JP6299409B2 - 位相差顕微鏡及び位相差顕微鏡システム - Google Patents

Description

本技術は、観察対象物の位相差像を撮像することが可能な位相差顕微鏡及び位相差顕微鏡システムに関する。

観察対象物の位相差像を生成することが可能な位相差顕微鏡は、特徴的な構成としてリング絞りとフェーズプレート（位相板）を備える。リング絞りは、リング状のスリットが形成された遮光板であり、フェーズプレートは、リング状の位相シフト膜を備える透明板である。光源から照射された照明光（均一光）はリング絞りのスリットを通過してリング状に成形され、コンデンサレンズ（集光レンズ）によって観察対象物に集光される。ここで、照明光は、観察対象物を直進した直接光と、観察対象物によって回折を受けた回折光に分けられる。

直接光は、位相シフト膜を透過して位相がずれ、かつ減光される。回折光は、大部分がフェーズプレートの透明部分（位相シフト膜以外の領域）を透過するため、位相と明るさは変化しない。直接光と回折光が干渉することによって位相差像が生成され、観察対象物における位相差をコントラストとして観察することが可能となる。

ここで、一般に顕微鏡における光学分解能は、波長に反比例し、対物レンズのＮＡ（開口数）に比例するため、ＮＡが大きいほど光学分解能が高い。上記のように位相差顕微鏡においては、直接光及び回折光から位相差像を生成するが、回折光は直接光に比較して弱いため、可能な限り多く取り込むことが行われてきた。

具体的には、通常、リング絞りのスリット及びフェーズプレートの位相シフト膜は、対物レンズの瞳面における径が対物レンズのＮＡ／２以下となるように構成されている（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。これは、位相シフト膜の内側を透過する回折光（−１次回折光）と位相シフト部の外側を透過する回折光（＋１次回折光）の両者を位相差像の生成に利用するためである。

特開２０００−１９４１０号公報 特開昭５８−７１２３号公報

しかしながら、対物レンズの瞳面における位相シフト膜の径が対物レンズのＮＡ／２以下であると、観察対象物を透過する直接光は対物レンズの半分以下のＮＡでしか位相差像に取り込まれず、光学分解能が低下してしまうという問題がある。

以上のような事情に鑑み、本技術の目的は、高い光学分解能を実現することが可能な位相差顕微鏡及び位相差顕微鏡システムを提供することにある。

上記目的を達成するため、本技術の一形態に係る位相差顕微鏡は、対物レンズと、フェーズプレートと、リング絞りとを具備する。
上記フェーズプレートは、輪帯状であり、入射光の位相をシフトさせる位相シフト領域と、入射光を透過する第１の光透過領域とを有し、上記位相シフト領域は空間周波数の高域成分を強調する。
上記リング絞りは、入射光を透過する第２の光透過領域と、入射光を遮光する第１の遮光領域とを有し、上記フェーズプレートと共役である。

この構成によれば、リング絞りによって成形された照明光は、観察対象物を透過することによって、直接光と回折光に分けられる。リング絞りは、フェーズプレートと共役であり、即ち、第２の光透過領域の像が対物レンズの瞳面において位相シフト領域の像に含まれるように構成されているため、直接光はフェーズプレートの位相シフト領域を通過し、回折光はフェーズプレートの第１の光透過領域を通過する。直接光は位相シフト領域によって位相がずれるため、直接光と回折光の干渉が生じ、位相差像が形成される。位相シフト領域は空間周波数の高域成分を強調するように構成されているため、位相差像の高い光学分解能を実現することが可能である。

上記フェーズプレートは、上記瞳面における上記位相シフト領域の像が、上記対物レンズのＮＡ／２より大きい径となるように構成されていてもよい。

この構成によれば、対物レンズの瞳面における位相シフト領域の像が、ＮＡ／２より大きい径となるように構成されていることにより、対物レンズの高ＮＡ成分を位相差像に取り込むことが可能となり、高い光学分解能を得ることができる。

上記フェーズプレートはさらに、入射光を遮光する第２の遮光領域を有し、上記第１の光透過領域は上記位相シフト領域の内周領域に設けられ、上記第２の遮光領域は上記位相シフト領域の外周領域に設けられていてもよい。

この構成によれば、回折光のうち＋１次回折光は第２の遮光領域によって遮光され、−１次回折光は第１の光透過領域を通過する。即ち、＋１次回折光は位相差像の生成に利用されず、−１次回折光のみが位相差像の生成に利用される。これにより、回折光における低域成分と高域成分の不連続を解消することが可能である。

上記位相シフト領域は、液晶素子であってもよい。

位相シフト領域を液晶素子とすることにより、液晶素子の屈折率を変化させることができ、位相シフト領域の位相シフト量を制御することが可能となる。これにより、直接光と回折光の干渉の程度を向上させ、位相差像の高い光学分解能を実現することが可能である

上記位相シフト領域は、入射光を減光してもよい。

上記のように照明光は、観察対象物を透過することによって、直接光と回折光に分けられるが、回折光は直接光に比較して大幅に弱いため、直接光の光量を抑制する必要がある。位相シフト領域に、位相シフトに加え減光の機能を持たせることにより、フェーズプレートによる直接光の光量の抑制が可能である。

上記位相差顕微鏡は、さらに、輪帯状であり、入射光を減光する減光領域と、入射光を透過する第３の光透過領域とを有し、上記対物レンズの瞳面において上記遮光領域の像が上記位相シフト領域の像に一致するように構成された減光プレートを具備してもよい。

この構成によれば、フェーズプレートとは別に設けられた減光プレートによって、直接光の光量の抑制がなされる。瞳面において減光領域の像が位相シフト領域の像に一致することにより、直接光を抑制することが可能となる。

上記位相シフト領域は、液晶素子であってもよい。

位相シフト領域を液晶素子とすることにより、液晶素子の屈折率を変化させることができ、位相シフト領域の位相シフト量を制御することが可能となる。これにより、直接光と回折光の干渉の程度を向上させ、位相差像の高い光学分解能を実現することが可能である

上記フェーズプレートは、同心円状に配設された複数の位相シフト領域を備えていてもよい。

この構成によれば、複数の位相シフト領域から、対物レンズのＮＡに応じて利用する位相シフト領域を切り替えることが可能であり、ＮＡが異なる複数の対物レンズに対して、一つのフェーズプレートで対応することが可能である。

上記フェーズプレートは、上記瞳面における上記位相シフト領域の像が、上記対物レンズのＮＡ／２より大きい径となるように構成されていてもよい。

この構成によれば、液晶素子の制御により、位相シフト領域の位相シフト量を調整することが可能であると共に、対物レンズの高ＮＡ成分を位相差像に取り込むことが可能となり、高い光学分解能を得ることができる。

上記目的を達成するため、本技術の一形態に係る位相差顕微鏡システムは、位相差顕微鏡と、撮像部と、制御部と、表示部とを具備する。
上位位相差顕微鏡は、対物レンズと、輪帯状であり、入射光の位相をシフトさせる位相シフト領域と、入射光を透過する第１の光透過領域とを有し、上記位相シフト領域は空間周波数の高域成分を強調するフェーズプレートと、入射光を透過する第２の光透過領域と、入射光を遮光する第１の遮光領域とを有し、上記フェーズプレートと共役であるリング絞りとを備える。
上記撮像部は、上記位相差顕微鏡によって生成された位相差像を撮像する。
上記制御部は、上記位相差顕微鏡及び上記撮像部を制御し、上記撮像部に位相差像を撮像させる。
上記表示部は、上記撮像部によって撮像された位相差像を表示する。

以上のように、本技術によれば、高い光学分解能を実現することが可能な位相差顕微鏡及び位相差顕微鏡システムを提供することが可能である。なお、ここに記載された効果は必ずしも限定されるものではなく、本開示中に記載されたいずれかの効果であってもよい。

