JP2006163090A

JP2006163090A - 位相差顕微鏡

Info

Publication number: JP2006163090A
Application number: JP2004356136A
Authority: JP
Inventors: Tatsuro Otaki; 達朗大瀧
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2004-12-09
Filing date: 2004-12-09
Publication date: 2006-06-22

Abstract

【課題】鮮明な断層像を得ることができる位相差顕微鏡を提供する。
【解決手段】光源からの光束を被検物体Ｏに照射するための照明光学系を構成するコンデンサレンズ２と、照明光学系の光路に配置されたリング絞り１と、被検物体Ｏからの光束を集光して像を形成する結像光学系を構成する対物レンズ３と、結像光学系の光路上の、リング絞り１と共役な位置に配置された位相板５とを備えている位相差顕微鏡において、照明光学系の照明光の開口角Ｔ１と位相板５の位相変換部５ａに対応する開口角Ｔ２とにＴ１×２＜Ｔ２の関係を持たせた。
【選択図】図２

Description

この発明は、位相差顕微鏡に関し、特に生物標本等の無色透明な物体を染色することなく観察できる位相差顕微鏡に関する。

位相差顕微鏡においては、照明系に配した絞りによって制限された照明光で位相物体を含む被検物体を照明し、この絞りと共役位置の対物レンズ内に位相を変換する位相膜を配して被検物体を透過した照明光の０次光と回折光とに位相差を与え、被検物体によって生じる位相差を光の強弱であるコントラストに変える。これにより、通常視認できないような透明な被検物体を可視化して観察することができる。
特開平２０００−１９４１０号公報

ところで、位相差顕微鏡を用いて細胞等の透明な被検物体の断層像を観察したいという要求がある。

しかし、被検物体の観察したい位置の前後の空間周波数の低い成分の像が観察したい位置の断層像にノイズとして重なると、その断層像が全体としてコントラストの低い不鮮明な画像になるという問題がある。

この発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、その課題は鮮明な断層像を得ることができる位相差顕微鏡を提供することである。

前述の課題を解決するため請求項１記載の発明は、光源からの光束を被検物体に照射するための照明光学系と、前記照明光学系の光路に配置された開口絞りと、前記被検物体からの光束を集光して像を形成する結像光学系と、前記結像光学系の光路上の、前記開口絞りと共役な位置に配置された位相板とを備えている位相差顕微鏡において、前記照明光学系の照明光の開口角Ｔ１と前記位相板の位相変換部又は透過率変調部に対応する開口角Ｔ２とがＴ１×２＜Ｔ２の関係にあることを特徴とする。

請求項２記載の発明は、請求項１記載の位相差顕微鏡において、前記像を画像信号として出力する撮像手段と、前記画像信号を記憶する記憶手段と、（Ｔ２−Ｔ１）／２の式で定められた数値に基づいて前記画像信号の空間周波数の低い成分を除去する制御手段とを備えていることを特徴とする。

請求項３記載の発明は、請求項１又は２記載の位相差顕微鏡において、前記被検物体が載置され、光軸方向へ移動可能なステージと、前記制御手段の出力信号に基づいて前記照明光学系に対する前記ステージの相対移動を制御するステージ制御手段とを備えていることを特徴とする。

請求項４記載の発明は、請求項３記載の位相差顕微鏡において、前記制御手段は前記光軸方向の異なる位置で画像信号を取得し、それらの画像信号を前記記憶手段に記憶させることを特徴とする。

この発明の位相差顕微鏡によれば、鮮明な断層像を得ることができる。

以下、この発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。

図１はこの発明の第１実施形態に係る位相差顕微鏡の概念図である。

この位相差顕微鏡はリング絞り（開口絞り）１とコンデンサレンズ２と対物レンズ３と結像レンズ４と位相板５とＣＣＤ（ＣｈａｒｇｅＣｏｕｐｌｅｄＤｅｖｉｃｅ）（撮像手段）６とパソコン（パーソナルコンピュータ）（制御手段）７とＤＲＡＭ（ＤｙｎａｍｉｃＲａｎｄｏｍＡｃｃｅｓｓＭｅｍｏｒｙ）（記憶手段）８とＣＲＴモニタ９とを備える。なお、記憶手段としてはＤＲＡＭ８に代えてハードディスク等を用いてもよい。

リング絞り１はリング状の開口（図示せず）を有する円板である。リング絞り１は光源（図示せず）からの照明光をリング状の絞り光とする。リング絞り１はコンデンサレンズ２の前側焦点位置に配置されている。

照明光の開口数／対物レンズ３の開口数の値は０．４〜０．５の間に設定されている。この値を中心にして±２．５％〜±５％の間の値にすれば、対物レンズ３の解像力を生かした観察ができる。

