JP7193989B2

JP7193989B2 - 顕微鏡装置

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Description

本明細書の開示は、顕微鏡装置に関する。

無染色で生細胞を観察する方法の一つとして、微分干渉観察法（Differential Interference Contrast microscopy、以降、ＤＩＣ法と記す。）が知られている。ＤＩＣ法は、偏光の干渉によって生じる明暗のコントラストで標本を可視化する観察法であり、例えば、特許文献１に記載されている。ＤＩＣ法は、位相勾配に応じた明るさによって立体感のある画像（以降、位相勾配画像と記す。）を得ることができるため、生細胞の生育状態などを把握しやすいという点で優れている。

仏国特許発明第１０５９１２３号明細書

ところで、生細胞は、プラスチックシャーレなどのプラスチック容器に収容されていることがある。しかしながら、プラスチックは、入射した偏光の振動面を乱してしまうため、ＤＩＣ法によって、プラスチック容器に収容したまま生細胞を観察することは困難である。

以上のような実情から、本発明の一側面に係る目的は、標本をプラスチック容器に収容したままであっても、その標本の位相勾配画像を得ることを可能とする技術を提供することである。

本発明の一態様に係る顕微鏡装置は、標本を照明する照明光学系と、前記標本からの光を導く観察光学系と、前記観察光学系の瞳、又は、前記瞳と光学的に共役な位置に設けられた強度変調部であって、前記強度変調部に入射した入射光を減光する、前記強度変調部と、を備え、前記瞳内又は前記瞳の像内における前記強度変調部の強度透過率分布である光利用率分布は、第１方向に単調増加又は単調減少し、且つ、前記観察光学系の光軸又は前記照明光学系の光軸を中心とした両側で変化する。

本発明の別の態様に係る顕微鏡装置は、標本を照明する照明光学系と、前記標本からの光を導く観察光学系と、前記観察光学系の瞳、又は、前記瞳と光学的に共役な位置に設けられた強度変調部であって、前記強度変調部に入射した入射光を減光する、前記強度変調部と、を備え、前記瞳内又は前記瞳の像内における前記強度変調部の強度反射率分布である光利用率分布は、第１方向に単調増加又は単調減少し、且つ、前記観察光学系の光軸又は前記照明光学系の光軸を中心とした両側で変化する。

上記の態様によれば、標本をプラスチック容器に収容したままであっても、その標本の位相勾配画像を得ることができる。

顕微鏡装置１の構成を例示した図である。強度変調部１５の作用について説明するための図である。顕微鏡装置２の構成を例示した図である。強度変調部１５の強度透過率分布を例示した図である。顕微鏡装置３の構成を例示した図である。第１実施形態に係る顕微鏡装置１００の構成を例示した図である。コントラスト強調処理の効果を例示した図である。瞳面における照明光束の範囲を例示した図である。開口絞りにより制限された照明光学系の開口数と画像のコントラストの関係の一例を示した図である。開口絞りにより制限された照明光学系の開口数と画像のコントラストの関係の別の例を示した図である。立体形状表示方法を説明するための図である。第２実施形態に係る顕微鏡装置３００の構成を例示した図である。強度変調部の設定と画像の関係の一例を示した図である。強度変調部の設定と画像の関係の別の例を示した図である。立体形状表示方法を説明するための図である。方位の異なる複数のグラデーションフィルタを並べた例を示した図である。グラデーションフィルタの角度を変更する例を示した図である。第３実施形態に係る顕微鏡装置４００の構成を例示した図である。空間光変調器５００を例示した図である。第３実施形態に係る顕微鏡装置６００の構成を例示した図である。

図１は、顕微鏡装置１の構成を例示した図である。図１に示す顕微鏡装置１は、微分干渉顕微鏡で得られる画像に類似する位相勾配画像を得る装置である。

顕微鏡装置１は、標本１３を照明する照明光学系１２と、標本１３からの光を撮像素子１６へ導く観察光学系１４と、入射光を減光する強度変調部１５を備えている。顕微鏡装置１は、さらに、照明光を出射する光源１１と、撮像素子１６と、標本１３の画像を表示する表示装置１７を備えてもよい。

照明光学系１２は、光源１１から出射した照明光で、標本１３を照明する。照明光学系１２は、一枚以上のレンズを含んでいる。標本１３は、入射光に位相変化を生じさせる位相物体である。標本１３は、例えば、無染色の生体標本である。観察光学系１４は、標本１３を透過した光を撮像素子１６へ導き、撮像素子１６の受光面上に標本１３の光学像を形成する。観察光学系１４は、レンズ１４ａ及びレンズ１４ｂを含んでいる。

強度変調部１５は、観察光学系１４の瞳に設けられていて、強度変調部１５に入射する入射光を減光する。観察光学系１４の瞳内における強度変調部１５の強度透過率分布は、特定方向（以降、第１方向と記す。）に単調増加又は単調減少する。この単調増加又は単調減少は、観察光学系１４の瞳面において、少なくとも照明光束が通過する領域の範囲内で達成されることが望ましい。

なお、本明細書において “方向”とは、直線で定義され、“向き”とは、矢印で定義される。つまり、例えば、南北方向は、ひとつの方向であるが、北向きと南向きは違う向きである。また、本明細書において、ある方向によって定義される２つの向きの一方を、ある方向の正の向きと表現し、２つの向きの他方を、ある方向の負の向きと表現する。つまり、例えば、北向きを南北方向の正の向きと表現し、南向きを南北方向の負の向きと表現する。なお、正負に意味はなく、従って、北向きを南北方向の負の向きと表現し、南向きを南北方向の正の向きと表現してもよい。

