WO2019069823A1 - 撮像装置、撮像装置の作動方法及び撮像制御プログラム - Google Patents

撮像装置、撮像装置の作動方法及び撮像制御プログラム Download PDF

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室岡　孝
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    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
    • G01N21/4788—Diffraction

Definitions

  • the present invention relates to an imaging device for imaging an observation target contained in a container, an operation method of the imaging device, and an imaging control program.
  • Pluripotent stem cells such as ES (Embryonic Stem) cells and iPS (Induced Pluripotent Stem) cells have the ability to differentiate into cells of various tissues, and they can be used in regenerative medicine, drug development, disease elucidation, etc. It is noted that it can be applied in
  • pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells or cells induced to differentiate are imaged with a microscope device or the like, and the characteristics of the image are captured to evaluate the differentiation state of cells etc. There is.
  • photographing conditions are set in advance, and photographing is performed under the set photographing conditions.
  • clouding of the container that is, droplets attached to the container, changes in the amount and concentration of the culture fluid due to evaporation, etc., errors in the type of container, human error, etc. Due to various factors, the set shooting conditions may not necessarily be optimum conditions at the time of shooting.
  • Patent Document 1 the prior photographing is performed to acquire the prior captured image, and the light amount distribution of the irradiation light is set so that the incident light amount increases as the luminance decreases in the prior captured image, and the photographing is performed again (main photographing).
  • pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells are accommodated in a culture vessel such as a well plate, and are cultured in an incubator under control of environmental temperature and humidity. Then, when imaging the cultured pluripotent stem cells, the culture vessel is moved from the incubator to the microscope apparatus.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and it is an object of the present invention to provide an image pickup apparatus capable of acquiring a photographed image in which a reduction in image quality caused by droplets adhering to a container is suppressed, an operation method of the image pickup apparatus To aim.
  • An imaging apparatus is an imaging unit for imaging an observation target housed in a container, A heating unit that heats a container in which the observation target is accommodated; A pre-measurement unit that measures the brightness of light transmitted through or reflected by the container before the actual imaging by the imaging unit; When the value of brightness measured by the pre-measurement unit is smaller than a preset standard value, the droplets adhering to the container increase the temperature of the container by the heating unit, or keep the temperature of the container constant by the heating unit And a control unit that causes the imaging unit to perform main shooting after being removed.
  • the “container” is generically referred to as a container including a lid when the lid is covered.
  • main photographing means photographing performed when acquiring a photographed image desired by the user
  • pre-measurement means preliminary measurement performed before the main photographing is performed.
  • the pre-measurement unit may irradiate light to the bottom surface of the container and measure the light intensity of the reflected light reflected on the bottom surface.
  • the pre-measurement unit may be a laser displacement sensor.
  • the pre-measurement unit may measure the pixel value in the transmission image acquired by imaging the observation target contained in the container by the imaging unit.
  • control unit may determine that the droplet adhering to the container has been removed when a preset time has elapsed since heating of the container was started by the heating unit. .
  • the heating unit when heating of the container is started by the heating unit, when the heating unit is not in operation, the heating unit is operated in advance when the heating is activated. If the container is installed in the imaging apparatus, the user has determined that the user has made an input indicating the start, and the controller determines that the brightness value is smaller than the preset standard value. It is possible to adopt one of the time points taken. Note that the setting may be made changeable by the user at the start time.
  • control unit can lengthen the preset time as the value of the brightness is smaller.
  • the imaging device of the present invention includes a stage on which a container in which an observation target is accommodated is installed,
  • the container containing the observation target is stored in the incubator prior to installation on the stage,
  • the heating unit may heat the container to the temperature in the incubator.
  • the heating unit may be made of heat glass or may be made of an incubator.
  • An operation method of an imaging apparatus is an operation method of an imaging apparatus including an imaging unit, a heating unit, a pre-measurement unit, and a control unit,
  • the heating unit heats the container containing the observation target
  • the pre-measurement unit measures the brightness of light transmitted through or reflected by the container before the observation target contained in the container is captured by the imaging unit. If the control unit determines that the brightness value measured by the pre-measurement unit is smaller than a preset standard value, the droplets adhering to the container rise in temperature of the container by the heating unit, or the heating unit After being removed by maintaining the temperature constant, the imaging unit is made to perform main imaging.
  • the method of operating the imaging device according to the present invention may be provided as a program that causes a computer to execute.
  • Another imaging apparatus is an imaging unit for imaging an observation target stored in a container.
  • a heating unit that heats a container in which the observation target is accommodated;
  • An imaging apparatus comprising: a pre-measurement unit that measures the brightness of light transmitted through or reflected by a container prior to actual imaging by the imaging unit;
  • a memory for storing instructions for causing a computer to execute;
  • a processor configured to execute the stored instructions, the processor heating the droplets adhering to the container when the brightness value measured by the pre-measurement unit is smaller than a preset standard value.
  • the heating unit heats the container in which the observation target is housed, and the pre-measurement unit is the observation target housed in the container by the imaging unit.
  • the control unit determines that the value of the brightness measured by the pre-measurement unit is smaller than a preset standard value.
  • the imaging unit Since the droplets attached to the image are removed by raising the temperature of the container by the heating unit or by maintaining the temperature of the container constant by the heating unit, the imaging unit causes the imaging unit to perform photographing, so that the droplets attached to the container It is possible to acquire a photographed image in which the deterioration of the image quality caused thereby is suppressed.
  • the figure which shows schematic structure of the microscope apparatus of 1st Embodiment in the microscope observation system of this embodiment Schematic diagram showing the configuration of the imaging optical system Perspective view showing the configuration of the stage Block diagram showing the configuration of the microscope observation system of the present embodiment
  • a schematic diagram showing how droplets are attached to the culture vessel A schematic diagram showing how droplets adhere to a culture vessel with a lid
  • Flow chart showing processing of the first embodiment performed in the microscope observation system of the present embodiment Flow chart showing processing of the second embodiment performed in the microscope observation system of the present embodiment
  • FIG. 1 is a view showing a schematic configuration of a microscope apparatus 10 in the microscope observation system 1 of the first embodiment.
  • the microscope observation system 1 includes the microscope apparatus 10 and a microscope control device 20 described later, and the microscope observation system 1 corresponds to the imaging apparatus of the present invention.
  • the microscope device 10 captures a phase difference image of cultured cells to be observed.
  • the microscope device 10 includes a white light source 11 that emits white light, a condenser lens 12, a slit plate 13, an imaging optical system 14, an imaging optical system drive unit 15, and an imaging unit And 16, a detection unit 18, a stage 51, and a heating unit 19.
  • the slit plate 13 is provided with a ring-shaped slit for transmitting white light to a light shielding plate for shielding white light emitted from the white light source 11, and the white light passes through the slit to form a ring shape.
  • Illumination light L is formed.
  • FIG. 2 is a diagram showing a detailed configuration of the imaging optical system 14.
  • the imaging optical system 14 includes a phase difference lens 14 a and an imaging lens 14 d.
  • the phase difference lens 14a includes an objective lens 14b and a phase plate 14c.
  • the phase plate 14 c has a phase ring formed on a transparent plate transparent to the wavelength of the illumination light L.
  • the size of the slit of the slit plate 13 described above is in a conjugate relationship with the phase ring of the phase plate 14 c.
  • phase film for shifting the phase of the incident light by 1 ⁇ 4 wavelength and a light reducing filter for reducing the incident light are formed in a ring shape.
  • the direct light incident on the phase ring is shifted in phase by 1 ⁇ 4 wavelength and is weakened in brightness by passing through the phase ring.
  • most of the diffracted light diffracted by the object of observation passes through the transparent plate of the phase plate 14c, and its phase and brightness do not change.
  • the phase difference lens 14a having the objective lens 14b is moved in the optical axis direction of the objective lens 14b by the imaging optical system drive unit 15 shown in FIG.
  • the optical axis direction of the objective lens 14b and the Z direction are the same direction.
  • the autofocus control is performed by the movement of the phase difference lens 14 a in the Z direction, and the contrast of the phase difference image captured by the imaging unit 16 is adjusted.
  • the magnification of the phase difference lens 14a may be changed.
  • the phase difference lens 14a or the imaging optical system 14 having different magnifications may be configured to be exchangeable.
  • the replacement of the phase difference lens 14a or the imaging optical system 14 may be performed automatically or may be performed manually by the user.
  • the imaging optical system drive unit 15 includes an actuator such as a piezoelectric element, for example, and drives based on a control signal output from the control unit 22 described later.
  • the imaging optical system drive unit 15 is configured to pass the phase difference image that has passed through the phase difference lens 14a as it is. Further, the configuration of the imaging optical system drive unit 15 is not limited to the piezoelectric element, as long as the retardation lens 14a can be moved in the Z direction, and other known configurations can be used.
  • the imaging lens 14 d receives the phase difference image that has passed through the phase difference lens 14 a and the imaging optical system drive unit 15, and forms an image on the imaging unit 16.