本技術の第１の実施形態に係る位相差顕微鏡の構成を示す模式図である。 同位相差顕微鏡のリング絞りの平面図である。 同位相差顕微鏡のフェーズプレートの平面図である。 同位相差顕微鏡の対物レンズの瞳面の模式図である。 同位相差顕微鏡の瞳面における位相シフト領域の像を示す模式図である。 同位相差顕微鏡の瞳面における位相シフト領域の像を示す模式図である。 同位相差顕微鏡の瞳面における位相シフト領域の像及び光透過領域の像を示す模式図である。 同位相差顕微鏡の、フェーズプレートに入射する直接光及び回折光を示す模式図である。 比較例に係る位相差顕微鏡のフェーズプレートの平面図である。 同位相差顕微鏡の瞳面における位相シフト領域の像及び光透過領域の像を示す模式図である。 同位相差顕微鏡の、フェーズプレートに入射する直接光及び回折光を示す模式図である。 照明光の低ＮＡ成分によって撮影サンプルを撮像した明視野者画像である。 照明光の高ＮＡ成分によって撮影サンプルを撮像した明視野者画像である。 本技術の第１の実施形態の変形例に係る位相差顕微鏡の減光プレートを示す平面図である。 本技術の第１の実施形態に係る位相差顕微鏡システムの構成を示す模式図である。 本技術の第２の実施形態に係る位相差顕微鏡の構成を示す模式図である。 同位相差顕微鏡のフェーズプレートの平面図である。 同位相差顕微鏡の、フェーズプレートに入射する直接光及び回折光を示す模式図である。 第１の実施形態に係る位相差顕微鏡のフェーズプレートに入射する直接光及び回折光のうち、回折光を低域成分と高域成分に分解した模式図である。 第２の実施形態に係る位相差顕微鏡のフェーズプレートに入射する直接光及び回折光のうち、回折光を低域成分と高域成分に分解した模式図である。 本技術の第２の実施形態に係る位相差顕微鏡システムの構成を示す模式図である。 本技術の第３の実施形態に係る位相差顕微鏡の構成を示す模式図である。 同位相差顕微鏡のフェーズプレートの平面図である。 同位相差顕微鏡のフェーズプレートの断面図である。 同位相差顕微鏡のフェーズプレートにおける印加電圧と位相シフト量の関係を表す断面図である。 同位相差顕微鏡のフェーズプレートの断面図である。 同位相差顕微鏡の減光プレートの平面図である。 本技術の第３の実施形態の変形例に係る位相差顕微鏡のフェーズプレートを示す平面図である。 本技術の第２の実施形態に係る位相差顕微鏡システムの構成を示す模式図である。 本技術の実施例に係る検証実験系の構成を示す模式図である。 同検証実験系の減光プレートが備える減光領域（光透過率２０％）の光透過特性を示すグラフである。 同検証実験系の減光プレートが備える減光領域（光透過率１０％）の光透過特性を示すグラフである。 同検証実験系に用いた各種フェーズプレートの写真である。 同検証実験系に用いた各種フェーズプレートの写真である。 同検証実験系に用いた各種フェーズプレートの位相シフト領域の径を示す表である。 同検証実験系に用いた各種減光プレートの減光領域の径を示す表である。 同検証実験系に用いた各種フェーズプレートの位相シフト領域の径及びリング絞りの光透過領域の径を示す表である。 同検証実験系の光学系パラメータ及び各種領域の径を示す表である。 同検証実験系の光学系パラメータ及び各種領域の径を示す表である。 同検証実験系によって撮像された位相差像である。 同検証実験系によって撮像された位相差像である。 同検証実験系によって撮像された位相差像である。 同検証実験系によって撮像された位相差像である。 同検証実験系によって撮像された位相差像である。 同検証実験系によって撮像された位相差像である。 同検証実験系によって撮像された位相差像である。 同検証実験系によって撮像された位相差像に周波数解析を施した結果を示すグラフである。

＜第１の実施形態＞
本技術の第１の実施形態に係る位相差顕微鏡について説明する。

［位相差顕微鏡の構成］
図１は、本実施形態に係る位相差顕微鏡１００の構成示す模式図である。同図に示すように、位相差顕微鏡１００は、光源１０１、光源レンズ１０２、視野絞り１０３、リレーレンズ１０４、開口絞り１０５、リング絞り１０６、コンデンサレンズ１０７、ステージ１０８、対物レンズ１０９、フェーズプレート１１０、結像レンズ１１１及び撮像部１１２を有する。また、ステージ１０８には、観察対象物Ｓが載置されている。観察対象物Ｓは例えば培養液中の細胞である。

以降の説明おいて、リング絞り１０６からフェーズプレート１１０に対する方向をＺ方向とし、Ｚ方向に垂直な方向をＸ方向、Ｚ方向及びＸ方向に垂直な方向をＹ方向とする。Ｚ方向は、位相差顕微鏡１００の光軸方向に一致し、Ｘ方向及びＹ方向は、ステージ１０８のステージ面に沿った方向である。

光源１０１は、観察対象物に照射される照明光を生成する光源であり、ハロゲンランプや白色ＬＥＤ（Light Emitting Diode）等、任意の構成の光源を利用することができる。図１において、光源１０１から照射された照明光の光路を光路Ｌ１として示す。

光源レンズ１０２は、光源１０１から照射された照明光を集光するレンズである。光源レンズ１０２は任意の構成のものを利用することができるが、照明光を均一光（ケーラー照明光）にすることが可能なものが好適である。

視野絞り１０３は、観察対象物Ｓと共役となる位置に配置され、照明光が観察対象物Ｓに照射される範囲を制限する。視野絞り１０３は例えば、円形の開口が形成された遮光板であるものとすることができる。

リレーレンズ１０４は、照明光を伝達するレンズである。リレーレンズ１０４は任意の構成のものを利用することができる。

開口絞り１０５は、光源１０１と共役となる位置に配置され、観察対象物Ｓに照射される照明光の光量を調整する。開口絞り１０５は例えば、円形の開口が形成された遮光板であるものとすることができる。

リング絞り１０６は、照明光をリング状に成形する。図２は、リング絞り１０６を示す平面図であり、リング絞り１０６をＺ方向からみた図である。同図に示すように、リング絞り１０６は、遮光領域１０６ａと光透過領域１０６ｂを有する。遮光領域１０６ａは入射光を遮蔽する領域であり、光透過領域１０６ｂは入射光を透過する領域である。リング絞り１０６は、遮光性部材にスリットを形成して光透過領域１０６ｂとし、それ以外の領域を遮光領域１０６ａとしたものとすることができる。

リング絞り１０６に入射した照明光Ｌ１は、遮光領域１０６ａを通過することによってリング状に成形される。図１には、リング絞り１０６の通過光の光路を光路Ｌ２として示す。

ここで、リング絞り１０６は、フェーズプレート１１０と共役となるように、即ち、対物レンズ１０９の瞳面において光透過領域１０６ｂの像が、フェーズプレート１１０の位相シフト領域の像に含まれるように構成されている。この詳細については後述する。

コンデンサレンズ１０７は、照明光を観察対象物Ｓに集光するレンズである。コンデンサレンズ１０７は任意の構成のものを利用することができる。

ステージ１０８は、観察対象物Ｓを支持する。ステージ１０８は、図示しない駆動機構によって、Ｘ方向、Ｙ方向及びＺ方向に移動可能に構成されている。なおステージ１０８の少なくとも中心部分は、光透過性を有する材料からなる。

対物レンズ１０９は、観察対象物の像を所定倍率に拡大する。対物レンズ１０９は、各種拡大倍率のものから所望の拡大倍率に応じて選択することが可能である。ここで、対物レンズ１０９は瞳面（後側焦点面）を有する。図１に、対物レンズ１０９の瞳面を瞳面Ｈとして示す。

フェーズプレート１１０は、入射光の一部を位相シフトさせる。図１に示すように、フェーズプレート１１０は対物レンズ１０９に一体的に構成されているものが一般的であるが、対物レンズ１０９と独立して位相差顕微鏡１００に設けられていてもよい。フェーズプレート１１０は、図１に示すように対物レンズ１０９の瞳面Ｈに配置されるものとすることができる。また、フェーズプレート１１０は、瞳面Ｈとは異なる位置であって、位相差顕微鏡１００において共役となる位置に配置されてもよい。

図３は、フェーズプレート１１０を示す平面図であり、フェーズプレート１１０をＺ方向からみた図である。同図に示すように、フェーズプレート１１０は、位相シフト領域１１０ａと光透過領域１１０ｂを有する。位相シフト領域１１０ａは、フェーズプレート１１０において一定の幅を有する輪帯状の領域であり、入射光の位相をシフトさせる領域である。位相のシフト量は典型的には＋１／４波長又は−１／４波長である。位相シフト領域１１０ａは、入射光の位相シフトすると共に減光するものとすることができるが、後述するように位相シフトのみを行うものであってもよい。

光透過領域１１０ｂは、入射光の位相をシフトさせることなく透過させる領域である。フェーズプレート１１０は、光透過性部材に輪帯状に位相膜を成膜して位相シフト領域１１０ａとし、それ以外の領域を光透過領域１１０ｂとしたものとすることができる。

ここで、フェーズプレート１１０は、対物レンズ１０９の瞳面Ｈにおける位相シフト領域１１０ａの像が、対物レンズ１０９のＮＡ／２より大きい径となるように構成されている。この詳細については後述する。

結像レンズ１１１は、観察対象物Ｓの像を撮像部１１２の撮像面（撮像素子）に結像させる。結像レンズ１１１は、任意の構成のものを利用することができる。

撮像部１１２は、観察対象物の位相差像を撮像する。具体的には撮像部１１２は、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）やＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）等の撮像素子を備えるものとすることができる。