また、本明細書において、“単調増加”又は“単調減少”とは、連続的且つ単調に増加又は減少する場合の他、少なくとも３段以上のステップで段階的に単調増加又は単調減少するものを含む。つまり、強度透過率が第１方向に単調増加するとは、強度透過率分布の第１方向の位置に対する微分値が第１方向の位置によらず０以上であることをいう。また、強度透過率が第１方向に単調減少するとは、強度透過率分布の第１方向の位置に対する微分値が第１方向の位置によらず０以下であることをいう。

強度変調部１５は、例えば、強度透過率分布を有する透過型の減光フィルタを含んでもよい。その場合、瞳内における強度透過率分布は、第１方向に単調増加又は単調減少する。なお、減光フィルタは、例えば、グラデーションフィルタ、ＮＤ（Neutral Density）フィルタなどである。

光源１１は、標本１３を照明する照明光を出射する。光源１１は、例えば、ハロゲンランプである。撮像素子１６は、観察光学系１４によって導かれた標本１３からの光に基づいて標本１３の画像データを取得する画像取得部の一例である。撮像素子１６は、例えば、ＣＣＤ（Charge-Coupled Device）イメージセンサ、ＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide-Semiconductor）イメージセンサなどである。表示装置１７は、微分干渉顕微鏡で得られる画像に類似する標本１３の位相勾配画像を表示する。表示装置１７は、例えば、液晶ディスプレイ、有機ＥＬ（OLED）ディスプレイ、ＣＲＴ（Cathode Ray Tube）ディスプレイなどである。

図２は、強度変調部１５の作用について説明するための図である。図１に示す顕微鏡装置１では、標本１３を透過した光は、標本１３の位相勾配に応じた強度透過率で、強度変調部１５で減光される。以下、図２を参照しながら、この点について詳細に説明する。

図２には、光源１１から出射した照明光束のうち光軸上から出射した光束が描かれている。光軸上から出射した光束は、図１に示すように、照明光学系１２によって光軸と平行な平行光束に変換されて、標本１３に照射される。このため、標本１３に位相勾配が無い場合であれば、光軸と平行な平行光束のままで標本１３から出射し、瞳位置に集光することになる。従って、光束全体は、標本１３中の通過した領域によらず、強度変調部１５において同じ強度透過率で減光される。これに対して、図２に示すように、標本１３に位相勾配が有る場合には、標本１３へ入射した光束は、標本１３の位相勾配により屈折する。従って、光束を構成する光線は、標本１３中の通過した領域に生じている位相勾配に応じて、瞳面の異なる位置を通過することになり、その結果、瞳面に配置された強度変調部１５において異なる強度透過率で減光される。

例えば、図２に示す例では、標本１３は、点Ｓ１、点Ｓ３、点Ｓ５を通過する光線に対して局所的な位相勾配を有しない。このため、これらの光線は、標本１３で屈折せず、光軸と平行な光線のままで観察光学系１４に入射して、いずれも強度変調部１５上の点Ｆ２を通過する。これにより、点Ｓ１、点Ｓ３、点Ｓ５を通過する光線は、強度変調部１５においていずれも中程度の強度透過率で減光され、それぞれ、撮像素子１６上の点Ｐ５、点Ｐ３、点Ｐ１に入射する。なお、図２に示す強度変調部１５の濃淡は、強度透過率を示し、図２に示す撮像素子１６の濃淡は、撮像素子１６の受光面における光強度を示している。

また、標本１３は、点Ｓ２を通過する光線に対して局所的な位相勾配を有している。このため、点Ｓ２を通過する光線は、標本１３で屈折し、光軸に対して傾いた光線として観察光学系１４に入射し、強度変調部１５上の点Ｆ２とは異なる点Ｆ３を通過する。これにより、点Ｓ２を通過する光線は、強度変調部１５において低い強度透過率で減光され、撮像素子１６上の点Ｐ４に入射する。

さらに、標本１３は、点Ｓ４を通過する光線に対して、点Ｓ２を通過する光線に対して有する位相勾配とは反対の符号の局所的な位相勾配を有している。このため、点Ｓ４を通過する光線は、標本１３で点Ｓ２を通過する光線とは反対方向へ屈折し、光軸に対して点Ｓ２を通過する光線とは反対方向へ傾いた光線として観察光学系１４に入射する。これにより、点Ｓ４を通過する光線は、強度変調部１５上の、点Ｆ２を基準として点Ｆ３とは反対側に位置する点Ｆ１を通過する。このため、点Ｓ４を通過する光線は、強度変調部１５において高い強度透過率で減光され、撮像素子１６上の点Ｐ２に入射する。

以上のように、顕微鏡装置１では、標本１３を通過する光線は標本１３の局所的な位相勾配に応じて瞳面の異なる位置を通過する。さらに、顕微鏡装置１では、単調増加又は単調減少する強度透過率が瞳面に割り当てられているため、瞳面において局所的な位相勾配に応じた強度透過率で光強度が変調される。従って、顕微鏡装置１によれば、撮像素子１６上に位相勾配に応じた光強度を有する光学像を形成することが可能であり、微分干渉顕微鏡で得られる画像に類似する位相勾配画像を得ることができる。

また、顕微鏡装置１では、強度変調部１５を瞳面に設けるだけで、位相勾配画像を得ることができる。このため、微分干渉顕微鏡では必要であった高価なノマルスキープリズムを用いる必要がない。また、微分干渉顕微鏡とは異なり専用の対物レンズ及び専用のコンデンサレンズを用いる必要もない。従って、顕微鏡装置１によれば、既存の顕微鏡からの拡張が容易であり、微分干渉顕微鏡よりも安価に構成することができる。

さらに、顕微鏡装置１では、偏光特性を利用することなく、位相勾配に起因する光の屈折を利用して画像にコントラストをつけている。このため、偏光の振動面を乱してしまうプラスチックが光路上に置かれても観察に影響を及ぼさない。従って、顕微鏡装置１によれば、微分干渉顕微鏡とは異なり、プラスチック容器を用いることが可能であり、標本１３をプラスチック容器に収容したままであっても、標本１３の位相勾配画像を得ることができる。