  • the imaging unit 16 includes an imaging element that receives an image of the observation target S formed by the imaging lens 14d, captures an image of the observation target S, and outputs a phase difference image as an observation image.
  • an imaging element a CCD (charge-coupled device) image sensor, a CMOS (Complementary Metal-Oxide Semiconductor) image sensor, or the like can be used.
  • an imaging device an imaging device provided with a RGB (Red Green Blue) color filter may be used, or a monochrome imaging device may be used.
  • the detection unit 18 detects the position in the Z direction (vertical direction) of the culture container 50 installed on the stage 51.
  • the detection unit 18 includes a first displacement sensor 18a and a second displacement sensor 18b.
  • the first displacement sensor 18a and the second displacement sensor 18b are provided side by side in the X direction shown in FIG. 1 with the phase difference lens 14a interposed therebetween.
  • the first displacement sensor 18a and the second displacement sensor 18b in the present embodiment are laser displacement gauges (laser displacement sensors), and the culture vessel 50 is irradiated with laser light and the reflected light is detected to detect the culture vessel.
  • the position in the Z direction of the bottom surface of 50 is detected.
  • the detection unit 18 corresponds to the pre-measurement unit of the present invention, and the light intensity of the reflected light is measured.
  • the pre-measurement unit according to the present embodiment uses the detection unit 18, the present invention is not limited to this.
  • a laser displacement sensor may be provided in the microscope apparatus 10 separately from the detection unit 18.
  • the laser displacement sensor can also use a specular reflection optical system measuring instrument.
  • the present invention is not limited to the laser displacement sensor.
  • a confocal sensor can be used.
  • the position information representing the position of the culture vessel 50 in the Z direction detected by the detection unit 18 is output to the control unit 22, and the control unit 22 controls the imaging optical system drive unit 15 based on the input position information. Control and perform auto focus control.
  • a stage 51 is provided between the slit plate 13 and the phase difference lens 14 a and the detection unit 18. On the stage 51, a culture container 50 containing cells to be observed is installed.
  • a petri dish, a dish, a well plate in which a plurality of wells are arranged, or the like can be used as the culture vessel 50.
  • a well plate in which a plurality of wells are arranged is used as the culture vessel 50.
  • pluripotent stem cells such as iPS cells and ES cells, nerves induced to differentiate from stem cells, cells of skin, myocardium and liver, skins removed from human body, retina, There are myocardium, blood cells, nerves and cells of organs.
  • the stage 51 is moved in the X direction and the Y direction orthogonal to each other by a horizontal direction drive unit 17 (see FIG. 4) described later.
  • the X direction and the Y direction are directions orthogonal to each other on a plane parallel to the observation target installation surface P1, and the Z direction is a direction orthogonal to the X direction and the Y direction.
  • the observation target setting surface P1 is a boundary between the bottom of the culture vessel 50 and the cell to be observed (see FIGS. 5 and 6).
  • FIG. 3 shows an example of the stage 51. As shown in FIG. At the center of the stage 51, a rectangular opening 51a is formed. The culture vessel 50 is placed on a member forming the opening 51a, and a phase difference image of cells in the culture vessel 50 is configured to pass through the opening 51a.
  • the heating unit 19 heats the culture container 50 in which cells to be observed are accommodated.
  • the heating unit 19 is made of heat glass, and the heat glass covers the movable range of the stage 51 in the X direction and Y direction in which the stage 51 moves, and is installed above the stage 51.
  • heating unit 19 is in the incubator housed when cells to be observed S housed in culture container 50 are cultured, ie, the incubator in which culture container 50 is housed before being set on stage 51.
  • the temperature is set to raise the temperature of the culture vessel 50 to the temperature of In the present embodiment, for example, the temperature is set to 35 degrees.
  • the heating unit 19 is controlled by the control unit 22 to turn on and off the operation.
  • FIG. 4 is a block diagram showing the configuration of the microscope control device 20 according to the first embodiment.
  • the block diagram of the one part structure controlled by each part of the microscope control apparatus 20 is shown.
  • the microscope control device 20 includes a CPU (Central Processing Unit) 21, a primary storage unit 24, It is comprised from the computer provided with the secondary storage part 25 and external I / F (Interface) 27 grade
  • the CPU 21 includes a control unit 22 and a processing unit 23, and controls the entire microscope observation system 1.
  • the primary storage unit 24 is a volatile memory used as a work area or the like when executing various programs.
  • An example of the primary storage unit 24 is a RAM (Random Access Memory).
  • the secondary storage unit 25 is a non-volatile memory in which various programs, various parameters, and the like are stored in advance, and one embodiment of the imaging control program 26 of the present invention is installed. When the imaging control program 26 is executed by the CPU 21, the control unit 22 and the processing unit 23 function.
  • Examples of the secondary storage unit 25 include an EEPROM (Electrically Erasable Programmable Read-Only Memory), a flash memory, and the like.
  • the external I / F 27 controls transmission and reception of various information between the microscope apparatus 10 and the microscope control apparatus 20.
  • the CPU 21, the primary storage unit 24, and the secondary storage unit 25 are connected to the bus line 28.
  • the external I / F 27 is also connected to the bus line 28.
  • the imaging control program 26 is recorded on a recording medium such as a digital versatile disc (DVD) and a compact disc read only memory (CD-ROM) and distributed, and is installed in the computer from the recording medium.
  • a recording medium such as a digital versatile disc (DVD) and a compact disc read only memory (CD-ROM) and distributed, and is installed in the computer from the recording medium.
  • the imaging control program 26 is stored in a state accessible from the outside with respect to the storage device or network storage of the server computer connected to the network, and installed after being downloaded to the computer in response to an external request. It may be done.
  • the dedicated computer may be firmware that executes a program stored in a non-volatile memory, such as a built-in ROM (Read Only Memory) or a flash memory.
  • a dedicated circuit such as an application specific integrated circuit (ASIC) or field programmable gate arrays (FPGA) that permanently stores a program for executing at least a part of functions of the microscope controller 20. May be provided.
  • the program instruction stored in the dedicated circuit may be combined with the program instruction executed by the general-purpose CPU programmed to use the program of the dedicated circuit.
  • the computer hardware configuration may be combined to execute program instructions.
  • the control unit 22 controls the imaging optical system drive unit 15 based on the position information of the culture container 50 in the Z direction detected by the detection unit 18 as described above. Then, the objective lens 14 b of the imaging optical system 14 is moved in the optical axis direction by the drive of the imaging optical system drive unit 15, and autofocus control is performed. Further, the control unit 22 drives and controls the horizontal direction drive unit 17 to move the stage 51 in the X direction and the Y direction.
  • the horizontal drive unit 17 is configured of an actuator having a piezoelectric element or the like.
  • the stage 51 is moved in the X and Y directions under the control of the control unit 22, and the imaging optical system 14 is two-dimensionally scanned in the culture vessel 50, and each observation by the imaging optical system 14 is performed. Take a phase difference image of the position. That is, phase difference images for each of a plurality of imaging regions (fields of view) divided in one well are captured.
  • the control unit 22 also functions as a display control unit that causes the display device 30 to display one composite phase difference image generated by combining the phase difference images of the respective observation positions captured by the microscope device 10. .
  • the control unit 22 when the light intensity measured by the detection unit 18 is smaller than a preset standard value, the control unit 22 according to the present embodiment is configured such that the droplets attached to the culture container 50 are not heated by the heating unit 19. After the temperature is raised or removed by keeping the temperature of the culture vessel 50 constant by the heating unit 19, the imaging unit 16 is made to perform the main photographing.
  • main imaging means imaging performed when acquiring a phase difference image desired by the user.
  • FIG. 5 is a schematic view showing the droplet W adhering to the culture vessel 50
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing the droplet W adhering to the culture vessel 50 with the lid 50a.
  • the cells to be observed S contained in the culture vessel 50 are cultured in a state where the environmental temperature and the environmental humidity are controlled in an incubator (not shown). Then, when imaging an image of the cultured cells, the culture vessel 50 is moved from the incubator to the microscope apparatus 10.
  • the culture vessel 50 is irradiated with laser light by the detection unit 18 before main imaging by the imaging unit 16, and pre-measurement of measuring the light intensity of the reflected light is performed. . Then, the control unit 22 determines whether the light intensity measured by the detection unit 18 is smaller than a preset standard value, and when it is determined that the light intensity is smaller, it is assumed that the droplet W1 is attached. After the droplet W1 is removed, the imaging unit 16 causes the imaging of the phase difference image of the observation target S.
  • the standard value of the light intensity is a value obtained by measuring the light intensity of the culture vessel 50 in a state in which the droplet W1 is not attached, for example, in advance. Are stored in the secondary storage unit 25 as
  • the imaging unit 16 performs the main photographing.
  • the temperature of the culture vessel 50 does not always rise.