対物レンズ１０９、フェーズプレート１１０、結像レンズ１１１及び撮像部１１２によって撮像光学系が構成される。図１において、撮像光学系の光路を光路Ｌ３として示す。観察対象物Ｓと撮像部１１２の撮像面は共役関係を構成し、撮像部１１２によって観察対象物Ｓの位相差像が撮像される。

［リング絞りとフェーズプレートの詳細な構成について］
上記のように、フェーズプレート１１０は、対物レンズ１０９の瞳面Ｈにおける位相シフト領域１１０ａの像が、対物レンズ１０９のＮＡ／２より大きい径となるように構成されている。

図４は、対物レンズ１０９の瞳面Ｈを示す模式図である。同図に示すように、瞳面Ｈの中心がＮＡ０に相当し、瞳面Ｈの周縁がＮＡ１に相当する。破線の円で示す、瞳面Ｈの半分の径がＮＡ／２に相当する径である。

図５は、瞳面Ｈ及び瞳面Ｈにおける位相シフト領域１１０ａの像を示す模式図である。同図において、位相シフト領域１１０ａの像を像Ｆ１として示す。なお、「位相シフト領域１１０ａの像」は、図１に示すように、フェーズプレート１１０が瞳面Ｈ上に位置する場合には、位相シフト領域１１０ａそのものである。また、フェーズプレート１１０が瞳面Ｈ上に位置しない場合には、瞳面Ｈに投影された位相シフト領域１１０ａの像である。

同図に示すように、像Ｆ１は、ＮＡ／２より大きい径を有する。なお、像Ｆ１の径は、輪帯形状の円形の２辺のうち内側の辺の径であり、同図において像Ｆ１の径を径Ｒとして示す。図６は、瞳面Ｈにおける位相シフト領域１１０ａの像Ｆ１の他の態様を示す模式図である。図６（ａ）に示すように像Ｆ１はＮＡ／２よりわずかに大きい径を有していてもよく、図６（ｂ）に示すように像Ｆ１の外周が瞳面Ｈの周縁に接する径を有していてもよい。

像Ｆ１の大きさ（径）は、フェーズプレート１１０が瞳面Ｈ上に位置する場合には、フェーズプレート１１０における位相シフト領域１１０ａの配設範囲によって決定される。また、フェーズプレート１１０が瞳面Ｈ上に位置しない場合には、フェーズプレート１１０における位相シフト領域１１０ａの配設範囲と、フェーズプレート１１０と瞳面Ｈの位置関係によって決定される。即ち、フェーズプレート１１０は、フェーズプレート１１０の配置に応じて、像Ｆ１が対物レンズ１０９のＮＡ／２より大きい径となるように構成されている。

また、上記のようにリング絞り１０６は、フェーズプレート１１０と共役となるように、即ち、瞳面Ｈにおいて光透過領域１０６ｂの像が、フェーズプレート１１０の位相シフト領域１１０ａの像（像Ｆ１）に含まれるように構成されている。図７は、瞳面Ｈ及び瞳面Ｈにおける位相シフト領域１１０ａの像及び光透過領域１０６ｂの像を示す模式図である。同図において、光透過領域１０６ｂの像を像Ｆ２として示す。同図に示すように、像Ｆ２は、像Ｆ１に含まれている。像Ｆ１は、ＮＡ／２より大きい径を有するので、像Ｆ１に含まれる像Ｆ２もＮＡ／２より大きい径を有する。

像Ｆ２の大きさ（径）は、リング絞り１０６における光透過領域１０６ｂの配設範囲と、リング絞り１０６と瞳面Ｈの位置関係によって決定される。即ち、リング絞り１０６は、リング絞り１０６の配置に応じて、像Ｆ２が像Ｆ１に含まれるように構成されている。像Ｆ１が図６（ａ）及び図６（ｂ）に示すような配置である場合も、図７と同様に像Ｆ２が像Ｆ１に含まれるように、リング絞り１０６が構成される。

［位相差顕微鏡による位相差像の撮像について］
位相差顕微鏡１００は以上のような構成を有する。光源１０１から照射された照明光（図１中Ｌ１）は、光源レンズ１０２によって集光され、視野絞り１０３によって照射範囲が制限される。さらに、リレーレンズ１０４によって伝達され、開口絞り１０５によって光量が調節される。さらに、照明光はリング絞り１０６の光透過領域１０６ｂ（図２参照）を透過してリング状に成形され（図１中Ｌ２）、コンデンサレンズ１０７によって観察対象物Ｓに照射される。

ここで、照明光は、観察対象物を透過し、直進した直接光と、観察対象物Ｓによって回折を受けた回折光に分けられる。図８は、フェーズプレート１１０に入射する直接光及び回折光を示す模式図である。同図においては、直接光をＰ、回折光をＤとして示す。回折光Ｄは、直接光Ｐより内側に回折した−１次回折光Ｄ（−１）と、直接光Ｐより外側に回折した＋１次回折光Ｄ（＋１）を含む。また、回折光Ｄはより高次の回折光を含んでいてもよい。回折光Ｄは回折によって、直接光Ｐに対して波長が約１／４波長遅れる。

同図に示すように、直接光Ｐは、フェーズプレート１１０の位相シフト領域１１０ａを透過して位相がずれ（＋１／４波長又は−１／４波長）、かつ減光される。以下、位相シフト領域１１０ａを透過した直接光を直接光Ｐ'とする。回折光Ｄは、大部分がフェーズプレート１１０の光透過領域１１０ｂを透過するため、位相と明るさは変化しない。以下、光透過領域１１０ｂを透過した回折光を回折光Ｄ'（＋１次回折光Ｄ'（＋１）及び−１次回折光Ｄ'（−１））とする。

直接光Ｐ'は位相シフト領域１１０ａを通過して位相がずれているため、直接光Ｐ'と回折光Ｄ'の位相の差は０又は１／２波長となり、直接光Ｐ'と回折光Ｄ'は干渉する。また、回折光Ｄは直接光Ｐに比較して光量が大幅に小さいが、直接光Ｐは位相シフト領域１１０ａによって減光されるため、直接光Ｐ'と回折光Ｄ'は同程度の光量となる。

直接光Ｐ'及び回折光Ｄ'は結像レンズ１１１によって撮像部１１２の撮像面に結像され（図１中Ｌ３）、位相差像が生成される。このように、位相差顕微鏡１００においては、直接光Ｐが位相シフト領域１１０ａに入射することが必要である。このため、図８に示すように、瞳面Ｈにおいて光透過領域１０６ｂの像（像Ｆ２）が、位相シフト領域１１０ａの像（像Ｆ１）に含まれていることが必要である。

［位相差顕微鏡の効果］
位相差顕微鏡１００の効果について、比較例との比較の上で説明する。図９は、比較例に係る位相差顕微鏡が備えるフェーズプレート１０１０の平面図である。同図に示すようにフェーズプレート１０１０は、位相シフト領域１０１０ａ及び光透過領域１０１０ｂを有する。図１０は、比較例に係る位相差顕微鏡の瞳面Ｈを示す模式図である。

図１０に示すように、比較例に係る位相差顕微鏡の瞳面Ｈにおいては、フェーズプレートの位相シフト領域の像Ｆ１が、対物レンズのＮＡ／２より小さい径となるように構成されている。また、リング絞りの光透過領域の像Ｆ２は像Ｆ１に含まれるように構成されている。これは、一般的な位相差顕微鏡の構成と同様である。

図１１は、比較例に係る位相差顕微鏡において、フェーズプレート１０１０に入射する直接光及び回折光を示す模式図である。同図に示すように、観察対象物Ｓに入射した照明光は、直接光Ｐと、回折光Ｄ（−１次回折光Ｄ（−１）及び＋１次回折光Ｄ（＋１））に分けられる。直接光Ｐは位相シフト領域１０１０ａを透過して直接光Ｐ'となり、回折光Ｄは光透過領域１０１０ｂを透過して回折光Ｄ'（−１次回折光Ｄ'（−１）及び＋１次回折光Ｄ'（＋１））となる。

ここで、比較例に係る位相差顕微鏡においては、図１０に示すように、瞳面Ｈにおけるリング絞りの光透過領域の像（Ｆ２）がＮＡ／２より小さい径となるように構成されている。したがって、位相差像を構成する明視野像（直接光Ｐ'）は対物レンズにおいて低ＮＡ〜中ＮＡの成分を切り出した明視野像に等しく、対物レンズのＮＡを最大限に利用することができない。

これに対し、本実施形態に係る位相差顕微鏡１００においては、図７に示すように、瞳面Ｈにおける光透過領域１０６ｂの像（Ｆ２）がＮＡ／２より大きい径となるように構成されている。これにより、位相差像を構成する明視野像（直接光Ｐ'）は対物レンズにおいて中ＮＡ〜高ＮＡの成分を切り出した明視野像に等しく、対物レンズのＮＡを最大限に利用することが可能である。即ち、この構成では比較例の構成に比較して高い光学分解能を得ることができる。

