JP2013228361A - 撮像装置および撮像方法 - Google Patents

Abstract

【課題】流動体を窪部に注入してなる試料の画像を撮像する技術において、照射光に起因する画像の濃度ムラを軽減することのできる技術を提供する。
【解決手段】ウェルに流動体が注入されてなる試料に対し、例えば液晶シャッターにより光量分布を任意に設定可能な照明部から、光量分布を標準状態に設定した照明光を照射して事前撮像画像を取得し、その輝度分布を検出する。その結果、輝度が低かった部分ほど入射光量が多くなるように、ウェルに入射させる照明光の光量分布を設定して撮像を行うことで、事前撮像画像における輝度ムラをキャンセルする。
【選択図】図５

Description

この発明は、窪部に流動体を注入してなる試料を撮像する撮像装置および撮像方法に関し、特にその照明のための照射光を調整する技術に関する。

医療や生物科学の実験においては、例えばウェルとも称される窪部を多数配列して設けたプレート状の器具の各ウェルに液体やゲル状の流動体（例えば培養液、培地等）を注入し、ここで細胞等を培養したものを試料として観察、計測することが行われる。このような器具は、例えばマイクロプレート、マイクロタイタープレート等と呼ばれるものである。近年では、試料をＣＣＤカメラ等で撮像してデータ化し、該画像データに種々の画像処理を施して観察や分析に供することが行われるようになってきている。

この場合、たとえ試料に照射する照明光の光量分布を均一なものとしても、試料の表面（液面）のメニスカスによる光の屈折に起因して試料の内容物（細胞等）に入射する光量が位置により不均一となり、これに起因する明るさのムラが画像に生じることがある。このような問題に着目した従来技術として、例えば特許文献１に記載の技術においては、光の入射方向を異ならせて複数回撮像した部分画像から１つのウェルの画像を再構成することで、照明光のムラに起因する画像の濃度ムラの解消が図られている。

米国特許第７７１８１３１号明細書

上記従来技術は、単に光の入射方向を切り換えているのみであり、もともと入射光が届きにくい部分、例えば窪部の周縁部における光量不足を解消するものとはなっていない。したがって試料の内容物に入射させる光量自体を均一にするには至っていない。このような入射光量のムラは試料の内容物（細胞等）の像において輝度のムラを生じさせる。例えば画像解析によって自動的に細胞の検出や種類の判別等の分析を行う際には、画像内に含まれる細胞等の分析対象物の輝度が重要な情報として用いられるが、入射光量のムラはこのような分析の精度を低下させるものであり、上記従来技術ではこの問題に対応することができなかった。

この発明は上記課題に鑑みなされたものであり、流動体を窪部に注入してなる試料の画像を撮像する技術において、照射光に起因する画像の濃度ムラを軽減することのできる技術を提供することを目的とする。

この発明にかかる撮像装置の一の態様は、上記目的を達成するため、液体を保持可能な窪部が形成された試料保持プレートを略水平状態に保持する保持手段と、前記保持手段に保持された前記試料保持プレートの上方から、前記窪部に流動体が注入されてなる試料の表面に光を入射させる光照射手段と、前記試料を撮像して前記試料の画像を取得する撮像手段と、前記光照射手段から前記試料の表面に入射させる光の光量分布を制御する制御手段とを備え、前記制御手段は、予め前記光量分布を所定の標準状態に設定して前記撮像手段が前記試料を撮像した事前撮像画像における輝度分布に基づいて、前記試料の表面に入射させる光の光量分布を設定し、前記撮像手段は、前記制御手段により設定された光量分布での光照射下で、前記試料の画像を取得することを特徴としている。

また、この発明の他の態様は、試料保持プレートに設けられた窪部に流動体を注入してなる試料を撮像する撮像方法であって、上記目的を達成するため、略水平に保持した前記試料保持プレートの上方から前記試料の表面に向けて、光量分布が所定の標準状態である光を照射し、前記試料を撮像して事前撮像画像を取得する事前撮像工程と、前記事前撮像画像の輝度分布を検出する輝度分布検出工程と、前記検出工程での検出結果に基づき前記試料に入射させる光の光量分布を設定する光量分布設定工程と、前記光量分布設定工程で設定された光量分布での光照射下で、前記試料の画像を取得する画像取得工程とを備えることを特徴としている。

このように構成された発明では、照射光の光量分布をいったん所定の標準状態に設定した上で撮像対象である試料を実際に撮像して得た事前撮像画像での輝度分布に基づき、当該試料の画像を取得する際の光照射条件が設定される。このように、既定の光量分布で事前に撮像した画像から輝度分布を把握しておくことで、試料の内部を均一な光量分布の光で照射しながら試料の撮像を行うことができる。したがって、本発明によれば、照射光の光量ムラに起因する画像の輝度ムラを軽減して、例えば画像解析等に好適に利用可能な高品質の画像を得ることが可能である。