  • the temperature of the incubator is controlled to be constant, and also in the present embodiment, the culture vessel 50 is controlled by the heating unit 19 by the control unit 22 so as to be the same temperature as the temperature in the incubator.
  • up and down hunting of about ⁇ 0.5 ° C. may occur.
  • control unit 22 does not adhere droplet W1 to bottom surface P2 of culture vessel 50. It is determined that In the present embodiment, the heating unit 19 is operated with the power turned on in advance. Therefore, when the heating unit 19 starts heating the culture vessel 50, the control unit 22 determines that the light intensity of the reflected light is smaller than the standard value, and for example, 60 seconds from when it is determined that the light intensity is small. When it has elapsed, the control unit 22 determines that the droplet W1 has been removed. Although 60 seconds have elapsed in the present embodiment, the present invention is not limited to this, and the user can appropriately change the setting of the elapsed time.
  • control unit 22 may set the elapsed time to be longer as the light intensity of the reflected light is smaller.
  • a table in which the light intensity and the elapsed time are associated can be stored in the secondary storage unit 25.
  • the time when heating of the culture vessel 50 is started by the heating unit 19 is not limited to the above.
  • the time when the culture vessel 50 is installed on the stage 51 It may be the time when the user has made an input indicating the start by operating the input device 40 described later.
  • the time of operation may be set as the time when the above-described start is started.
  • the pre-measurement unit that is, the detection unit 18 controls the light intensity of the light reflected on the bottom surface of the culture container 50 before the imaging of the observation target S housed in the culture container 50 by the imaging unit 16 is performed.
  • the controller 22 measures the temperature rise of the culture container 50 by the droplet W1 attached to the bottom surface P2 of the culture container 50.
  • the imaging unit 16 causes the imaging unit 16 to perform main imaging after the temperature is removed by maintaining the temperature of the culture container 50 constant by the heating unit 19, imaging in which the image quality deterioration due to the droplet W1 attached to the culture container 50 is suppressed Images can be acquired.
  • the processing unit 23 performs various processing such as gamma correction, luminance / color difference conversion, and compression processing on the image signal acquired by the imaging unit 16. Further, the processing unit 23 outputs an image signal obtained by performing various processes to the control unit 22 for each frame at a specific frame rate. In addition, the processing unit 23 combines the phase difference images of the respective observation positions R captured by the microscope device 10 to generate one combined phase difference image.
  • an input device 40 and a display device 30 are connected to the microscope control device 20 by a bus line 28.
  • the display device 30 displays the composite phase difference image generated by the control unit 22 as described above, and includes, for example, a liquid crystal display or the like.
  • the display device 30 may be configured by a touch panel and used as the input device 40.
  • the input device 40 includes a mouse, a keyboard, and the like, and receives various setting inputs by the user.
  • the input device 40 receives setting inputs such as, for example, an instruction to change the magnification of the phase difference lens 14 a and an instruction to change the moving speed of the stage. It also accepts setting input such as an instruction to change the elapsed time described above. Further, an input indicating that the temperature rise of the culture vessel 50 has been started can be received by the heating unit 19.
  • FIG. 7 is a flowchart of processing performed in the microscope observation system 1 of the present embodiment.
  • the culture container 50 containing the observation target S is taken out from the incubator and installed on the stage 51, and the heating unit 19 is the culture container.
  • the temperature of the culture vessel 50 is raised by heating 50 (step S1).
  • the detection unit 18 irradiates the bottom surface P2 of the culture vessel 50 with a laser beam (step S2), and measures the light intensity of the reflected light (step S3).
  • step S4 when the controller 22 determines that the measured light intensity is smaller than the standard value (step S4; YES), the liquid adhering to the bottom surface P2 of the culture container 50 as described above by the controller 22. If it is determined that the droplet W1 has been removed, that is, if, for example, 60 seconds have elapsed since heating of the culture vessel 50 was started by the heating unit 19 (step S5; YES), the control unit 22 sends the imaging unit 16 The main photographing is performed (step S6).
  • step S5 determines that the droplet W1 attached to the bottom surface P2 of the culture vessel 50 is not removed, for example, if 60 seconds have not elapsed (step S5; NO)
  • the controller 22 The process of step S5 is repeated until it is determined that the droplet W1 has been removed, that is, until 60 seconds have elapsed.
  • step S4 when it is determined in step S4 that the light intensity measured by the control unit 22 is equal to or greater than the standard value (step S4; NO), the CPU 21 shifts the process to step S6 and the control unit 22 captures an image. The main photographing is performed by the unit 16 (step S6).
  • phase difference images at each observation position R of the captured observation target S are combined by the processing unit 23 to generate one combined phase difference image, and the generated combined phase difference image is displayed by the control unit 22 by the display device 30. Is displayed on.
  • the heating unit 19 heats the culture container 50 containing the observation target S, and the detection unit 18 receives the observation target S stored in the culture container 50 by the imaging unit 16.
  • the light intensity of the light reflected from the culture container 50 is measured, and when the light intensity measured by the detection unit 18 is smaller than the preset standard value, the culture container is measured.
  • the imaging unit 16 Since imaging is performed, it is possible to acquire a captured image in which the deterioration of the image quality caused by the droplet W1 attached to the bottom surface P2 of the culture container 50 is suppressed.
  • the microscope observation system of this embodiment is the same as the configuration of the microscope observation system 1 of the embodiment shown in FIG. 1 and described above, and only the pre-measurement unit is different. Therefore, only the pre-measurement unit will be described below, and the description of the other configurations will be omitted.
  • the pre-measurement unit measures the pixel value in the transmission image, that is, the phase difference image acquired by causing the imaging unit 16 to image the observation target S housed in the culture container 50 before the main imaging by the imaging unit 16. Perform pre-measurement.
  • the pixel value in the phase difference image acquired by the pre-measurement unit causing the imaging unit 16 to perform imaging, ie, pre-imaging, via the control unit 22 before the actual imaging is performed by the imaging unit 16 make a pre-measurement. Then, the control unit 22 determines whether the pixel value measured by the pre-measurement unit is smaller than a preset standard value, and when it is determined that the control unit 22 is smaller, the droplets W1, W2, W3 The controller 22 causes the imaging unit 16 to again capture the phase difference image of the observation target S after the droplets W1, W2, and W3 are removed. That is, the main shooting is performed.
  • the above standard value of the pixel value is acquired in advance by examining the value for which the phase difference image is suitable, for example, photographing the observation target S in a state in which the droplets W1, W2 and W3 are not attached
  • the pixel values of are measured, and the measured values are stored in the secondary storage unit 25 as standard values.
  • the user confirms in advance that there is no clouding in the culture container 50 of the same type (for example, the same maker model number) in which the culture medium of the type used in the experiment is placed, it is spatially uniform from the entire culture container 50 Measure to average.
  • the culture container 50 is a plate having six wells, three points are measured in each well, and the average value of the pixel values of a total of 18 points is stored as a standard value.
  • the sum of pixel values may be stored as a standard value.
  • FIG. 8 is a flowchart of processing performed in the microscope observation system of the present embodiment.
  • the culture container 50 containing the observation target S is taken out from the incubator and installed on the stage 51, and the heating unit 19 is the culture container.
  • the temperature of the culture vessel 50 is raised by heating 50 (step S21).
  • control unit 22 causes the imaging unit 16 to image the observation target S contained in the culture vessel 50, thereby acquiring a phase difference image (transmission image) (step S22). Then, the pre-measurement unit measures the pixel value in the phase difference image. (Step S23). In the present embodiment, specifically, the average value of pixel values is calculated as described above.
  • control unit 22 determines that the average value of the measured pixel values is smaller than the standard value (step S24; YES)
  • the control unit 22 controls the droplets W1, W2, and so on attached to the culture container 50. If it is determined that W3 has been removed, that is, if 60 seconds have elapsed since the heating unit 19 started raising the temperature of the culture vessel 50 (step S25; YES And the control unit 22 causes the imaging unit 16 to perform main shooting (step S26).
  • step S25 determines that the droplets W1, W2 and W3 attached to the culture vessel 50 are not removed, for example, if 60 seconds have not elapsed (step S25; NO).
  • step S25 determines that the droplets W1, W2, and W3 attached to the culture vessel 50 are not removed, for example, if 60 seconds have not elapsed (step S25; NO)
  • the controller 22 The process of step S25 is repeated until it is determined that the droplets W1, W2, and W3 have been removed, that is, until 60 seconds have elapsed.
  • step S24 when it is determined in step S24 that the average value of the measured pixel values is equal to or greater than the standard value (step S24; NO), the CPU 21 shifts the processing to step S26, and the control unit 22 causes the imaging unit 16 to perform main shooting (step S26).
  • phase difference images of each observation position of the captured observation target S are combined by the processing unit 23 to generate one combined phase difference image, and the generated combined phase difference image is displayed on the display device 30 by the control unit 21. Is displayed.
