JP3790905B2 - 位相差顕微鏡 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、例えば、細胞やバクテリア等の透明な標本を観察したり、半導体のパターン露光に用いられる位相シフトマスク等の位相膜の欠陥を検査するのに用いられる位相差顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
位相差顕微鏡においては、照明系の瞳位置にリングスリットを配置し、このリングスリットと共役な位置関係にある対物レンズの瞳位置に位相リングを配置して、標本面で回折した光のうち０次光の位相および強度に変化を与えて他の回折光と干渉させることにより、標本の位相量を像のコントラストに変えて観察し得るようにしている。
【０００３】
このような位相差顕微鏡について、例えば、「Some improvements in the phase contrast microscope」K.Yamamoto,A.Taira,J.Microscopy,129(1983), p.49-62には、位相差像のコントラストを改善する方法が記載されており、また、例えば、「位相差顕微鏡の像コントラストに関する考察」大木裕史，光学，Vol.20, No.9, 1991, p.590-594 には、結像特性が記載されている。
【０００４】
また、干渉計を用いた精密測定法として、例えば、「応用光学 光計測入門」谷田貝豊彦著、丸善株式会社、には、干渉計の参照平面をピエゾ素子等を用いて微小振動させて参照光に位相変化を与えることにより、測定精度の向上を図った位相変調干渉法が記載されている。なお、この位相変調干渉法は、干渉縞が移動するように見えることから、縞走査手法とも呼ばれている。さらに、特公平７−６０２１６号公報には、位相差顕微鏡による観察像から被観察物体の振幅分布情報と位相分布情報とを分離する画像処理方法が開示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、位相差顕微鏡を用いることによって、生体細胞やバクテリア等の位相物体を、位相量に比例した強度分布に変換して観察することができ、また、半導体ウエハ上の露光パターンの検査や露光用の位相シフトマスクの検査を行うことができる。しかし、位相差顕微鏡による観察においては、位相物体中に吸収体が存在すると、吸収体の影響によって位相差像のコントラスト低下や情報の欠落が生じることになる。
【０００６】
例えば、半導体ウエハ上に形成されたパターンを検査する場合、パターンを形成する蒸着物質の反射率の差や段差があると、それによって位相差像のコントラストが低下して、正確なパターン検査ができなくなるという問題が生じることになる。また、半導体製造分野においては、形成するパターンを高密度化するために、最近、露光するマスクに位相分布や振幅分布を持たせた位相シフトマスクやハーフトーンマスクが用いられるようになってきているが、その位相シフトマスクやハーフトーンマスクの位相分布や振幅分布を正確に求めて欠陥を検査する場合には、位相分布と振幅分布とが混在していると、位相分布を正確に求めることが難しくなるという問題が生じることになる。
【０００７】
また、生体標本のように波長と比較して厚い標本を観察する場合には、例えば、「顕微鏡における逆問題について」高橋，根本，電気通信学会技術研究報告MBE88-58,P.35-42,1988 において指摘されているように、本来標本には存在しない空間周波数成分（非線形項）の影響が位相差像に現れるため、位相差顕微鏡による画像が被観察物体の位相分布に比例した画像にならなくなるという問題が生じることになる。
【０００８】
さらに、特公平７−６０２１６号公報に開示されている画像処理方法では、位相差顕微鏡の応答特性を考慮することなく、位相差像から被観察物体の位相分布を求めるようにしているため、被観察物体の周波数特性により、求められる位相分布が異なったものになってしまう問題がある。また、かかる画像処理方法では、ハロー等の非線形成分の影響についても考慮されていないため、非線形成分による位相分布の不確定性が残ってしまうという問題もある。
【０００９】
この発明は、上述した問題点に着目してなされたもので、被観察物体に振幅分布および位相分布の両方が混在している場合でも、正確に位相分布を抽出できるよう適切に構成した位相差顕微鏡を提供することを目的とするものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成する請求項１に係る位相差顕微鏡の発明は、
光源と、
この光源からの光を被観察物体に導く照明光学系と、
この照明光学系のほぼ瞳位置に配置した輪帯状または円形の開口と、
前記照明光学系により照明される前記被観察物体の像を拡大して結像する結像光学系と、