なお、この種の試料においては、例えば流動体の注入の仕方のばらつきやウェル壁面に対する濡れ性等に起因して、その表面の凹凸の形状は試料ごとに一定しないことがあり得るが、本発明によれば、実際の撮像対象である試料の事前撮像結果に基づき光量分布を設定するため、このような試料のばらつきにも対応することが可能である。

これらの発明においては、例えば、事前撮像画像から所定の空間周波数以上の高周波成分を除去したバックグラウンド画像における輝度が低い位置ほど入射光量が大きくなるように、照射光の光量分布を設定することができる。撮像対象となる試料には流動体中に分布する細胞等が含まれるが、照射光の光量ムラを検出するに際してはこのような細胞等の像は誤差要因となり得る。そこで、その影響を高い空間周波数成分を除去することで排除し、残ったバックグラウンド画像における輝度分布を検出することで、より高精度に光量設定を行うことが可能となる。また、バックグラウンド画像において輝度の低い位置に対してより多くの光を入射させるようにすることで、輝度ムラの少ない画像を取得することができる。

また、この発明にかかる撮像装置の他の態様は、上記目的を達成するため、液体を保持可能な窪部が形成された試料保持プレートを略水平状態に保持する保持手段と、前記保持手段に保持された前記試料保持プレートの上方から、前記窪部に流動体が注入されてなる試料の表面に向けて光を出射する光照射手段と、前記光照射手段から出射されて前記試料の表面に入射する光の光量分布を制御して、前記試料の表面を透過して前記窪部の内部に入射する光の光量分布を均一化させる制御手段と、前記制御手段により制御された光量分布での光照射下で、前記試料を撮像して前記試料の画像を取得する撮像手段とを備えることを特徴としている。

このように構成された発明では、試料の表面における入射光の光量分布を均一化させるのではなく、試料の内部に到達する光の光量分布が均一となるように、入射光の光量分布を制御する。言い換えれば、試料表面での屈折により光量分布が変化することを見越して、これを補償するような光量分布を試料表面への入射光に予め与えておく。こうすることによっても、試料の内容物に対する入射光量を均一にして、輝度ムラの少ない画像を取得することが可能である。

本発明にかかる撮像装置における光照射手段は、例えば、光源と、該光源と試料との間に配置されて光の透過量を位置ごとに設定可能な透過光量調整部とを有し、制御手段が該透過光量調整部を制御するものとすることができる。このような構成によれば、光源と試料との間に設けられた透過光量調整部によって最終的に試料に入射する光の光量分布が調整されるため、光源自体には細かく光量分布を調整する機能が要求されず、種々の発光デバイスを光源として用いることができる。また、光源自体が有する固有の光量分布が画像の品質に影響を及ぼすこともない。

この場合、透過光量調整部は、光源からの光に含まれる複数の波長成分に対して異なる透過量を設定可能であるようにしてもよい。このようにすると、試料に入射させる光のスペクトル分布を制御して、より多様な画像を取得することができる。例えば、撮像の目的に応じて照射光の波長を切り換えることができる。

これらの機能を実現する透過光量調整部としては、例えば液晶シャッターを用いることが可能である。液晶シャッターとしては微小な画素単位での透過光量の調節が可能な低価格の製品が既に広く普及しており、このような製品を応用して本発明の光量分布の設定を行うことが可能である。

また例えば、光照射手段は、複数の発光モジュールを配列してなる光源を有し、制御手段が複数の発光モジュールの発光量を個別に制御するものであってもよい。このような構成によれば、光源から出射される光の光量分布自体を変化させることができる。このような用途には、例えばＬＥＤ（Light Emitting Diode）アレイのように発光素子を多数並べたものを光源として用いることができる。

また例えば、光照射手段は、光源と、該光源からの光を反射して試料の表面に入射させるとともにその反射方向を互いに独立して変更可能な複数の反射ミラーとを備え、制御手段は複数の反射ミラーそれぞれの反射方向を制御するものであってもよい。光源からの光の反射方向を変えることによっても、試料に入射させる光の光量分布を調節することが可能である。このような用途には、例えばＤＭＤ（Digital Mirror Device）のように微小な反射ミラーを多数並べたデバイスを用いることができる。

これらの発明においては、例えば、試料保持プレートに対し相対的に走査移動するラインセンサを用いて試料の画像を取得するようにしてもよい。撮像を目的としたラインセンサとしては、本発明の用途にも好適に適用可能な高解像度のものが製品化されており、これを試料保持プレートに保持された試料に対し走査移動させることで、解像度の高い高品質の二次元画像を取得することができる。