図１２及び図１３は、比較例と本実施形態に係る位相差顕微鏡の光学分解能の差異を示す画像であり、撮影サンプル（線幅０．４μｍのライン＆スペースのチャート）を位相差顕微鏡によって撮像した画像である。図１２は、ＮＡ０．３、光学倍率２０倍の対物レンズを備え、対物レンズの瞳面において、ＮＡ０．１〜０．１２の範囲にリング絞りの光透過領域の像が位置するように構成された位相差顕微鏡によって撮像された画像である。図１３は、同一の対物レンズを備え、対物レンズの瞳面において、ＮＡ０．２４〜０．２８の範囲にリング絞りの光透過領域の像が位置するように構成された位相差顕微鏡によって撮像された画像である。

両画像の撮像の際には、位相差顕微鏡にはフェーズプレートが装着されず、即ち両画像は位相差画像ではなく明視野画像である。しかしながら、位相差顕微鏡には上記のようにリング絞りが装着されており、光学分解能は位相差画像と同等とみなせる。

図１２と図１３を比較すると、図１２においては、線幅０．４μｍのラインが分解されていないのに対し、図１３においては、線幅０．４μｍのラインが分解されている。このことから、本実施形態に係る位相差顕微鏡１００は、高い光学分解能を有することがわかる。

また、一般的な空間フィルタの原理を考慮すると、位相差顕微鏡１００は空間周波数の高域を強調する効果が得られる。したがって、本実施形態によれば、位相差顕微鏡において実質的に光学分解能を向上させ、かつ、空間周波数の高域を高コントラストで観察することが可能である。

［変形例］
上記説明では、フェーズプレート１１０の位相シフト領域１１０ａは、入射光を位相シフトし、かつ減光するとしたが、位相シフト領域１１０ａは入射光を位相シフトするのみとすることも可能である。この場合、位相差顕微鏡１００は、フェーズプレート１１０とは別に、入射光を減光する減光プレートを備えるものとすることができる。減光プレートは、フェーズプレート１１０に隣接して配置されてもよく、フェーズプレート１１０とは離間した位置であって、位相差顕微鏡１００において共役となる位置に配置されてもよい。

図１４は、減光プレート１１３を示す平面図である。同図に示すように、減光プレート１１３は、減光領域１１３ａと光透過領域１１３ｂを有する。減光領域１１３ａは入射光を減光する領域であり、輪帯状に形成されている。光透過領域１１３ｂは入射光を減光することなく透過する領域である。減光プレート１１３は、光透過性部材に輪帯状に減光膜を成膜して減光領域１１３ａとし、それ以外の領域を光透過領域１１３ｂとしたものとすることができる。

減光領域１１３ａは、フェーズプレート１１０の位相シフト領域１１０ａが減光の機能を有する構成と同様に、位相シフト領域１１０ａを透過した直接光Ｐ'（図８参照）を減光する。したがって、減光プレート１１３は、対物レンズ１０９の瞳面Ｈにおいて、位相シフト領域１１０ａの像Ｆ１（図７参照）に減光領域１１３ａの像が一致するように構成される。瞳面Ｈにおいて像Ｆ１は、ＮＡ／２より大きい径を有するので、像Ｆ１に一致する減光領域１１３ａの像もＮＡ／２より大きい径を有する。

この構成を有する位相差顕微鏡も、フェーズプレート１１０の位相シフト領域１１０ａが減光の機能を有する構成と同様に、高い光学分解能を有するものとすることが可能である。

[位相差顕微鏡システムについて]
上記位相差顕微鏡１００は、顕微鏡システムを構成していてもよい。図１５は、位相差顕微鏡１００を含む位相差顕微鏡システム１０００の構成を示す模式図である。

同図に示すように、位相差顕微鏡システム１０００は、位相差顕微鏡１００、制御部１２０及び表示部１３０を有する。

位相差顕微鏡１００は、上記のような構成を有する。上述のように位相差顕微鏡１００は、観察対象物の位相差像を撮像する撮像部１１２を備える。

制御部１２０は、位相差顕微鏡１００及び撮像部１１２を制御し、撮像部１１２に位相差像を撮像させる。具体的には制御部１２０は、光源１０１、ステージ１０８及び対物レンズ１０９に接続され、これらを制御するものとすることができる。

例えば制御部１２０は、ステージ１０８に観察対象物Ｓが載置されると、撮像部１１２によって撮像された位相差像のコントラストが最も大きくなるように調整するものとすることができる。この他にも制御部１２０は、位相差顕微鏡１００の各構成を制御し、撮像部１１２に位相差像を撮像させるものとすることができる。制御部１２０は、撮像部１１２によって撮像された位相差像を表示部１３０に供給する。

表示部１３０は、制御部１２０から供給された位相差像を表示する。表示部１３０は、ＬＣＤ（liquid crystal display）等の画像表示装置であるものとすることができる。

位相差顕微鏡システム１０００は以上のような構成を有する。位相差顕微鏡システム１０００は位相差顕微鏡１００を含むので、上述のように対物レンズのＮＡを最大限に利用することが可能であり、高い光学分解能を得ることができる。

＜第２の実施形態＞
本技術の第２の実施形態に係る位相差顕微鏡について説明する。

［位相差顕微鏡の構成］
図１６は、本実施形態に係る位相差顕微鏡２００の構成を示す模式図である。位相差顕微鏡２００は、第１の実施形態に係る位相差顕微鏡１００とはフェーズプレートの構成が異なり、その他の構成は同一である。位相差顕微鏡２００において位相差顕微鏡１００と同一の構成については同一の符号を付し、説明を省略する。

図１６に示すように、位相差顕微鏡２００はフェーズプレート２１０を有する。同図に示すように、フェーズプレート２１０は対物レンズ１０９に一体的に構成されているものが一般的であるが、対物レンズ１０９と独立して位相差顕微鏡２００に設けられていてもよい。フェーズプレート２１０は、図１６に示すように対物レンズ１０９の瞳面Ｈに配置されるものとすることができる。また、フェーズプレート２１０は、瞳面Ｈとは異なる位置であって、位相差顕微鏡２００において共役となる位置に配置されてもよい。

図１７は、フェーズプレート２１０を示す平面図であり、フェーズプレート２１０をＺ方向からみた図である。同図に示すように、フェーズプレート２１０は、位相シフト領域２１０ａ、光透過領域２１０ｂ及び遮光領域２１０ｃを有する。

位相シフト領域２１０ａは、フェーズプレート２１０において一定の幅を有する輪帯状の領域であり、入射光の位相をシフトさせる領域である。位相のシフト量は典型的には＋１／４波長又は−１／４波長である。位相シフト領域２１０ａは、入射光の位相シフトすると共に減光するものとすることができるが、後述するように位相シフトのみを行うものであってもよい。ここで、位相シフト領域２１０ａは、一般的なフェーズプレートや第１の実施形態に係るフェーズプレート１１０の位相シフト領域に比較して減光量が大きいものが好適である。

光透過領域２１０ｂは、入射光の位相をシフトさせることなく透過させる領域である。光透過領域２１０ｂは、図１７に示すように位相シフト領域２１０ａの内周領域に設けられている。遮光領域２１０ｃは、入射光を遮光する領域である。遮光領域２１０ｃは、図１７に示すように位相シフト領域２１０ａの外周領域に設けられている。

フェーズプレート２１０は、光透過性部材に輪帯状に位相膜を成膜して位相シフト領域２１０ａとし、位相シフト領域２１０ａの外周領域に遮光膜を成膜して遮光領域２１０ｃとし、それ以外の領域を光透過領域２１０ｂとしたものとすることができる。

ここで、フェーズプレート２１０は、第１の実施形態と同様に、対物レンズ１０９の瞳面Ｈにおける位相シフト領域２１０ａの像が、対物レンズ１０９のＮＡ／２より大きい径となるように構成されている。即ち、フェーズプレート２１０は、瞳面Ｈにおける位相シフト領域２１０ａの像が図５の像Ｆ１と同様となるように構成されている。

リング絞り１０６は、第１の実施形態と同様に、フェーズプレート２１０と共役となるように、即ち、瞳面Ｈにおいて光透過領域１０６ｂの像（像Ｆ２）が、位相シフト領域２１０ａの像（像Ｆ１）に含まれるように構成されている（図７参照）。像Ｆ１は、ＮＡ／２より大きい径を有するので、像Ｆ１に含まれる像Ｆ２もＮＡ／２より大きい径を有する。