位相板５はリング絞り１の開口と同形状のリング状の位相変換部を有する透明な円板である。位相変換部は、その透過光の位相に遅れ（又は進み）を生じさせるとともに、透過光量を低下させる。位相板５は、対物レンズ３の後側焦点面位置であって、リング絞り１と共役な位置に配置されている。

コンデンサレンズ２と対物レンズ３との間に細胞等の透明な被検物体Ｏが配置されている。被検物体Ｏ中には大きさの異なる位相物体が含まれている。

ＣＣＤ６は受光した光の強弱の像をその光の強弱に応じた画像信号に変換して出力する。

パソコン７はＣＣＤ６から出力された画像信号に基づいてＤＲＡＭ８、ＣＲＴモニタ９を制御する。

光源（図示せず）からの照明光束はリング絞り１の開口を通る際にリング状の光束となる。この光束はコンデンサレンズ２によって集光され、被検物体Ｏが照明される。光源からコンデンサレンズ２までの光学部材が照明光学系を構成する。

被検物体Ｏを透過した照明光束は対物レンズ３、位相板５及び結像レンズ４を順次透過し、ＣＣＤ６の撮像面６ａに結像する（像Ｉを作る）。対物レンズ３から結像レンズ４までの光学部材が結像光学系を構成する。

像ＩはＣＣＤ６で光の強弱に応じた画像信号に変換され、パソコン７に入力される。

パソコン７は画像信号をＤＲＡＭ８に記憶させるとともに、画像信号から空間周波数の低い成分を除去し、ＣＲＴモニタ９に断層像として表示する。

パソコン７で空間周波数の低い成分が除去された画像信号はＤＲＡＭ８に別途記憶される。

図２は照明光の開口角と対物レンズ及び位相板との関係を説明する図、図３は位相板の平面図である。

位相板５は位相変換部５ａと光強度を変えない部分５ｃとからなる。

位相変換部５ａを透過した光と光強度を変えない部分５ｃを透過した光との間にはπ/２の位相差が生じる。

位相変換部５ａのうち領域５ａ−１（位相変換部５ａの中間の領域）の幅がリング絞り１の開口の幅Ｗ１に対応する。

被検物体Ｏに照射される照明光の開口角Ｔ１（開口絞り１の開口の幅Ｗ１とコンデンサレンズ２の焦点距離とで決まる）と、位相変換部５ａに対応する開口角Ｔ２（位相変換部５ａの幅Ｗ２と対物レンズ３の焦点距離とで決まる）との間には以下の関係がある。

Ｔ１×２＜Ｔ２（１）
例えば、開口数０．８の対物レンズの場合、Ｔ１＝０．０８、Ｔ２＝０．１６である。

光源から発せられた波長λの照明光はリング絞り１、コンデンサレンズ２を介して被検物体Ｏに照射される。

被検物体Ｏを透過した照明光（０次光）と、被検物体Ｏ中の位相物体（図示せず）に応じて発生した回折光とが対物レンズ３に入射する。

被検物体Ｏで生じた回折光の一部が位相変換部５ａを透過する。

後述するように、位相物体が大きい方が回折角θが小さくなるため、空間周波数の低い成分の回折光の強度が低下する。

したがって、ＣＣＤ６で撮像された画像は低コントラストの像になる。

一方、空間周波数の高い成分の回折光の強度はほとんど低下しないため、ＣＣＤ６で撮像された画像は空間周波数の高い成分が強調された高コントラストの像になる。

空間周波数の高い成分は焦点ずれによるコントラストの変化が大きく、いわゆるボケた像が検出され難いので、被検物体Ｏの鮮明な断層像が得られる。

なお、パソコン７を用い、以下のように画像処理を行うようにすれば、より鮮明な断層像を得ることができる。

すなわち、次の式（２）で定められた数値Ｆに基づいて画像信号の空間周波数１／ｄ以下の成分を除去し、径がｄより大きい位相物体のコントラストを低下させる。

Ｆ＝（Ｔ２−Ｔ１）／２（２）
なお、ｄは次の式（３）とＦ＝θとから求められる。

θ＝ｓｉｎ^-1（０．６１λ／ｎ・ｄ）（３）
ただし、０≦θ≦π／２である。

なお、θは、被検物体Ｏで生じる回折光の回折角（エアリの第１暗環までの角度）、λは照明光の波長、ｎは位相物体の屈折率である。

このようにして得られた断層像は、被検物体Ｏの空間周波数の低い成分がより低コントラストになり、より鮮明になる。

この実施形態によれば、観察したい位置の前後の被検物体の空間周波数の低い成分の像が観察したい位置の断層像にノイズとして重なることがなく、鮮明な断層像を得ることができる。

