JP3540352B2

JP3540352B2 - 位相差顕微鏡

Info

Publication number: JP3540352B2
Application number: JP04569794A
Authority: JP
Inventors: 裕石渡
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1993-12-17
Filing date: 1994-03-16
Publication date: 2004-07-07
Anticipated expiration: 2019-07-07
Also published as: JPH07225341A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、例えば細胞やバクテリア等の透明な標本を観察するのに用いられる位相差顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
位相差顕微鏡においては、照明系の瞳位置に任意形状の開口を配置し、この任意形状の開口と共役な位置関係にある対物レンズの瞳位置に、前記任意形状の開口と共役な形状、すなわち相似の形状の位相板を配置して、標本面で回折した光のうち０次光の位相および強度に変化を与えて他の回折光と干渉させることにより、標本の位相量を像のコントラストに変えて観察し得るようにしている。
【０００３】
また、位相差顕微鏡による位相差像のコントラストについて、例えば、「"Some improvements in the phase contrast microscope" K.Yamamoto,A.Taira,J.Microscopy,129(1983),p.49 〜62」には、その改善方法が記載されている。従来の位相差顕微鏡においては、一般に、位相板の径を対物レンズの瞳径の半分程度にして、像コントラストを改善している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、位相差顕微鏡による結像においては、例えば「 "位相差顕微鏡の像コントラストに関する考察" 大木裕史，光学，vol.20,No.9(1991),p.590 〜594 」に記載されているように、カットオフ周波数が位相板の径と瞳径との比によって決まる。このため、通常の明視野顕微鏡と比較して解像力が劣るという欠点がある。この欠点を除去するには、位相板の径と瞳径との比を１に近づければ良いが、このようにすると上記文献にも記載されているように、低い帯域の空間周波数のコントラストが下がるため、像全体のコントラストが下がり、見た目にはっきりしない像になってしまうという問題がある。
【０００５】
また、位相板の位置を変えずに像コントラストを上げる方法として、位相板の吸収を大きくすることが考えられる。しかし、位相板の吸収を大きくすると、例えば「 "顕微鏡における逆問題について" 高橋，根本，電気通信学会技術研究報告MBE88-58,P.35 〜42,1988 」において指摘されているように、生体標本のように波長と比較して厚い標本に対しては、本来標本には存在しない空間周波数成分（非線形項）の影響が現れ、正確な位相差像が再現されなくなるという問題が生じることになる。
【０００６】
以上のことから、従来の位相差顕微鏡においては、解像力と像コントラストとの双方を満足するものが得られなかった。
【０００７】
この発明は、上記の点に鑑みてなされたもので、像コントラストを低下させることなく、解像力を有効に向上できるよう適切に構成した位相差顕微鏡を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、この発明では、照明光学系の瞳位置に任意形状の開口を配置し、この任意形状の開口と標本面を介して共役な位置関係にある結像光学系の瞳位置に、前記任意形状の開口と共役な形状の位相板を配置して、前記標本面に配置される標本を位相差法により観察するようにした位相差顕微鏡において、
前記結像光学系の結像面に配置した撮像素子と、この撮像素子により撮像された画像を記憶する記憶手段と、この記憶手段に記憶された画像を処理する処理手段とを設けると共に、前記位相板をほぼ同位相量で符号が反対の位相差量を与えるよう構成し、その各位相差量における画像を前記撮像素子を介して前記記憶手段に記憶し、その記憶された２つの画像の差画像を前記処理手段から得るようにする。
【０００９】
前記位相板は液晶を有するのが、この液晶に印加する電圧を制御して、ほぼ同位相量で符号が反対の位相差量を与える点で好ましい。
また、前記位相板は、輪帯形状をもって構成すると共に、その輪帯の中心部の半径ｒと、前記結像光学系の瞳の半径Ｒとの比を、１＞ｒ／Ｒ≧０．５とするのが、コントラストを劣化させずに解像力を良くする点で好ましい。
【００１０】
さらに、前記処理手段から得られた差画像を、デコンボリューション演算する演算手段を設けることが、位相変化のゆるやかな標本（空間周波数の低い標本）についてコントラストを低下させず、しかも特定の空間周波数帯域の位相分布のコントラストを強調することなく、標本の位相分布を正確にコントラストに変換する点で好ましい。
さらにまた、前記演算手段によるデコンボリューション演算は、前記処理手段から得られた差画像をフーリエ変換し、その値を光学的伝達関数で割り算して、再びフーリエ変換することが、標本の位相分布を正確にコントラストに変換する点で好ましい。
【００１１】
【作用】
位相差顕微鏡の結像について、１次元のモデルを用いて説明する。
いま、結像光学系の瞳関数をP(ξ) 、照明光学系の瞳関数をQ(ξ) 、位相物体（標本）の位相分布をφ(x) として弱位相近似を行うと、位相物体の像強度分布I(x)は、
【数１】