図１及び図２では、強度変調部１５を観察光学系１４の瞳に配置する例を示したが、強度変調部１５の配置場所は、観察光学系１４の瞳に限らない。図３に示す顕微鏡装置２のように、照明光学系１２の瞳に配置してもよい。なお、レンズ１２ａとレンズ１２ｂは、照明光学系１２を構成するレンズである。この場合も、観察光学系１４の瞳と照明光学系１２の瞳は光学的に共役であるため、同様の効果を得ることができる。

つまり、強度変調部１５は、観察光学系１４の瞳又は観察光学系１４の瞳と光学的に共役な位置に設けられていれば良い。そして、強度変調部１５が観察光学系１４の瞳と光学的に共役な位置に設けられている場合には、瞳と光学的に共役な位置に投影される観察光学系１４の瞳の像内における強度変調部１５の強度透過率分布が、第１方向に単調増加又は単調減少すればよい。

図４は、強度変調部１５の強度透過率分布を例示した図である。強度変調部１５は、図４に示すように、例えば、下式（１）で表される強度透過率分布を有している。ここで、Ｔは、強度透過率分布を示し、ξは、瞳面内における第１方向の位置を示している。位置ξ＝０は瞳面の中心位置であり、位置ξ＝－１、１は、それぞれ瞳面における瞳の端部位置である。

式（１）に示す強度透過率分布の第１方向の位置に対する２階微分値は、正である。瞳内における強度透過率分布の第１方向の位置に対する２階微分値が正であれば、強度透過率が位置に対して線形に変化する場合よりも、位相勾配画像のコントラストを向上させることができる。従って、瞳内における強度透過率分布の第１方向の位置に対する２階微分値は正であることが望ましい。

また、式（１）に示す強度透過率分布は、第１方向の位置の指数関数である。瞳内における強度透過率分布が第１方向の位置の指数関数であれば、標本１３の平坦部分を通過する光線に作用する強度透過率と標本１３の傾斜部分を通過する光線に作用する強度透過率との比が、標本１３に入射する光束の角度によらず一定となる。

例えば、図２では、光源１１の光軸上から出射し、標本１３へ光軸と平行に入射した照明光束を例示したが、光源１１の光軸外から出射した照明光束は、標本１３に斜めに入射する。その結果、斜めに入射した照明光束は、強度変調部１５において、平行に入射した照明光束に対して、一定距離だけ平行移動した位置を通過する。強度透過率分布が指数関数であれば、瞳面において一定距離だけ離れた位置の２つの強度透過率の比は、位置によらず一定値に維持される。このため、平行に入射した照明光束と斜めに入射した照明光束は、同じコントラスト比で光学像を形成することになる。

撮像素子１６に入射する光は、光源１１上の各点からの照明光束の集合である。このため、各照明光束が同じコントラスト比を実現することで、互いにコントラストを打ち消しあうことなく、高いコントラストを実現することが可能である。従って、瞳内における強度透過率分布は第１方向の位置の指数関数であることが望ましい。

図１から図３では、開口絞りを有しない顕微鏡装置１及び顕微鏡装置２を例示したが、図５に示す顕微鏡装置３は、強度変調部１５と光学的に共役な位置に配置された開口絞り１８を有している。開口絞り１８の開口径を調整することで、観察光学系１４は、観察光学系１４から出射する光束であって、強度変調部１５の開口よりも小さな開口に対応する光束によって、標本１３の光学像を形成することができる。これにより、強度変調部１５の開口全部を通る光束によって光学像を形成する場合よりも、高いコントラストを有する光学像を得ることが可能である。また、開口絞り１８の開口径を調整することで、コントラストの調整も可能となる。

図５では、強度変調部１５が光源１１から標本１３までの照明光路上に、開口絞り１８が標本１３から撮像素子１６までの検出光路上に設けられた例が示されているが、強度変調部１５が検出光路上に、開口絞り１８が照明光路上に配置されても良い。開口絞り１８は、照明光路上に配置された場合でも検出光路上に配置された場合でも、撮像素子１６に入射する光束を絞り込むことが可能であり、同様の効果を得ることができるからである。

なお、本明細書において、単に、光学系の開口数といった場合、その光学系の光学設計により決定される開口数であって、その光学系が実現し得る最大の開口数のことをいう。

強度変調部１５が検出光路上に配置されている場合、照明光学系１２の開口数は、観察光学系１４の物体側の開口数よりも小さいことが望ましい。この場合、開口絞り１８を有しなくても、観察光学系１４の像側の開口数よりも小さな開口数に対応する光束によって光学像を形成することができる。従って、開口絞り１８の開口径を調整した場合と同様に、高いコントラストを有する光学像を得ることができる。より具体的には、照明光学系１２の開口数は、例えば、観察光学系１４の物体側の開口数の９０％以下であることが望ましい。
以下、本発明の実施形態について具体的に説明する。

＜第１実施形態＞
図６は、本実施形態に係る顕微鏡装置１００の構成を例示した図である。図７は、コントラスト強調処理の効果を例示した図である。図８は、瞳面における照明光束の範囲を例示した図である。図９及び図１０は、開口絞りにより制限された照明光学系の開口数と画像のコントラストの関係を例示した図である。図１１は、立体形状表示方法を説明するための図である。

顕微鏡装置１００は、図６に示すように、鏡基１１０と鏡筒１２０の間にアダプタ１３０を備える倒立顕微鏡と、カメラ１４０と、制御装置１５０と、表示装置１６０を備えている。

鏡基１１０は、光源１１１と、開口絞り１１２を有するコンデンサ１１３と、ステージ１１４と、対物レンズ１１５と、ノーズピース１１６と、結像レンズ１１７を備えている。鏡筒１２０は、単眼又は双眼鏡筒であり、接眼レンズ１２１を備えている。なお、開口絞り１１２は、羽根絞り等からなり、開口径を調整可能である。