前記被観察物体を介して前記照明光学系の瞳位置と共役な前記結像光学系の瞳位置またはその近傍に配置され、前記開口とほぼ共役な形状を有する位相差量が可変の位相板と、
前記結像光学系の像面に配置した撮像素子と、
この撮像素子により撮像された画像を記憶する記憶手段と、
この記憶手段に記憶された画像を処理する処理手段とを有し、
前記位相板の位相差量を変化させて、少なくとも３つの異なる位相差量での位相差像を前記撮像素子で順次撮像して、撮像したそれぞれの画像情報を前記記憶手段に記憶し、その記憶された少なくとも３つの画像情報に基づいて、前記処理手段により、前記位相板の位相差量の変化による各点の強度変化を各画像ごとに求め、その強度変化を縞走査手法により処理して前記被観察物体の位相分布を求めることを特徴とするものである。
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の位相差顕微鏡において、前記位相分布は、前記縞走査手法により処理して求めた位相分布情報と、前記照明光学系の瞳関数および前記結像光学系の瞳関数から求められる光学的伝達関数とを用いたデコンボリューション処理により求めることを特徴とするものである。
請求項３に係る発明は、請求項１に記載の位相差顕微鏡において、前記位相分布は、前記記憶手段に記憶された少なくとも３つの画像情報に基づいて、前記位相板の位相差量の変化に対して強度変化の小さい像面上の点を選出し、
その選出した点における位相板の位相差量の変化に対して変動しない強度成分を求め、その強度成分を初期値に用いて、画像情報全体について位相板の位相差量の変化に対して変動しない強度分布情報を求め、
その強度分布情報と、前記縞走査手法により処理して求めた位相分布情報とに基づいて求めることを特徴とするものである。
請求項４に係る発明は、請求項１に記載の位相差顕微鏡において、前記位相分布は、前記記憶手段に記憶された少なくとも３つの画像情報に基づいて、前記位相板の位相差量の変化に対して強度変化の小さい像面上の点を選出し、
その選出した点における位相板の位相差量の変化に対して変動しない強度成分を求め、その強度成分を初期値に用いて、画像情報全体について位相板の位相差量の変化に対して変動しない強度分布情報を求め、
その強度分布情報と、前記縞走査手法により処理して求めた位相情報と、前記照明光学系の瞳関数および前記結像光学系の瞳関数から求められる光学的伝達関数とを用いたデコンボリューション処理により求めることを特徴とするものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
この発明の実施の形態について、１次元の物体をモデルに用いて説明する。
物体面を透過した光および回折した光を、複素平面上でベクトルを用いて表すと、図１に示すようになる。ここで、DC(x) は物体を透過して像面に到達した光の振幅を、AC(x) は物体で回折されて像面に到達した光の振幅をそれぞれ表す。また、像面に到達した光の振幅をA(x)、位相をω(x) で表す。
【００１２】
結像光学系の瞳関数をP(ξ) 、照明光学系の瞳関数をQ(ξ) 、被観察物体の位相分布をφ(x) 、振幅分布ｍ(x) とし、位相変化は小さく、振幅分布も注目している点の近傍でほぼ一様であるとすると、位相差顕微鏡による被観察物体の像強度分布I(x)は、
【数１】
で与えられる。ただし、Φ(f) はφ(x) のフーリエ変換を表し、ｆは空間周波数を示す。また、Φr(f)はΦ(f) の実部、Φj(f)はΦ(f) の虚部を示す。
【００１３】
（１）式において、第１項は、被観察物体で回折されずに透過した光の成分を表し、第２項は、被観察物体で回折され、透過光に対して位相変化を生じた光の成分を表し、第３項は、被観察物体で回折され、透過光に対して位相変化を生じない光の成分を表す。そして、第４項は、非線形な情報の伝達を表しているものと考えられる。
【００１４】
ここで、位相差顕微鏡の結像光学系の瞳関数をP(ξ) は、下記の（２）式で示す関数の線形結合で表すことができるものとし、
【数２】
照明光学系の瞳関数Q(ξ) が、Q(ξ) ＝ Pb(ξ) で表せるとすると、上記（１）式は、
【数３】
と書き換えることができる。
【００１５】
上記（３）式から、位相差顕微鏡における像強度分布は、位相板の位相差量により変化することがわかる。ここで、（３）式を位相差の変化量θに着目して、近似的に書き直すと、
【数４】
と表すことができる。
【００１６】
上記（５）式から、縞走査手法を適用することができるので、θについてＮ段階の縞走査手法を適用すると、
【数５】
で与えられる。特に、Ｎ＝４の場合には、
【数６】
となる。
【００１７】
また、図１から、
【数７】
となる。また、
【数８】
が成立する。
【００１８】
（１０）および（１１）式に対する解は、図２に示すように２点存在するが、どちらの解を選択するかは、以下のようにして行うことができる。
▲１▼観察面上で明らかに回折成分が小さい場所、例えば、細胞の外側やサンプルのない場所を見つける。