この場合、光照射手段については、試料保持プレートに対し固定的に設けてもよく、またラインセンサの走査移動に伴ってラインセンサと一体的に試料保持プレートに対し相対移動させるようにしてもよい。いずれの構成によっても、ラインセンサによる撮像対象領域に光を照射して、十分な光量で撮像を行うことができる。光照射手段を移動させない構成としては、例えば窪部の上面全体に光を照射することのできる面光源（光拡散手段によるものも含む）を用いることができる。

また、ラインセンサとともに移動させる場合、試料保持プレートに対する光照射手段の相対移動に同期させて試料の表面に入射させる光の光量分布を変化させることで、設定された光量分布を実現することができる。このような機能を実現するための構成としては、例えばラインセンサにおける撮像素子の配列方向に沿って多数の発光素子を配列した線光源（例えばＬＥＤアレイ）を用い、各発光素子の発光量を個別に制御するようにすればよい。

さらに、この発明にかかる撮像方法においては、試料保持プレートに設けられた複数の窪部のそれぞれに保持された試料のそれぞれについて撮像を行う場合、事前撮像工程、輝度分布検出工程、光量分布設定工程および画像取得工程を各試料ごとに実行することが望ましい。試料の表面状態や光照射手段との位置関係は試料ごとに異なるから、試料ごとに個別に照射光量分布の設定を行って撮像することにより、試料のばらつきによらない高品質の画像を安定して撮像することができる。

この発明によれば、窪部に流動体が注入されてなる試料の内容物に均一な光が入射するように、試料表面での屈折を加味して予め光量分布が調節された光が照射された状態で、当該試料の画像が取得される。このため、照射光の光量ムラに起因する画像の濃度ムラを軽減して、画像解析等にも好適に利用可能な高品質の画像を得ることが可能である。

この発明にかかる撮像装置の第１実施形態の概略構成を示す図である。 マイクロプレートの構造をより詳細に示す図である。 第１実施形態の装置が採り得る２つの撮像態様を示す図である。 第１実施形態における撮像動作を示すフローチャートである。 照射光量分布の算出モデルを示す図である。 この発明にかかる撮像装置の第２実施形態の主要部を示す図である。 第２実施形態における撮像動作を示すフローチャートである。 発光プロファイルの考え方を説明する図である。 この発明にかかる撮像装置の第３実施形態の主要部を示す図である。 この発明にかかる撮像装置の第４実施形態の主要部を示す図である。 第４実施形態における透過光量調整部材の作成方法の一例を示すフローチャートである。 第４実施形態における線分の設定例を示す図である。 ウェル内画素の輝度値の算出原理を説明するための図である。 この発明にかかる撮像装置の第５・第６実施形態の主要部を示す図である。 ウェルと撮像ユニットとの間で光量分布を調整する例を示す図である。

図１はこの発明にかかる撮像装置の第１実施形態の概略構成を示す図である。この撮像装置１は、複数の、例えば９６個（１２×８のマトリクス配列）のウェルＷを形成されたサンプル（マイクロプレート）Ｍの下面周縁部に当接して該マイクロプレートＭを略水平状態に保持するホルダ１１と、該ホルダ１１の上部に設けられた照明部１２と、ホルダ１１の下部に設けられた撮像ユニット１３と、これらを司って所定の動作を実行させる制御部１０とを備えている。以下の説明のために図１に示す通りに座標軸を設定する。Ｘ−Ｙ平面は水平面であり、Ｚ軸は鉛直軸である。

マイクロプレートＭにおける各ウェルＷの直径および深さは代表的には数ｍｍ程度であり、ウェルＷそれぞれには、例えば培養液、培地、試薬などの液体等（一部のみ図示）が注入されている。なお、この撮像装置１が対象とするマイクロプレートのウェル数およびそのサイズはこれらに限定されるものではなく任意である。

照明部１２は、制御部１０に設けられた光源制御部１１２ａによって制御され、光源制御部１１２ａからの制御指令に応じてホルダ１１に保持されたマイクロプレートＭに向けて上方から光を照射する光源１２ａを備えている。光源１２ａは、ホルダ１１に保持されるマイクロプレートＭの平面サイズと同等もしくはそれより大きな平面サイズを有し、その下面から略一様な光量分布の光を出射する面光源である。光源１２ａから出射される光は可視光であり、特に白色光が好ましい。このような光源としては、蛍光によるもの、ＥＬ（Electroluminescence）によるもの、多数のＬＥＤ素子をマトリクス配列したものなどを用いることができる。