アダプタ１３０は、光路切り替えミラー１３６を備えている。光路切り替えミラー１３６の位置を変更することで、結像レンズ１１７が形成した光学像を接眼レンズ１２１の前側焦点位置に投影する目視観察状態と、結像レンズ１１７が形成した光学像をカメラ１４０に投影する撮影状態と、を切り換えることができる。

アダプタ１３０は、さらに、リレーレンズ１３１と、グラデーションフィルタ１３２と、スライダ１３３と、ダイヤル１３４と、リレーレンズ１３５を備えている。グラデーションフィルタ１３２が設置されているスライダ１３３は、リレーレンズ１３１とリレーレンズ１３５の間に設けられていて、スライダ１３３を所定の位置まで挿入することで、グラデーションフィルタ１３２上に開口絞り１１２の像が投影される。

グラデーションフィルタ１３２は、上述した強度変調部の一例であり、特定方向に単調増加または単調減少する強度透過率を有している。また、グラデーションフィルタ１３２は、スライダ１３３に設けられたダイヤル１３４の回転に連動して方位が変化する。従って、利用者は、ダイヤル１３４を操作することで、強度透過率が単調増加又は単調減少する方向を調整することができる。

カメラ１４０は、観察光学系によって導かれた標本からの光に基づいて標本の画像データを取得する画像取得部である。カメラ１４０は、画像データに基づいて、表示装置１６０に表示される標本の画像のコントラストを強調する強調処理を行ってもよい。即ち、カメラ１４０は、画像取得部であり、コントラスト強調部であってもよい。

制御装置１５０は、カメラ１４０を制御する制御装置であり、ダイヤル１５１を備えている。利用者がダイヤル１５１を回転することで、顕微鏡装置１００は、強調処理におけるコントラストの強調量を調整することができる。なお、制御装置１５０は、表示装置１６０を制御する制御装置であってもよい。この場合、利用者がダイヤル１５１を回転することで、表示装置１６０が画像データに基づいて、表示装置１６０に表示される標本の画像のコントラストを強調する強調処理を行ってもよい。

表示装置１６０は、画像データに基づいて標本の画像のコントラストを強調するコントラスト強調部１６１を備えている。

以上のように構成された顕微鏡装置１００によれば、グラデーションフィルタ１３２の強度透過率分布によって、標本の位相勾配に応じた光強度を有する光学像をカメラ１４０上に形成することができる。このため、図７に示すように、微分干渉顕微鏡で得られる画像２０１に類似した位相勾配画像である画像２０２及び画像２０３を得ることができる。なお、画像２０１、画像２０２及び画像２０３は、大小２つの半球状の標本を撮影した画像である。画像２０２は、カメラ１４０でコントラストを強調する前の画像であり、画像２０３は、カメラ１４０でコントラストを強調した後の画像である。

また、顕微鏡装置１００では、グラデーションフィルタ１３２によって位相勾配をコントラストに変換し、さらに、画像処理によってコントラストを強調する。これにより、図７の画像２０３に示すように、位相勾配がコントラストとして十分に視認される画像を得ることができる。

また、顕微鏡装置１００では、既存の顕微鏡にアダプタ１３０を追加するだけで位相勾配画像を得ることができる。また、偏光特性を利用することなく位相勾配画像を得ることができる。従って、顕微鏡装置１００によれば、安価な構成によって、プラスチック容器に収容したまま標本の位相勾配画像を得ることができる。

さらに、顕微鏡装置１００では、開口絞り１１２の開口径を調整することで、図８に示すように、対物レンズ１１５の瞳面において、照明光束が通過する領域Ｄ２を対物レンズ１１５の瞳Ｄ１内に収めることができる。このため、入射光の角度に依存したコントラストの変動を抑えることが可能となり、高いコントラストを得ることができる。また、コントラストを調整することもできる。

図９に示す画像２０４から画像２０８は、画像処理によってコントラストを強調する前の画像であり、開口絞り１１２で制限された照明光学系の開口数（ＮＡ）を０．５５から０．１まで段階的に小さくしたときの画像である。また、図１０に示す画像２０９から画像２１３は、画像処理によってコントラストを強調した後の画像であり、開口絞り１１２で制限された照明光学系の開口数（ＮＡ）を０．５５から０．１まで段階的に小さくしたときの画像である。図９及び図１０に示すように、開口絞り１１２で制限された照明光学系の開口数を小さくするほど、コントラストを強調することができる。一方で、コントラストを強調しすぎると、立体感が失われるため、コントラストと立体感のバランスを見て、開口絞り１１２を調整することが望ましい。

また、コントラストに応じてデフォーカス特性も変化する。コントラストが強すぎると、デフォーカス量が大きくなるに従って、像がボケるだけではなく、リンギングが目立ってくる。このため、コントラストと立体感に加えて、デフォーカス特性も加味して、開口絞り１１２を調整することが望ましい。

また、画像処理によってコントラストを強調しすぎると、ノイズが強く重畳することになる。そのため、画像処理前の画像のコントラストはある程度高いことが望ましい。具体的には、開口絞り１１２で制限された照明光学系の開口数は、対物レンズ１１５の物体側の開口数の９０％以下であることが望ましい。

さらに、顕微鏡装置１００では、ダイヤル１３４を回転することで、グラデーションフィルタ１３２の方位を変更することができる。これにより、位相勾配画像でコントラストが付く方向、つまり、位相勾配を検出する方向、を調整することができる。また、図１１に示すように、ダイヤル１３４を回転することで、グラデーションフィルタ１３２の方位が９０度異なる向きで２枚の位相勾配画像（画像２１４と画像２１５）を取得してもよい。９０度方位が異なる２枚の位相勾配画像を演算処理することで、位相勾配の検出方向に起因した情報の欠落を補うことができるため、画像２１６に示すように、標本の立体形状をより正確に表示することができる。