▲２▼その場所で、DC(x) の大きい値を正しい解とする。
▲３▼DC(x) は、隣り合う２点間では小さい値を持つことを考慮しながら、観察面上でDC(x) の分布を決定する。
▲４▼重根の前後では、DC(x) の微分値が連続するなどの条件を用いることにより、正しい解の決定が可能である。
このようにして決定したDC(x) を、上記（９）式に代入することにより、被観察物体の位相情報ω(x) を、振幅情報ｍ(x) から分離して求めることができる。
【００１９】
ここで、抽出した位相情報ω(x) は、上記（４）式で与えられる顕微鏡光学系の応答関数の影響を受けているので、好ましくは、照明光学系の瞳関数と結像光学系の瞳関数とから（４）式により応答関数を計算し、その応答関数を用いてデコンボリューション処理を行う。これにより、より正確な位相情報を得ることができる。なお、上記の説明では、Ｎ＝４として、４つの異なる位相差量の画像を用いて縞走査手法を行ったが、縞走査手法は、一般に、Ｎ≧３であればよいので、少なくとも３つ以上の位相差量の異なる画像が有ればよい。
【００２０】
【実施例】
以下、この発明の実施例について説明する。
図３は、この発明の一実施例を示す位相差顕微鏡の概略図である。この位相差顕微鏡は、光源（図示せず）、照明光学系１および結像光学系３を有する。照明光学系１は、コンデンサレンズ１ａを有し、この照明光学系１のほぼ瞳位置には、輪帯状または円形の開口としてのリングスリット２を配置する。結像光学系３は、対物レンズ３ａを有し、この結像光学系３の、リングスリット２と標本面を介して共役な位置関係にある瞳位置またはその近傍には、リングスリット２と共役な形状、すなわち相似の形状を有する位相板４を配置する。
【００２１】
位相板４は、図４Ａに示すように、２枚の平行平板１０ａ，１０ｂによって液晶１１を挟み込んで形成する。平行平板１０ａ，１０ｂには、それぞれ図４Ｂ，４Ｃに示すように、輪帯状の透明電極１２ａ，１２ｂをコートする。これら透明電極１２ａ，１２ｂは、図３に示すように、液晶コントロール装置１３に接続し、この液晶コントロール装置１３により透明電極１２ａ，１２ｂを介して液晶１１に印加する電圧を制御して、透明電極１２ａ，１２ｂ以外の部分を透過する光と、電極部分を透過する光との光路差を変化させて、位相差量を可変にするようにする。
【００２２】
また、結像光学系３の像面には、ＣＣＤ等よりなる電子撮像素子６を配置し、この電子撮像素子６で撮像した画像をフレームメモリ等の記憶装置７に記憶して、演算処理装置８で処理するようにする。なお、演算処理装置８には、上述した縞走査手法の演算処理プログラム、および位相情報と振幅情報とを分離するための演算処理プログラムを格納しておく。
【００２３】
この実施例では、上記の位相差顕微鏡を、オリンパス光学工業（株）製の倒立顕微鏡ＩＭＴ−２を用い、この倒立顕微鏡に対物レンズの瞳をリレーする光学系を付加し、そのリレーした瞳位置に上記の位相板４を配置して構成した。図５は、かかる顕微鏡光学系の応答関数、すなわち照明光学系１の瞳関数および結像光学系３の瞳関数から求められる光学的伝達関数を示すもので、横軸は、結像光学系３の瞳径を１に規格化したときの値で、結像光学系３の開口数ＮＡと光源の波長λを用いたＮＡ／λを単位とし、縦軸は、ＭＴＦを表している。
【００２４】
このようにして、標本面に被観察物体５を配置して照明光学系１により照明すると共に、液晶コントロール装置１３により位相板４による位相差量を制御し、その少なくとも３つの異なる位相差量での位相差像を結像光学系３を介して電子撮像素子６で順次撮像して、それぞれの画像情報を記憶装置７に記憶する。画像処理装置８では、記憶装置７に記憶された少なくとも３つの異なる位相差量での画像情報に基づいて、上述した演算を行って、位相板４の位相差量の変化による像面上の各点の強度変化を求め、その強度変化を縞走査手法により処理して被観察物体５の位相分布情報を抽出する。
【００２５】
図６Ａは、被観察物体として、石英ガラス基板をエッチングして作成した位相格子上に部分的に露光した写真フィルムを重ねたものを用い、これを明視野で顕微鏡観察した場合の画像を示し、図６Ｂは、同じ被観察物体を、上述した実施例によって処理した画像を示す。また、図７Ａは、被観察物体として、染色したタマネギの表皮を用い、これを明視野で顕微鏡観察した場合の画像を示し、図７Ｂは、同じ被観察物体を、上述した実施例によって処理した画像を示す。
【００２６】
図６ＡおよびＢの比較から明らかなように、この実施例による位相差顕微鏡によれば、被観察物体の振幅情報に影響されることなく、位相分布情報を抽出することができる。また、図７ＡおよびＢの比較から明らかなように、この実施例による位相差顕微鏡によれば、染色の影響を取り除いた位相分布情報を抽出することができる。
【００２７】