で与えられる。ただし、Φ(f) はφ(x) のフーリエ変換を表し、ｆは空間周波数を示す。
【００１２】
また、位相差顕微鏡の結像光学系の瞳関数をP(ξ) は、下記の（２）式で示す関数の線形結合で表すことができる。
【数２】

【００１３】
ここで、照明光学系の瞳関数Q(ξ) が、Q(ξ) ＝ Pb(ξ) で表せるとすると、上記（１）式は、
【数３】

になる。したがって、位相差顕微鏡における像コントラストは近似的に（３）式で表される。
【００１４】
上記（４）式において、θは、位相板で０次光に与える位相の変化量を表している。この位相の変化量θは、通常、θ＝±π／２であり、θ＝π／２のときがダークコントラスト、θ＝−π／２のときがブライトコントラストである。ここで、ダークコントラストのときの像強度分布をIa、ブライトコントラストのときの像強度分布をIbとして、Ib−Iaを考えると、
【数４】

となり、位相差像に関する像強度分布のみが２倍になる。
【００１５】
したがって、θ＝±π／２のそれぞれの画像を、結像光学系の結像面に配置した撮像素子で撮像し、その各々の画像を記憶手段に記憶して、その記憶された２つの画像から処理手段により差画像を作れば、（５）式に示すように、位相差像に関する像強度分布のみが２倍となって現れることになる。しかも、この位相差像には、（３）式において含まれていた非線形項が相殺されるので、非線形項による影響を小さくでき、したがって正確な位相差像を得ることが可能となる。
【００１６】
ここで、θ＝±π／２の２つの画像は、θ＝±π／２の位相板を、結像光学系の瞳内で機械的に入れ換えることにより得ることもできるが、この場合には２つの状態間で光軸の移動が生じる等の理由から、照明光学系の瞳位置に配置した任意形状の開口の像と位相板とをそれぞれの状態で完全に一致させるのが困難となり、同一条件の２つの画像を得るのが難しくなる。
【００１７】
そこで、この発明の好適実施例においては、位相板を液晶を用いて構成し、この液晶に印加する電圧を制御して、θ＝±π／２の位相差量を与えるようにする。このようにすれば、常に同一条件で２つの画像を得ることができるので、より正確な位相差像を得ることが可能となる。
【００１８】
また、上記（４）式から、位相差顕微鏡における空間周波数特性は、位相板の径ｒと、結像光学系の瞳径Ｒとの比を１に近づけると、カットオフ周波数が高くなり、したがって解像力を良くすることが可能となる。しかも、この発明によれば、上述したように、θ＝±π／２のときの２つの画像の差画像をとれば、位相差像のコントラストを２倍に高めることができるので、解像力を向上させることによるコントラストの低下を低減できる。したがって、この発明の構成によって、コントラストを劣化させずに解像力を良くするために、更に以下の（６）式の条件を満足することが望ましい。
【数５】
１＞ｒ／Ｒ≧０．５（６）
【００１９】
ここで、上記（６）式の上限を越え、ｒ／Ｒ＝１となると、位相差量を与えることができなくなって、位相差顕微鏡として機能しなくなってしまい好ましくない。また上記（６）式の下限を越え、ｒ／Ｒ＜０．５となると、所望の解像力を得ることができなくなってしまい好ましくない。
【００２０】
次に、上記（５）式をフーリエ変換すると、
【数６】

となる。さらに、この（７）式を、 2DC・F(f)で割り算して、フーリエ変換すると、
【数７】

になる。ここで、（８）式のF(f)は、上記（４）式において、θ＝±π／２とすると、
【数８】

となり、照明光学系および結像光学系の瞳関数から求めることができる。なお、θが任意の値であっても、上記（４）式から、F(f)を求めることができる。
【００２１】
以上の式展開では、照明光学系の瞳位置に配置した任意形状の開口と、結像光学系の瞳位置に配置した前記開口と共役な形状の位相板との形状が一致するものとしているが、前記開口の形状が、
【数９】