＜第２実施形態＞
図１２は、本実施形態に係る顕微鏡装置３００の構成を例示した図である。図１３及び図１４は、強度変調部の設定と画像との関係を例示した図である。図１５は、立体形状表示方法を説明するための図である。

顕微鏡装置３００は、アダプタ１３０の代わりにアダプタ３３０を備える点、制御装置１５０の代わりに制御装置１８０を備える点、及び表示装置１６０の代わりに表示装置１９０を備える点が、顕微鏡装置１００とは異なる。その他の点は、顕微鏡装置１００と同様である。

制御装置１８０は、カメラ１４０又は表示装置１９０が行うコントラスト強調処理を調整するダイヤル１８１に加えて、カメラ１４０又は表示装置１９０が行う彩度強調処理を調整するダイヤル１８２を備えている。

表示装置１９０は、コントラスト強調処理を行うコントラスト強調部１９１に加えて、彩度強調処理を行う彩度強調部１９２を備えている。彩度強調部１９２は、画像データに基づいて、表示装置１９０に表示される標本の画像の彩度を強調する処理を行う。

アダプタ３３０は、スライダ１３３の代わりにスライダ３３３を備えている点が、アダプタ１３０とは異なる。スライダ３３３は、リレーレンズ１３１とリレーレンズ１３５の間の光路上に配置されていて、複数のグラデーションカラーフィルタ（グラデーションカラーフィルタ３３２ａ、グラデーションカラーフィルタ３３２ｂ）が設置されている。スライダ３３３を所定の位置まで挿入することで、複数のグラデーションカラーフィルタを含む強度変調部上に開口絞り１１２の像が投影される。

グラデーションカラーフィルタ３３２ａ及びグラデーションカラーフィルタ３３２ｂは、分光透過率分布（分光強度透過率分布）の異なる複数の強度変調素子の一例である。グラデーションカラーフィルタ３３２ａは、第１波長に対して、特定方向に単調増加又は単調減少する強度透過率を有している。グラデーションフィルタ３３２ｂは、第１波長とは異なる第２波長に対して、特定方向に単調増加又は単調減少する強度透過率を有している。なお、第１波長は、例えば、赤色の波長であり、第２波長は、例えば、青色の波長である。

グラデーションカラーフィルタ３３２ａの方位は、スライダ３３３に設けられたダイヤル３３４ａを回転することで変更可能である。グラデーションカラーフィルタ３３２ｂの方位は、スライダ３３３に設けられたダイヤル３３４ｂを回転することで変更可能である。

以上のように構成された顕微鏡装置３００によっても、複数のグラデーションカラーフィルタを含む強度変調部で位相勾配に応じて減光することができるため、顕微鏡装置１００と同様に、微分干渉顕微鏡で得られる画像に類似した位相勾配画像を得ることができる。

また、顕微鏡装置３００では、ダイヤル３３４ａ及びダイヤル３３４ｂを操作して２枚のグラデーションカラーフィルタの方位を反対に向けることで、図１３に示すように、瞳内における強度変調部の第１波長に対する第１強度透過率分布は、第１方向の正の向きに単調増加し、瞳内における強度変調部の第２波長に対する第２強度透過率分布は、第１方向の負の向きに単調増加する。これにより、画像２１７に示すように、第１方向の位相勾配の符号によって色が異なる位相勾配画像を得ることができる。具体的には、例えば、矢印Ａ１の向きに赤が濃くなり、矢印Ａ２の向きに青が濃くなる画像を得ることができる。従って、濃淡に加えて色の違いで標本の形状、特に、凹凸を認識することが可能であり、色の違いによって位相勾配の正負も認識することができる。このため、顕微鏡装置１００よりも容易に標本の形状を正しく認識することができる。

また、顕微鏡装置３００では、ダイヤル３３４ａ及びダイヤル３３４ｂを操作して２枚のグラデーションカラーフィルタの方位を例えば９０度ずらすことで、図１４に示すように、瞳内における強度変調部の第１波長に対する第１強度透過率分布は、第１方向に単調増加又は単調減少し、瞳内における強度変調部の第２波長に対する第２強度透過率分布は、第１方向とは異なる方向に単調増加又は単調減少する。これにより、画像２１８に示すように、位相勾配の方向によって色合い（色のバランス）の異なる位相勾配画像を得ることができる。具体的には、例えば、矢印Ａ３の向きに赤が濃くなり、矢印Ａ４の向きに青が濃くなる画像を得ることができる。従って、濃淡に加えて色の違いで標本の形状、特に厚さ方向の２次元分布を認識することが可能であり、色合いの違いによって位相勾配の向きも認識することができる。このため、顕微鏡装置１００よりも容易に標本の形状を正しく認識することができる。

また、顕微鏡装置３００では、図１５に示すように、カメラ１４０で取得した位相勾配画像をＲ成分の画像２１９、Ｇ成分の画像２２０、Ｂ成分の画像２２１に分解してもよい。これらの画像からそれぞれ異なる方向の位相勾配を検出することで、標本の立体形状を特定することが可能であり、特定した標本の立体形状を画像２２２に示すように立体表示することができる。

なお、以上では、グラデーションカラーフィルタ３３２ａとグラデーションカラーフィルタ３３２ｂで強度透過率が単調増加又は単調減少する方向又は向きが異なる例を示したが、これらを同じ向きに向けても良い。その場合、グラデーションカラーフィルタ３３２ａとグラデーションカラーフィルタ３３２ｂで強度透過率の増加率又は減少率が異なることが望ましい。つまり、瞳内における強度透過率分布は、波長に応じて第１方向の正の向きに異なる増加率又は減少率を有することが望ましい。これにより、第１方向の正の向きに波長間での強度透過率の比に違いが生じることになるため、位相勾配に応じて色合いの異なる位相勾配画像を得ることができる。