図４はこの発明の第２実施形態に係る位相差顕微鏡に用いられる位相板の平面図である。

なお、第２実施形態に係る位相差顕微鏡の構成（位相板を除く）は第１実施形態に係る位相差顕微鏡の構成と同じである。

位相板５１は透明な円板である。位相板５１は第１透過率変調部５１ａと第２透過率変調部５１ｂと無変調部５１ｃとからなる。

リング状の第２透過率変調部５１ｂはリング状の第１透過率変調部５１ａの内側及び外側にそれぞれ形成されている。

被検物体Ｏに照射される照明光の開口角Ｔ１と、第１透過率変調部５１ａ及び第２透過率変調部５１ｂ（幅Ｗ３）に対する開口角Ｔ２とは式（１）の関係にある。

例えば、開口数０．８の対物レンズの場合、Ｔ１＝０．０８、Ｔ２＝０．１６である。また、開口数０．６の対物レンズの場合、Ｔ１＝０．０３、Ｔ２＝０．０６である。なお、Ｔ２＝０．０９としてもよい。

第１実施形態と同様に、式（２）で定まる数値Ｆに基づいて、画像信号の空間周波数の低い成分を除去する画像処理を行えば、被検物体Ｏの空間周波数の低い成分の像が、低コントラストとなる。

この実施形態によれば、第１実施形態と同様の効果を奏する。

図５はこの発明の第３実施形態に係る位相差顕微鏡の概念図であり、第１実施形態と共通する部分には同一符号を付してその説明を省略する。

この実施形態は被検物体Ｏを保持するステージ１１をステージ制御装置（ステージ制御手段）１０からの指令によって光軸方向へ移動させるようにした点で第１実施形態と相違する。

ステージ１１の駆動手段としてはモータやピエゾ素子がある。

ステージ制御装置１０は例えばマイクロコンピュータ等で構成される。

ステージ制御装置１０はパソコン７からの指令に基づいてステージ駆動手段としてのモータやピエゾ素子を駆動し、ステージ１１を光軸方向へ所定間隔ずつ移動させる。

ステージ１１の移動毎にＣＣＤ６で像を取得する。取得された各像は被検物体Ｏの空間周波数成分の低い成分が除去された断層像である。

パソコン７はＣＣＤ６から画像信号を取り込むとともに、取り込んだ画像信号をＤＲＡＭ８に記憶させる。

また、パソコン７は連続的に取り込んだ断層像に対して、画像処理（例えば断層像毎に２次元画像処理を行い、得られた各断層層を接続する）を行って、被検物体Ｏの３次元像を作成し、それをＣＲＴモニタ９に表示させる。

この実施形態によれば、第１実施形態と同様の効果を奏するとともに、被検物体Ｏの内部まで明瞭に見える３次元像を作成することができる。

図１はこの発明の第１実施形態に係る位相差顕微鏡の概念図である。図２は照明光の開口角と対物レンズ及び位相板との関係を説明する図である。図３は位相板の平面図である。図４はこの発明の第２実施形態に係る位相差顕微鏡に用いられる位相板の平面図である。図５はこの発明の第３実施形態に係る位相差顕微鏡の概念図である。

符号の説明

１リング絞り（開口絞り）
２コンデンサレンズ
３対物レンズ
４結像レンズ
５，５１位相板
５ａ位相変換部
５ｃ光強度を変えない部分
６ＣＣＤ（撮像手段）
７パソコン（制御手段）
８ＤＲＡＭ（記憶手段）
１０ステージ制御装置（ステージ制御手段）
１１ステージ
５１ａ第１透過率変調部
５１ｂ第２透過率変調部
５１ｃ無変調部
Ｏ被検物体
Ｉ像

Claims

光源からの光束を被検物体に照射するための照明光学系と、
前記照明光学系の光路に配置された開口絞りと、
前記被検物体からの光束を集光して像を形成する結像光学系と、
前記結像光学系の光路上の、前記開口絞りと共役な位置に配置された位相板と
を備えている位相差顕微鏡において、
前記照明光学系の照明光の開口角Ｔ１と前記位相板の位相変換部又は透過率変調部に対応する開口角Ｔ２とが
Ｔ１×２＜Ｔ２
の関係にあることを特徴とする位相差顕微鏡。
前記像を画像信号として出力する撮像手段と、前記画像信号を記憶する記憶手段と、（Ｔ２−Ｔ１）／２の式で定められた数値に基づいて前記画像信号の空間周波数の低い成分を除去する制御手段とを備えていることを特徴とする請求項１記載の位相差顕微鏡。
前記被検物体が載置され、光軸方向へ移動可能なステージと、前記制御手段の出力信号に基づいて前記照明光学系に対する前記ステージの相対移動を制御するステージ制御手段とを備えていることを特徴とする請求項１又は２記載の位相差顕微鏡。
前記制御手段は前記光軸方向の異なる位置で画像信号を取得し、それらの画像信号を前記記憶手段に記憶させることを特徴とする請求項３記載の位相差顕微鏡。