なお、図６Ｂおよび図７Ｂに示す画像を得るにあたっては、図３に示した演算処理装置８において、以下の処理を行った。すなわち、記憶装置７に記憶された少なくとも３つの異なる位相差量での画像情報に基づいて、上述した演算を行って、位相板４の位相差量の変化による像面上の各点の強度変化を求め、その強度変化を縞走査手法により処理して被観察物体５の位相分布情報を抽出する。また、位相板４の位相差量の変化に対して強度変化の小さい像面上の点を選出して、その選出した点における位相板４の位相差量の変化に対して変動しない強度成分を求め、その強度成分を初期値に用いて、画像情報全体について位相板４の位相差量の変化に対して変動しない強度分布情報を求める。その後、上記の位相分布情報、強度分布情報および光学系の伝達関数を用いてデコンボリューション処理して位相分布を求める。
【００２８】
この発明は、上述した実施例にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、図３に示す演算処理装置８における処理は、少なくとも３つの異なる位相差量での画像情報に基づいて、位相板４の位相差量の変化による像面上の各点の強度変化を求め、その強度変化を縞走査手法により処理して被観察物体５の位相分布情報を出力することもできる。また、このようにして求めた位相分布情報と、光学系の伝達関数とを用いてデコンボリューション処理することにより位相分布を求めて出力することもできる。あるいは、位相板４の位相差量の変化に対して強度変化の小さい像面上の点を選出して、その選出した点における位相板４の位相差量の変化に対して変動しない強度成分を求め、その強度成分を初期値に用いて、画像情報全体について位相板４の位相差量の変化に対して変動しない強度分布情報を求め、その強度分布情報と上記の縞走査手法により求めた位相分布情報とに基づいて位相分布を求めて出力するようにすることもできる。
【００３１】
【発明の効果】
以上のように、請求項１に係る発明によれば、位相板の位相差量を変化させて、少なくとも３つの異なる位相差量での位相差像を撮像素子で順次撮像して記憶手段に記憶し、その記憶された少なくとも３つの画像情報に基づいて、位相板の位相差量の変化による像面上の各点の強度変化を求め、その強度変化を縞走査手法により処理して被観察物体の位相分布情報を抽出するようにしたので、被観察物体に振幅分布および位相分布の両方が混在している場合でも、位相分布を正確に抽出することができる。また、請求項２に係る発明によれば、被観察物体に振幅分布および位相分布の両方が混在している場合でも、より正確に位相分布を抽出することができ、請求項３に係る発明によれば、被観察物体に振幅分布および位相分布の両方が混在している場合でも、振幅分布に影響されることなく、位相分布を抽出することができ、請求項４に係る発明によれば、被観察物体に振幅分布および位相分布の両方が混在している場合でも、振幅分布に影響されることなく、位相分布をより正確に抽出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の原理を説明するための図である。
【図２】同じく、この発明の原理を説明するための図である。
【図３】この発明の一実施例の要部の構成を示す図である。
【図４】図１に示す位相板の一例の構成を示す図である。
【図５】図３に示す実施例の光学系の伝達関数を示す図である。
【図６】明視野での顕微鏡観察像と、この発明の実施例による顕微鏡観察像との比較例の一例を示す顕微鏡写真である。
【図７】同じく、比較例の他の例を示す顕微鏡写真である。
【符号の説明】
１ 照明光学系
１ａ コンデンサレンズ
２ リングスリット
３ 結像光学系
３ａ 対物レンズ
４ 位相板
５ 被観察物体
６ 電子撮像素子
７ 記憶装置
８ 演算処理装置
１０ａ，１０ｂ 平行平板
１１ 液晶
１２ａ，１２ｂ 透明電極
１３ 液晶コントロール装置
【発明の属する技術分野】
この発明は、例えば、細胞やバクテリア等の透明な標本を観察したり、半導体のパターン露光に用いられる位相シフトマスク等の位相膜の欠陥を検査するのに用いられる位相差顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
位相差顕微鏡においては、照明系の瞳位置にリングスリットを配置し、このリングスリットと共役な位置関係にある対物レンズの瞳位置に位相リングを配置して、標本面で回折した光のうち０次光の位相および強度に変化を与えて他の回折光と干渉させることにより、標本の位相量を像のコントラストに変えて観察し得るようにしている。
【０００３】
このような位相差顕微鏡について、例えば、「Some improvements in the phase contrast microscope」K.Yamamoto,A.Taira,J.Microscopy,129(1983), p.49-62には、位相差像のコントラストを改善する方法が記載されており、また、例えば、「位相差顕微鏡の像コントラストに関する考察」大木裕史，光学，Vol.20, No.9, 1991, p.590-594 には、結像特性が記載されている。