図６に示す顕微鏡装置１００及び図１２に示す顕微鏡装置３００では、スライダに設けられたダイヤルを回転することで、グラデーションフィルタまたはグラデーションカラーフィルタの方位、即ち、位相勾配の検出方向、を変更する例を示したが、位相勾配の検出方向は、他の方法により変更してもよい。例えば、顕微鏡装置１００は、図１６に示すように、スライダ１３３に、複数の強度変調素子を含む強度変調部を設けても良い。複数の強度変調素子は、単調増加又は単調減少する向きが互いに異なる強度透過率分布を有する複数のグラデーションフィルタ（グラデーションフィルタ１３２ａ、グラデーションフィルタ１３２ｂ、グラデーションフィルタ１３２ｃ、グラデーションフィルタ１３２ｄ）である。スライダ１３３を観察光学系の光軸と交差する方向へスライドして、複数の強度変調素子を移動することで、光路上に置かれる強度変調素子を変更し、それによって、位相勾配の検出方向を変更してもよい。

図６では、強度変調部を回転するダイヤル１３４が瞳内又は瞳の像内における強度変調部の強度透過率分布を変更する変更手段として機能する例が示され、図１６では、スライダ１３３が変更手段として機能する例が示されたが、変更手段はこれらの例に限らない。例えば、図１７に示すように、変更手段は、観察光学系の光軸に対する強度変調部（グラデーションフィルタ１３２）の角度を変更する回転軸１３２ｅであってもよい。対物レンズの瞳径に合わせて回転軸１３２ｅを回転することで、グラデーションフィルタ１３２の強度透過率の最も高い領域と最も低い領域を瞳の端部に一致させることができる。このため、グラデーションフィルタ１３２の強度透過率分布を有効に活用して高いコントラストを得ることができる。

＜第３実施形態＞
図１８は、本実施形態に係る顕微鏡装置４００の構成を例示した図である。顕微鏡装置４００は、アダプタ１３０の代わりにアダプタ４３０を備える点が、顕微鏡装置１００とは異なる。その他の点は、顕微鏡装置１００と同様である。

アダプタ４３０は、リレーレンズ１３１の代わりに可変焦点光学系４３１を備える点、スライダ１３３を案内するガイド４３２を備える点が、アダプタ１３０とは異なる。

可変焦点光学系４３１は、観察光学系に含まれていて、グラデーションフィルタ１３２と標本の間の光路上に配置されている。可変焦点光学系４３１の焦点距離を変更することで、グラデーションフィルタ１３２に投影される対物レンズ１１５の瞳の像の大きさが変化する。従って、可変焦点光学系４３１の焦点距離を変更することで、グラデーションフィルタ１３２が有する強度透過率分布のどの範囲を利用するかを調整することができる。また、対物レンズの交換に伴う瞳径の変化に対しても、可変焦点光学系４３１の焦点距離の変更で対処することができる。

ガイド４３２は、光軸方向へのスライダ１３３の移動を案内することで、グラデーションフィルタ１３２を光軸方向へ動かす移動手段の一例である。移動手段によりグラデーションフィルタ１３２を含む強度変調部を光軸方向へ動かすことで、強度変調部と瞳面の位置関係を調整することが出来る。これは、対物レンズの交換によって瞳面の位置が変化した場合に特に効果的である。

以上のように構成された顕微鏡装置４００によっても、強度変調部で位相勾配に応じて減光することができるため、顕微鏡装置１００と同様に、微分干渉顕微鏡で得られる画像に類似した位相勾配画像を得ることができる。

なお、図６、図１２、図１８では、強度変調部がグラデーションフィルタを含む例を示したが、強度変調部は、グラデーションフィルタに限らない。例えば、図１９に示すような、複数の画素５０１が格子状に配列した空間光変調器５００であってもよく、空間光変調器５００によって第１方向に単調増加又は単調減少する強度透過率分布を実現してもよい。

＜第４の実施形態＞
図２０は、本実施形態に係る顕微鏡装置６００の構成を例示した図である。顕微鏡本体６１０と、コンピュータ６４０と、表示装置１６０を備えている。なお、ＰＭＴ６３１とコンピュータ６４０は、画像取得部６５０を構成する。

顕微鏡本体６１０は、レーザ走査型顕微鏡を拡張したものであり、コンピュータ６４０と協働することで共焦点画像を得ることができる。レーザ光源６１１から出射したレーザ光は、ビームエキスパンダ６１２で光束径が拡大されて、その後、開口絞り６１３、ダイクロイックミラー６１４、ガルバノミラー６１５、及びリレーレンズ６１６を経由して、ノーズピース６１７に装着された対物レンズ６１８に入射する。ノーズピース６１７には、対物レンズ６１８の他に倍率の異なる対物レンズ６１９が装着されている。対物レンズ６１８は、レーザ光を集光して、ステージ６２０に置かれたプラスチックシャーレ６２１内の培養細胞６２２の一点に照射する。レーザ光の集光位置は、ガルバノミラー６１５でのレーザ光の偏向方向によって制御可能である。従って、ガルバノミラー６１５を制御することで培養細胞６２２をニ次元に走査することができる。

レーザ光が照射された培養細胞６２２では、蛍光が発生し、対物レンズ６１８、リレーレンズ６１６、ガルバノミラー６１５を経由してダイクロイックミラー６１４へ入射する。その後、ダイクロイックミラー６１４で反射した蛍光は、レンズ６２３によって共焦点絞り６２４へ照射され、焦点位置から生じた蛍光のみが共焦点絞り６２４に設けられたピンホールを通過して、光電子増倍管（以降、ＰＭＴと記す。）６２５に入射する。

