filter 332b are examples of a plurality of intensity modulation elements having different spectral transmittance distributions (spectral intensity transmittance distributions).
  • the gradation color filter 332a has an intensity transmittance that monotonically increases or decreases in a specific direction with respect to the first wavelength.
  • the gradation filter 332b has an intensity transmittance that monotonically increases or monotonically decreases in a specific direction with respect to a second wavelength different from the first wavelength.
  • the first wavelength is, for example, a red wavelength
  • the second wavelength is, for example, a blue wavelength.
  • the direction of the gradation color filter 332a can be changed by rotating the dial 334a provided on the slider 333.
  • the orientation of the gradation color filter 332b can be changed by rotating the dial 334b provided on the slider 333.
  • the microscope apparatus 300 configured as described above, since it is possible to reduce the light intensity according to the phase gradient in the intensity modulation unit including a plurality of gradation color filters, it is possible to obtain with a differential interference microscope as in the microscope apparatus 100. A phase gradient image similar to the image can be obtained.
  • the dials 334a and 334b are operated to direct the directions of the two gradation color filters in opposite directions, so that as shown in FIG.
  • the 1-intensity transmittance distribution monotonically increases in the positive direction of the first direction
  • the second intensity transmittance distribution for the second wavelength of the intensity modulator in the pupil monotonically increases in the negative direction of the first direction.
  • the image 217 it is possible to obtain a phase gradient image having different colors depending on the sign of the phase gradient in the first direction. Specifically, for example, an image in which red becomes dark in the direction of arrow A1 and blue becomes dark in the direction of arrow A2 can be obtained.
  • the shape of the sample in particular, the unevenness, by the difference in color in addition to the shade, and the positive and negative of the phase gradient by the difference in color. For this reason, the shape of the sample can be recognized correctly more easily than the microscope apparatus 100.
  • the dials 334a and 334b are operated to shift the directions of the two gradation color filters by 90 degrees, for example, so that the first wavelength of the intensity modulator in the pupil can be adjusted as shown in FIG.
  • the first intensity transmittance distribution monotonously increases or decreases monotonically in the first direction
  • the second intensity transmittance distribution for the second wavelength of the intensity modulator in the pupil monotonically increases or monotonously in a direction different from the first direction. Decrease.
  • a phase gradient image having different hues (color balance) depending on the direction of the phase gradient can be obtained.
  • an image in which red becomes darker in the direction of arrow A3 and blue becomes darker in the direction of arrow A4 can be obtained. Therefore, it is possible to recognize the shape of the sample, particularly the two-dimensional distribution in the thickness direction, based on the difference in color in addition to the shade, and also the direction of the phase gradient due to the difference in hue. For this reason, the shape of the sample can be recognized correctly more easily than the microscope apparatus 100.
  • the phase gradient image acquired by the camera 140 may be decomposed into an R component image 219, a G component image 220, and a B component image 221, as shown in FIG.
  • the three-dimensional shape of the sample can be specified by detecting the phase gradients in different directions from these images, and the three-dimensional shape of the specified sample can be stereoscopically displayed as shown in the image 222.
  • the gradation color filter 332a and the gradation color filter 332b have different directions or directions in which the intensity transmittance monotonously increases or decreases, but they may be oriented in the same direction.
  • the slider 133 may be provided with an intensity modulator including a plurality of intensity modulators.
  • the plurality of intensity modulation elements are a plurality of gradation filters (gradation filter 132a, gradation filter 132b, gradation filter 132c, gradation filter 132d) having intensity transmittance distributions in which the directions of monotonous increase or monotonic decrease are different from each other.
  • FIG. 6 shows an example in which the dial 134 that rotates the intensity modulating unit functions as a changing unit that changes the intensity transmittance distribution of the intensity modulating unit in the pupil or in the image of the pupil.
  • the slider 133 is changed.
  • the change means is not limited to these examples.
  • the changing unit may be a rotating shaft 132e that changes the angle of the intensity modulator (gradation filter 132) with respect to the optical axis of the observation optical system.
  • FIG. 18 is a diagram illustrating the configuration of the microscope apparatus 400 according to the present embodiment.
  • the microscope apparatus 400 differs from the microscope apparatus 100 in that an adapter 430 is provided instead of the adapter 130.
  • the other points are similar to those of the microscope apparatus 100.
  • Adaptor 430 is different from adapter 130 in that variable focus optical system 431 is provided instead of relay lens 131, and guide 432 that guides slider 133 is provided.
  • the variable focus optical system 431 is included in the observation optical system and is arranged on the optical path between the gradation filter 132 and the sample.
  • the focal length of the variable focus optical system 431 By changing the focal length of the variable focus optical system 431, the size of the image of the pupil of the objective lens 115 projected on the gradation filter 132 changes. Therefore, by changing the focal length of the variable focus optical system 431, it is possible to adjust which range of the intensity transmittance distribution of the gradation filter 132 is used. Further, a change in the pupil diameter due to the replacement of the objective lens can be dealt with by changing the focal length of the variable focus optical system 431.
  • the guide 432 is an example of a moving unit that moves the gradation filter 132 in the optical axis direction by guiding the movement of the slider 133 in the optical axis direction.
  • the intensity modulation unit includes a gradation filter
  • the intensity modulation unit is not limited to the gradation filter.
  • a spatial light modulator 500 in which a plurality of pixels 501 are arranged in a lattice may be used, and the spatial light modulator 500 monotonously increases or decreases monotonically in the intensity transmittance distribution. May be realized.
  • FIG. 20 is a diagram illustrating the configuration of the microscope apparatus 600 according to the present embodiment.
  • the microscope main body 610, the computer 640, and the display device 160 are provided.
  • the PMT 631 and the computer 640 form an image acquisition unit 650.
  • the microscope main body 610 is an extension of the laser scanning microscope, and it is possible to obtain a confocal image by cooperating with the computer 640.
  • the beam diameter of the laser light emitted from the laser light source 611 is expanded by the beam expander 612, and then the laser light is attached to the nosepiece 617 via the aperture stop 613, the dichroic mirror 614, the galvano mirror 615, and the relay lens 616. It is incident on the formed objective lens 618.
  • an objective lens 619 having a different magnification is attached to the nose piece 617.
  • the objective lens 618 collects the laser light and irradiates it onto one point of the cultured cells 622 in the plastic petri dish 621 placed on the stage 620.
  • the focus position of the laser light can be controlled by the deflection direction of the laser light at the galvano mirror 615. Therefore, the cultured cells 622 can be two-dimensionally scanned by controlling the galvanometer mirror 615.
  • Fluorescence is generated in the cultured cells 622 irradiated with the laser light, and enters the dichroic mirror 614 via the objective lens 618, the relay lens 616, and the galvano mirror 615. After that, the fluorescence reflected by the dichroic mirror 614 is irradiated onto the confocal diaphragm 624 by the lens 623, and only the fluorescence generated from the focus position passes through the pinhole provided in the confocal diaphragm 624, and the photomultiplier tube ( Hereinafter, it will be referred to as PMT.) 625.
  • PMT. photomultiplier tube
  • the computer 640 obtains a confocal image by two-dimensionally mapping the signal output from the PMT 625 during the scanning of the cultured cells 622 using the scanning position of the laser light.
  • the microscope body 610 further includes a universal condenser 626, a lens 630, and a PMT 631.