【０００４】
また、干渉計を用いた精密測定法として、例えば、「応用光学 光計測入門」谷田貝豊彦著、丸善株式会社、には、干渉計の参照平面をピエゾ素子等を用いて微小振動させて参照光に位相変化を与えることにより、測定精度の向上を図った位相変調干渉法が記載されている。なお、この位相変調干渉法は、干渉縞が移動するように見えることから、縞走査手法とも呼ばれている。さらに、特公平７−６０２１６号公報には、位相差顕微鏡による観察像から被観察物体の振幅分布情報と位相分布情報とを分離する画像処理方法が開示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、位相差顕微鏡を用いることによって、生体細胞やバクテリア等の位相物体を、位相量に比例した強度分布に変換して観察することができ、また、半導体ウエハ上の露光パターンの検査や露光用の位相シフトマスクの検査を行うことができる。しかし、位相差顕微鏡による観察においては、位相物体中に吸収体が存在すると、吸収体の影響によって位相差像のコントラスト低下や情報の欠落が生じることになる。
【０００６】
例えば、半導体ウエハ上に形成されたパターンを検査する場合、パターンを形成する蒸着物質の反射率の差や段差があると、それによって位相差像のコントラストが低下して、正確なパターン検査ができなくなるという問題が生じることになる。また、半導体製造分野においては、形成するパターンを高密度化するために、最近、露光するマスクに位相分布や振幅分布を持たせた位相シフトマスクやハーフトーンマスクが用いられるようになってきているが、その位相シフトマスクやハーフトーンマスクの位相分布や振幅分布を正確に求めて欠陥を検査する場合には、位相分布と振幅分布とが混在していると、位相分布を正確に求めることが難しくなるという問題が生じることになる。
【０００７】
また、生体標本のように波長と比較して厚い標本を観察する場合には、例えば、「顕微鏡における逆問題について」高橋，根本，電気通信学会技術研究報告MBE88-58,P.35-42,1988 において指摘されているように、本来標本には存在しない空間周波数成分（非線形項）の影響が位相差像に現れるため、位相差顕微鏡による画像が被観察物体の位相分布に比例した画像にならなくなるという問題が生じることになる。
【０００８】
さらに、特公平７−６０２１６号公報に開示されている画像処理方法では、位相差顕微鏡の応答特性を考慮することなく、位相差像から被観察物体の位相分布を求めるようにしているため、被観察物体の周波数特性により、求められる位相分布が異なったものになってしまう問題がある。また、かかる画像処理方法では、ハロー等の非線形成分の影響についても考慮されていないため、非線形成分による位相分布の不確定性が残ってしまうという問題もある。
【０００９】
この発明は、上述した問題点に着目してなされたもので、被観察物体に振幅分布および位相分布の両方が混在している場合でも、正確に位相分布を抽出できるよう適切に構成した位相差顕微鏡を提供することを目的とするものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成する請求項１に係る位相差顕微鏡の発明は、
光源と、
この光源からの光を被観察物体に導く照明光学系と、
この照明光学系のほぼ瞳位置に配置した輪帯状または円形の開口と、
前記照明光学系により照明される前記被観察物体の像を拡大して結像する結像光学系と、
前記被観察物体を介して前記照明光学系の瞳位置と共役な前記結像光学系の瞳位置またはその近傍に配置され、前記開口とほぼ共役な形状を有する位相差量が可変の位相板と、
前記結像光学系の像面に配置した撮像素子と、
この撮像素子により撮像された画像を記憶する記憶手段と、
この記憶手段に記憶された画像を処理する処理手段とを有し、
前記位相板の位相差量を変化させて、少なくとも３つの異なる位相差量での位相差像を前記撮像素子で順次撮像して、撮像したそれぞれの画像情報を前記記憶手段に記憶し、その記憶された少なくとも３つの画像情報に基づいて、前記処理手段により、前記位相板の位相差量の変化による各点の強度変化を各画像ごとに求め、その強度変化を縞走査手法により処理して前記被観察物体の位相分布を求めることを特徴とするものである。
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の位相差顕微鏡において、前記位相分布は、前記縞走査手法により処理して求めた位相分布情報と、前記照明光学系の瞳関数および前記結像光学系の瞳関数から求められる光学的伝達関数とを用いたデコンボリューション処理により求めることを特徴とするものである。