コンピュータ６４０は、培養細胞６２２の走査中にＰＭＴ６２５から出力される信号を、レーザ光の走査位置を用いて二次元にマッピングすることで、共焦点画像を得る。

顕微鏡本体６１０は、さらに、ユニバーサルコンデンサ６２６と、レンズ６３０と、ＰＭＴ６３１を備えている。ユニバーサルコンデンサ６２６のターレットには、複数の変調素子（変調素子６２７、変調素子６２８、変調素子６２９）が収容されていて、複数の変調素子の中から選択した変調素子を光路上に配置することができる。

ユニバーサルコンデンサ６２６に収容されている複数の変調素子のうちの少なくとも１つは、強度変調部である。この例では、変調素子６２８は、例えば、特定方向に単調増加又は単調減少する強度透過率分布を有するグラデーションフィルタであり、対物レンズ６１８の瞳と光学的に共役な位置に配置されている。

培養細胞６２２に照射されたレーザ光は、プラスチックシャーレ６２１を透過してユニバーサルコンデンサ６２６に入射する。その後、ユニバーサルコンデンサ６２６内の変調素子６２８で位相勾配に応じた強度透過率で減光されて、レンズ６３０を経由してＰＭＴ６３１へ入射する。

コンピュータ６４０は、培養細胞６２２の走査中にＰＭＴ６３１から出力される信号を、レーザ光の走査位置を用いて二次元にマッピングすることで、位相勾配画像を得る。なお、コンピュータ６４０は、位相勾配画像のコントラストを強調する画像処理を行ってもよく、コンピュータ６４０の代わりに表示装置１６０のコントラスト強調部１６１がコントラストを強調する画像処理を行ってもよい。

位相勾配画像を得る場合、予め、対物レンズ６１８から出射する光束の開口数がユニバーサルコンデンサ６２６の開口数よりも小さくなるように、開口絞り６１３の開口径を調整することが望ましい。これにより、高いコントラストの位相勾配画像を得ることができる。

以上のように構成された顕微鏡装置６００によれば、共焦点画像と同時に、微分干渉顕微鏡で得られる画像に類似した位相勾配画像を得ることができる。このため、運動する生細胞について、蛍光色素の位置と細胞の構造の相関を正確に把握することができる。

上述した実施形態は、発明の理解を容易にするための具体例を示したものであり、本発明の実施形態はこれらに限定されるものではない。上述した実施形態の一部を他の実施形態に適用して本発明の更に別の実施形態を構成してもよい。顕微鏡装置は、特許請求の範囲の記載を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。

例えば、上述した実施形態では、位相勾配画像を倒立顕微鏡で取得する例を示したが、位相勾配画像は正立顕微鏡で取得してもよい。また、上述した実施形態では、位相勾配画像を透過光に基づいて取得する例を示したが、位相勾配画像は反射光に基づいて取得してもよい。即ち、落射照明光学系を用いて位相勾配画像を取得してもよい。さらに、上述した実施形態では、強度変調部がグラデーションフィルタを含む例を示したが、強度反射率が分布を持つグラデーションミラーを含んでも良い。この場合、強度変調部の、瞳内又は瞳の像内における強度反射率分布は、第１方向に単調増加又は単調減少すればよい。

なお、強度変調部の強度透過率分布と強度変調部の強度反射率分布は、いずれも強度変調部に入射する光強度と強度変調部から出射する光強度の比率を示す分布である。つまり、強度変調部の強度透過率分布と強度変調部の強度反射率分布は、いずれも強度変調部での光利用率を示す光利用率分布の一例である。また、強度変調部の分光強度透過率分布と強度変調部の分光強度反射率分布は、強度変調部での分光光利用率を示す分光光利用率分布の一例である。

１、２、３、１００、３００、４００、６００顕微鏡装置
１１、１１１光源
１２照明光学系
１２ａ、１２ｂ、１４ａ、１４ｂ、６２３、６３０レンズ
１３標本
１４観察光学系
１５強度変調部
１６撮像素子
１７、１６０、１９０表示装置
１８、１１２、６１３開口絞り
１１０鏡基
１１３コンデンサ
１１４、６２０ステージ
１１５、６１８、６１９対物レンズ
１１６、６１７ノーズピース
１１７結像レンズ
１２０鏡筒
１２１接眼レンズ
１３０、３３０、４３０アダプタ
１３１、１３５、６１６リレーレンズ
１３２、１３２ａ－１３２ｄグラデーションフィルタ
１３２ｅ回転軸
１３３スライダ
１３４、１５１、１８１、１８２、３３４ａ、３３４ｂダイヤル
１３６光路切り替えミラー
１４０カメラ
１５０、１８０制御装置
１６１、１９１コントラスト強調部
１９２彩度強調部
２０１－２２２画像
３３２ａ、３３２ｂグラデーションカラーフィルタ
５００空間光変調器
５０１画素
３３３スライダ
４３１可変焦点光学系
４３２ガイド
６１０顕微鏡本体
６１１レーザ光原
６１２ビームエキスパンダ
６１４ダイクロイックミラー
６１５ガルバノミラー
６２１プラスチックシャーレ
６２２培養細胞
６２４共焦点絞り
６２５、６３１ＰＭＴ
６２６ユニバーサルコンデンサ
６２７－６２９変調素子
６４０コンピュータ
６５０画像取得部