  • the turret of the universal capacitor 626 houses a plurality of modulation elements (modulation element 627, modulation element 628, and modulation element 629), and a modulation element selected from the plurality of modulation elements can be arranged on the optical path. it can.
  • At least one of the plurality of modulators housed in the universal capacitor 626 is an intensity modulator.
  • the modulation element 628 is, for example, a gradation filter having an intensity transmittance distribution that monotonically increases or monotonically decreases in a specific direction, and is arranged at a position optically conjugate with the pupil of the objective lens 618.
  • the laser light applied to the cultured cells 622 passes through the plastic petri dish 621 and enters the universal capacitor 626. After that, the light is attenuated by the modulation element 628 in the universal capacitor 626 with the intensity transmittance corresponding to the phase gradient, and enters the PMT 631 via the lens 630.
  • the computer 640 obtains a phase gradient image by two-dimensionally mapping the signal output from the PMT 631 during the scanning of the cultured cells 622 using the scanning position of the laser light. Note that the computer 640 may perform image processing that emphasizes the contrast of the phase gradient image, and instead of the computer 640, the contrast enhancing unit 161 of the display device 160 may perform image processing that enhances the contrast.
  • the microscope apparatus 600 configured as described above, it is possible to obtain the confocal image and the phase gradient image similar to the image obtained by the differential interference microscope. Therefore, it is possible to accurately grasp the correlation between the position of the fluorescent dye and the cell structure in the moving living cell.
  • the phase gradient image may be acquired by the upright microscope.
  • the example in which the phase gradient image is acquired based on the transmitted light has been described, but the phase gradient image may be acquired based on the reflected light. That is, you may acquire a phase gradient image using an epi-illumination optical system.
  • the example in which the intensity modulator includes the gradation filter is shown, but a gradation mirror having a distribution of intensity reflectance may be included. In this case, the intensity reflectance distribution in the pupil or in the image of the pupil of the intensity modulator may be monotonically increasing or monotonically decreasing in the first direction.
  • the intensity transmittance distribution of the intensity modulator and the intensity reflectance distribution of the intensity modulator are both distributions showing the ratio of the light intensity incident on the intensity modulator and the light intensity emitted from the intensity modulator. That is, the intensity transmittance distribution of the intensity modulator and the intensity reflectance distribution of the intensity modulator are both examples of the light utilization factor distribution indicating the light utilization factor of the intensity modulator.
  • the spectral intensity transmittance distribution of the intensity modulator and the spectral intensity reflectance distribution of the intensity modulator are examples of the spectral light utilization factor distribution indicating the spectral light utilization factor of the intensity modulator.