光源１２ａの下面には、例えば液晶シャッターからなる透過光量調整部１２ｂが配置されており、光源１２ａからマイクロプレートＭに向けて照射される光の光量分布を制御する。より具体的には、透過光量調整部１２ｂは、一方主面側から入射されて他方主面側へ透過する光の光路を微小なセル単位で開閉することにより、一方主面側から他方主面側への光の透過量を加減する。シャッターの開閉は制御部１０に設けられたシャッター制御部１１２ｂによりセルごとに制御される。これにより、例えば、単位面積中シャッターが開かれた面積が大きいほど、当該領域では光の透過量が多くなる。このように、位置ごとに光の透過量を制御することで、マイクロプレートＭに入射する光の光量分布を細かく制御することができる。

なお、上記のように面光源と液晶シャッターとからなる照明部１２としては、例えば既に製品化されている液晶表示パネルを用いることが可能である。すなわち、液晶表示パネルに設けられたバックライトを光源１２ａとして、また駆動回路を含む液晶部を透過光量調整部１２ｂとして機能させることができる。そして、表示パネルに図形パターンを表示させるのと同様にして、種々のパターンの透過光量分布を実現することができる。さらに、カラー表示可能な表示パネルを用いれば、ＲＧＢそれぞれの波長成分に対する透過パターンを独立して設定することが可能である。撮像素子の解像度が高く、各色画素間の色分布が目立つ場合には、上記表示パネルに適宜拡散板を組み合わせて光の散乱度を上げるようにしてもよい。また面光源としては、液晶のようなシャッタータイプだけではなく、有機ＥＬパネルのような面発光タイプのものであってもよい。

上記のように構成された照明部１２により、マイクロプレートＭに形成された複数のウェルＷに対し一括して、光量分布が制御された光Ｌが照明光として照射される。なお、ホルダ１１へのマイクロプレートＭの載置およびホルダ１１からのマイクロプレートＭの取り出しを容易とするために、ホルダ１１の上部から照明部１２を退避させることが可能な構成とすることが望ましい。このためには、照明部１２を可動アームやヒンジ（図示せず）等の可動部材によって支持することが望ましい。

撮像ユニット１３は、照明部１２から出射されてホルダ１１に保持されたマイクロプレートＭの下方に透過してくる透過光Ｌｔを受光することでマイクロプレートＭの画像を撮像するカメラとして機能するものである。撮像の解像度としては、例えば２４００ｄｐｉ（dots per inch）程度とする。撮像ユニット１３は制御部１０に設けられたカメラ駆動機構１１３に連結されており、カメラ駆動機構１１３は、ホルダ１１に保持されたマイクロプレートＭの下面に沿って撮像ユニット１３を水平面内で走査移動させる。すなわち、この実施形態では、撮像ユニット１３がマイクロプレートＭの下面に沿って走査移動可能となっている。

撮像ユニット１３により撮像された画像データは画像処理部１１４に与えられる。画像処理部１１４は、撮像ユニット１３からの画像データに対して適宜画像処理を施したり、画像データに基づく所定の演算処理を実行する。処理前後のデータは必要に応じて記憶部１１５に記憶保存される。また、検出処理部１１６は、画像処理部１１４から与えられる画像データに基づき所定の検出処理を行って、画像に含まれる特徴的な部位を検出する。この検出処理は、例えば画像の輝度データを解析することによって当該画像の中で光学的特性がその周囲領域とは異なる領域を検出する処理であり、また当該領域について特徴量を算出することにより、当該領域がどのような起源・種類のものであるかの分類が可能である。このように画像からある特徴を有する部位を識別し検出する処理や、そのような処理に好適な特徴量については種々の技術が公知であるので、ここでは詳しい説明を省略する。

検出処理部１１６による検出結果も記憶部１１５に保存される。また、画像処理部１１４は必要に応じて検出処理部１１６による検出結果に基づいた画像処理を行う。そして、適宜の画像処理が施された画像データは例えば液晶ディスプレイ等の表示手段を有する表示部１１８に与えられ、表示部１１８は与えられた画像データに対応する画像を表示してユーザに提示する。さらに、この撮像装置１は、画像処理の内容や表示の態様等についてユーザからの操作指示入力を受け付けるための入力受付部１１７を有している。入力受付部１１７は、例えばキーボード、マウス、タッチパッド等の入力受付手段またはそれらを適宜組み合わせたものであり、ユーザからの指示入力を受け付けて制御部１０がこれを装置の動作に反映させることで、ユーザが所望する機能を実現する。

この撮像装置１は、各ウェルＷに保持された流動体（本明細書では、液体、ゲル状のまたは半流動性を有する固体、および、例えば軟寒天のように流動性を有する状態でウェルに注入されその後固化するものの総称である）およびその中に含まれる細胞等の撮像対象物の光学像を撮像したり、その光学像から所定の光学的特徴を有する、より具体的にはウェルＷに保持された液体等とは異なる光学的特性を有する特異な部分をその光学的特性の差異を利用して検出するという用途に適用することができる。例えば、培養液や培地中の細胞や細胞集塊（スフェロイド）を撮像対象物として撮像したり、さらに画像処理によりそのような細胞等を自動的に検出する目的に好適に使用することができる。