  • the heating unit 19 heats the culture container 50 containing the observation target S, and the imaging unit 16 performs main imaging of the observation target S stored in the culture container 50.
  • the control unit 22 causes the imaging unit 16 to pre-photograph the observation target S to obtain a phase difference image, and the pre-measurement unit measures pixel values in the obtained phase difference image and calculates the average value of the pixel values.
  • the control unit 22 calculates the droplets W1, W2, and W3 attached to the culture vessel 50 when the average value of the pixel values measured by the pre-measurement unit is smaller than the preset standard value.
  • the imaging unit 16 causes the imaging unit 16 to perform main photography after being removed by the temperature rise of the culture vessel 50 due to 19, the photographed image in which the deterioration of the image quality caused by the droplets W1, W2, W3 attached to the culture vessel 50 is suppressed It is possible .
  • the heating unit 19 is made of heat glass, but may be made of a small incubator 70 formed in a crown covering the stage 51 as shown in FIG.
  • droplet removal can be performed by reducing the humidity in the small incubator 70 or raising the temperature.
  • the small incubator 70 can be made of heat glass having a frame 71a, and the culture vessel 50 can be made of a vessel with a heat panel.
  • the stage 51 is provided with a holding portion 51b formed of a hole for holding the culture container 50 above the opening 51a, and the periphery of the bottom of the culture container 50 is covered by the edge of the holding portion 51b.
  • the container 50 is held.
  • a thermal insulation box manufactured by Tokai Hit Company may be used.
  • the autofocus control is performed.
  • the autofocus control may not be performed.
  • the present invention is applied to a phase contrast microscope, but the present invention is not limited to a phase contrast microscope, and can be applied to other microscopes such as a differential interference microscope and a bright field microscope. .
  • the container containing the observation target is heated, and the brightness of light transmitted or reflected through the container is measured before the observation target contained in the container is actually photographed, and the measured brightness value is set in advance. If it is smaller than the specified standard value, the droplet attached to the container is removed by maintaining the temperature of the container constant by the heating unit or by keeping the temperature of the container constant by the heating unit, and then the main imaging is performed. Therefore, it is possible to acquire a photographed image in which the deterioration of the image quality caused by the droplets adhering to the container is suppressed.
  • microscope observation system 10 microscope apparatus 11 white light source 12 condenser lens 13 slit plate 14 imaging optical system 14a phase difference lens 14b objective lens 14c phase plate 14d imaging lens 15 imaging optical system drive unit 16 imaging unit 17 horizontal direction drive unit 18 detection unit 19 heating unit 20 microscope control device 21 CPU 22 control unit 23 processing unit 24 primary storage unit 25 secondary storage unit 26 imaging control program 27 external I / F 28 bus line 30 display device 40 input device 50 culture vessel 50a lid 51 stage 51a opening 51b holding part 70 small incubator L illumination light C culture medium P1 observation target installation surface P2 bottom surface P3 upper surface S lower surface observation target W1 droplet W2 droplet W3 droplet

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Abstract

撮像装置、撮像装置の作動方法及び撮像制御プログラムにおいて、容器に付着した液滴に起因する画質の低下を抑制した撮影画像を取得できるようにする。加熱部が、観察対象が収容された容器を加熱し、プレ測定部が、撮像部により容器に収容された観察対象が本撮影される前に、容器を透過又は反射する光の明るさを測定し、制御部が、プレ測定部により測定された明るさの値が予め設定された標準値よりも小さい場合に、容器に付着した液滴が加熱部による容器の温度上昇、または、加熱部により容器の温度を一定に維持することにより除去された後で撮像部に本撮影させる。

Description

撮像装置、撮像装置の作動方法及び撮像制御プログラム
　本発明は、容器内に収容された観察対象を撮像する撮像装置及び撮像装置の作動方法並びに撮像制御プログラムに関するものである。
　ＥＳ（Embryonic Stem）細胞及びｉＰＳ（Induced Pluripotent Stem）細胞等の多能性幹細胞は、種々の組織の細胞に分化する能力を備えたものであり、再生医療、薬の開発、及び病気の解明等において応用が可能なものとして注目されている。
　そして、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞、又は分化誘導された細胞等を顕微鏡装置等で撮像し、その画像の特徴を捉えることで細胞の分化状態等を評価する方法が提案されている。