  • 21 and 22 are diagrams showing the relationship between the aperture position of the aperture stop and the movement of the image due to defocusing. As shown in FIG. 21 (a), when the aperture position (area D2 through which the illumination light flux passes) is on the optical axis, the image is illuminated by defocusing, as shown by image 291 in FIG. 21 (b). It may move in a direction orthogonal to the axis. As shown in FIG. 21 (a), when the aperture position (area D2 through which the illumination light flux passes) is on the optical axis, the image is illuminated by defocusing, as shown by image 291 in FIG. 21 (b). It may move in a direction orthogonal to the axis. As shown in FIG.

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Abstract

顕微鏡装置１は、標本１３を照明する照明光学系１２と、標本１３からの光を導く観察光学系１４と、観察光学系１４の瞳に設けられた強度変調部１５を備える。強度変調部１５は、強度変調部１５に入射した入射光を減光する。瞳内における強度変調部１５の強度透過率分布は、第１方向に単調増加又は単調減少する。

Description

顕微鏡装置
　本明細書の開示は、顕微鏡装置に関する。
　無染色で生細胞を観察する方法の一つとして、微分干渉観察法（Differential Interference Contrast microscopy、以降、ＤＩＣ法と記す。）が知られている。ＤＩＣ法は、偏光の干渉によって生じる明暗のコントラストで標本を可視化する観察法であり、例えば、特許文献１に記載されている。ＤＩＣ法は、位相勾配に応じた明るさによって立体感のある画像（以降、位相勾配画像と記す。）を得ることができるため、生細胞の生育状態などを把握しやすいという点で優れている。
仏国特許発明第１０５９１２３号明細書
　ところで、生細胞は、プラスチックシャーレなどのプラスチック容器に収容されていることがある。しかしながら、プラスチックは、入射した偏光の振動面を乱してしまうため、ＤＩＣ法によって、プラスチック容器に収容したまま生細胞を観察することは困難である。
　以上のような実情から、本発明の一側面に係る目的は、標本をプラスチック容器に収容したままであっても、その標本の位相勾配画像を得ることを可能とする技術を提供することである。
　本発明の一態様に係る顕微鏡装置は、標本を照明する照明光学系と、前記標本からの光を導く観察光学系と、前記観察光学系の瞳、又は、前記瞳と光学的に共役な位置に設けられた強度変調部であって、前記強度変調部に入射した入射光を減光する、前記強度変調部と、を備え、前記瞳内又は前記瞳の像内における前記強度変調部の強度透過率分布である光利用率分布は、第１方向に単調増加又は単調減少する。
　本発明の別の態様に係る顕微鏡装置は、標本を照明する照明光学系と、前記標本からの光を導く観察光学系と、前記観察光学系の瞳、又は、前記瞳と光学的に共役な位置に設けられた強度変調部であって、前記強度変調部に入射した入射光を減光する、前記強度変調部と、を備え、前記瞳内又は前記瞳の像内における前記強度変調部の強度反射率分布である光利用率分布は、第１方向に単調増加又は単調減少する。
　上記の態様によれば、標本をプラスチック容器に収容したままであっても、その標本の位相勾配画像を得ることができる。
顕微鏡装置１の構成を例示した図である。 強度変調部１５の作用について説明するための図である。 顕微鏡装置２の構成を例示した図である。 強度変調部１５の強度透過率分布を例示した図である。 顕微鏡装置３の構成を例示した図である。 第１実施形態に係る顕微鏡装置１００の構成を例示した図である。 コントラスト強調処理の効果を例示した図である。 瞳面における照明光束の範囲を例示した図である。 開口絞りにより制限された照明光学系の開口数と画像のコントラストの関係の一例を示した図である。 開口絞りにより制限された照明光学系の開口数と画像のコントラストの関係の別の例を示した図である。 立体形状表示方法を説明するための図である。 第２実施形態に係る顕微鏡装置３００の構成を例示した図である。 強度変調部の設定と画像の関係の一例を示した図である。 強度変調部の設定と画像の関係の別の例を示した図である。 立体形状表示方法を説明するための図である。 方位の異なる複数のグラデーションフィルタを並べた例を示した図である。 グラデーションフィルタの角度を変更する例を示した図である。 第３実施形態に係る顕微鏡装置４００の構成を例示した図である。 空間光変調器５００を例示した図である。 第３実施形態に係る顕微鏡装置６００の構成を例示した図である。 開口絞りの開口位置とデフォーカスに伴う画像の移動との関係を示した図である。 開口絞りの開口位置とデフォーカスに伴う画像の移動との関係を示した別の図である。
　図１は、顕微鏡装置１の構成を例示した図である。図１に示す顕微鏡装置１は、微分干渉顕微鏡で得られる画像に類似する位相勾配画像を得る装置である。
　顕微鏡装置１は、標本１３を照明する照明光学系１２と、標本１３からの光を撮像素子１６へ導く観察光学系１４と、入射光を減光する強度変調部１５を備えている。顕微鏡装置１は、さらに、照明光を出射する光源１１と、撮像素子１６と、標本１３の画像を表示する表示装置１７を備えてもよい。
　照明光学系１２は、光源１１から出射した照明光で、標本１３を照明する。照明光学系１２は、一枚以上のレンズを含んでいる。標本１３は、入射光に位相変化を生じさせる位相物体である。標本１３は、例えば、無染色の生体標本である。観察光学系１４は、標本１３を透過した光を撮像素子１６へ導き、撮像素子１６の受光面上に標本１３の光学像を形成する。観察光学系１４は、レンズ１４ａ及びレンズ１４ｂを含んでいる。
　強度変調部１５は、観察光学系１４の瞳に設けられていて、強度変調部１５に入射する入射光を減光する。観察光学系１４の瞳内における強度変調部１５の強度透過率分布は、特定方向（以降、第１方向と記す。）に単調増加又は単調減少する。この単調増加又は単調減少は、観察光学系１４の瞳面において、少なくとも照明光束が通過する領域の範囲内で達成されることが望ましい。
　なお、本明細書において “方向”とは、直線で定義され、“向き”とは、矢印で定義される。つまり、例えば、南北方向は、ひとつの方向であるが、北向きと南向きは違う向きである。また、本明細書において、ある方向によって定義される２つの向きの一方を、ある方向の正の向きと表現し、２つの向きの他方を、ある方向の負の向きと表現する。つまり、例えば、北向きを南北方向の正の向きと表現し、南向きを南北方向の負の向きと表現する。なお、正負に意味はなく、従って、北向きを南北方向の負の向きと表現し、南向きを南北方向の正の向きと表現してもよい。
　また、本明細書において、“単調増加”又は“単調減少”とは、連続的且つ単調に増加又は減少する場合の他、少なくとも３段以上のステップで段階的に単調増加又は単調減少するものを含む。つまり、強度透過率が第１方向に単調増加するとは、強度透過率分布の第１方向の位置に対する微分値が第１方向の位置によらず０以上であることをいう。また、強度透過率が第１方向に単調減少するとは、強度透過率分布の第１方向の位置に対する微分値が第１方向の位置によらず０以下であることをいう。
　強度変調部１５は、例えば、強度透過率分布を有する透過型の減光フィルタを含んでもよい。その場合、瞳内における強度透過率分布は、第１方向に単調増加又は単調減少する。なお、減光フィルタは、例えば、グラデーションフィルタ、ＮＤ（Neutral Density）フィルタなどである。