図２はマイクロプレートの構造をより詳細に示す図である。図２（ａ）に示すように、マイクロプレートＭは、略円筒状（より厳密には、底面に向けて断面積が漸減するテーパー付き）の側面形状を有する貫通孔Ｍ１が一定のピッチで規則的に二次元マトリクス配置された上部プレートＭ２と、上部プレートＭ２の下面に各貫通孔Ｍ１を塞ぐように貼付された下面シートＭ３とを有している。

下面シートＭ３は上部プレートＭ２の下面にぴったりと密着されており、上部プレートＭ２の貫通孔Ｍ１の側面と、下面シートＭ３とによって囲まれた空間に液体を保持することが可能となっている。すなわち、この空間が流動体を保持するウェルＷとして機能し、貫通孔Ｍ１の側面がウェルＷの側壁面を、また下面シートＭ３がウェルＷの底面をそれぞれなしている。下面シートＭ３は透明な樹脂、例えばＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）樹脂により形成されたシート体である。

上記のように構成されたマイクロプレートＭのウェルＷに流動体（例えば液体）が注入された状態で、上方から光が入射された場合を考える。このとき、図２（ｂ）に示すように、注入された流動体の表面（液面）Ｓがメニスカスを形成している。この状態で上方からウェルＷに均一な面内分布を有する光Ｌが入射されると、液面Ｓがほぼ水平なウェルＷの中心付近では入射光Ｌがほぼ直進して流動体内に入射する。これに対して、ウェルＷの側壁面に近い液面に入射した光は、液面での屈折により進行方向が曲げられる。これに起因して、ウェル底面のうち側壁面に近い周縁部Ｐでは照明光が届きにくく、図２（ｂ）の下部に示すように、中央付近に比べて入射する光量が小さくなる傾向にある。

このような入射光量の分布は、例えばウェル底面で培養された細胞等のオブジェクトに入射する照明光の光量が位置ごとに異なることを意味する。このため、同じオブジェクトの像であってもウェルＷ内での位置によってその輝度が異なることになる。このことは、撮像されたオブジェクトの輝度を有意な情報として該オブジェクトを分析する処理において誤差の原因となり得る。

そこで、この実施形態では、前記したように照射光量分布を制御可能な照明部１２を設けている。そして、後述する撮像動作においては、撮像対象である試料を予め撮像した事前撮像画像における輝度分布に基づいて、ウェル底面に均一な光が入射するように撮像時の照明光の光量分布を設定し、該照明条件下で撮像を行う。

なお、ウェルＷに注入された流動体の表面状態は、流動体の粘度、ウェル壁面に対する濡れ性、注入時の作業ばらつき等により試料ごとに異なる。これに起因して、ウェル底面における入射光量の分布も試料ごとに異なったものとなり得る。本実施形態の技術思想はこのように試料ごとに異なる液面の状態に対応することが可能なものであるが、ここでは理解を容易にするために、図２（ｂ）に示すように液面が下に凸のメニスカスを形成しているものとする。

図３は本実施形態の装置が採り得る２つの撮像態様を示す図である。ここでは１つのウェルＷについて撮像を行う場合の例を挙げるが、複数のウェルについて一括して撮像を行う場合でも考え方は同じである。図３（ａ）に示す第１の態様では、撮像対象であるウェルＷの上方から、照明部１２からの略均一な照明光Ｌが入射する。ウェルＷの下方には結像光学系１３１と、多数の微細な受光素子を二次元配列した二次元撮像素子１３２が順に配置されている。これらは撮像ユニット１３を構成するものであるが、図３（ａ）では、当該構成の撮像ユニットを他と区別するため符号１３ａを付している。二次元撮像素子１３２としては、ＣＣＤセンサおよびＣＭＯＳセンサなどを用いることができる。なお、ここでは結像光学系１３１を単一のレンズにより示しているが、複数のレンズからなるものであってもよい。

ウェルＷの底面からの透過光は結像光学系１３１により、その下方に配置された二次元撮像素子１３２の受光面に収束される。これにより、二次元撮像素子１３２の受光面にはウェル底面およびその近傍に分布するオブジェクト（細胞等）の像が結像し、二次元撮像素子１３２により、ウェルの画像が取得される。この態様は、二次元パターンの照明部と二次元パターンの撮像素子との組み合わせであると言える。

一方、図３（ｂ）に示す第２の態様の撮像ユニット１３ｂでは、結像光学系１３１の下方に、多数の微細な受光素子を一次元配列した一次元撮像素子（ラインセンサ）１３３が配置される。そして、一次元撮像素子１３３がその長手方向（受光素子配列方向）に直交する方向Ｄｓに走査移動しながら撮像を行うことで、上記第１の態様と同様に、ウェルＷの二次元画像が取得される。この態様は、二次元パターンの照明部と一次元パターンの撮像素子との組み合わせである。撮像ユニット１３が上記したいずれの態様の構成を有するものであっても、以下に説明する撮像動作を適用することが可能であり、それにより得られる作用効果は基本的に同じである。