請求項３に係る発明は、請求項１に記載の位相差顕微鏡において、前記位相分布は、前記記憶手段に記憶された少なくとも３つの画像情報に基づいて、前記位相板の位相差量の変化に対して強度変化の小さい像面上の点を選出し、
その選出した点における位相板の位相差量の変化に対して変動しない強度成分を求め、その強度成分を初期値に用いて、画像情報全体について位相板の位相差量の変化に対して変動しない強度分布情報を求め、
その強度分布情報と、前記縞走査手法により処理して求めた位相分布情報とに基づいて求めることを特徴とするものである。
請求項４に係る発明は、請求項１に記載の位相差顕微鏡において、前記位相分布は、前記記憶手段に記憶された少なくとも３つの画像情報に基づいて、前記位相板の位相差量の変化に対して強度変化の小さい像面上の点を選出し、
その選出した点における位相板の位相差量の変化に対して変動しない強度成分を求め、その強度成分を初期値に用いて、画像情報全体について位相板の位相差量の変化に対して変動しない強度分布情報を求め、
その強度分布情報と、前記縞走査手法により処理して求めた位相情報と、前記照明光学系の瞳関数および前記結像光学系の瞳関数から求められる光学的伝達関数とを用いたデコンボリューション処理により求めることを特徴とするものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
この発明の実施の形態について、１次元の物体をモデルに用いて説明する。
物体面を透過した光および回折した光を、複素平面上でベクトルを用いて表すと、図１に示すようになる。ここで、DC(x) は物体を透過して像面に到達した光の振幅を、AC(x) は物体で回折されて像面に到達した光の振幅をそれぞれ表す。また、像面に到達した光の振幅をA(x)、位相をω(x) で表す。
【００１２】
結像光学系の瞳関数をP(ξ) 、照明光学系の瞳関数をQ(ξ) 、被観察物体の位相分布をφ(x) 、振幅分布ｍ(x) とし、位相変化は小さく、振幅分布も注目している点の近傍でほぼ一様であるとすると、位相差顕微鏡による被観察物体の像強度分布I(x)は、
【数１】
【００１３】
（１）式において、第１項は、被観察物体で回折されずに透過した光の成分を表し、第２項は、被観察物体で回折され、透過光に対して位相変化を生じた光の成分を表し、第３項は、被観察物体で回折され、透過光に対して位相変化を生じない光の成分を表す。そして、第４項は、非線形な情報の伝達を表しているものと考えられる。
【００１４】
ここで、位相差顕微鏡の結像光学系の瞳関数をP(ξ) は、下記の（２）式で示す関数の線形結合で表すことができるものとし、
【数２】
【数３】
【００１５】
上記（３）式から、位相差顕微鏡における像強度分布は、位相板の位相差量により変化することがわかる。ここで、（３）式を位相差の変化量θに着目して、近似的に書き直すと、
【数４】
【００１６】
上記（５）式から、縞走査手法を適用することができるので、θについてＮ段階の縞走査手法を適用すると、
【数５】
【数６】
【００１７】
また、図１から、
【数７】
【数８】
【００１８】
（１０）および（１１）式に対する解は、図２に示すように２点存在するが、どちらの解を選択するかは、以下のようにして行うことができる。
▲１▼観察面上で明らかに回折成分が小さい場所、例えば、細胞の外側やサンプルのない場所を見つける。
▲２▼その場所で、DC(x) の大きい値を正しい解とする。
▲３▼DC(x) は、隣り合う２点間では小さい値を持つことを考慮しながら、観察面上でDC(x) の分布を決定する。
▲４▼重根の前後では、DC(x) の微分値が連続するなどの条件を用いることにより、正しい解の決定が可能である。
このようにして決定したDC(x) を、上記（９）式に代入することにより、被観察物体の位相情報ω(x) を、振幅情報ｍ(x) から分離して求めることができる。
【００１９】
ここで、抽出した位相情報ω(x) は、上記（４）式で与えられる顕微鏡光学系の応答関数の影響を受けているので、好ましくは、照明光学系の瞳関数と結像光学系の瞳関数とから（４）式により応答関数を計算し、その応答関数を用いてデコンボリューション処理を行う。これにより、より正確な位相情報を得ることができる。なお、上記の説明では、Ｎ＝４として、４つの異なる位相差量の画像を用いて縞走査手法を行ったが、縞走査手法は、一般に、Ｎ≧３であればよいので、少なくとも３つ以上の位相差量の異なる画像が有ればよい。
【００２０】
【実施例】
以下、この発明の実施例について説明する。
図３は、この発明の一実施例を示す位相差顕微鏡の概略図である。この位相差顕微鏡は、光源（図示せず）、照明光学系１および結像光学系３を有する。照明光学系１は、コンデンサレンズ１ａを有し、この照明光学系１のほぼ瞳位置には、輪帯状または円形の開口としてのリングスリット２を配置する。結像光学系３は、対物レンズ３ａを有し、この結像光学系３の、リングスリット２と標本面を介して共役な位置関係にある瞳位置またはその近傍には、リングスリット２と共役な形状、すなわち相似の形状を有する位相板４を配置する。