　光源１１は、標本１３を照明する照明光を出射する。光源１１は、例えば、ハロゲンランプである。撮像素子１６は、観察光学系１４によって導かれた標本１３からの光に基づいて標本１３の画像データを取得する画像取得部の一例である。撮像素子１６は、例えば、ＣＣＤ（Charge-Coupled Device）イメージセンサ、ＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide-Semiconductor）イメージセンサなどである。表示装置１７は、微分干渉顕微鏡で得られる画像に類似する標本１３の位相勾配画像を表示する。表示装置１７は、例えば、液晶ディスプレイ、有機ＥＬ（OLED）ディスプレイ、ＣＲＴ（Cathode Ray Tube）ディスプレイなどである。
　図２は、強度変調部１５の作用について説明するための図である。図１に示す顕微鏡装置１では、標本１３を透過した光は、標本１３の位相勾配に応じた強度透過率で、強度変調部１５で減光される。以下、図２を参照しながら、この点について詳細に説明する。
　図２には、光源１１から出射した照明光束のうち光軸上から出射した光束が描かれている。光軸上から出射した光束は、図１に示すように、照明光学系１２によって光軸と平行な平行光束に変換されて、標本１３に照射される。このため、標本１３に位相勾配が無い場合であれば、光軸と平行な平行光束のままで標本１３から出射し、瞳位置に集光することになる。従って、光束全体は、標本１３中の通過した領域によらず、強度変調部１５において同じ強度透過率で減光される。これに対して、図２に示すように、標本１３に位相勾配が有る場合には、標本１３へ入射した光束は、標本１３の位相勾配により屈折する。従って、光束を構成する光線は、標本１３中の通過した領域に生じている位相勾配に応じて、瞳面の異なる位置を通過することになり、その結果、瞳面に配置された強度変調部１５において異なる強度透過率で減光される。
　例えば、図２に示す例では、標本１３は、点Ｓ１、点Ｓ３、点Ｓ５を通過する光線に対して局所的な位相勾配を有しない。このため、これらの光線は、標本１３で屈折せず、光軸と平行な光線のままで観察光学系１４に入射して、いずれも強度変調部１５上の点Ｆ２を通過する。これにより、点Ｓ１、点Ｓ３、点Ｓ５を通過する光線は、強度変調部１５においていずれも中程度の強度透過率で減光され、それぞれ、撮像素子１６上の点Ｐ５、点Ｐ３、点Ｐ１に入射する。なお、図２に示す強度変調部１５の濃淡は、強度透過率を示し、図２に示す撮像素子１６の濃淡は、撮像素子１６の受光面における光強度を示している。
　また、標本１３は、点Ｓ２を通過する光線に対して局所的な位相勾配を有している。このため、点Ｓ２を通過する光線は、標本１３で屈折し、光軸に対して傾いた光線として観察光学系１４に入射し、強度変調部１５上の点Ｆ２とは異なる点Ｆ３を通過する。これにより、点Ｓ２を通過する光線は、強度変調部１５において低い強度透過率で減光され、撮像素子１６上の点Ｐ４に入射する。
　さらに、標本１３は、点Ｓ４を通過する光線に対して、点Ｓ２を通過する光線に対して有する位相勾配とは反対の符号の局所的な位相勾配を有している。このため、点Ｓ４を通過する光線は、標本１３で点Ｓ２を通過する光線とは反対方向へ屈折し、光軸に対して点Ｓ２を通過する光線とは反対方向へ傾いた光線として観察光学系１４に入射する。これにより、点Ｓ４を通過する光線は、強度変調部１５上の、点Ｆ２を基準として点Ｆ３とは反対側に位置する点Ｆ１を通過する。このため、点Ｓ４を通過する光線は、強度変調部１５において高い強度透過率で減光され、撮像素子１６上の点Ｐ２に入射する。
　以上のように、顕微鏡装置１では、標本１３を通過する光線は標本１３の局所的な位相勾配に応じて瞳面の異なる位置を通過する。さらに、顕微鏡装置１では、単調増加又は単調減少する強度透過率が瞳面に割り当てられているため、瞳面において局所的な位相勾配に応じた強度透過率で光強度が変調される。従って、顕微鏡装置１によれば、撮像素子１６上に位相勾配に応じた光強度を有する光学像を形成することが可能であり、微分干渉顕微鏡で得られる画像に類似する位相勾配画像を得ることができる。
　また、顕微鏡装置１では、強度変調部１５を瞳面に設けるだけで、位相勾配画像を得ることができる。このため、微分干渉顕微鏡では必要であった高価なノマルスキープリズムを用いる必要がない。また、微分干渉顕微鏡とは異なり専用の対物レンズ及び専用のコンデンサレンズを用いる必要もない。従って、顕微鏡装置１によれば、既存の顕微鏡からの拡張が容易であり、微分干渉顕微鏡よりも安価に構成することができる。
　さらに、顕微鏡装置１では、偏光特性を利用することなく、位相勾配に起因する光の屈折を利用して画像にコントラストをつけている。このため、偏光の振動面を乱してしまうプラスチックが光路上に置かれても観察に影響を及ぼさない。従って、顕微鏡装置１によれば、微分干渉顕微鏡とは異なり、プラスチック容器を用いることが可能であり、標本１３をプラスチック容器に収容したままであっても、標本１３の位相勾配画像を得ることができる。
　図１及び図２では、強度変調部１５を観察光学系１４の瞳に配置する例を示したが、強度変調部１５の配置場所は、観察光学系１４の瞳に限らない。図３に示す顕微鏡装置２のように、照明光学系１２の瞳に配置してもよい。なお、レンズ１２ａとレンズ１２ｂは、照明光学系１２を構成するレンズである。この場合も、観察光学系１４の瞳と照明光学系１２の瞳は光学的に共役であるため、同様の効果を得ることができる。
　つまり、強度変調部１５は、観察光学系１４の瞳又は観察光学系１４の瞳と光学的に共役な位置に設けられていれば良い。そして、強度変調部１５が観察光学系１４の瞳と光学的に共役な位置に設けられている場合には、瞳と光学的に共役な位置に投影される観察光学系１４の瞳の像内における強度変調部１５の強度透過率分布が、第１方向に単調増加又は単調減少すればよい。
　図４は、強度変調部１５の強度透過率分布を例示した図である。強度変調部１５は、図４に示すように、例えば、下式（１）で表される強度透過率分布を有している。ここで、Ｔは、強度透過率分布を示し、ξは、瞳面内における第１方向の位置を示している。位置ξ＝０は瞳面の中心位置であり、位置ξ＝－１、１は、それぞれ瞳面における瞳の端部位置である。
　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　式（１）に示す強度透過率分布の第１方向の位置に対する２階微分値は、正である。瞳内における強度透過率分布の第１方向の位置に対する２階微分値が正であれば、強度透過率が位置に対して線形に変化する場合よりも、位相勾配画像のコントラストを向上させることができる。従って、瞳内における強度透過率分布の第１方向の位置に対する２階微分値は正であることが望ましい。
　また、式（１）に示す強度透過率分布は、第１方向の位置の指数関数である。瞳内における強度透過率分布が第１方向の位置の指数関数であれば、標本１３の平坦部分を通過する光線に作用する強度透過率と標本１３の傾斜部分を通過する光線に作用する強度透過率との比が、標本１３に入射する光束の角度によらず一定となる。
　例えば、図２では、光源１１の光軸上から出射し、標本１３へ光軸と平行に入射した照明光束を例示したが、光源１１の光軸外から出射した照明光束は、標本１３に斜めに入射する。その結果、斜めに入射した照明光束は、強度変調部１５において、平行に入射した照明光束に対して、一定距離だけ平行移動した位置を通過する。強度透過率分布が指数関数であれば、瞳面において一定距離だけ離れた位置の２つの強度透過率の比は、位置によらず一定値に維持される。このため、平行に入射した照明光束と斜めに入射した照明光束は、同じコントラスト比で光学像を形成することになる。
　撮像素子１６に入射する光は、光源１１上の各点からの照明光束の集合である。このため、各照明光束が同じコントラスト比を実現することで、互いにコントラストを打ち消しあうことなく、高いコントラストを実現することが可能である。従って、瞳内における強度透過率分布は第１方向の位置の指数関数であることが望ましい。
　図１から図３では、開口絞りを有しない顕微鏡装置１及び顕微鏡装置２を例示したが、図５に示す顕微鏡装置３は、強度変調部１５と光学的に共役な位置に配置された開口絞り１８を有している。開口絞り１８の開口径を調整することで、観察光学系１４は、観察光学系１４から出射する光束であって、強度変調部１５の開口よりも小さな開口に対応する光束によって、標本１３の光学像を形成することができる。これにより、強度変調部１５の開口全部を通る光束によって光学像を形成する場合よりも、高いコントラストを有する光学像を得ることが可能である。また、開口絞り１８の開口径を調整することで、コントラストの調整も可能となる。