［位相差顕微鏡による位相差像の撮像について］
位相差顕微鏡２００は以上のような構成を有する。光源１０１から照射された照明光（図１６中Ｌ１）は、光源レンズ１０２によって集光され、視野絞り１０３によって照射範囲が制限される。さらに、リレーレンズ１０４によって伝達され、開口絞り１０５によって光量が調節される。さらに、照明光はリング絞り１０６の光透過領域１０６ｂを透過してリング状に成形され（図１６中Ｌ２）、コンデンサレンズ１０７によって観察対象物Ｓに照射される。

ここで、照明光は、観察対象物を透過し、直進した直接光と、観察対象物Ｓによって回折を受けた回折光に分けられる。図１８は、フェーズプレート２１０に入射する直接光及び回折光を示す模式図である。同図においては、直接光をＰ、回折光をＤとして示す。回折光Ｄは、直接光Ｐより内側に回折した−１次回折光Ｄ（−１）と、直接光Ｐより外側に回折した＋１次回折光Ｄ（＋１）を含む。また、回折光Ｄはより高次の回折光を含んでいてもよい。

回折光Ｄの回折角（直接光Ｐと回折光Ｄのなす角）は、位相物体（観察対象物Ｓ）のサイズによって異なり、位相物体が小さいほど回折角度は大きくなる。このため、回折角が大きい回折光Ｄは、空間周波数の高域成分である。回折光Ｄは回折によって、直接光Ｐに対して波長が約１／４波長遅れる。

同図に示すように、直接光Ｐは、フェーズプレート２１０の位相シフト領域２１０ａを透過して位相がずれ（＋１／４波長又は−１／４波長）、かつ減光される。−１次回折光Ｄ（−１）は、光透過領域２１０ｂを透過し、位相と明るさは変化しない。＋１次回折光Ｄ（＋１）は遮光領域２１０ｃによって遮光される。

位相シフト領域２１０ａを通過した直接光Ｐ'と、光透過領域２１０ｂを通過した−１次回折光Ｄ'（−１）は干渉し、結像レンズ１１１によって撮像部１１２の撮像面に結像され（図１６中Ｌ３）、位相差像が生成される。上記のように＋１次回折光Ｄ（＋１）は遮光領域２１０ｃによって遮光されるため、位相差像には＋１次回折光Ｄ（＋１）は取り込まれない。

［位相差顕微鏡の効果］
位相差顕微鏡２００の効果について説明する。図１９は、上述した第１の実施形態に係るフェーズプレート１１０に入射する直接光及び回折光のうち、回折光を低域成分と高域成分に分解した図である。上述のように観察対象物Ｓに入射した照明光は、直接光Ｐと回折光Ｄに分けられる。

ここで、回折光Ｄの回折角度（直接光Ｐと回折光Ｄのなす角）は、位相物体（観察対象物Ｓ）のサイズによって異なり、位相物体が小さいほど回折角度は大きくなる。このため、回折光Ｄは、回折角度が異なる複数の周波数成分を含んでいる。回折角度の小さい成分は、大きい位相物体に由来し、回折光Ｄにおける空間周波数の低域成分である。回折角度の大きい成分は、小さい位相物体に由来し、回折光Ｄにおける空間周波数の高域成分である。

図１９においては、回折光Ｄの低域成分を低域成分Ｄｌ（−１次低域成分Ｄｌ（−１）及び＋１次低域成分Ｄｌ（＋１））とし、回折光の高域成分を回折光Ｄｈ（−１次高域成分Ｄｈ（−１）及び＋１次高域成分Ｄｈ（＋１））とする。図１９に示すフェーズプレート１１０の構成では、位相シフト領域１１０ａの位置によって、＋１次回折光Ｄ（＋１）のうち低域成分Ｄｌ（＋１）は光透過領域１１０ｂに入射するが、高域成分Ｄｈ（＋１）はフェーズプレート１１０に入射しない。一方、−１次回折光Ｄ（−１）は、低域成分Ｄｌ（−１）と高域成分Ｄｈ（−１）の両者が光透過領域１１０ｂに入射する。

この場合、回折光Ｄの低域成分は、−１次低域成分Ｄｌ（−１）と＋１次低域成分Ｄ１（＋１）の両者が位相差像に取り込まれるのに対し、高域成分は−１次高域成分Ｄｈ（−１）のみが位相差像に取り込まれ、＋１次高域成分Ｄｈ（＋１）は位相差像に取り込まれない。これにより、低域成分と高域成分の光量が不連続となり、位相差像においては低域に比べて高域が暗くなる。

一方で、比較例に係る構成（図１１参照）においては、位相シフト領域１０１０ａの内外の回折光が同程度に光透過領域１０１０ｂを透過するため、＋１次回折光Ｄ（＋１）と−１次回折光Ｄ（−１）において、高域成分の入射光量の差異が生じない。即ち、第１の実施形態に係る構成では、比較例に係る構成に比べて光学分解能が向上し、より高い高域成分を位相差像に取り込むことが可能であるものの、低域成分に比較して高域成分の光量が減少する。

図２０は、本実施形態に係るフェーズプレート２１０に入射する直接光Ｐ及び回折光Ｄのうち、回折光を低域成分と高域成分に分解した模式図である。上記のように、フェーズプレート２１０においては、位相シフト領域２１０ａの外周領域に遮光領域２１０ｃが設けられている。このため、同図に示すように、＋１次回折光は、低域成分Ｄｌ（＋１）と高域成分Ｄｈ（＋１）の両者が遮光領域２１０ｃによって遮光される。

一方、−１次回折光は、低域成分Ｄｌ（−１）と高域成分Ｄｈ（−１）の両者が光透過領域２１０ｂを透過する。このため、＋１次回折光Ｄ（＋１）と−１次回折光Ｄ（−１）の間で、高域成分の入射光量の差異が生じない。即ち、本実施形態の構成によれば、比較例に係る構成に比べて光学分解能が向上し、より高い高域成分を位相差像に取り込むことが可能であることに加え、低域成分に比較して高域成分の光量が減少することを防止することが可能である。

なお、フェーズプレート２１０においては、上記のように、＋１次回折光Ｄ（＋１）が遮光され、−１次回折光Ｄ（−１）のみが位相差像の生成に利用されるため、良好な位相差像を得るためには、−１次回折光Ｄ（−１）に対する直接光Ｐ'の強度を抑える必要がある。このため、フェーズプレート２１０の位相シフト領域２１０ａは、一般的なフェーズプレートや第１の実施形態に係るフェーズプレート１１０の位相シフト領域に比較して減光量が大きいものが好適である。

［変形例］
本実施形態においても、第１の実施形態と同様に、位相差顕微鏡２００がフェーズプレート２１０とは別に減光プレートを備えるものとしてもよい。減光プレートは、減光領域と光透過領域を有し、対物レンズの瞳面における減光領域の像が対物レンズのＮＡ／２より大きい径となるように構成されるものとすることができる。

また、フェーズプレート２１０は、遮光領域２１０ｃを備えるものとしたが、輪帯状の遮光領域を備える遮光プレートをフェーズプレート２１０とは別に設けてもよい。この場合、フェーズプレート２１０は、第１の実施形態に係るフェーズプレート１１０と同様の構成とすることができる。遮光プレートは、＋１次回折光Ｄ（＋１）（図２０参照）を遮光できる構成であればよい。

[位相差顕微鏡システムについて]
上記位相差顕微鏡２００は、顕微鏡システムを構成していてもよい。図２１は、位相差顕微鏡２００を含む位相差顕微鏡システム２０００の構成を示す模式図である。

同図に示すように、位相差顕微鏡システム２０００は、位相差顕微鏡２００、制御部２２０及び表示部２３０を有する。

位相差顕微鏡２００は、上記のような構成を有する。上述のように位相差顕微鏡２００は、観察対象物の位相差像を撮像する撮像部１１２を備える。

制御部２２０は、位相差顕微鏡２００及び撮像部１１２を制御し、撮像部１１２に位相差像を撮像させる。具体的には制御部２２０は、光源１０１、ステージ１０８及び対物レンズ１０９に接続され、これらを制御するものとすることができる。

例えば制御部２２０は、ステージ１０８に観察対象物Ｓが載置されると、撮像部１１２によって撮像された位相差像のコントラストが最も大きくなるように調整するものとすることができる。この他にも制御部２２０は、位相差顕微鏡２００の各構成を制御し、撮像部１１２に位相差像を撮像させるものとすることができる。制御部２２０は、撮像部１１２によって撮像された位相差像を表示部２３０に供給する。

表示部２３０は、制御部２２０から供給された位相差像を表示する。表示部２３０は、ＬＣＤ（liquid crystal display）等の画像表示装置であるものとすることができる。

位相差顕微鏡システム２０００は以上のような構成を有する。位相差顕微鏡システム２０００は位相差顕微鏡２００を含むので、上述のように対物レンズのＮＡを最大限に利用することが可能であり、高い光学分解能を得ることができる。