　一般的に、顕微鏡装置を用いて上記細胞を撮影する場合には、予め撮影条件を設定しておき、設定された撮影条件で撮影を行う。しかしながら培養された多能性幹細胞が収容された容器において、容器の曇りすなわち容器に付着した液滴、蒸発等に起因する培養液の量や濃度の変化、容器の種類の間違い、人為的ミス等の様々な要因により上記設定された撮影条件が撮影時において必ずしも最適な条件ではない場合がある。
　そこで特許文献１には、事前撮影を行って事前撮像画像を取得し、事前撮像画像において輝度が低かった部分ほど入射光量が多くなるように照射光の光量分布を設定して再度撮影（本撮影）を行うことにより、照射光に起因する画像の濃度ムラを軽減する技術が開示されている。
特開２０１３－２２８３６１号公報
　一方、一般的に、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞は、ウェルプレートなどの培養容器内に収容され、インキュベータ内において、環境温度及び環境湿度が管理された状態で培養される。そして、培養された多能性幹細胞を撮像する際に、培養容器がインキュベータから顕微鏡装置に移動される。
　しかしながら、インキュベータから顕微鏡装置に培養容器を移動させた際、インキュベータ内と外気との温度及び湿度の違いにより結露が生じ、培養容器の底面や、培養容器の蓋等に液滴が付着して培養容器に曇りが生じてしまう場合がある。培養容器に液滴が付着したままの状態で細胞の撮像を行った場合には、液滴に起因して細胞を通過した光の焦点位置がずれ、ボケた画像となってしまう問題がある。またオートフォーカス制御を行う際にも、例えばレーザ変位センサにより培養容器の底面の位置を検出する場合に、上記曇りによってレーザ変位センサの光強度が実際の値よりも低下してしまい、適切なオートフォーカスができず、やはりボケた画像となってしまう問題がある。
　本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、容器に付着した液滴に起因する画質の低下を抑制した撮影画像を取得できる撮像装置及び撮像装置の作動方法並びに撮像制御プログラムを提供することを目的とする。
　本発明の撮像装置は容器に収容された観察対象を撮像する撮像部と、
　観察対象が収容された容器を加熱する加熱部と、
　撮像部による本撮影の前に、容器を透過又は反射する光の明るさを測定するプレ測定部と、
　プレ測定部により測定した明るさの値が予め設定された標準値よりも小さい場合に、容器に付着した液滴が加熱部による容器の温度上昇、または、加熱部により容器の温度を一定に維持することにより除去された後で撮像部に本撮影させる制御部とを備える。
　なお、本発明において、「容器」は、蓋が被せられている場合には、蓋も含めて容器と総称する。
　また、本発明において「本撮影」は、ユーザが所望する撮影画像を取得する際に行われる撮影を意味し、「プレ測定」は上記本撮影が行われる前に行われる事前測定を意味する。
　また、本発明の撮像装置においては、プレ測定部が、容器の底面に対して光を照射し、底面で反射した反射光の光強度を測定してもよい。
　この場合、プレ測定部はレーザ変位センサであってもよい。
　また、本発明の撮像装置においては、プレ測定部が、撮像部により容器に収容された観察対象を撮像して取得した透過画像における画素値を測定してもよい。
　なお、本発明においては「光強度」と「画素値」が明るさに相当する。
　また、本発明の撮像装置においては、制御部が、加熱部により容器の加熱が開始されてから予め設定された時間が経過した場合に容器に付着した液滴が除去されたと判断してもよい。
　なお、本発明においては、加熱部により容器の加熱が開始された時点は、加熱部が稼働していない場合には、稼働させた時点を上記開始された時点とし、加熱部が予め稼働されている場合には、容器が撮像装置に設置された時点、ユーザによって上記開始されたことを示す入力があった時点、及び制御部により明るさの値が予め設定された標準値よりも小さいと判別された時点のうちの１つを採用することができる。なお、上記開始された時点は、ユーザによって設定変更可能としてもよい。
　また、本発明の撮像装置は、制御部が、明るさの値が小さいほど予め設定された時間を長くすることができる。
　また、本発明の撮像装置は、観察対象が収容された容器が設置されるステージを備え、
　観察対象が収容された容器が、ステージへの設置前にインキュベータ内に収容されており、
　加熱部が、容器をインキュベータ内の温度まで加熱してもよい。
　なお、本発明の撮像装置は、加熱部が、ヒートガラスで構成されていてもよいし、インキュベータで構成されていてもよい。
　本発明の撮像装置の作動方法は、撮像部と加熱部とプレ測定部と制御部とを備える撮像装置の作動方法であって、
　加熱部が、観察対象が収容された容器を加熱し、
　プレ測定部が、撮像部により容器に収容された観察対象が本撮影される前に、容器を透過又は反射する光の明るさを測定し、
　制御部が、プレ測定部により測定された明るさの値が予め設定された標準値よりも小さい場合に、容器に付着した液滴が加熱部による容器の温度上昇、または、加熱部により容器の温度を一定に維持することにより除去された後で前記撮像部に本撮影させる。
　なお、本発明による撮像装置の作動方法をコンピュータに実行させるプログラムとして提供してもよい。
　本発明による他の撮像装置は、容器に収容された観察対象を撮像する撮像部と、
　観察対象が収容された容器を加熱する加熱部と、
　撮像部による本撮影の前に、容器を透過又は反射する光の明るさを測定するプレ測定部とを備える撮像装置であって、
　コンピュータに実行させるための命令を記憶するメモリと、
　記憶された命令を実行するよう構成されたプロセッサとを備え、プロセッサは、プレ測定部により測定した明るさの値が予め設定された標準値よりも小さい場合に、容器に付着した液滴が加熱部による容器の温度上昇、または、加熱部により容器の温度を一定に維持することにより除去された後で撮像部に本撮影させる処理を実行する。
　本発明の撮像装置及び撮像装置の作動方法並びに撮像制御プログラムによれば、加熱部が、観察対象が収容された容器を加熱し、プレ測定部が、撮像部により容器に収容された観察対象が本撮影される前に、容器を透過又は反射する光の明るさを測定し、制御部が、プレ測定部により測定された明るさの値が予め設定された標準値よりも小さい場合に、容器に付着した液滴が、加熱部による容器の温度上昇、または、加熱部により容器の温度を一定に維持することにより除去された後で撮像部に本撮影させるので、容器に付着した液滴に起因する画質の低下を抑制した撮影画像を取得することができる。
本実施形態の顕微鏡観察システムにおける第１の実施形態の顕微鏡装置の概略構成を示す図 結像光学系の構成を示す模式図 ステージの構成を示す斜視図 本実施形態の顕微鏡観察システムの構成を示すブロック図 培養容器に液滴が付着している様子を示す模式図 蓋付の培養容器に液滴が付着している様子を示す模式図 本実施形態の顕微鏡観察システムにおいて行われる第１の実施形態の処理を示すフローチャート 本実施形態の顕微鏡観察システムにおいて行われる第２の実施形態の処理を示すフローチャート 本顕微鏡観察システムにおける第２の実施形態の顕微鏡装置の概略構成を示す図
　以下、本発明の撮像装置の第１の実施形態を用いた顕微鏡観察システム１について、図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、第１の実施形態の顕微鏡観察システム１における顕微鏡装置１０の概略構成を示す図である。なお本実施形態では、顕微鏡観察システム１は顕微鏡装置１０と後述する顕微鏡制御装置２０とから構成されており、顕微鏡観察システム１が本発明の撮像装置に相当する。
　顕微鏡装置１０は、観察対象である培養された細胞の位相差画像を撮像するものである。具体的には、顕微鏡装置１０は、図１に示すように、白色光を出射する白色光源１１、コンデンサレンズ１２、スリット板１３、結像光学系１４、結像光学系駆動部１５、撮像部１６、検出部１８、ステージ５１及び加熱部１９を備える。
　スリット板１３は、白色光源１１から出射された白色光を遮光する遮光板に対して白色光を透過するリング形状のスリットが設けられたものであり、白色光がスリットを通過することによってリング状の照明光Ｌが形成される。
　図２は、結像光学系１４の詳細な構成を示す図である。結像光学系１４は、図２に示すように、位相差レンズ１４ａ及び結像レンズ１４ｄを備える。位相差レンズ１４ａは、対物レンズ１４ｂ及び位相板１４ｃを備える。位相板１４ｃは、照明光Ｌの波長に対して透明な透明板に対して位相リングを形成したものである。なお、上述したスリット板１３のスリットの大きさは、位相板１４ｃの位相リングと共役な関係にある。
　位相リングは、入射された光の位相を１／４波長ずらす位相膜と、入射された光を減光する減光フィルタとがリング状に形成されたものである。位相リングに入射された直接光は、位相リングを通過することによって位相が１／４波長ずれ、かつ明るさが弱められる。一方、観察対象によって回折された回折光は大部分が位相板１４ｃの透明板を通過し、その位相及び明るさは変化しない。
　対物レンズ１４ｂを有する位相差レンズ１４ａは、図１に示す結像光学系駆動部１５によって対物レンズ１４ｂの光軸方向に移動する。なお、本実施形態においては、対物レンズ１４ｂの光軸方向とＺ方向（鉛直方向）とは同じ方向である。位相差レンズ１４ａのＺ方向への移動によってオートフォーカス制御が行われ、撮像部１６によって撮像される位相差画像のコントラストが調整される。
　また、位相差レンズ１４ａの倍率を変更可能な構成としてもよい。具体的には、異なる倍率を有する位相差レンズ１４ａ又は結像光学系１４を交換可能に構成するようにしてもよい。位相差レンズ１４ａ又は結像光学系１４の交換は、自動的に行うようにしてもよいし、ユーザが手動で行うようにしてもよい。