　図５では、強度変調部１５が光源１１から標本１３までの照明光路上に、開口絞り１８が標本１３から撮像素子１６までの検出光路上に設けられた例が示されているが、強度変調部１５が検出光路上に、開口絞り１８が照明光路上に配置されても良い。開口絞り１８は、照明光路上に配置された場合でも検出光路上に配置された場合でも、撮像素子１６に入射する光束を絞り込むことが可能であり、同様の効果を得ることができるからである。
　なお、本明細書において、単に、光学系の開口数といった場合、その光学系の光学設計により決定される開口数であって、その光学系が実現し得る最大の開口数のことをいう。
　強度変調部１５が検出光路上に配置されている場合、照明光学系１２の開口数は、観察光学系１４の物体側の開口数よりも小さいことが望ましい。この場合、開口絞り１８を有しなくても、観察光学系１４の像側の開口数よりも小さな開口数に対応する光束によって光学像を形成することができる。従って、開口絞り１８の開口径を調整した場合と同様に、高いコントラストを有する光学像を得ることができる。より具体的には、照明光学系１２の開口数は、例えば、観察光学系１４の物体側の開口数の９０％以下であることが望ましい。
　以下、本発明の実施形態について具体的に説明する。
＜第１実施形態＞
　図６は、本実施形態に係る顕微鏡装置１００の構成を例示した図である。図７は、コントラスト強調処理の効果を例示した図である。図８は、瞳面における照明光束の範囲を例示した図である。図９及び図１０は、開口絞りにより制限された照明光学系の開口数と画像のコントラストの関係を例示した図である。図１１は、立体形状表示方法を説明するための図である。
　顕微鏡装置１００は、図６に示すように、鏡基１１０と鏡筒１２０の間にアダプタ１３０を備える倒立顕微鏡と、カメラ１４０と、制御装置１５０と、表示装置１６０を備えている。
　鏡基１１０は、光源１１１と、開口絞り１１２を有するコンデンサ１１３と、ステージ１１４と、対物レンズ１１５と、ノーズピース１１６と、結像レンズ１１７を備えている。鏡筒１２０は、単眼又は双眼鏡筒であり、接眼レンズ１２１を備えている。なお、開口絞り１１２は、羽根絞り等からなり、開口径を調整可能である。
　アダプタ１３０は、光路切り替えミラー１３６を備えている。光路切り替えミラー１３６の位置を変更することで、結像レンズ１１７が形成した光学像を接眼レンズ１２１の前側焦点位置に投影する目視観察状態と、結像レンズ１１７が形成した光学像をカメラ１４０に投影する撮影状態と、を切り換えることができる。
　アダプタ１３０は、さらに、リレーレンズ１３１と、グラデーションフィルタ１３２と、スライダ１３３と、ダイヤル１３４と、リレーレンズ１３５を備えている。グラデーションフィルタ１３２が設置されているスライダ１３３は、リレーレンズ１３１とリレーレンズ１３５の間に設けられていて、スライダ１３３を所定の位置まで挿入することで、グラデーションフィルタ１３２上に開口絞り１１２の像が投影される。
　グラデーションフィルタ１３２は、上述した強度変調部の一例であり、特定方向に単調増加または単調減少する強度透過率を有している。また、グラデーションフィルタ１３２は、スライダ１３３に設けられたダイヤル１３４の回転に連動して方位が変化する。従って、利用者は、ダイヤル１３４を操作することで、強度透過率が単調増加又は単調減少する方向を調整することができる。
　カメラ１４０は、観察光学系によって導かれた標本からの光に基づいて標本の画像データを取得する画像取得部である。カメラ１４０は、画像データに基づいて、表示装置１６０に表示される標本の画像のコントラストを強調する強調処理を行ってもよい。即ち、カメラ１４０は、画像取得部であり、コントラスト強調部であってもよい。
　制御装置１５０は、カメラ１４０を制御する制御装置であり、ダイヤル１５１を備えている。利用者がダイヤル１５１を回転することで、顕微鏡装置１００は、強調処理におけるコントラストの強調量を調整することができる。なお、制御装置１５０は、表示装置１６０を制御する制御装置であってもよい。この場合、利用者がダイヤル１５１を回転することで、表示装置１６０が画像データに基づいて、表示装置１６０に表示される標本の画像のコントラストを強調する強調処理を行ってもよい。
　表示装置１６０は、画像データに基づいて標本の画像のコントラストを強調するコントラスト強調部１６１を備えている。
　以上のように構成された顕微鏡装置１００によれば、グラデーションフィルタ１３２の強度透過率分布によって、標本の位相勾配に応じた光強度を有する光学像をカメラ１４０上に形成することができる。このため、図７に示すように、微分干渉顕微鏡で得られる画像２０１に類似した位相勾配画像である画像２０２及び画像２０３を得ることができる。なお、画像２０１、画像２０２及び画像２０３は、大小２つの半球状の標本を撮影した画像である。画像２０２は、カメラ１４０でコントラストを強調する前の画像であり、画像２０３は、カメラ１４０でコントラストを強調した後の画像である。
　また、顕微鏡装置１００では、グラデーションフィルタ１３２によって位相勾配をコントラストに変換し、さらに、画像処理によってコントラストを強調する。これにより、図７の画像２０３に示すように、位相勾配がコントラストとして十分に視認される画像を得ることができる。
　また、顕微鏡装置１００では、既存の顕微鏡にアダプタ１３０を追加するだけで位相勾配画像を得ることができる。また、偏光特性を利用することなく位相勾配画像を得ることができる。従って、顕微鏡装置１００によれば、安価な構成によって、プラスチック容器に収容したまま標本の位相勾配画像を得ることができる。
　さらに、顕微鏡装置１００では、開口絞り１１２の開口径を調整することで、図８に示すように、対物レンズ１１５の瞳面において、照明光束が通過する領域Ｄ２を対物レンズ１１５の瞳Ｄ１内に収めることができる。このため、入射光の角度に依存したコントラストの変動を抑えることが可能となり、高いコントラストを得ることができる。また、コントラストを調整することもできる。
　図９に示す画像２０４から画像２０８は、画像処理によってコントラストを強調する前の画像であり、開口絞り１１２で制限された照明光学系の開口数（ＮＡ）を０．５５から０．１まで段階的に小さくしたときの画像である。また、図１０に示す画像２０９から画像２１３は、画像処理によってコントラストを強調した後の画像であり、開口絞り１１２で制限された照明光学系の開口数（ＮＡ）を０．５５から０．１まで段階的に小さくしたときの画像である。図９及び図１０に示すように、開口絞り１１２で制限された照明光学系の開口数を小さくするほど、コントラストを強調することができる。一方で、コントラストを強調しすぎると、立体感が失われるため、コントラストと立体感のバランスを見て、開口絞り１１２を調整することが望ましい。
　また、コントラストに応じてデフォーカス特性も変化する。コントラストが強すぎると、デフォーカス量が大きくなるに従って、像がボケるだけではなく、リンギングが目立ってくる。このため、コントラストと立体感に加えて、デフォーカス特性も加味して、開口絞り１１２を調整することが望ましい。
　また、画像処理によってコントラストを強調しすぎると、ノイズが強く重畳することになる。そのため、画像処理前の画像のコントラストはある程度高いことが望ましい。具体的には、開口絞り１１２で制限された照明光学系の開口数は、対物レンズ１１５の物体側の開口数の９０％以下であることが望ましい。
　さらに、顕微鏡装置１００では、ダイヤル１３４を回転することで、グラデーションフィルタ１３２の方位を変更することができる。これにより、位相勾配画像でコントラストが付く方向、つまり、位相勾配を検出する方向、を調整することができる。また、図１１に示すように、ダイヤル１３４を回転することで、グラデーションフィルタ１３２の方位が９０度異なる向きで２枚の位相勾配画像（画像２１４と画像２１５）を取得してもよい。９０度方位が異なる２枚の位相勾配画像を演算処理することで、位相勾配の検出方向に起因した情報の欠落を補うことができるため、画像２１６に示すように、標本の立体形状をより正確に表示することができる。