図４は第１実施形態における撮像動作を示すフローチャートである。ウェルＷに試料を保持するマイクロプレートＭがオペレータによってホルダ１１にセットされた後、制御部１０が装置各部を制御して図４の動作を実行することにより、試料を含むウェルＷの画像が取得される。まず、透過光量調整部１２ｂの液晶シャッターを全開状態、すなわち面内全ての位置で光源１２ａからの光を通過させる状態に設定する（ステップＳ１０１）。これにより、ウェルＷに保持された試料の表面には、光源１２ａから出射される略一様な光がそのまま入射する。このときの光量分布を、後の動作の基準となる標準状態とする。

この状態で、撮像ユニット１３による撮像動作（プリスキャン動作）を実行する（ステップＳ１０２）。以下では、このときに得られた画像を「事前撮像画像」と称する。事前撮像画像では、試料表面での照明光の屈折に起因する輝度のムラが生じており、このままで各種の分析に供するには必ずしも適さないものである。この実施形態では、後の本スキャン動作における照明条件を最適化するためのサンプルとして事前撮像画像を利用する。

続いて、事前撮像画像に対し画像の平滑化を行う（ステップＳ１０３）。すなわち、画像に含まれる比較的高い空間周波数成分を適宜のフィルタ処理等によって除去する。事前撮像画像には試料内の細胞等の像が含まれるが、この時点で必要なのは照明光に起因する輝度の分布に関する情報であり、細胞等に関する情報は不要である。想定される細胞等のサイズに対応した平滑化を行うことにより、画像から細胞等の像を除去したバックグラウンド画像が得られる。

こうして得られたバックグラウンド画像における輝度を画素ごとに求めて、該画像における輝度分布を検出する（ステップＳ１０４）。ここで検出された輝度分布は、ウェル底面への入射光量の分布を示すものである。次に、実際の撮像において均一な入射光量分布が得られるように、こうして検出された輝度分布をキャンセルするような照射光量の分布を算出する（ステップＳ１０５）。

図５は照射光量分布の算出モデルを示す図である。試料表面が図２（ｂ）に示すように下に凸のメニスカスを有するとき、ウェルの中央部で輝度が高く、周縁部で低くなる輝度分布が得られると想定される。これはウェル底面への入射光量を反映したものである。このとき、光源１２ａから出射される光自体は面内において略一様である。したがって、図５（ａ）に一点鎖線で示すように、輝度の高い部分に対応する試料表面への入射光量を予め低く抑えるようにすれば、ウェル底面における光量分布をより均一な状態に近付けることが可能である。このような光量分布の調整は、透過光量調整部１２ｂにおける透過パターンを制御することにより実現可能である。

上記のような照射光量分布の調整を行うことで、光源１２ａからの出射光自体に多少の光量分布（シェーディング）があったとしても、これをキャンセルすることができる。同様に、試料表面の凹凸に起因する輝度のムラについても併せてキャンセルすることが可能である。

なお、上記原理によれば光量分布は均一に近づくが、全体としての光量は低下して画像が暗くなる。均一な明るさが確保できていれば、画像全体が暗くなること自体はあまり問題とはならないと考えられる。また細胞種によっては強い光の刺激によって細胞自体の状態が変化してしまう場合がある。したがって、このように明るい部分の入射光量を低下させるという調整方法で、実用的には十分であると考えられる。一方、より明るさを必要とする用途に対しては、図５（ａ）に二点鎖線で示すように、光源１２ａからの発光量を増大させるための措置を必要に応じて実行するようにしてもよい。

図５（ｂ）は照明光の光路上の各位置における光量分布を模式的に示している。光源１２ａから出射される光Ｌ1の光量は、右上の吹き出しボックス内に示したように一様（実線）または何らかの分布（破線）を有するものである。一方、事前撮像画像から設定された透過光量調整部１２ｂにおける光の透過率は、左上の吹き出しボックス内に示したように、事前撮像画像における輝度分布を反転させたような分布となる。

その結果、透過光量調整部１２ｂを通過した光Ｌ2の光量分布は、右中段の吹き出しボックス内に示したように、事前撮像画像において低輝度であった領域ほど光量が大きくなる。このような光Ｌ2がウェルＷ内の試料に入射すると、ウェル底面に入射する光Ｌ3の光量は、右下の吹き出しボックス内に示すように、位置によらずほぼ一様なものとなる。