【００２１】
位相板４は、図４Ａに示すように、２枚の平行平板１０ａ，１０ｂによって液晶１１を挟み込んで形成する。平行平板１０ａ，１０ｂには、それぞれ図４Ｂ，４Ｃに示すように、輪帯状の透明電極１２ａ，１２ｂをコートする。これら透明電極１２ａ，１２ｂは、図３に示すように、液晶コントロール装置１３に接続し、この液晶コントロール装置１３により透明電極１２ａ，１２ｂを介して液晶１１に印加する電圧を制御して、透明電極１２ａ，１２ｂ以外の部分を透過する光と、電極部分を透過する光との光路差を変化させて、位相差量を可変にするようにする。
【００２２】
また、結像光学系３の像面には、ＣＣＤ等よりなる電子撮像素子６を配置し、この電子撮像素子６で撮像した画像をフレームメモリ等の記憶装置７に記憶して、演算処理装置８で処理するようにする。なお、演算処理装置８には、上述した縞走査手法の演算処理プログラム、および位相情報と振幅情報とを分離するための演算処理プログラムを格納しておく。
【００２３】
この実施例では、上記の位相差顕微鏡を、オリンパス光学工業（株）製の倒立顕微鏡ＩＭＴ−２を用い、この倒立顕微鏡に対物レンズの瞳をリレーする光学系を付加し、そのリレーした瞳位置に上記の位相板４を配置して構成した。図５は、かかる顕微鏡光学系の応答関数、すなわち照明光学系１の瞳関数および結像光学系３の瞳関数から求められる光学的伝達関数を示すもので、横軸は、結像光学系３の瞳径を１に規格化したときの値で、結像光学系３の開口数ＮＡと光源の波長λを用いたＮＡ／λを単位とし、縦軸は、ＭＴＦを表している。
【００２４】
このようにして、標本面に被観察物体５を配置して照明光学系１により照明すると共に、液晶コントロール装置１３により位相板４による位相差量を制御し、その少なくとも３つの異なる位相差量での位相差像を結像光学系３を介して電子撮像素子６で順次撮像して、それぞれの画像情報を記憶装置７に記憶する。画像処理装置８では、記憶装置７に記憶された少なくとも３つの異なる位相差量での画像情報に基づいて、上述した演算を行って、位相板４の位相差量の変化による像面上の各点の強度変化を求め、その強度変化を縞走査手法により処理して被観察物体５の位相分布情報を抽出する。
【００２５】
図６Ａは、被観察物体として、石英ガラス基板をエッチングして作成した位相格子上に部分的に露光した写真フィルムを重ねたものを用い、これを明視野で顕微鏡観察した場合の画像を示し、図６Ｂは、同じ被観察物体を、上述した実施例によって処理した画像を示す。また、図７Ａは、被観察物体として、染色したタマネギの表皮を用い、これを明視野で顕微鏡観察した場合の画像を示し、図７Ｂは、同じ被観察物体を、上述した実施例によって処理した画像を示す。
【００２６】
図６ＡおよびＢの比較から明らかなように、この実施例による位相差顕微鏡によれば、被観察物体の振幅情報に影響されることなく、位相分布情報を抽出することができる。また、図７ＡおよびＢの比較から明らかなように、この実施例による位相差顕微鏡によれば、染色の影響を取り除いた位相分布情報を抽出することができる。
【００２７】
なお、図６Ｂおよび図７Ｂに示す画像を得るにあたっては、図３に示した演算処理装置８において、以下の処理を行った。すなわち、記憶装置７に記憶された少なくとも３つの異なる位相差量での画像情報に基づいて、上述した演算を行って、位相板４の位相差量の変化による像面上の各点の強度変化を求め、その強度変化を縞走査手法により処理して被観察物体５の位相分布情報を抽出する。また、位相板４の位相差量の変化に対して強度変化の小さい像面上の点を選出して、その選出した点における位相板４の位相差量の変化に対して変動しない強度成分を求め、その強度成分を初期値に用いて、画像情報全体について位相板４の位相差量の変化に対して変動しない強度分布情報を求める。その後、上記の位相分布情報、強度分布情報および光学系の伝達関数を用いてデコンボリューション処理して位相分布を求める。
【００２８】
この発明は、上述した実施例にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、図３に示す演算処理装置８における処理は、少なくとも３つの異なる位相差量での画像情報に基づいて、位相板４の位相差量の変化による像面上の各点の強度変化を求め、その強度変化を縞走査手法により処理して被観察物体５の位相分布情報を出力することもできる。また、このようにして求めた位相分布情報と、光学系の伝達関数とを用いてデコンボリューション処理することにより位相分布を求めて出力することもできる。あるいは、位相板４の位相差量の変化に対して強度変化の小さい像面上の点を選出して、その選出した点における位相板４の位相差量の変化に対して変動しない強度成分を求め、その強度成分を初期値に用いて、画像情報全体について位相板４の位相差量の変化に対して変動しない強度分布情報を求め、その強度分布情報と上記の縞走査手法により求めた位相分布情報とに基づいて位相分布を求めて出力するようにすることもできる。