を満足していれば、F(f)は、
【数１０】

から得ることができる。すなわち、開口の形状、位相板の形状、透過率および位相板に与える位相差量から、F(f)を求めることができる。
【００２２】
したがって、液晶によって作られた位相板の印加電圧を調整して、０＜θの状態の位相差像を、第１画像として記憶手段に取り込み、次に、θ＜０の状態の位相差像を、第２画像として記憶手段に取り込んで、処理手段によりそれらの画像の強度信号を引き算した差画像を求め、その差画像を演算手段において、開口の形状、位相板の形状、透過率およびθから求められるF(f)によりデコンボリューションすれば、観察標本の位相分布を正確にコントラストに変換することが可能となる。
【００２３】
なお、照明光学系の瞳位置に配置する開口、およびこの開口と標本面を介して共役な位置関係にある結像光学系の瞳位置に配置する位相板は、標本面で回折した光のうち、０次光の位相および強度に変化を与えて、他の回折光と干渉させるという作用を生じれば足りる。したがって、開口は、従来から用いられている輪帯開口の他、任意の形状とすることができ、それに応じて位相板も任意の形状にすることができる。
【００２４】
【実施例】
以下、この発明の実施例について説明する。
図１は、この発明の第１実施例を示すものである。この位相差顕微鏡は、コンデンサレンズ１ａを有する照明光学系１の瞳位置に、任意形状の開口としてのリングスリット２を配置し、このリングスリット２と標本面を介して共役な位置関係にある対物レンズ３ａを有する結像光学系３の瞳位置に、任意形状の開口と共役な形状、すなわち相似の形状の位相板としての位相リング４を配置して、標本面に配置される標本５を照明光学系１により照明して、位相差法により観察するものである。
【００２５】
この実施例では、結像光学系３による像を、その結像面に配置した電子撮像素子６で撮像して、その画像を記憶装置７に記憶し、この記憶装置７に記憶された画像に基づいて処理装置８により位相差像を得るようにする。
【００２６】
また、位相リング４は、図２Ａに示すように、２枚の平行平板１０ａ，１０ｂによって液晶１１を挟み込んで形成する。平行平板１０ａ，１０ｂには、それぞれ図２Ｂ，Ｃに示すように、輪帯状の透明電極１２ａ，１２ｂをコートすると共に、これら透明電極１２ａ，１２ｂ上のいずれか一方または双方に吸収膜をコートする。ここで、吸収膜は、一方の電極上に設ける場合には、その透過率を１０〜１５％程度とし、双方の電極上に設ける場合には、二つの吸収膜を合わせた透過率が１０〜１５％程度となるようにする。なお、この輪帯形状を持つ位相リング４は、解像力およびコントラストの点から、その輪帯の中心部の半径ｒが、結像光学系３の瞳の半径Ｒに対して、ｒ／Ｒ≧０．５を満足するよう構成する。この実施例では、結像光学系３の瞳の半径Ｒを１と規格化したとき、透明電極１２ａ，１２ｂの内径ｒ１をｒ１＝０．７、外形ｒ２をｒ２＝０．８とする。
【００２７】
この位相リング４の透明電極１２ａ，１２ｂは、液晶コントロール装置１３に接続し、この液晶コントロール装置１３により透明電極１２ａ，１２ｂを介して液晶１１に印加する電圧を制御して、透明電極１２ａ，１２ｂ以外の部分を透過する光に対して、電極部分を透過する光に、±π／２の光路差を与えるようにする。
【００２８】
なお、電子撮像素子６は、そのカットオフ周波数が結像光学系３のカットオフ周波数よりも低いと、結像光学系３の解像力を向上させても、受像の際に解像力が低下してしまうため、電子撮像素子６に入射する光束のＮＡを、照明光の波長をλ、電子撮像素子６の１画素の大きさをｕとするとき、λ／ＮＡ≧２ｕを満足するようにする。
【００２９】
このようにして、この実施例では、位相リング４の液晶１１に印加する電圧を液晶コントロール装置１３により制御して、π／２および−π／２の光路差を順次与え、これによりダークコントラストとブライトコントラストとの２つの状態の画像を電子撮像素子６で順次撮像し、それらの画像を記憶装置７に記憶して、この記憶装置７に記憶された２つの画像の差画像を処理装置８で得る。したがって、この実施例によれば、位相差像のコントラストが２倍で、かつ従来の位相差顕微鏡よりも高解像度の画像を得ることができる。
【００３０】
図３は、この発明の第２実施例を示すものである。この実施例では、図１に示す構成において、処理装置８から得られる差画像をデコンボリューション演算する演算装置１４を設けると共に、位相リング４により±π／２の位相差量を与えるようにする。
【００３１】
このようにして、位相差量がπ／２（ダークコントラスト）のときの位相差像を第１画像として記憶装置７に記憶すると共に、位相差量が−π／２（ブライトコントラスト）のときの位相差像を第２画像として記憶装置７に記憶する。この記憶装置７に記憶された第１，第２画像は、処理装置８に供給して、電子撮像素子６の各画素毎に第１，第２画像の差信号を演算し、これによりバックグランドの明視野成分や非線形成分を除去した差画像信号を得て、演算装置１４に供給する。
【００３２】
演算装置１４では、処理装置７からの差画像信号をデコンボリューション演算する。このため、まず、処理装置７からの差画像信号を、電子撮像素子６の１画素の大きさでサンプリングしてフーリエ変換し、次にその値を光学的伝達関数で割り算した後、再びフーリエ変換する。