このように、事前撮像画像における輝度分布に基づいて透過光量調整部１２ｂを制御し、ウェルＷに入射する照明光の光量分布を調節することによって、ウェル底面に入射する光の光量分布を適切に設定することが可能である。すなわち、ウェル底面において光量分布が一様となるための試料表面における光量分布を算出し、それを実現するための透過光量調整部１２ｂの透過パターンを求めればよい。

図４に戻って撮像動作の説明を続ける。上記原理に基づき透過光量調整部１２ｂの液晶シャッターの各セルを制御することにより、ウェル底面に入射する光の光量分布を均一化する（ステップＳ１０６）。そして、この状態で撮像ユニット１３による撮像（本スキャン動作）を実行することで、細胞等のオブジェクトを含むウェルＷの画像を取得することができる（ステップＳ１０７）。

このように構成された撮像動作では、ウェル底面に分布するオブジェクトに略均一な光が照射された状態で撮像を行うことにより、試料表面での照明光の屈折に起因して生じる輝度ムラのない画像を取得することができる。こうして取得された画像を各種の分析に供するための出力画像とすることにより、この実施形態では、照明光に起因する輝度ムラの少ない品質の良好な画像をユーザに提供することが可能である。

なお、複数のウェルＷについて撮像を行うに際しては、各ウェルごとに照射光量分布の設定を行うことが望ましい。この場合、１つのウェルを選択して図４に示す一連の処理を実行し、それが完了してから対象とするウェルを新たに選択して上記処理を繰り返すようにしてもよい。あるいは、複数のウェルを撮像視野に収めて一括してプリスキャン動作を行い、それぞれのウェルについてバックグラウンド画像の輝度分布を求めて照射光量分布を設定した上で本スキャン動作を行うようにしてもよい。

次に、この発明にかかる撮像装置の第２実施形態について説明する。上記した第１実施形態の撮像装置１は、マイクロプレートＭの上方に配置した照明部１２は略一様な光量分布を有する面光源１２ａを備えたものである。これに対して、次に説明する第２実施形態の撮像装置では、発光素子を１列に並べてなる線光源を有し、これをウェルＷに対して走査移動させることで、ウェルＷ全体に照明光を入射させるものである。この点を除く装置構成および各部の基本的な動作は第１実施形態と同一であるため、以下では同一構成には同一符号を付して説明を省略する。

図６はこの発明にかかる撮像装置の第２実施形態の主要部を示す図である。図６（ａ）に示すように、この実施形態では、ホルダ１１に保持されるマイクロプレートＭの上方に、マイクロプレートＭの上面に向けて光Ｌ21を出射する棒状の照明部２２が設けられている。また、撮像ユニット１３は、図３（ｂ）に示した一次元撮像素子１３３を有するものであり、照明部２２の長手方向は、一次元撮像素子１３３における受光素子の配列方向と平行となっている。つまり、この態様は、一次元パターンの照明部と一次元パターンの撮像素子との組み合わせである。

照明部２２は、マイクロプレートＭに対する一次元撮像素子１３３の走査移動と同期して、一次元撮像素子１３３と一体的にマイクロプレートＭに対して方向Ｄｓに走査移動する。すなわち、この実施形態では、ウェルＷのうち一次元撮像素子１３３と対向する部分の撮像を行いつつ、ウェルＷに対する一次元撮像素子１３３の相対位置が刻々と変化することにより二次元画像が取得され、照明部２２からの照明光は、各時刻において一次元撮像素子１３３が撮像する部分に集中的に照射される。

照明部２２としては、図６（ｂ）に示すように、微小な発光素子（例えばＬＥＤ）２２１を棒状のベース部材２２２の長手方向に多数並べた、例えばＬＥＤアレイ、バーＬＥＤ等と称されるものを用いることができる。各発光素子２２１は、光源制御部１２２により個別に点灯制御される。言い換えれば、光源制御部１２２は、各発光素子２２１の点灯タイミングや発光量を個別に制御することができる。

なお、照明部２２に設けられた多数の発光素子２２１については、その１つ１つが完全に独立して点灯制御されることを必要とするものではない。すなわち、隣接するいくつかの発光素子を１つのグループとして、グループ単位で点灯制御を行うようにしてもよい。また、点灯制御の態様としては点灯のオン・オフまたは発光量を調節することができ、制御対象としては点灯および消灯のタイミング、印加電圧、間欠点灯における点灯デューティなどを用いることができる。

このように構成された照明部２２では、列状に配置された発光素子２２１のそれぞれを個別に点灯制御することにより、発光素子２２１の配列方向における光量分布を任意に設定することができる。また、各発光素子２２１の点灯の態様を、照明部２２の走査移動に同期させて変化させることで、発光素子２２１の配列方向と直交する走査移動方向Ｄｓにおける光量分布を任意に変化させることができる。このように、１つの発光素子２２１における発光量の時間的変化と、複数の発光素子２２１間で発光量を相違させることとの組み合わせにより、この実施形態においても、ウェルＷに入射する光量（より厳密にはその積分値）の二次元的分布を任意に設定することが可能である。