＜第３の実施形態＞
本技術の第３の実施形態に係る位相差顕微鏡について説明する。

［位相差顕微鏡の構成］
図２２は、本実施形態に係る位相差顕微鏡３００の構成を示す模式図である。位相差顕微鏡３００は、第１の実施形態に係る位相差顕微鏡１００とはフェーズプレートの構成が異なり、その他の構成は同一である。位相差顕微鏡３００において位相差顕微鏡１００と同一の構成については同一の符号を付し、説明を省略する

図２２に示すように、位相差顕微鏡３００は、フェーズプレート３１０及び減光プレート３１１を有する。フェーズプレート３１０は、同図に示すように対物レンズ１０９とは独立して設けられてもよく、第１及び第２の実施形態と同様に対物レンズ１０９と一体的に設けられてもよい。

フェーズプレート３１０は、図２２に示すように対物レンズ１０９の瞳面Ｈとは異なる位置であって、位相差顕微鏡３００において図示しないリレーレンズによって共役となる位置に配置されてもよく、瞳面Ｈに設けられてもよい。減光プレート３１１は、フェーズプレート３１０に隣接して設けられてもよく、フェーズプレート３１０と離間して設けられてもよい。

図２３は、フェーズプレート３１０を示す平面図であり、フェーズプレート３１０をＺ方向からみた図である。同図に示すように、フェーズプレート３１０は、位相シフト領域３１０ａ及び光透過領域３１０ｂを有する。位相シフト領域３１０ａは、フェーズプレート２１０において一定の幅を有する輪帯状の領域であり、入射光の位相をシフトさせる領域である。

光透過領域３１０ｂは、入射光の位相をシフトさせることなく透過させる領域である。光透過領域３１０ｂは、フェーズプレート３１０において位相シフト領域３１０ａ以外の領域であるものとすることができる。

フェーズプレート３１０は液晶素子であるものとすることができる。図２４はフェーズプレート３１０の位相シフト領域３１０ａ近傍の断面図である。同図に示すように、位相シフト領域３１０ａは、透明基板３１２、透明導電層３１３、配向層３１４及び液晶材料層３１５が積層されて構成されているものとすることができる。

透明基板３１２は、ガラスや合成樹脂等の光透過性の高い材料からなる板状部材である。透明導電層３１３は、ＩＴＯ（Indium Tin Oxide）等の光透過性導電材料からなる層であり、図示しない配線又は端子によってフェーズプレート３１０の外部と電気的に接続されている。配向層３１４は、表面に微細な規則的構造が形成された層であり、液晶分子を特定の方向に配向させる。液晶材料層３１５には、液晶材料が充填されている。液晶材料の種類は特に限定されない。

位相シフト領域３１０ａにおいては、液晶材料層３１５を挟む二層の透明導電層３１３の間の電位差を変化させることにより、液晶分子の配向を変化させ、位相シフト領域３１０ａの屈折率（即ち、位相シフト量）を変化させることが可能である。図２５は、透明導電層３１３への印加電圧と位相シフト量の関係を示すグラフである。同図に示すように、透明導電層３１３への印加電圧によって、位相シフト量を制御することが可能である。

光透過領域３１０ｂは、透明基板３１６からなり、透明基板３１６は、ガラスや合成樹脂等の光透過性の高い材料からなる板状部材からなるものとすることができる。なお、フェーズプレート３１０の構成はここに示すものに限られず、位相シフト領域３１０ａの位相シフト量を任意に変更できる構成であればよい。

例えば、フェーズプレート３１０は、透明導電層３１３を位相シフト領域３１０ａの形状に合わせてパターニングしてもよい。図２６は、透明導電層３１３をパターニングしたフェーズプレート３１０の位相シフト領域３１０ａの近傍の断面図である。同図に示すように、位相シフト領域３１０ａは、透明基板３１２、透明導電層３１３、配向層３１４及び液晶材料層３１５が積層されて構成され、光透過領域３１０ｂは、透明基板３１２、配向層３１４及び液晶材料層３１５が積層されて構成されているものとすることができる。

この構成においても、液晶材料層３１５を挟む二層の透明導電層３１３の間の電位差を変化させることにより、液晶分子の配向を変化させ、位相シフト領域３１０ａの位相シフト量を変化させることが可能である。

フェーズプレート３１０は、第１及び第２の実施形態と同様に、対物レンズ１０９の瞳面Ｈにおける位相シフト領域３１０ａの像が、対物レンズ１０９のＮＡ／２より大きい径となるように構成されているものとすることができる。また、フェーズプレート３１０は、このように構成されているものでなくてもよく、即ち瞳面Ｈにおける位相シフト領域３１０ａの像が、対物レンズ１０９のＮＡ／２より小さい径を有していてもよい。

図２７は、減光プレート３１１を示す平面図である。同図に示すように、減光プレート３１１は、減光領域３１１ａと光透過領域３１１ｂを有する。減光領域３１１ａは入射光を減光する領域であり、輪帯状に形成されている。光透過領域３１１ｂは入射光を減光することなく透過する領域である。減光プレート３１１は、光透過性部材に輪帯状に減光膜を成膜して減光領域３１１ａとし、それ以外の領域を光透過領域３１１ｂとしたものとすることができる。

なお、フェーズプレート３１０の位相シフト領域３１０ａは、位相シフトの機能に加え、減光の機能を有していてもよい。この場合、位相差顕微鏡３００には減光プレート３１１を設ける必要がない。

リング絞り１０６は、第１の実施形態と同様に、フェーズプレート３１０と共役となるように、即ち、瞳面Ｈにおいて光透過領域１０６ｂの像（像Ｆ２）が、位相シフト領域２１０ａの像（像Ｆ１）に含まれるように構成されている（図７参照）。

［位相差顕微鏡による位相差像の撮像について］
位相差顕微鏡３００は以上のような構成を有する。光源１０１から照射された照明光（図２２中Ｌ１）は、光源レンズ１０２によって集光され、視野絞り１０３によって照射範囲が制限される。さらに、リレーレンズ１０４によって伝達され、開口絞り１０５によって光量が調節される。さらに、照明光はリング絞り１０６の光透過領域１０６ｂを透過してリング状に成形され（図２２中Ｌ２）、コンデンサレンズ１０７によって観察対象物Ｓに照射される。なお、光源１０１から照射される照明光は、フェーズプレート３１０の位相シフト領域３１０ａにおける液晶材料層３１５の液晶分子の配向方向に平行な偏光方向の照明光である必要がある。

ここで、照明光は、観察対象物Ｓを透過し、直進した直接光と、観察対象物Ｓによって回折を受けた回折光に分けられる。直接光はフェーズプレート３１０の位相シフト領域３１０ａを通過して位相がずれ、減光プレート３１１の減光領域３１１ａを通過して減光される。なお、フェーズプレート３１０は、予め透明導電層３１３に電圧が印加され、液晶材料層３１５の配向によって位相シフト領域３１０ａが所定の屈折率とされている。回折光は、フェーズプレート３１０の光透過領域３１０ｂ及び減光プレート３１１の光透過領域３１１ｂを透過する。直接光と回折光は干渉し、結像レンズ１１１によって撮像部１１２の撮像面に結像され（図２２中Ｌ３）、位相差像が生成される。

［位相差顕微鏡の効果］
位相差顕微鏡３００の効果について説明する。上記のように位相差顕微鏡３００においては、観察対象物Ｓを透過した直接光は、液晶素子である位相シフト領域３１０ａによって位相がずれる。ここで、一般に位相差顕微鏡のフェーズプレートにおける位相のシフト量は１／４波長である。＋１次回折光及び−１次回折光の回折による位相ずれは１／４波長であり、直接光と回折光を干渉させるためには直接光と回折光の位相を合わせる必要があるためである。

しかしながら、厳密には照明光の波長や観察対象物Ｓの大きさによって、直接光に付加すべき位相量は異なり、必ずしもフェーズプレートによる位相シフト量が１／４波長の場合に、最も位相差像の光学分解能が高くなるわけではない。

ここで、本実施形態に係る位相差顕微鏡３００のフェーズプレート３１０は、液晶素子である位相シフト領域３１０ａを備え、印加電圧によって位相シフト領域３１０ａの位相シフト量を変化させることが可能である（図２５参照）。これにより、照明光の波長や観察対象物Ｓの大きさに応じて、位相シフト領域３１０ａの位相シフト量を調整し、位相差像の光学分解能を向上させることが可能である。

［変形例］
フェーズプレート３１０は、同心円状に配設された複数の位相シフト領域を備えてもよい。図２８は複数の位相シフト領域を備えるフェーズプレート３１０を示す平面図である。同図に示すように、フェーズプレート３１０は、同心円状に配設された複数の位相シフト領域３１０ａを備えるものとすることができる。各位相シフト領域３１０ａは上述のように液晶素子によって構成されており、各位相シフト領域３１０ａ毎に屈折率（位相シフト量）を変更することが可能に構成されている。