【００３３】
ここで、リングスリット２と位相リング４の形状が一致するものとして、照明光学系１および結像光学系３の瞳を２次元に拡張して、位相リング４を構成する透明電極１２ａ，１２ｂ（図２参照）のｒ１＝０．７、ｒ２＝０．８から、
【数１１】
∫ Pb(ξ)Pa(ξ+f)dξ （１０）
を計算すると、図４の結果が得られる。
【００３４】
図４において、横軸は、結像光学系３の瞳の半径を１に規格化したとの値で、結像光学系３の開口数ＮＡと光源の波長λを用いたＮＡ／λを単位とした座標である。また、縦軸は、上記（１０）式を、
【数１２】
∫ Pb(ξ)dξ
で規格化したときのＭＴＦを表している。
【００３５】
したがって、図４は、上述した条件のリングスリット２および位相リング４を用いたときの光学系の伝達関数を表すことになるので、この伝達関数を用いて、上述したようにして処理装置７からの差画像をデコンボリューション演算すれば、標本５の位相変化がゆるやか（空間周波数が低い）な場合でも、標本５の位相分布を正確に求めることができる。また、この位相分布をコントラストで表現する場合には、先に述べたデコンボリューション演算により、コントラストを低下させることなく、しかも特定の空間周波数帯域の位相分布のコントラストを強調することなく、表現することが可能となる。
【００３６】
この発明の第３実施例においては、図３に示す第２実施例において、位相リング４を構成する輪帯状の透明電極１２ａ，１２ｂ（図２参照）の内径ｒ１および外径ｒ２を、それぞれｒ１＝０．５５およびｒ２＝０．６５とする。この場合の光学系の伝達関数は、図５に示すようになるので、この伝達関数を用いて、処理装置８から得られる±π／２の位相差量の差画像をデコンボリューション演算する。したがって、この実施例においても、第２実施例と同様に、標本の位相分布を正確に求めることができる。
【００３７】
この発明の第４実施例においては、図３に示す第２実施例において、位相リング４を構成する一方の透明電極１２ａまたは１２ｂ（図２参照）を、輪帯状ではなく全面電極とし、他方の透明電極１２ｂまたは１２ａは、内径ｒ１および外径ｒ２が、それぞれｒ１＝０．１５およびｒ２＝０．２５の輪帯状とする。この場合の光学系の伝達関数は、図６に示すようになるので、この伝達関数を用いて、処理装置８から得られる±π／２の位相差量の差画像をデコンボリューション演算する。したがって、この実施例においても、上述した実施例と同様に、標本の位相分布を正確に求めることができる。
【００３８】
この発明の第５実施例においては、図３に示す第２実施例において、位相リング４を構成する透明電極１２ａ，１２ｂ（図２参照）の内径ｒ１および外径ｒ２を、それぞれｒ１＝０．８７２およびｒ２＝０．９２８とする。この場合の光学系の伝達関数は、図７に示すようになるので、この伝達関数を用いて、処理装置８から得られる±π／２の位相差量の差画像をデコンボリューション演算する。したがって、この実施例においても、上述した実施例と同様に、標本の位相分布を求めることができると共に、特に、この実施例の場合には、伝達関数のカットオフ周波数が通常の明視野光学系のカットオフ周波数と同等まであるので、標本５の位相分布をより正確に求めることができる。
【００３９】
【発明の効果】
以上のように、この発明によれば、位相差顕微鏡の位相板を、ほぼ同位相量で符号が反対の位相差量を与えるよう構成し、その各々の位相差量における画像の差画像を得るようにしたので、位相差像のコントラストを従来の２倍にできると共に、位相板の径を結像光学系の瞳径に近づけることによるコントラストの低下を低減して、解像力を良くすることができる。
【００４０】
また、従来は、位相板の位相膜における吸収を大きくすると、標本の基本周波数の他に倍高調波の成分が現れて、正確な位相差像が得られなかったが、この発明によれば、ほぼ同位相量で符号が反対の位相差量における２つの画像の差画像を得るので、倍高調波の成分を相殺でき、したがって正確な位相差像を得ることができる。
【００４１】
さらに、位相差顕微鏡の位相板を、ほぼ同位相量で符号が反対の位相差量を与えるよう構成し、その各々の位相差量における画像の差画像をとれば、標本の位相分布と光学系の伝達関数とのコンボリューションで与えられる信号が得られるので、この信号をデコンボリューション演算することにより、標本の位相分布を正確に求めることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の第１実施例を示す図である。
【図２】図１に示す位相リングの構成を示す図である。
【図３】この発明の第２実施例を示す図である。
【図４】第２実施例における光学系の伝達関数を示す図である。
【図５】この発明の第３実施例を説明するための光学系の伝達関数を示す図である。
【図６】この発明の第４実施例を説明するための光学系の伝達関数を示す図である。
【図７】この発明の第５実施例を説明するための光学系の伝達関数を示す図である。
【符号の説明】
１照明光学系
１ａコンデンサレンズ
２リングスリット
３結像光学系
３ａ対物レンズ
４位相リング
５標本
６電子撮像素子
７記憶装置
８処理装置
１０ａ，１０ｂ平行平板
１１液晶
１２ａ，１２ｂ透明電極
１３液晶コントロール装置
１４演算装置