Claims

標本を照明する照明光学系と、
前記標本からの光を導く観察光学系と、
前記観察光学系の瞳、又は、前記瞳と光学的に共役な位置に設けられた強度変調部であって、前記強度変調部に入射した入射光を減光する、前記強度変調部と、を備え、
前記瞳内又は前記瞳の像内における前記強度変調部の強度透過率分布である光利用率分布は、第１方向に単調増加又は単調減少し、且つ、前記観察光学系の光軸又は前記照明光学系の光軸を中心とした両側で変化する
ことを特徴とする顕微鏡装置。
標本を照明する照明光学系と、
前記標本からの光を導く観察光学系と、
前記観察光学系の瞳、又は、前記瞳と光学的に共役な位置に設けられた強度変調部であって、前記強度変調部に入射した入射光を減光する、前記強度変調部と、を備え、
前記瞳内又は前記瞳の像内における前記強度変調部の強度反射率分布である光利用率分布は、第１方向に単調増加又は単調減少し、且つ、前記観察光学系の光軸又は前記照明光学系の光軸を中心とした両側で変化する
ことを特徴とする顕微鏡装置。
請求項１又は請求項２に記載の顕微鏡装置において、さらに、
前記観察光学系によって導かれた前記標本からの光に基づいて前記標本の画像データを取得する画像取得部と、
前記画像取得部で取得した前記画像データに基づいて、表示装置に表示される前記標本の画像のコントラストを強調する処理を行うコントラスト強調部と、を備える
ことを特徴とする顕微鏡装置。
請求項３に記載の顕微鏡装置において、さらに、
前記表示装置を備える
ことを特徴とする顕微鏡装置。
請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、
前記観察光学系は、前記観察光学系から出射する光束であって、前記観察光学系の像側の開口数よりも小さな開口数に対応する光束で、前記標本の光学像を形成する
ことを特徴する顕微鏡装置。
請求項５に記載の顕微鏡装置において、
前記照明光学系の開口数は、前記観察光学系の物体側の開口数よりも小さい
ことを特徴する顕微鏡装置。
請求項６に記載の顕微鏡装置において、
前記顕微鏡装置は、さらに、前記照明光学系の瞳に配置された開口絞りを有し、
前記強度変調部は、前記観察光学系の光路上に配置され、
前記開口絞りの開口中心の像は、前記観察光学系の瞳の中心である光軸上に投影される
ことを特徴する顕微鏡装置。
請求項６又は請求項７に記載の顕微鏡装置において、
前記照明光学系の開口数は、前記観察光学系の物体側の開口数の９０％以下である
ことを特徴する顕微鏡装置。
請求項５、６、８のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、さらに、
開口絞りを有する
ことを特徴する顕微鏡装置。
請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、
前記瞳内又は前記瞳の像内における前記光利用率分布の、前記第１方向の位置に対する２階微分値は、正である
ことを特徴する顕微鏡装置。
請求項１０に記載の顕微鏡装置において、
前記瞳内又は前記瞳の像内における前記光利用率分布は、前記第１方向の位置の指数関数である
ことを特徴する顕微鏡装置。
請求項３又は請求項４に記載の顕微鏡装置において、
前記画像データに基づいて、前記表示装置に表示される前記標本の画像の彩度を強調する処理を行う彩度強調部と、を備える
ことを特徴とする顕微鏡装置。
請求項１乃至請求項１２のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、
前記瞳内又は前記瞳の像内における前記光利用率分布は、波長に応じて前記第１方向の正の向きに異なる増加率又は減少率を有する
ことを特徴する顕微鏡装置。
請求項１乃至請求項１３のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、
前記瞳内又は前記瞳の像内における前記強度変調部の第１波長に対する第１光利用率分布は、前記第１方向の正の向きに単調増加し、
前記瞳内又は前記瞳の像内における前記強度変調部の第２波長に対する第２光利用率分布は、前記第１方向の負の向きに単調増加し、
前記第１波長と前記第２波長は、異なる
ことを特徴する顕微鏡装置。
請求項１乃至請求項１２のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、
前記瞳内又は前記瞳の像内における前記強度変調部の第１波長に対する第１光利用率分布は、前記第１方向に単調増加又は単調減少し、
前記瞳内又は前記瞳の像内における前記強度変調部の第２波長に対する第２光利用率分布は、前記第１方向とは異なる方向に単調増加又は単調減少し、
前記第１波長と前記第２波長は、異なる
ことを特徴する顕微鏡装置。
請求項１３乃至請求項１５のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、
前記強度変調部は、分光光利用率分布の異なる複数の強度変調素子を含み、
ことを特徴する顕微鏡装置。
請求項１乃至請求項１６のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、さらに、
前記瞳内又は前記瞳の像内における前記光利用率分布を変更する変更手段を備える
ことを特徴する顕微鏡装置。
請求項１７に記載の顕微鏡装置において、
前記変更手段は、前記強度変調部を回転する
ことを特徴する顕微鏡装置。
請求項１７に記載の顕微鏡装置において、
前記強度変調部は、複数の強度変調素子を含み、
前記複数の強度変調素子は、単調増加又は単調減少する向きが互いに異なる光利用率分布を有し、
前記変更手段は、前記観察光学系の光軸又は前記照明光学系の光軸と交差する方向へ、前記複数の強度変調素子を移動する
ことを特徴する顕微鏡装置。
請求項１７に記載の顕微鏡装置において、
前記変更手段は、前記観察光学系の光軸又は前記照明光学系の光軸に対する前記強度変調部の角度を変更する
ことを特徴する顕微鏡装置。
請求項１７に記載の顕微鏡装置において、
前記強度変調部は、検出光路上に配置され、
前記変更手段は、前記観察光学系に含まれる可変焦点光学系であって、前記強度変調部と前記標本の間の光路上に配置された前記可変焦点光学系である
ことを特徴する顕微鏡装置。
請求項１乃至請求項２１のいずか１項のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、さらに、
前記観察光学系の光軸の方向又は前記照明光学系の光軸の方向に、前記強度変調部を動かす移動手段を備える
ことを特徴する顕微鏡装置。
請求項１又は請求項２に記載の顕微鏡装置において、
前記強度変調部は、複数の画素が格子状に配列した空間光変調器を含む
ことを特徴する顕微鏡装置。
請求項１に記載の顕微鏡装置において、
前記強度変調部は、前記強度透過率分布を有するグラデーションフィルタを含む
ことを特徴する顕微鏡装置。
請求項２に記載の顕微鏡装置において、
前記強度変調部は、前記強度反射率分布を有するグラデーションミラーを含む
ことを特徴する顕微鏡装置。