　結像光学系駆動部１５は、例えば圧電素子のようなアクチュエータを備え、後述する制御部２２から出力された制御信号に基づいて駆動する。なお、結像光学系駆動部１５は、位相差レンズ１４ａを通過した位相差画像をそのまま通過させる構成となっている。また、結像光学系駆動部１５の構成は圧電素子に限らず、位相差レンズ１４ａをＺ方向に移動可能なものであればよく、その他の公知な構成を用いることができる。
　結像レンズ１４ｄは、位相差レンズ１４ａ及び結像光学系駆動部１５を通過した位相差画像が入射され、これを撮像部１６に結像する。
　撮像部１６は、結像レンズ１４ｄによって結像された観察対象Ｓの像を受光し、観察対象Ｓを撮像して位相差画像を観察画像として出力する撮像素子を備える。撮像素子としては、ＣＣＤ（charge-coupled device）イメージセンサ、及びＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサ等を用いることができる。撮像素子としては、ＲＧＢ（Red Green Blue）のカラーフィルタが設けられた撮像素子を用いてもよいし、モノクロの撮像素子を用いてもよい。
　検出部１８は、ステージ５１に設置された培養容器５０のＺ方向（鉛直方向）の位置を検出する。検出部１８は、具体的には、第１の変位センサ１８ａ及び第２の変位センサ１８ｂを備える。第１の変位センサ１８ａ及び第２の変位センサ１８ｂは、位相差レンズ１４ａを挟んで、図１に示すＸ方向に並べて設けられている。本実施形態における第１の変位センサ１８ａ及び第２の変位センサ１８ｂはレーザ変位計（レーザ変位センサ）であり、培養容器５０にレーザ光を照射し、その反射光を検出することによって、培養容器５０の底面のＺ方向の位置を検出する。なお本実施形態においては検出部１８が本発明のプレ測定部に相当し、反射光の光強度が測定される。本実施形態のプレ測定部は検出部１８を使用したが、本発明はこれに限られるものではなく、例えば検出部１８とは別にレーザ変位センサを顕微鏡装置１０に設けても良い。レーザ変位センサは、正反射光学系計測器を使用することもできる。なお本発明はレーザ変位センサに限られず、例えば共焦点式センサを使用することもできる。
　検出部１８によって検出された培養容器５０のＺ方向の位置を表す位置情報は、制御部２２に出力され、制御部２２は、入力された位置情報に基づいて、結像光学系駆動部１５を制御し、オートフォーカス制御を行う。
　スリット板１３と位相差レンズ１４ａ及び検出部１８との間には、ステージ５１が設けられている。ステージ５１上には、観察対象である細胞が収容された培養容器５０が設置される。
　培養容器５０としては、シャーレ、ディッシュ又は複数のウェルが配列されたウェルプレート等を用いることができる。なお、本実施形態においては、複数のウェルが配列されたウェルプレートを培養容器５０として用いるものとする。また、培養容器５０に収容される細胞としては、ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞といった多能性幹細胞、幹細胞から分化誘導された神経、皮膚、心筋及び肝臓の細胞、並びに人体から取り出された皮膚、網膜、心筋、血球、神経及び臓器の細胞等がある。
　ステージ５１は、後述する水平方向駆動部１７（図４参照）によって互いに直交するＸ方向及びＹ方向に移動する。Ｘ方向及びＹ方向は、観察対象設置面Ｐ１に平行な面上において互いに直交する方向であり、Ｚ方向は、Ｘ方向及びＹ方向に直交する方向である。なお、観察対象設置面Ｐ１は、培養容器５０の底部と観察対象である細胞との境界面である（図５、図６参照）。
　図３は、ステージ５１の一例を示す図である。ステージ５１の中央には、矩形の開口５１ａが形成されている。開口５１ａを形成する部材の上に培養容器５０が設置され、培養容器５０内の細胞の位相差画像が開口５１ａを通過するように構成されている。
　加熱部１９は、観察対象である細胞が収容された培養容器５０を加熱するものである。本実施形態において加熱部１９は、ヒートガラスで構成されており、ヒートガラスはステージ５１が移動するＸ方向及びＹ方向においてステージ５１の移動可能範囲をカバーしてステージ５１の上方に設置される。また加熱部１９は、培養容器５０に収容された観察対象Ｓである細胞が培養される際に収容されていたインキュベータ内、すなわち培養容器５０がステージ５１への設置前に収容されていたインキュベータ内の温度まで培養容器５０の温度を上昇させるように温度設定される。本実施形態においては例えば３５度に温度設定する。そして加熱部１９は、制御部２２により稼働のオンオフが制御される。
　次に、顕微鏡装置１０を制御する顕微鏡制御装置２０の構成について説明する。図４は、第１の実施形態の顕微鏡制御装置２０の構成を示すブロック図である。なお、顕微鏡装置１０については、顕微鏡制御装置２０の各部により制御される一部の構成のブロック図を示している。
　顕微鏡制御装置２０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）２１、一次記憶部２４、
二次記憶部２５及び外部Ｉ／Ｆ（Interface）２７等を備えたコンピュータから構成される。ＣＰＵ２１は、制御部２２及び処理部２３を備え、顕微鏡観察システム１の全体を制御する。一次記憶部２４は、各種プログラムの実行時のワークエリア等として用いられる揮発性のメモリである。一次記憶部２４の一例としては、ＲＡＭ（Random Access Memory）が挙げられる。二次記憶部２５は、各種プログラム及び各種パラメータ等を予め記憶した不揮発性のメモリであり、本発明の撮像制御プログラム２６の一実施形態がインストールされている。この撮像制御プログラム２６がＣＰＵ２１によって実行されることによって制御部２２及び処理部２３が機能する。二次記憶部２５の一例としては、ＥＥＰＲＯＭ（Electrically Erasable Programmable Read-Only Memory）又はフラッシュメモリ等が挙げられる。外部Ｉ／Ｆ２７は顕微鏡装置１０と顕微鏡制御装置２０との間の各種情報の送受信を司る。ＣＰＵ２１、一次記憶部２４、及び二次記憶部２５は、バスライン２８に接続されている。また、外部Ｉ／Ｆ２７も、バスライン２８に接続されている。
　撮像制御プログラム２６は、ＤＶＤ（Digital Versatile Disc）及びＣＤ－ＲＯＭ（Compact Disc Read Only Memory）などの記録媒体に記録されて配布され、その記録媒体からコンピュータにインストールされる。又は、撮像制御プログラム２６は、ネットワークに接続されたサーバコンピュータの記憶装置もしくはネットワークストレージに対して、外部からアクセス可能な状態で記憶され、外部からの要求に応じてコンピュータにダウンロードされた後に、インストールされるようにしてもよい。
　また、上記では、汎用コンピュータが顕微鏡制御装置２０として機能する場合について説明したが、専用コンピュータによって実施されてもよい。専用コンピュータは、内蔵されたＲＯＭ(Read Only Memory)やフラッシュメモリなど、不揮発メモリに記録されたプログラムを実行するファームウェアであってもよい。さらに、この顕微鏡制御装置２０の少なくとも一部の機能を実行するためのプログラムを永久的に記憶するＡＳＩＣ（Application Specific Integrated Circuit ：特定用途向け集積回路）やＦＰＧＡ（field programmable gate arrays）などの専用回路を設けるようにしてもよい。あるいは、専用回路に記憶されたプログラム命令と、専用回路のプログラムを利用するようにプログラムされた汎用のＣＰＵによって実行されるプログラム命令と組み合わせるようにしてもよい。以上のように、コンピュータのハードウェア構成をどのように組み合わせてプログラム命令を実行してもよい。
　制御部２２は、上述したように検出部１８によって検出された培養容器５０のＺ方向の位置情報に基づいて、結像光学系駆動部１５を制御する。そして、結像光学系駆動部１５の駆動によって結像光学系１４の対物レンズ１４ｂが光軸方向に移動し、オートフォーカス制御が行われる。また制御部２２は、水平方向駆動部１７を駆動制御し、これによりステージ５１をＸ方向及びＹ方向に移動させる。水平方向駆動部１７は、圧電素子等を有するアクチュエータから構成される。
　本実施形態においては、制御部２２による制御によってステージ５１をＸ方向及びＹ方向に移動させ、結像光学系１４を培養容器５０内において２次元状に走査し、結像光学系１４による各観察位置の位相差画像を撮像する。すなわち１つのウェル内で分割された複数の撮像領域（視野）毎の位相差画像が撮像される。
　また、制御部２２は、顕微鏡装置１０によって撮像された各観察位置の位相差画像を結合することによって生成された１枚の合成位相差画像を表示装置３０に表示させる表示制御部としても機能する。
　また、本実施形態の制御部２２は、検出部１８により測定された光強度が予め設定された標準値よりも小さい場合に、培養容器５０に付着した液滴が加熱部１９による培養容器５０の温度上昇、または加熱部１９により培養容器５０の温度を一定に維持することにより除去された後で撮像部１６に本撮影を行わせる。なお、ここでいう本撮影とは、ユーザが所望する位相差画像を取得する際に行われる撮影を意味する。
　ここで培養容器５０に付着した液滴について説明する。図５は培養容器５０に液滴Ｗが付着している様子を示す模式図、図６は蓋５０ａ付の培養容器５０に液滴Ｗが付着している様子を示す模式図である。培養容器５０に収容された観察対象Ｓである細胞は、図示しないインキュベータ内において、環境温度及び環境湿度が管理された状態で培養される。そして、培養された細胞の画像を撮像する際に、培養容器５０がインキュベータから顕微鏡装置１０に移動される。