【００３１】
【発明の効果】
以上のように、請求項１に係る発明によれば、位相板の位相差量を変化させて、少なくとも３つの異なる位相差量での位相差像を撮像素子で順次撮像して記憶手段に記憶し、その記憶された少なくとも３つの画像情報に基づいて、位相板の位相差量の変化による像面上の各点の強度変化を求め、その強度変化を縞走査手法により処理して被観察物体の位相分布情報を抽出するようにしたので、被観察物体に振幅分布および位相分布の両方が混在している場合でも、位相分布を正確に抽出することができる。また、請求項２に係る発明によれば、被観察物体に振幅分布および位相分布の両方が混在している場合でも、より正確に位相分布を抽出することができ、請求項３に係る発明によれば、被観察物体に振幅分布および位相分布の両方が混在している場合でも、振幅分布に影響されることなく、位相分布を抽出することができ、請求項４に係る発明によれば、被観察物体に振幅分布および位相分布の両方が混在している場合でも、振幅分布に影響されることなく、位相分布をより正確に抽出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の原理を説明するための図である。
【図２】同じく、この発明の原理を説明するための図である。
【図３】この発明の一実施例の要部の構成を示す図である。
【図４】図１に示す位相板の一例の構成を示す図である。
【図５】図３に示す実施例の光学系の伝達関数を示す図である。
【図６】明視野での顕微鏡観察像と、この発明の実施例による顕微鏡観察像との比較例の一例を示す顕微鏡写真である。
【図７】同じく、比較例の他の例を示す顕微鏡写真である。
【符号の説明】
１ 照明光学系
１ａ コンデンサレンズ
２ リングスリット
３ 結像光学系
３ａ 対物レンズ
４ 位相板
５ 被観察物体
６ 電子撮像素子
７ 記憶装置
８ 演算処理装置
１０ａ，１０ｂ 平行平板
１１ 液晶
１２ａ，１２ｂ 透明電極
１３ 液晶コントロール装置
Claims (4)
- 光源と、
この光源からの光を被観察物体に導く照明光学系と、
この照明光学系のほぼ瞳位置に配置した輪帯状または円形の開口と、
前記照明光学系により照明される前記被観察物体の像を拡大して結像する結像光学系と、
前記被観察物体を介して前記照明光学系の瞳位置と共役な前記結像光学系の瞳位置またはその近傍に配置され、前記開口とほぼ共役な形状を有する位相差量が可変の位相板と、
前記結像光学系の像面に配置した撮像素子と、
この撮像素子により撮像された画像を記憶する記憶手段と、
この記憶手段に記憶された画像を処理する処理手段とを有し、
前記位相板の位相差量を変化させて、少なくとも３つの異なる位相差量での位相差像を前記撮像素子で順次撮像して、撮像したそれぞれの画像情報を前記記憶手段に記憶し、その記憶された少なくとも３つの画像情報に基づいて、前記処理手段により、前記位相板の位相差量の変化による各点の強度変化を各画像ごとに求め、その強度変化を縞走査手法により処理して前記被観察物体の位相分布を求めることを特徴とする位相差顕微鏡。 - 前記位相分布は、前記縞走査手法により処理して求めた位相分布情報と、前記照明光学系の瞳関数および前記結像光学系の瞳関数から求められる光学的伝達関数とを用いたデコンボリューション処理により求めることを特徴とする請求項１に記載の位相差顕微鏡。
- 前記位相分布は、前記記憶手段に記憶された少なくとも３つの画像情報に基づいて、前記位相板の位相差量の変化に対して強度変化の小さい像面上の点を選出し、
その選出した点における位相板の位相差量の変化に対して変動しない強度成分を求め、その強度成分を初期値に用いて、画像情報全体について位相板の位相差量の変化に対して変動しない強度分布情報を求め、
その強度分布情報と、前記縞走査手法により処理して求めた位相分布情報とに基づいて求めることを特徴とする請求項１に記載の位相差顕微鏡。 - 前記位相分布は、前記記憶手段に記憶された少なくとも３つの画像情報に基づいて、前記位相板の位相差量の変化に対して強度変化の小さい像面上の点を選出し、
その選出した点における位相板の位相差量の変化に対して変動しない強度成分を求め、その強度成分を初期値に用いて、画像情報全体について位相板の位相差量の変化に対して変動しない強度分布情報を求め、
その強度分布情報と、前記縞走査手法により処理して求めた位相情報と、前記照明光学系の瞳関数および前記結像光学系の瞳関数から求められる光学的伝達関数とを用いたデコンボリューション処理により求めることを特徴とする請求項１に記載の位相差顕微鏡。
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