＜第２実施形態＞
　図１２は、本実施形態に係る顕微鏡装置３００の構成を例示した図である。図１３及び図１４は、強度変調部の設定と画像との関係を例示した図である。図１５は、立体形状表示方法を説明するための図である。
　顕微鏡装置３００は、アダプタ１３０の代わりにアダプタ３３０を備える点、制御装置１５０の代わりに制御装置１８０を備える点、及び表示装置１６０の代わりに表示装置１９０を備える点が、顕微鏡装置１００とは異なる。その他の点は、顕微鏡装置１００と同様である。
　制御装置１８０は、カメラ１４０又は表示装置１９０が行うコントラスト強調処理を調整するダイヤル１８１に加えて、カメラ１４０又は表示装置１９０が行う彩度強調処理を調整するダイヤル１８２を備えている。
　表示装置１９０は、コントラスト強調処理を行うコントラスト強調部１９１に加えて、彩度強調処理を行う彩度強調部１９２を備えている。彩度強調部１９２は、画像データに基づいて、表示装置１９０に表示される標本の画像の彩度を強調する処理を行う。
　アダプタ３３０は、スライダ１３３の代わりにスライダ３３３を備えている点が、アダプタ１３０とは異なる。スライダ３３３は、リレーレンズ１３１とリレーレンズ１３５の間の光路上に配置されていて、複数のグラデーションカラーフィルタ（グラデーションカラーフィルタ３３２ａ、グラデーションカラーフィルタ３３２ｂ）が設置されている。スライダ３３３を所定の位置まで挿入することで、複数のグラデーションカラーフィルタを含む強度変調部上に開口絞り１１２の像が投影される。
　グラデーションカラーフィルタ３３２ａ及びグラデーションカラーフィルタ３３２ｂは、分光透過率分布（分光強度透過率分布）の異なる複数の強度変調素子の一例である。グラデーションカラーフィルタ３３２ａは、第１波長に対して、特定方向に単調増加又は単調減少する強度透過率を有している。グラデーションフィルタ３３２ｂは、第１波長とは異なる第２波長に対して、特定方向に単調増加又は単調減少する強度透過率を有している。なお、第１波長は、例えば、赤色の波長であり、第２波長は、例えば、青色の波長である。
　グラデーションカラーフィルタ３３２ａの方位は、スライダ３３３に設けられたダイヤル３３４ａを回転することで変更可能である。グラデーションカラーフィルタ３３２ｂの方位は、スライダ３３３に設けられたダイヤル３３４ｂを回転することで変更可能である。
　以上のように構成された顕微鏡装置３００によっても、複数のグラデーションカラーフィルタを含む強度変調部で位相勾配に応じて減光することができるため、顕微鏡装置１００と同様に、微分干渉顕微鏡で得られる画像に類似した位相勾配画像を得ることができる。
　また、顕微鏡装置３００では、ダイヤル３３４ａ及びダイヤル３３４ｂを操作して２枚のグラデーションカラーフィルタの方位を反対に向けることで、図１３に示すように、瞳内における強度変調部の第１波長に対する第１強度透過率分布は、第１方向の正の向きに単調増加し、瞳内における強度変調部の第２波長に対する第２強度透過率分布は、第１方向の負の向きに単調増加する。これにより、画像２１７に示すように、第１方向の位相勾配の符号によって色が異なる位相勾配画像を得ることができる。具体的には、例えば、矢印Ａ１の向きに赤が濃くなり、矢印Ａ２の向きに青が濃くなる画像を得ることができる。従って、濃淡に加えて色の違いで標本の形状、特に、凹凸を認識することが可能であり、色の違いによって位相勾配の正負も認識することができる。このため、顕微鏡装置１００よりも容易に標本の形状を正しく認識することができる。
　また、顕微鏡装置３００では、ダイヤル３３４ａ及びダイヤル３３４ｂを操作して２枚のグラデーションカラーフィルタの方位を例えば９０度ずらすことで、図１４に示すように、瞳内における強度変調部の第１波長に対する第１強度透過率分布は、第１方向に単調増加又は単調減少し、瞳内における強度変調部の第２波長に対する第２強度透過率分布は、第１方向とは異なる方向に単調増加又は単調減少する。これにより、画像２１８に示すように、位相勾配の方向によって色合い（色のバランス）の異なる位相勾配画像を得ることができる。具体的には、例えば、矢印Ａ３の向きに赤が濃くなり、矢印Ａ４の向きに青が濃くなる画像を得ることができる。従って、濃淡に加えて色の違いで標本の形状、特に厚さ方向の２次元分布を認識することが可能であり、色合いの違いによって位相勾配の向きも認識することができる。このため、顕微鏡装置１００よりも容易に標本の形状を正しく認識することができる。
　また、顕微鏡装置３００では、図１５に示すように、カメラ１４０で取得した位相勾配画像をＲ成分の画像２１９、Ｇ成分の画像２２０、Ｂ成分の画像２２１に分解してもよい。これらの画像からそれぞれ異なる方向の位相勾配を検出することで、標本の立体形状を特定することが可能であり、特定した標本の立体形状を画像２２２に示すように立体表示することができる。
　なお、以上では、グラデーションカラーフィルタ３３２ａとグラデーションカラーフィルタ３３２ｂで強度透過率が単調増加又は単調減少する方向又は向きが異なる例を示したが、これらを同じ向きに向けても良い。その場合、グラデーションカラーフィルタ３３２ａとグラデーションカラーフィルタ３３２ｂで強度透過率の増加率又は減少率が異なることが望ましい。つまり、瞳内における強度透過率分布は、波長に応じて第１方向の正の向きに異なる増加率又は減少率を有することが望ましい。これにより、第１方向の正の向きに波長間での強度透過率の比に違いが生じることになるため、位相勾配に応じて色合いの異なる位相勾配画像を得ることができる。
　図６に示す顕微鏡装置１００及び図１２に示す顕微鏡装置３００では、スライダに設けられたダイヤルを回転することで、グラデーションフィルタまたはグラデーションカラーフィルタの方位、即ち、位相勾配の検出方向、を変更する例を示したが、位相勾配の検出方向は、他の方法により変更してもよい。例えば、顕微鏡装置１００は、図１６に示すように、スライダ１３３に、複数の強度変調素子を含む強度変調部を設けても良い。複数の強度変調素子は、単調増加又は単調減少する向きが互いに異なる強度透過率分布を有する複数のグラデーションフィルタ（グラデーションフィルタ１３２ａ、グラデーションフィルタ１３２ｂ、グラデーションフィルタ１３２ｃ、グラデーションフィルタ１３２ｄ）である。スライダ１３３を観察光学系の光軸と交差する方向へスライドして、複数の強度変調素子を移動することで、光路上に置かれる強度変調素子を変更し、それによって、位相勾配の検出方向を変更してもよい。
　図６では、強度変調部を回転するダイヤル１３４が瞳内又は瞳の像内における強度変調部の強度透過率分布を変更する変更手段として機能する例が示され、図１６では、スライダ１３３が変更手段として機能する例が示されたが、変更手段はこれらの例に限らない。例えば、図１７に示すように、変更手段は、観察光学系の光軸に対する強度変調部（グラデーションフィルタ１３２）の角度を変更する回転軸１３２ｅであってもよい。対物レンズの瞳径に合わせて回転軸１３２ｅを回転することで、グラデーションフィルタ１３２の強度透過率の最も高い領域と最も低い領域を瞳の端部に一致させることができる。このため、グラデーションフィルタ１３２の強度透過率分布を有効に活用して高いコントラストを得ることができる。
＜第３実施形態＞
　図１８は、本実施形態に係る顕微鏡装置４００の構成を例示した図である。顕微鏡装置４００は、アダプタ１３０の代わりにアダプタ４３０を備える点が、顕微鏡装置１００とは異なる。その他の点は、顕微鏡装置１００と同様である。
　アダプタ４３０は、リレーレンズ１３１の代わりに可変焦点光学系４３１を備える点、スライダ１３３を案内するガイド４３２を備える点が、アダプタ１３０とは異なる。
　可変焦点光学系４３１は、観察光学系に含まれていて、グラデーションフィルタ１３２と標本の間の光路上に配置されている。可変焦点光学系４３１の焦点距離を変更することで、グラデーションフィルタ１３２に投影される対物レンズ１１５の瞳の像の大きさが変化する。従って、可変焦点光学系４３１の焦点距離を変更することで、グラデーションフィルタ１３２が有する強度透過率分布のどの範囲を利用するかを調整することができる。また、対物レンズの交換に伴う瞳径の変化に対しても、可変焦点光学系４３１の焦点距離の変更で対処することができる。