このフェーズプレート３１０は、対物レンズのＮＡに応じて位相シフト量を変更する位相シフト領域３１０ａを切り替えることが可能であり、ＮＡが異なる複数の対物レンズに対して、このフェーズプレート３１０のみで対応することが可能である。また、各位相シフト領域３１０ａは液晶素子であるので、上記のように照明光の波長や観察対象物Ｓの大きさに応じて、各位相シフト領域３１０ａの位相シフト量を調整し、位相差像の光学分解能を向上させることが可能である。

[位相差顕微鏡システムについて]
上記位相差顕微鏡３００は、顕微鏡システムを構成していてもよい。図２９は、位相差顕微鏡３００を含む位相差顕微鏡システム３０００の構成を示す模式図である。

同図に示すように、位相差顕微鏡システム３０００は、位相差顕微鏡３００、制御部３２０及び表示部３３０を有する。

位相差顕微鏡３００は、上記のような構成を有する。上述のように位相差顕微鏡３００は、観察対象物の位相差像を撮像する撮像部１１２を備える。

制御部３２０は、位相差顕微鏡３００及び撮像部１１２を制御し、撮像部１１２に位相差像を撮像させる。具体的には制御部３２０は、光源１０１、ステージ１０８及び対物レンズ１０９に接続され、これらを制御するものとすることができる。

例えば制御部３２０は、ステージ１０８に観察対象物Ｓが載置されると、撮像部１１２によって撮像された位相差像のコントラストが最も大きくなるように調整するものとすることができる。この他にも制御部３２０は、位相差顕微鏡３００の各構成を制御し、撮像部１１２に位相差像を撮像させるものとすることができる。制御部３２０は、撮像部１１２によって撮像された位相差像を表示部３３０に供給する。

表示部３３０は、制御部３２０から供給された位相差像を表示する。表示部３３０は、ＬＣＤ（liquid crystal display）等の画像表示装置であるものとすることができる。

位相差顕微鏡システム３０００は以上のような構成を有する。位相差顕微鏡システム３０００は位相差顕微鏡３００を含むので、上述のように対物レンズのＮＡを最大限に利用することが可能であり、高い光学分解能を得ることができる。

本技術の実施例について説明する。図３０は、実施例にかかる検証実験系４００の模式図である。同図に示すように、検証実験系４００は、顕微鏡光学系と検証光学系からなる。顕微鏡光学系は、光源４０１、レンズ４０２、ＧＩＦ（green interference filter：グリーン干渉フィルタ）４０３、レンズ４０４、リング絞り４０５及びレンズ４０６から構成されたケーラー照明系と、対物レンズ４０７及びレンズ４０８から構成された撮像系からなる。リング絞り４０５は、入射光を透過する輪帯状の光透過領域と、入射光を遮光する遮光領域を有する（図２参照）。本実施例においては、種々の径を有する遮光領域が形成されたリング絞り４０５を準備した。レンズ４０６と対物レンズ４０７の間には観察対象物Ｓが配置されている。対物レンズ４０７は拡大倍率２０倍であり、ＮＡは０．４５である。

検証光学系は、レンズ４０９、偏光子４１０、減光プレート４１１、フェーズプレート４１２及びレンズ４１３から構成されている。偏光子４１０は、入射光を偏光させる素子である。

減光プレート４１１は入射光を減光する輪帯状の減光領域と、入射光を透過する光透過領域を有する（図１４参照）。本実施例においては、ガラス又は合成石英からなる透明板にクロムを蒸着し、減光プレート４１１とした。クロムが形成された領域が減光領域であり、それ以外の領域が光透過領域である。減光領域は、光透過率が２０％のものと１０％のものを準備した。図３１は、光透過率が２０％の減光領域の光透過特性を示すグラフであり、図３２は、光透過率が１０％の減光領域の光透過特性を示すグラフである。本実施例においては、種々の径を有する減光領域が形成された減光プレート４１１を準備した。

フェーズプレート４１２は、液晶素子であり、入射光の位相をシフトさせる輪帯状の位相シフト領域と、入射光をそのまま透過する光透過領域を有する（図２３参照）。本実施例においては、種々の径を有する位相シフト領域が形成されたフェーズプレート４１２を準備した。

位置Ｚ１は開口リング像の位置であり、位置Ｚ２は通常の位相差像撮像において撮像素子(カメラ)が配置される位置である。位置Ｚ３は、本実施例において撮像素子が配置された位置である。

上記のように、リング絞り４０５、フェーズプレート４１２及び減光プレート４１１は、それぞれ径が異なる複数のものを準備した。

図３３及び図３４は、本実施例において利用したフェーズプレート４１２の写真である。同図に示すように、フェーズプレート４１２は位相シフト領域４１２ａと光透過領域４１２ｂを有する。これらの図に示すように、位相シフト領域４１２ａは種々の径を有する。

図３５は、位相シフト領域４１２ａの径を示す表である。以下、各フェーズプレート４１２に、位相シフト領域４１２ａの径が小さい順にＲｉｎｇ１〜６の番号を付する。また、以下の説明においてＲｉｎｇ１〜６の各フェーズプレート４１２と共に利用される減光プレート４１１及びリング絞り４０５もそれぞれＲｉｎｇ１〜６と表記する。

図３６は、減光プレート４１１の減光領域の径を示す表である。同図に示すように、減光領域の径は、共に利用されるフェーズプレート４１２の位相シフト領域４１２ａの径と同一である。

図３７は、フェーズプレート４１２の位相シフト領域及びリング絞り４０５の光透過領域の径を示す表である。同図に示すように、光透過領域は、リング絞り４０５に投影された位相シフト領域に収まる径を有する。即ち、リング絞り４０５の透過光はフェーズプレート４１２の位相シフト領域に入射する。

図３８及び図３９は、リング絞り４０５、フェーズプレート４１２及び減光プレート４１１の各領域の径と対物レンズＮＡの関係を示す表である。なお、「コンデンサ−ｆ」はコンデンサレンズの焦点距離であり、「ＯＬ−ｆ」は対物レンズの焦点距離である。各領域の「外径」及び「内径」は、左欄の面における径であり、「実外径」及び「実内径」は実際の径である。

Ｒｉｎｇ１−６のうち、Ｒｉｎｇ５、６は、対物レンズの瞳面における位相シフト領域の径（実内径及び実外形）のＮＡ率が０．５より大きく、即ち位相シフト領域の径が対物レンズのＮＡ／２より大きい径となるように構成されている。なお、一般的な位相差顕微鏡における各領域の径はＲｉｎｇ２と３の間である。

以上の構成を有する検証実験系４００を利用して位相差像を撮像した。

Ｒｉｎｇ２のリング絞り４０５、フェーズプレート４１２及び減光プレート４１１を検証実験系４００にセットした。減光プレート４１１は減光領域の光透過率が１０％のものを利用した。液晶素子であるフェーズプレート４１２への印可電圧を変更しながら位相差像を撮像した。上述のように液晶素子であるフェーズプレート４１２は、液晶素子への印可電圧によって位相シフト量が変動する（図２５参照）。

図４０及び図４１は各印可電圧で撮像された位相差像である。フェーズプレート４１２への印可電圧は、図４０（ａ）が２．６Ｖ、図４０（ｂ）が２．８Ｖ、図４０（ｃ）が３．０Ｖ、図４１（ａ）が３．４Ｖ、図４１（ｂ）が３．８Ｖ、図４１（ｃ）が４．２Ｖである。これらの図に示すように、印可電圧（位相シフト量）によって位相差像のコントラストが異なっている。図４０（ａ）及び図４１（ｃ）に示す位相差像はポジティブコントラストであり、図４４（ａ）に示す位相差像はネガティブコントラストである。このように、液晶素子であるフェーズプレートを利用することにより、一つのフェーズプレートを利用しながら位相差像のコントラストを調整できることがわかる。

また、Ｒｉｎｇ２及びＲｉｎｇ６のリング絞り４０５、フェーズプレート４１２及び減光プレート４１１を検証実験系４００にそれぞれセットして位相差像を撮像した。観察対象物は細胞内小胞とした。なお、フェーズプレート４１２への印可電圧は２．６Ｖ、減光プレートの光透過率は２０％とした。図４２はＲｉｎｇ６を利用して撮像された位相差像であり、図４３はＲｉｎｇ２を利用して撮像された位相差像である。

図４２と図４３を比較すると、図４２の方がコントラストは小さいが、微小なものを分解していることがわかる。即ち、フェーズプレート４１２の位相シフト領域４１２ａの径が大きい方が、対物レンズの高ＮＡ成分を位相差像に取り込むことが可能であるため、高い光学分解能を得ることができるといえる。