Claims

照明光学系の瞳位置に任意形状の開口を配置し、この任意形状の開口と標本面を介して共役な位置関係にある結像光学系の瞳位置に前記任意形状の開口と共役な形状の位相板を配置して、前記標本面に配置される標本を位相差法により観察するようにした位相差顕微鏡において、
前記結像光学系の結像面に配置した撮像素子と、この撮像素子により撮像された画像を記憶する記憶手段と、この記憶手段に記憶された画像を処理する処理手段とを設けると共に、前記位相板をほぼ同位相量で符号が反対の位相差量を与えるよう構成し、その各位相差量における画像を前記撮像素子を介して前記記憶手段に記憶し、その記憶された２つの画像の差画像を前記処理手段から得るようにしたことを特徴とする位相差顕微鏡。
前記位相板は液晶を有し、この液晶に印加する電圧を制御して、ほぼ同位相量で符号が反対の位相差量を与えるよう構成したことを特徴とする請求項１記載の位相差顕微鏡。
前記位相板を輪帯形状をもって構成すると共に、その輪帯の中心部の半径ｒと、前記結像光学系の瞳の半径Ｒとの比を、１＞ｒ／Ｒ≧０．５としたことを特徴とする請求項２記載の位相差顕微鏡。
前記処理手段から得られた差画像を、デコンボリューション演算する演算手段を設けたことを特徴とする請求項１、２または３記載の位相差顕微鏡。
前記演算手段によるデコンボリューション演算は、前記処理手段から得られた差画像をフーリエ変換し、その値を光学的伝達関数で割り算して、再びフーリエ変換することを特徴とする請求項４記載の位相差顕微鏡。
光源と、
該光源からの光を標本に導く照明光学系と、
該照明光学系の瞳位置に配置された任意形状の開口と、
前記標本の像を形成する結像光学系と、
該結像光学系側で、前記開口と共役な位置に配置され、前記開口と共役な形状を有する位相量変更手段と、
前記標本の像位置に配置された撮像素子と、
該撮像素子で撮像された画像を記憶する記憶手段と、
該記憶手段に記憶された画像を処理する処理手段とを有し、
前記位相量変更手段により第１の位相差量と、該第１の位相差量と位相量がほぼ同じで符号が反対の第２の位相差量とを発生させて、これら第１の位相差量における標本の画像と第２の位相差量における標本の画像とを前記撮像素子でそれぞれ撮像して前記記憶手段に記憶し、該記記憶手段に記憶された両画像の差画像を前記処理手段により得るよう構成したことを特徴とする位相差顕微鏡。