　ガイド４３２は、光軸方向へのスライダ１３３の移動を案内することで、グラデーションフィルタ１３２を光軸方向へ動かす移動手段の一例である。移動手段によりグラデーションフィルタ１３２を含む強度変調部を光軸方向へ動かすことで、強度変調部と瞳面の位置関係を調整することが出来る。これは、対物レンズの交換によって瞳面の位置が変化した場合に特に効果的である。
　以上のように構成された顕微鏡装置４００によっても、強度変調部で位相勾配に応じて減光することができるため、顕微鏡装置１００と同様に、微分干渉顕微鏡で得られる画像に類似した位相勾配画像を得ることができる。
　なお、図６、図１２、図１８では、強度変調部がグラデーションフィルタを含む例を示したが、強度変調部は、グラデーションフィルタに限らない。例えば、図１９に示すような、複数の画素５０１が格子状に配列した空間光変調器５００であってもよく、空間光変調器５００によって第１方向に単調増加又は単調減少する強度透過率分布を実現してもよい。
＜第４の実施形態＞
　図２０は、本実施形態に係る顕微鏡装置６００の構成を例示した図である。顕微鏡本体６１０と、コンピュータ６４０と、表示装置１６０を備えている。なお、ＰＭＴ６３１とコンピュータ６４０は、画像取得部６５０を構成する。
　顕微鏡本体６１０は、レーザ走査型顕微鏡を拡張したものであり、コンピュータ６４０と協働することで共焦点画像を得ることができる。レーザ光源６１１から出射したレーザ光は、ビームエキスパンダ６１２で光束径が拡大されて、その後、開口絞り６１３、ダイクロイックミラー６１４、ガルバノミラー６１５、及びリレーレンズ６１６を経由して、ノーズピース６１７に装着された対物レンズ６１８に入射する。ノーズピース６１７には、対物レンズ６１８の他に倍率の異なる対物レンズ６１９が装着されている。対物レンズ６１８は、レーザ光を集光して、ステージ６２０に置かれたプラスチックシャーレ６２１内の培養細胞６２２の一点に照射する。レーザ光の集光位置は、ガルバノミラー６１５でのレーザ光の偏向方向によって制御可能である。従って、ガルバノミラー６１５を制御することで培養細胞６２２をニ次元に走査することができる。
　レーザ光が照射された培養細胞６２２では、蛍光が発生し、対物レンズ６１８、リレーレンズ６１６、ガルバノミラー６１５を経由してダイクロイックミラー６１４へ入射する。その後、ダイクロイックミラー６１４で反射した蛍光は、レンズ６２３によって共焦点絞り６２４へ照射され、焦点位置から生じた蛍光のみが共焦点絞り６２４に設けられたピンホールを通過して、光電子増倍管（以降、ＰＭＴと記す。）６２５に入射する。
　コンピュータ６４０は、培養細胞６２２の走査中にＰＭＴ６２５から出力される信号を、レーザ光の走査位置を用いて二次元にマッピングすることで、共焦点画像を得る。
　顕微鏡本体６１０は、さらに、ユニバーサルコンデンサ６２６と、レンズ６３０と、ＰＭＴ６３１を備えている。ユニバーサルコンデンサ６２６のターレットには、複数の変調素子（変調素子６２７、変調素子６２８、変調素子６２９）が収容されていて、複数の変調素子の中から選択した変調素子を光路上に配置することができる。
　ユニバーサルコンデンサ６２６に収容されている複数の変調素子のうちの少なくとも１つは、強度変調部である。この例では、変調素子６２８は、例えば、特定方向に単調増加又は単調減少する強度透過率分布を有するグラデーションフィルタであり、対物レンズ６１８の瞳と光学的に共役な位置に配置されている。
　培養細胞６２２に照射されたレーザ光は、プラスチックシャーレ６２１を透過してユニバーサルコンデンサ６２６に入射する。その後、ユニバーサルコンデンサ６２６内の変調素子６２８で位相勾配に応じた強度透過率で減光されて、レンズ６３０を経由してＰＭＴ６３１へ入射する。
　コンピュータ６４０は、培養細胞６２２の走査中にＰＭＴ６３１から出力される信号を、レーザ光の走査位置を用いて二次元にマッピングすることで、位相勾配画像を得る。なお、コンピュータ６４０は、位相勾配画像のコントラストを強調する画像処理を行ってもよく、コンピュータ６４０の代わりに表示装置１６０のコントラスト強調部１６１がコントラストを強調する画像処理を行ってもよい。
　位相勾配画像を得る場合、予め、対物レンズ６１８から出射する光束の開口数がユニバーサルコンデンサ６２６の開口数よりも小さくなるように、開口絞り６１３の開口径を調整することが望ましい。これにより、高いコントラストの位相勾配画像を得ることができる。
　以上のように構成された顕微鏡装置６００によれば、共焦点画像と同時に、微分干渉顕微鏡で得られる画像に類似した位相勾配画像を得ることができる。このため、運動する生細胞について、蛍光色素の位置と細胞の構造の相関を正確に把握することができる。
　上述した実施形態は、発明の理解を容易にするための具体例を示したものであり、本発明の実施形態はこれらに限定されるものではない。上述した実施形態の一部を他の実施形態に適用して本発明の更に別の実施形態を構成してもよい。顕微鏡装置は、特許請求の範囲の記載を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。
　例えば、上述した実施形態では、位相勾配画像を倒立顕微鏡で取得する例を示したが、位相勾配画像は正立顕微鏡で取得してもよい。また、上述した実施形態では、位相勾配画像を透過光に基づいて取得する例を示したが、位相勾配画像は反射光に基づいて取得してもよい。即ち、落射照明光学系を用いて位相勾配画像を取得してもよい。さらに、上述した実施形態では、強度変調部がグラデーションフィルタを含む例を示したが、強度反射率が分布を持つグラデーションミラーを含んでも良い。この場合、強度変調部の、瞳内又は瞳の像内における強度反射率分布は、第１方向に単調増加又は単調減少すればよい。
　なお、強度変調部の強度透過率分布と強度変調部の強度反射率分布は、いずれも強度変調部に入射する光強度と強度変調部から出射する光強度の比率を示す分布である。つまり、強度変調部の強度透過率分布と強度変調部の強度反射率分布は、いずれも強度変調部での光利用率を示す光利用率分布の一例である。また、強度変調部の分光強度透過率分布と強度変調部の分光強度反射率分布は、強度変調部での分光光利用率を示す分光光利用率分布の一例である。
　上述した実施形態では、開口絞りの開口の中心が光軸上に位置する例を示したが、開口絞りは、開口位置を偏心する構造を有してもよい。偏心する構造には特に限定しないが、例えば、カム、スライダなどが採用されてもよい。図２１及び図２２は、開口絞りの開口位置とデフォーカスに伴う画像の移動との関係を示した図である。図２１（ａ）に示すように、開口位置（照明光束が通過する領域Ｄ２）が光軸上にあるときには、図２１（ｂ）に示す画像２９１のように、デフォーカスに伴って画像が光軸と直交する方向に移動することがある。図２２（ａ）に示すように、開口位置を光軸に対して偏心することで、つまり、照明光束が通過する領域Ｄ２を瞳Ｄ１に対して偏心することで、図２２（ｂ）に示すように、デフォーカスに伴う画像の移動を抑制することができる。
１、２、３、１００、３００、４００、６００　顕微鏡装置
１１、１１１　光源
１２　照明光学系
１２ａ、１２ｂ、１４ａ、１４ｂ、６２３、６３０　レンズ
１３　標本
１４　観察光学系
１５　強度変調部
１６　撮像素子
１７、１６０、１９０　表示装置
１８、１１２、６１３　開口絞り
１１０　鏡基
１１３　コンデンサ
１１４、６２０　ステージ
１１５、６１８、６１９　対物レンズ
１１６、６１７　ノーズピース
１１７　結像レンズ
１２０　鏡筒
１２１　接眼レンズ
１３０、３３０、４３０　アダプタ
１３１、１３５、６１６　リレーレンズ
１３２、１３２ａ－１３２ｄ　グラデーションフィルタ
１３２ｅ　回転軸
１３３　スライダ
１３４、１５１、１８１、１８２、３３４ａ、３３４ｂ　ダイヤル
１３６　光路切り替えミラー
１４０　カメラ
１５０、１８０　制御装置
１６１、１９１　コントラスト強調部
１９２　彩度強調部
２０１－２２２、２９１、２９２　画像
３３２ａ、３３２ｂ　グラデーションカラーフィルタ
５００　空間光変調器
５０１　画素
３３３　スライダ