　インキュベータから培養容器５０を取り出した際に、インキュベータ内と外気との温度及び湿度の違いに起因して結露が生じ、図５に示すように液滴Ｗ１が底面Ｐ２に付着して培養容器５０に曇りが生じてしまう。また図６に示すように培養容器５０に蓋５０ａが被せられている場合には、蓋５０ａの上面Ｐ３に液滴Ｗ２が、蓋５０ａの下面Ｐ４に液滴Ｗ３がそれぞれ付着してしまう場合もある。培養容器５０の底面Ｐ２や蓋５０ａの上面Ｐ３、下面Ｐ４に液滴Ｗ１、Ｗ２，Ｗ３が付着した場合、オートフォーカス制御において、検出部１８により培養容器５０の底面Ｐ２の位置を検出する際に、特に底面Ｐ２に付着した液滴Ｗ１によって検出部１８の光強度が実際の値、すなわち液滴Ｗ１が付着していない場合よりも低下してしまい、適切なオートフォーカス制御を行うことができない。
　そこで、本実施形態の顕微鏡観察システムにおいては、撮像部１６による本撮影の前に、検出部１８により培養容器５０にレーザ光を照射し、その反射光の光強度を測定する、プレ測定を行う。そして制御部２２によって検出部１８により測定された光強度が予め設定された標準値よりも小さいか否かを判定し、小さいと判定した場合には液滴Ｗ１が付着しているとして、その液滴Ｗ１が除去された後、撮像部１６に観察対象Ｓの位相差画像の撮像を行わせる。なお光強度の上記標準値は、予め位相差画像が好適となる値を検討して、例えば液滴Ｗ１が付着していない状態の培養容器５０の光強度を測定して測定した値を標準値として二次記憶部２５に記憶しておく。
　本実施形態では、制御部２２が底面Ｐ２に付着した液滴Ｗ１が加熱部１９による培養容器５０の温度上昇、または加熱部１９により培養容器５０の温度を一定に維持することにより除去された後で撮像部１６に本撮影を行わせる。なお、培養容器５０の温度は常に上昇するのではく、例えば計測時間が長い場合等には、インキュベータ内の温度と培養容器５０の温度が同じ温度となり、培養容器５０の温度の上昇がほとんどない場合もあり得る。インキュベータの温度は通常、一定になるように制御されており、本実施形態においても培養容器５０は加熱部１９によりインキュベータ内の温度と同じ温度になるように制御部２２により制御される。ただし例えば±０．５℃程度の上り下がりのハンチングを生じる場合もある。
　そして具体的には、加熱部１９により培養容器５０の加熱が開始されてから予め設定された時間が経過した場合に、制御部２２が培養容器５０の底面Ｐ２に液滴Ｗ１が付着していないと判定する。なお本実施形態において加熱部１９は、予め電源がオンにされて稼働されている。従って、加熱部１９により培養容器５０の加熱が開始された時点は、制御部２２により反射光の光強度が標準値よりも小さいと判定された時点とし、小さいと判定された時点から例えば６０秒経過した場合に、制御部２２は液滴Ｗ１が除去されたと判断する。なお本実施形態では６０秒経過した場合としたが、本発明はこれに限られるものではなく、経過時間についてはユーザによって適宜設定変更可能とする。また制御部２２が反射光の光強度が小さいほど経過時間が長くなるように設定してもよい。光強度が小さいほど液滴Ｗ１が多く付着している可能性が高い、つまり曇り度合が大きいので、経過時間を長くすることにより液滴Ｗ１を確実に除去することができる。なおこの場合、光強度と経過時間とを対応付けたテーブルを二次記憶部２５に記憶しておくことができる。
　なお加熱部１９により培養容器５０の加熱が開始された時点は、上記に限られるものではなく、例えば加熱部１９が予め稼働されている場合には、培養容器５０がステージ５１に設置された時点であってもよいし、ユーザが後述する入力装置４０を操作することによって上記開始されたことを示す入力をした時点であってもよい。また加熱部１９が稼働していない場合には、稼働させた時点を上記開始された時点としてもよい。
　本実施形態においては、プレ測定部すなわち検出部１８が、撮像部１６により培養容器５０に収容された観察対象Ｓが本撮影される前に、培養容器５０の底面を反射する光の光強度を測定し、制御部２２が、測定された光強度が予め設定された標準値よりも小さい場合に、培養容器５０の底面Ｐ２に付着した液滴Ｗ１が加熱部１９による培養容器５０の温度上昇、または加熱部１９により培養容器５０の温度を一定に維持することにより除去された後で撮像部１６に本撮影させるので、培養容器５０に付着した液滴Ｗ１に起因する画質の低下を抑制した撮影画像を取得することができる。
　次に、図４に戻り、処理部２３は、撮像部１６によって取得された画像信号に対して、ガンマ補正、輝度・色差変換、及び圧縮処理等の各種処理を行う。また、処理部２３は、各種処理を行って得た画像信号を特定のフレームレートで１フレーム毎に制御部２２に出力する。また、処理部２３は、顕微鏡装置１０によって撮像された各観察位置Ｒの位相差画像を結合することによって、１枚の合成位相差画像を生成する。
　また顕微鏡制御装置２０には、入力装置４０と表示装置３０とがバスライン２８によって接続されている。
　表示装置３０は、上述したように制御部２２によって生成された合成位相差画像を表示するものであり、例えば液晶ディスプレイ等を備える。また、表示装置３０をタッチパネルによって構成し、入力装置４０と兼用してもよい。
　入力装置４０は、マウス及びキーボード等を備えたものであり、ユーザによる種々の設定入力を受け付ける。本実施形態の入力装置４０は、例えば位相差レンズ１４ａの倍率の変更指示及びステージの移動速度の変更指示等の設定入力を受け付ける。また上述した経過時間の変更指示等の設定入力も受け付ける。また加熱部１９により培養容器５０の温度の上昇が開始されたことを示す入力を受け付けることもできる。
　次に、本実施形態の顕微鏡観察システム１が行う処理について説明する。図７は、本実施形態の顕微鏡観察システム１において行われる処理のフローチャートである。
　まず、加熱部１９の電源がオンにされて加熱部１９が稼働した状態で、観察対象Ｓが収容された培養容器５０がインキュベータから取り出され、ステージ５１上に設置され、加熱部１９が培養容器５０を加熱して培養容器５０の温度を上昇させる（ステップＳ１）。
　次に、検出部１８が培養容器５０の底面Ｐ２にレーザ光を照射し（ステップＳ２）、その反射光の光強度を測定する（ステップＳ３）。
　次に、制御部２２が測定された光強度が標準値よりも小さいと判定した場合に（ステップＳ４；ＹＥＳ）、制御部２２が上述したようにして、培養容器５０の底面Ｐ２に付着した液滴Ｗ１が除去されたと判定した場合に、すなわち加熱部１９により培養容器５０の加熱が開始されてから例えば６０秒が経過した場合に、（ステップＳ５；ＹＥＳ）、制御部２２が撮像部１６に本撮影を行わせる（ステップＳ６）。また制御部２２が培養容器５０の底面Ｐ２に付着した液滴Ｗ１が除去されていないと判定した場合に、例えば６０秒が経過していない場合に（ステップＳ５；ＮＯ）、制御部２２が、液滴Ｗ１が除去されたと判定するまで、すなわち６０秒が経過するまでステップＳ５の処理を繰り返し行う。
　一方、ステップＳ４にて制御部２２が測定された光強度が標準値以上であると判定した場合には（ステップＳ４；ＮＯ）、ＣＰＵ２１が処理をステップＳ６へ移行して、制御部２２は撮像部１６に本撮影を行わせる（ステップＳ６）。
　以上のようにして顕微鏡観察システム１による撮像が行われる。撮像された観察対象Ｓの各観察位置Ｒの位相差画像は、処理部２３によって結合されて１枚の合成位相差画像が生成され、生成された合成位相差画像は制御部２２によって表示装置３０に表示される。
　上記実施形態の顕微鏡観察システムによれば、加熱部１９が、観察対象Ｓが収容された培養容器５０を加熱し、検出部１８が、撮像部１６により培養容器５０に収容された観察対象Ｓが本撮影される前に、培養容器５０を反射する光の光強度を測定し、制御部２２が、検出部１８により測定された光強度が予め設定された標準値よりも小さい場合に、培養容器５０の底面Ｐ２に付着した液滴Ｗ１が、加熱部１９による培養容器５０の温度上昇、または加熱部１９により培養容器５０の温度を一定に維持することにより除去された後で撮像部１６に本撮影させるので、培養容器５０の底面Ｐ２に付着した液滴Ｗ１に起因する画質の低下を抑制した撮影画像を取得することができる。
　次に本発明の撮像装置の第２の実施形態を用いた顕微鏡観察システムについて説明する。なお本実施形態の顕微鏡観察システムは図１に示して上述した実施形態の顕微鏡観察システム１の構成と同一であり、プレ測定部のみが異なる。このためプレ測定部についてのみ以下説明して、その他の構成についての説明は省略する。
　本実施形態のプレ測定部は、撮像部１６による本撮影の前に、撮像部１６に培養容器５０に収容された観察対象Ｓを撮像させて取得した透過画像つまり位相差画像における画素値を測定する、プレ測定を行う。
　培養容器５０に蓋５０ａが被されている場合、培養容器５０に液滴が付着している場合には、白色光源１１より射出され、スリット板１３を介して培養容器５０へ入射した光は、培養容器５０の蓋５０ａの上面Ｐ３に付着した液滴Ｗ２及び下面Ｐ４に付着した液滴Ｗ３の少なくとも一方の液滴によって散乱してしまう。このため、観察対象Ｓを透過する透過光の焦点位置がずれてしまい、撮像部１６による撮影により取得した位相差画像がボケた画像となってしまう。
　そこで本実施形態においては、撮像部１６による本撮影が行われる前に、プレ測定部が制御部２２を介して撮像部１６に撮影すなわちプレ撮影を行わせることにより取得した位相差画像における画素値の測定をする、プレ測定を行う。そして制御部２２によってプレ測定部により測定された画素値が予め設定された標準値よりも小さいか否かを判定し、制御部２２が小さいと判定した場合には、液滴Ｗ１，Ｗ２，Ｗ３が付着しているとして、その液滴Ｗ１，Ｗ２，Ｗ３が除去された後、制御部２２が撮像部１６に観察対象Ｓの位相差画像の撮像を再度行わせる。すなわち本撮影を行わせる。なお画素値の上記標準値は、予め位相差画像が好適となる値を検討して、例えば液滴Ｗ１，Ｗ２，Ｗ３が付着していない状態の観察対象Ｓを撮影して取得した位相差画像の画素値を測定して、測定した値を標準値として二次記憶部２５に記憶しておく。具体的には、予め、実験で使用する種類の培地を入れた同じ種類（例えば、同じメーカー型番）の培養容器５０に曇りがないことをユーザが確認後に、培養容器５０全体から空間的に均等に計測して平均する。例えば培養容器５０が６つのウェルを有するプレートの場合は、各ウェルにおいて３点計測し、合計１８点の画素値の平均値を標準値として記憶する。なお画素値の総和を標準値として記憶してもよい。