また、Ｒｉｎｇ２、Ｒｉｎｇ４及びＲｉｎｇ６のリング絞り４０５、フェーズプレート４１２及び減光プレート４１１を検証実験系４００にそれぞれセットして、位相差像を撮像した。観察対象物は、反射面の無いＤＶＤ（Digital Versatile Disc）−ＲＯＭの盤面とした。なお、フェーズプレート４１２への印可電圧は２．６Ｖ、減光プレートの光透過率は１０％とした。図４４はＲｉｎｇ６を利用して撮像された位相差像、図４５はＲｉｎｇ４を利用して撮像された位相差像、図４６はＲｉｎｇ２を利用して撮像された位相差像である。

また、図４７は、図４４乃至図４６に示す位相差像に周波数解析を施した結果である。この結果から、Ｒｉｎｇ６を利用して撮像した位相差像（図４４）は１３５０ｌｉｎｅ／ｍｍ（ＤＶＤのトラックピッチ）の周波数成分を多く含み、即ち、Ｒｉｎｇ６の場合のみＤＶＤのピットを検出可能であることがわかる。このことからも、フェーズプレート４１２の位相シフト領域４１２ａの径が大きい方が、対物レンズの高ＮＡ成分を位相差像に取り込むことが可能であるため、高い光学分解能を得ることができるといえる。

なお、本技術は以下のような構成もとることができる。

（１）
対物レンズと、
輪帯状であり、入射光の位相をシフトさせる位相シフト領域と、入射光を透過する第１の光透過領域とを有し、上記位相シフト領域は空間周波数の高域成分を強調するフェーズプレートと、
入射光を透過する第２の光透過領域と、入射光を遮光する第１の遮光領域とを有し、上記フェーズプレートと共役であるリング絞りと
を具備する位相差顕微鏡。

上記（２）に記載の位相差顕微鏡であって、
上記フェーズプレートは、上記瞳面における上記位相シフト領域の像が、上記対物レンズのＮＡ／２より大きい径となるように構成されている
位相差顕微鏡。

（３）
上記（１）又は（２）に記載の位相差顕微鏡であって、
上記フェーズプレートはさらに、入射光を遮光する第２の遮光領域を有し、上記第１の光透過領域は上記位相シフト領域の内周領域に設けられ、上記第２の遮光領域は上記位相シフト領域の外周領域に設けられている
位相差顕微鏡。

（４）
上記（１）から（３）のいずれか一つに記載の位相差顕微鏡であって、
上記位相シフト領域は、液晶素子である
位相差顕微鏡。

（５）
上記（１）から（４）のいずれか一つに記載の位相差顕微鏡であって、
上記位相シフト領域は、入射光を減光する
位相差顕微鏡。

（６）
上記（１）から（５）のいずれか一つに記載の位相差顕微鏡であって、
さらに、輪帯状であり、入射光を減光する減光領域と、入射光を透過する第３の光透過領域とを有し、上記対物レンズの瞳面において上記遮光領域の像が上記位相シフト領域の像に一致するように構成された減光プレート
を具備する位相差顕微鏡。

（７）
上記（１）から（６）のいずれか一つに記載の位相差顕微鏡であって、
上記位相シフト領域は、液晶素子である
位相差顕微鏡。

（８）
上記（１）から（７）のいずれか一つに記載の位相差顕微鏡であって、
上記フェースプレートは、同心円状に配設された複数の位相シフト領域を備える
位相差顕微鏡。

（９）
上記（１）から（８）のいずれか一つに記載の位相差顕微鏡であって、
上記フェーズプレートは、上記瞳面における上記位相シフト領域の像が、上記対物レンズのＮＡ／２より大きい径となるように構成されている
位相差顕微鏡。

（１０）
対物レンズと、輪帯状であり、入射光の位相をシフトさせる位相シフト領域と、入射光を透過する第１の光透過領域とを有し、上記位相シフト領域は空間周波数の高域成分を強調するフェーズプレートと、入射光を透過する第２の光透過領域と、入射光を遮光する第１の遮光領域とを有し、上記フェーズプレートと共役であるリング絞りとを備える位相差顕微鏡と、
上記位相差顕微鏡によって生成された位相差像を撮像する撮像部と、
上記位相差顕微鏡及び上記撮像部を制御し、上記撮像部に位相差像を撮像させる制御部と、
上記撮像部によって撮像された位相差像を表示する表示部と
を具備する位相差顕微鏡システム。

１００、２００、３００…位相差顕微鏡
１０１…光源
１０２…光源レンズ
１０４…リレーレンズ
１０６…リング絞り
１０７…コンデンサレンズ
１０８…ステージ
１０９…対物レンズ
１１０、２１０、３１０…フェーズプレート
１１１…結像レンズ
１１２…撮像部
１２０、２２０、３２０…制御部
１３０、２３０、３３０…表示部
１０００、２０００、３０００…位相差顕微鏡システム

Claims (9)

1. 対物レンズと、
   輪帯状であり、入射光の位相をシフトさせる位相シフト領域と、入射光を透過する第１の光透過領域とを有し、前記位相シフト領域は空間周波数の高域成分を強調するフェーズプレートと、
   入射光を透過する第２の光透過領域と、入射光を遮光する第１の遮光領域とを有し、前記フェーズプレートと共役であるリング絞りと、
   輪帯状であり、入射光を減光する減光領域と、入射光を透過する第３の光透過領域とを有し、前記対物レンズの瞳面において前記遮光領域の像が前記位相シフト領域の像に一致するように構成された減光プレートと、
   入射する＋１次回折光の低域成分と高域成分を遮光する輪帯状の第２の遮光領域と
   を具備し、
   前記フェーズプレートは前記瞳面における前記位相シフト領域の像が、前記対物レンズのＮＡ／２より大きい径となるように構成され、
   前記瞳面における前記第１の光透過領域の像は前記位相シフト領域の像の内周領域に設けられ、前記第２の遮光領域の像は前記位相シフト領域の外周領域に設けられる
   位相差顕微鏡。
2. 請求項１に記載の位相差顕微鏡であって、
   前記フェーズプレートは前記第２の遮光領域を有し、
   前記第１の光透過領域は前記位相シフト領域の内周領域に設けられ、前記第２の遮光領域は前記位相シフト領域の外周領域に設けられる
   位相差顕微鏡。
3. 請求項１に記載の位相差顕微鏡であって、さらに、
   前記第２の遮光領域を備える遮光プレート
   を具備する位相差顕微鏡。
4. 請求項１から３のいずれか１つに記載の位相差顕微鏡であって、
   前記位相シフト領域は、入射光を減光する
   位相差顕微鏡。
5. 請求項１から４のいずれか１つに記載の位相差顕微鏡であって、
   前記フェーズプレートは、同心円状に配設された複数の位相シフト領域を備える
   位相差顕微鏡。
6. 請求項１から５のいずれか１つに記載の位相差顕微鏡であって、
   前記フェーズプレートは、前記瞳面上に配置される
   位相差顕微鏡。
7. 請求項１から６のいずれか１つに記載の位相差顕微鏡であって、
   前記位相シフト領域は、液晶素子である
   位相差顕微鏡。
8. 請求項７に記載の位相差顕微鏡であって、
   前記位相シフト領域は、液晶材料層を挟む二層の透明導電層を有し、
   前記二層の透明導電層の間の電位差を変化させることにより位相シフト量が制御される
   位相差顕微鏡。
9. 対物レンズと、輪帯状であり、入射光の位相をシフトさせる位相シフト領域と、入射光を透過する第１の光透過領域とを有し、前記位相シフト領域は空間周波数の高域成分を強調するフェーズプレートと、入射光を透過する第２の光透過領域と、入射光を遮光する第１の遮光領域とを有し、前記フェーズプレートと共役であるリング絞りと、輪帯状であり、入射光を減光する減光領域と、入射光を透過する第３の光透過領域とを有し、前記対物レンズの瞳面において前記遮光領域の像が前記位相シフト領域の像に一致するように構成された減光プレートと、入射する＋１次回折光の低域成分と高域成分を遮光する輪帯状の第２の遮光領域とを備える位相差顕微鏡と、
   前記位相差顕微鏡によって生成された位相差像を撮像する撮像部と、
   前記位相差顕微鏡及び前記撮像部を制御し、前記撮像部に位相差像を撮像させる制御部と、
   前記撮像部によって撮像された位相差像を表示する表示部と
   を具備し、
   前記フェーズプレートは前記瞳面における前記位相シフト領域の像が、前記対物レンズのＮＡ／２より大きい径となるように構成され、
   前記瞳面における前記第１の光透過領域の像は前記位相シフト領域の像の内周領域に設けられ、前記第２の遮光領域の像は前記位相シフト領域の外周領域に設けられる
   位相差顕微鏡システム。