４３１　可変焦点光学系
４３２　ガイド
６１０　顕微鏡本体
６１１　レーザ光原
６１２　ビームエキスパンダ
６１４　ダイクロイックミラー
６１５　ガルバノミラー
６２１　プラスチックシャーレ
６２２　培養細胞
６２４　共焦点絞り
６２５、６３１　ＰＭＴ
６２６　ユニバーサルコンデンサ
６２７－６２９　変調素子
６４０　コンピュータ
６５０　画像取得部

Claims (25)

  1. 　標本を照明する照明光学系と、
    　前記標本からの光を導く観察光学系と、
    　前記観察光学系の瞳、又は、前記瞳と光学的に共役な位置に設けられた強度変調部であって、前記強度変調部に入射した入射光を減光する、前記強度変調部と、を備え、
    　前記瞳内又は前記瞳の像内における前記強度変調部の強度透過率分布である光利用率分布は、第１方向に単調増加又は単調減少する
    ことを特徴とする顕微鏡装置。
  2. 　標本を照明する照明光学系と、
    　前記標本からの光を導く観察光学系と、
    　前記観察光学系の瞳、又は、前記瞳と光学的に共役な位置に設けられた強度変調部であって、前記強度変調部に入射した入射光を減光する、前記強度変調部と、を備え、
    　前記瞳内又は前記瞳の像内における前記強度変調部の強度反射率分布である光利用率分布は、第１方向に単調増加又は単調減少する
    ことを特徴とする顕微鏡装置。
  3. 　請求項１又は請求項２に記載の顕微鏡装置において、さらに、
    　前記観察光学系によって導かれた前記標本からの光に基づいて前記標本の画像データを取得する画像取得部と、
    　前記画像取得部で取得した前記画像データに基づいて、表示装置に表示される前記標本の画像のコントラストを強調する処理を行うコントラスト強調部と、を備える
    ことを特徴とする顕微鏡装置。
  4. 　請求項３に記載の顕微鏡装置において、さらに、
    　前記表示装置を備える
    ことを特徴とする顕微鏡装置。
  5. 　請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、
    　前記観察光学系は、前記観察光学系から出射する光束であって、前記観察光学系の像側の開口数よりも小さな開口数に対応する光束で、前記標本の光学像を形成する
    ことを特徴する顕微鏡装置。
  6. 　請求項５に記載の顕微鏡装置において、
    　前記照明光学系の開口数は、前記観察光学系の物体側の開口数よりも小さい
    ことを特徴する顕微鏡装置。
  7. 　請求項６に記載の顕微鏡装置において、
    　前記照明光学系の開口数は、前記観察光学系の物体側の開口数の９０％以下である
    ことを特徴する顕微鏡装置。
  8. 　請求項５乃至請求項７のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、さらに、
    　開口絞りを有する
    ことを特徴する顕微鏡装置。
  9. 　請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、
    　前記瞳内又は前記瞳の像内における前記光利用率分布の、前記第１方向の位置に対する２階微分値は、正である
    ことを特徴する顕微鏡装置。
  10. 　請求項９に記載の顕微鏡装置において、
    　前記瞳内又は前記瞳の像内における前記光利用率分布は、前記第１方向の位置の指数関数である
    ことを特徴する顕微鏡装置。
  11. 　請求項３又は請求項４に記載の顕微鏡装置において、
    　前記画像データに基づいて、前記表示装置に表示される前記標本の画像の彩度を強調する処理を行う彩度強調部と、を備える
    ことを特徴とする顕微鏡装置。
  12. 　請求項１乃至請求項１１のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、
    　前記瞳内又は前記瞳の像内における前記光利用率分布は、波長に応じて前記第１方向の正の向きに異なる増加率又は減少率を有する
    ことを特徴する顕微鏡装置。
  13. 　請求項１乃至請求項１２のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、
    　前記瞳内又は前記瞳の像内における前記強度変調部の第１波長に対する第１光利用率分布は、前記第１方向の正の向きに単調増加し、
    　前記瞳内又は前記瞳の像内における前記強度変調部の第２波長に対する第２光利用率分布は、前記第１方向の負の向きに単調増加し、
    　前記第１波長と前記第２波長は、異なる
    ことを特徴する顕微鏡装置。
  14. 　請求項１乃至請求項１１のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、
    　前記瞳内又は前記瞳の像内における前記強度変調部の第１波長に対する第１光利用率分布は、前記第１方向に単調増加又は単調減少し、
    　前記瞳内又は前記瞳の像内における前記強度変調部の第２波長に対する第２光利用率分布は、前記第１方向とは異なる方向に単調増加又は単調減少し、
    　前記第１波長と前記第２波長は、異なる
    ことを特徴する顕微鏡装置。
  15. 　請求項１２乃至請求項１４のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、
    　前記強度変調部は、分光光利用率分布の異なる複数の強度変調素子を含み、
    ことを特徴する顕微鏡装置。
  16. 　請求項１乃至請求項１５のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、さらに、
    　前記瞳内又は前記瞳の像内における前記光利用率分布を変更する変更手段を備える
    ことを特徴する顕微鏡装置。
  17. 　請求項１６に記載の顕微鏡装置において、
    　前記変更手段は、前記強度変調部を回転する
    ことを特徴する顕微鏡装置。
  18. 　請求項１６に記載の顕微鏡装置において、
    　前記強度変調部は、複数の強度変調素子を含み、
    　前記複数の強度変調素子は、単調増加又は単調減少する向きが互いに異なる光利用率分布を有し、
    　前記変更手段は、前記観察光学系の光軸又は前記照明光学系の光軸と交差する方向へ、前記複数の強度変調素子を移動する
    ことを特徴する顕微鏡装置。
  19. 　請求項１６に記載の顕微鏡装置において、
    　前記変更手段は、前記観察光学系の光軸又は前記照明光学系の光軸に対する前記強度変調部の角度を変更する
    ことを特徴する顕微鏡装置。
  20. 　請求項１６に記載の顕微鏡装置において、
    　前記強度変調部は、検出光路上に配置され、
    　前記変更手段は、前記観察光学系に含まれる可変焦点光学系であって、前記強度変調部と前記標本の間の光路上に配置された前記可変焦点光学系である
    ことを特徴する顕微鏡装置。
  21. 　請求項１乃至請求項２０のいずか１項のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、さらに、
    　前記観察光学系の光軸の方向又は前記照明光学系の光軸の方向に、前記強度変調部を動かす移動手段を備える
    ことを特徴する顕微鏡装置。
  22. 　請求項１又は請求項２に記載の顕微鏡装置において、
    　前記強度変調部は、複数の画素が格子状に配列した空間光変調器を含む
    ことを特徴する顕微鏡装置。
  23. 　請求項１に記載の顕微鏡装置において、
    　前記強度変調部は、前記強度透過率分布を有するグラデーションフィルタを含む
    ことを特徴する顕微鏡装置。
  24. 　請求項２に記載の顕微鏡装置において、
    　前記強度変調部は、前記強度反射率分布を有するグラデーションミラーを含む
    ことを特徴する顕微鏡装置。
  25. 　請求項８に記載の顕微鏡装置において、
    　前記開口絞りは、開口位置を光軸に対して偏心する構造を有する
    ことを特徴する顕微鏡装置。
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