　次に本実施形態の顕微鏡観察システムが行う処理について説明する。図８は、本実施形態の顕微鏡観察システムにおいて行われる処理のフローチャートである。
　まず、加熱部１９の電源がオンにされて加熱部１９が稼働した状態で、観察対象Ｓが収容された培養容器５０がインキュベータから取り出され、ステージ５１上に設置され、加熱部１９が培養容器５０を加熱して培養容器５０の温度を上昇させる（ステップＳ２１）。
　次に、制御部２２が撮像部１６に培養容器５０に収容された観察対象Ｓを撮像させることにより位相差画像（透過画像）を取得する（ステップＳ２２）。そしてプレ測定部が位相差画像における画素値を測定する。（ステップＳ２３）。なお本実施形態においては、具体的には画素値の平均値を上述のようにして算出する。
　次に、制御部２２が測定された画素値の平均値が標準値よりも小さいと判定した場合に（ステップＳ２４；ＹＥＳ）、制御部２２が、培養容器５０に付着した液滴Ｗ１，Ｗ２，Ｗ３が除去されたか否かを判定し、除去されたと判定した場合に、すなわち加熱部１９により培養容器５０の温度の上昇が開始されてから例えば６０秒が経過した場合に、（ステップＳ２５；ＹＥＳ）、制御部２２が撮像部１６に本撮影を行わせる（ステップＳ２６）。また制御部２２が培養容器５０に付着した液滴Ｗ１，Ｗ２，Ｗ３が除去されていないと判定した場合に、例えば６０秒が経過していない場合に（ステップＳ２５；ＮＯ）、制御部２２が液滴Ｗ１，Ｗ２，Ｗ３が除去されたと判定するまで、すなわち６０秒が経過するまでステップＳ２５の処理を繰り返し行う。
　一方、ステップＳ２４にて制御部２２が測定された画素値の平均値が標準値以上であると判定した場合には（ステップＳ２４；ＮＯ）、ＣＰＵ２１が処理をステップＳ２６へ移行して、制御部２２は撮像部１６に本撮影を行わせる（ステップＳ２６）。
　以上のようにして顕微鏡観察システムによる撮像が行われる。撮像された観察対象Ｓの各観察位置の位相差画像は、処理部２３によって結合されて１枚の合成位相差画像が生成され、生成された合成位相差画像は制御部２１によって表示装置３０に表示される。
　上記実施形態の顕微鏡観察システムによれば、加熱部１９が、観察対象Ｓが収容された培養容器５０を加熱し、撮像部１６により培養容器５０に収容された観察対象Ｓが本撮影される前に、制御部２２が撮像部１６に上記観察対象Ｓをプレ撮影させることにより位相差画像を取得し、プレ測定部が、取得した位相差画像において画素値を測定して画素値の平均値を算出し、制御部２２が、プレ測定部により測定された画素値の平均値が予め設定された標準値よりも小さい場合に、培養容器５０に付着した液滴Ｗ１，Ｗ２，Ｗ３が、加熱部１９による培養容器５０の温度上昇により除去された後で撮像部１６に本撮影させるので、培養容器５０に付着した液滴Ｗ１，Ｗ２，Ｗ３に起因する画質の低下を抑制した撮影画像を取得することができる。
　上述した実施形態の顕微鏡観察システムは上記構成としたが、本発明はこれに限られるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において適宜変更可能である。
　上述した実施形態において加熱部１９はヒートガラスで構成されるものとしたが、図９に示すように、ステージ５１を覆う冠状に形成された小型インキュベータ７０で構成してもよい。この場合、小型インキュベータ７０内の湿度を下げたり、又は温度をあげたりすることによって液滴除去を行うことができる。なお、小型インキュベータ７０は、枠７１ａを有するヒートガラスで構成され、培養容器５０はヒートパネル付の容器で構成することができる。この場合、ステージ５１には開口５１ａの上側に培養容器５０を保持する穴で構成された保持部５１ｂが設けられ、この保持部５１ｂの縁に培養容器５０の底の周縁部がかかることにより培養容器５０が保持される。具体的には東海ヒット社製の保温箱を使用してもよい。
　また、上記実施形態の顕微鏡観察システムにおいては、オートフォーカス制御を行うようにしたが、オートフォーカス制御を行わない構成としてもよい。
　なお、上記実施形態は、本発明を位相差顕微鏡に適用したものであるが、本発明は、位相差顕微鏡に限らず、微分干渉顕微鏡及び明視野顕微鏡等のその他の顕微鏡に適用することができる。
　以下、本実施形態の作用効果について説明する。
　観察対象が収容された容器を加熱し、容器に収容された観察対象が本撮影される前に、容器を透過又は反射する光の明るさを測定し、測定された明るさの値が予め設定された標準値よりも小さい場合に、容器に付着した液滴が、加熱部による容器の温度上昇、または、加熱部により容器の温度を一定に維持することにより除去された後で本撮影をするので、容器に付着した液滴に起因する画質の低下を抑制した撮影画像を取得することができる。
　　　１　　　顕微鏡観察システム
　　　１０　　顕微鏡装置
　　　１１　　白色光源
　　　１２　　コンデンサレンズ
　　　１３　　スリット板
　　　１４　　結像光学系
　　　１４ａ　位相差レンズ
　　　１４ｂ　対物レンズ
　　　１４ｃ　位相板
　　　１４ｄ　結像レンズ
　　　１５　　結像光学系駆動部
　　　１６　　撮像部
　　　１７　　水平方向駆動部
　　　１８　　検出部
　　　１９　　加熱部
　　　２０　　顕微鏡制御装置
　　　２１　　ＣＰＵ
　　　２２　　制御部
　　　２３　　処理部
　　　２４　　一次記憶部
　　　２５　　二次記憶部
　　　２６　　撮像制御プログラム
　　　２７　　外部Ｉ／Ｆ
　　　２８　　バスライン
　　　３０　　表示装置
　　　４０　　入力装置
　　　５０　　培養容器
　　　５０ａ　蓋
　　　５１　　ステージ
　　　５１ａ　開口
　　　５１ｂ　保持部
　　　７０　　小型インキュベータ
　　　Ｌ　　　照明光
　　　Ｃ　　　培養液
　　　Ｐ１　　観察対象設置面
　　　Ｐ２　　底面
　　　Ｐ３　　上面
　　　Ｐ４　　下面
　　　Ｓ　　　観察対象
　　　Ｗ１　　液滴
　　　Ｗ２　　液滴
　　　Ｗ３　　液滴

Claims (11)

  1. 　容器に収容された観察対象を撮像する撮像部と、
    　前記観察対象が収容された容器を加熱する加熱部と、
    　前記撮像部による本撮影の前に、前記容器を透過又は反射する光の明るさを測定するプレ測定部と、
    　前記プレ測定部により測定した前記明るさの値が予め設定された標準値よりも小さい場合に、前記容器に付着した液滴が前記加熱部による前記容器の温度上昇、または、前記加熱部により前記容器の温度を一定に維持することにより除去された後で前記撮像部に本撮影させる制御部とを備えた撮像装置。
  2. 　前記プレ測定部が、前記容器の底面に対して光を照射し、前記底面で反射した反射光の光強度を測定する請求項１記載の撮像装置。
  3. 　前記プレ測定部が、前記撮像部により前記容器に収容された観察対象を撮像して取得した透過画像における画素値を測定する請求項１記載の撮像装置。
  4. 　前記制御部が、前記加熱部により前記容器の加熱が開始されてから予め設定された時間が経過した場合に前記容器に付着した液滴が除去されたと判断する請求項１～３いずれか１項記載の撮像装置。
  5. 　前記制御部が、前記明るさの値が小さいほど前記予め設定された時間を長くする請求項４項記載の撮像装置。
  6. 　観察対象が収容された容器が設置されるステージを備え、
    　観察対象が収容された容器が、前記ステージへの設置前にインキュベータ内に収容されており、
    　前記加熱部が、前記容器を前記インキュベータ内の温度まで加熱する請求項１～５いずれか１項記載の撮像装置。
  7. 　前記プレ測定部が、レーザ変位センサである請求項２記載の撮像装置。
  8. 　前記加熱部が、ヒートガラスで構成されている請求項１～７いずれか１項記載の撮像装置。
  9. 　前記加熱部が、インキュベータで構成されている請求項１～７いずれか１項記載の撮像装置。
  10. 　撮像部と加熱部とプレ測定部と制御部とを備える撮像装置の作動方法であって、
    　前記加熱部が、観察対象が収容された容器を加熱し、
    　前記プレ測定部が、前記撮像部により前記容器に収容された観察対象が本撮影される前に、前記容器を透過又は反射する光の明るさを測定し、
    　前記制御部が、前記プレ測定部により測定された前記明るさの値が予め設定された標準値よりも小さい場合に、前記容器に付着した液滴が前記加熱部による前記容器の温度上昇、または、前記加熱部により前記容器の温度を一定に維持することにより除去された後で前記撮像部に本撮影させる撮像装置の作動方法。
  11. 　容器に収容された観察対象を撮像する撮像部と、
    　前記観察対象が収容された容器を加熱する加熱部と、
    　前記撮像部による本撮影の前に、前記容器を透過又は反射する光の明るさを測定するプレ測定部とを備える撮像装置を撮像制御させるプログラムであって、
    　コンピュータを、
    　前記プレ測定部により測定した前記明るさの値が予め設定された標準値よりも小さい場合に、前記容器に付着した液滴が前記加熱部による前記容器の温度上昇、または、前記加熱部により前記容器の温度を一定に維持することにより除去された後で前記撮像部に本撮影させる制御手段として機能させるための撮像制御プログラム。
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