また、照明部２２としては、図６（ｃ）に示すように、個別に点灯制御される多数の発光素子２２３と、マイクロプレートＭの上方に配置され、一次元撮像素子１３３における受光素子の配列方向と同方向に列状に配列されてマイクロプレートＭの上面に向けて光を出射する多数の投光部材２２４と、これらの間を光学的に１対１に接続する例えば光ファイバーからなる導光部材２２５とを備えるものであってもよい。このような構成によっても、上記と同様の作用効果を得られる。

図７は第２実施形態における撮像動作を示すフローチャートである。この実施形態の撮像動作では、まず照明部２２および一次元撮像素子１３３を所定の初期位置（撮像する領域の一方端）に位置決めする（ステップＳ２０１）。そして、標準状態として、各発光素子２２１の発光量を同一値に設定する（ステップＳ２０２）。具体的には、各発光素子２２１に印加する駆動電圧を同一値とする。同一電圧を印加しても発光素子２２１ごとに発光量がばらつくことが考えられるが、第１実施形態における光源１２ａの光量分布と同様、これをキャンセルすることが可能であるので、ここではその差は無視するものとする。

続いて、第１実施形態と同様に、プリスキャン動作による事前撮像画像の取得（ステップＳ２０３）、事前撮像画像の平滑化（ステップＳ２０４）、平滑後のバックグラウンド画像の輝度分布の検出（ステップＳ２０５）およびこれをキャンセルするための照射光量分布の算出（ステップＳ２０６）を順番に行う。こうして得られた照射光量分布に基づき、発光素子２２１の点灯の態様を規定する発光プロファイルを、各発光素子２２１ごとに（または発光素子のグループごとに）設定する（ステップＳ２０７）。

図８は発光プロファイルの考え方を説明する図である。図８上段に示すように、照明部２２を走査移動方向Ｄｓに走査移動させることによりウェルＷの上方を通過させて、事前撮像画像が撮像される。同図中段は事前撮像画像から得られた輝度分布の例を示し、実線はウェルＷの中央付近の上方を通過する発光素子２２１ａの軌跡の直下位置における輝度分布を、また破線はウェルＷの周縁付近の上方を通過する発光素子２２１ｂの軌跡の直下位置における輝度分布を、それぞれ示している。

図８下段はこのような輝度分布をキャンセルするために必要な本スキャン動作における各発光素子の発光量と、走査移動方向Ｄｓにおける発光素子の位置（スキャン位置）との関係（発光プロファイル）を示している。実線はウェルＷの中央付近の上方を通過する発光素子２２１ａについての発光プロファイルを、また破線はウェルＷの周縁付近の上方を通過する発光素子２２１ｂについての発光プロファイルをそれぞれ示している。

各発光素子２２１を一定の発光量で発光させることを基本としつつ、事前撮像画像において輝度の上昇が見られた位置では該当する発光素子の発光量を低下させることにより、結果としてウェル底面に入射する照明光の光量分布が略一様となるようにすることができる。このように、照明部２２に設けられた各発光素子２２１ごとに（または発光素子のグループごとに）、事前撮像画像の輝度分布に基づき発光プロファイルを作成することができる。

図７に戻ってこの実施形態の撮像動作の説明を続ける。こうして発光素子ごとの発光プロファイルが作成されると、この発光プロファイルに基づいて各発光素子２２１を点灯制御して発光量を調節しながら、一次元撮像素子１３３による本スキャン動作を実行してウェルＷの画像を取得する（ステップＳ２０８）。このとき、各発光素子２２１の発光量が一次元撮像素子１３３の走査移動に同期してリアルタイムに調節されることにより、ウェル底面に入射する光量が一定した状態で撮像を行うことができる。そのため、第１実施形態と同様に、試料表面での照明光の屈折に起因して生じる輝度ムラのない画像を取得することが可能である。

図９はこの発明にかかる撮像装置の第３実施形態の主要部を示す図である。この実施形態は照明部３２の構成に特徴を有しており、その他の部分については上記した第１実施形態または第２実施形態の構成を適用することができる。したがって、ここでは本実施形態の特徴部分について主に説明する。

この実施形態の照明部３２は、光を出射する光源３２１と、ウェルＷの上方に配置されて、光源３２１から出射された光Ｌ31を反射させてウェルＷに入射させる反射ミラー部３２２とを備えている。反射ミラー部３２２は、互いに独立して角度を調整可能な微小な反射ミラー３２３を多数配列したものである。複数の反射ミラー３２３のそれぞれは、制御部１０に設けられたミラー制御部３３２により角度制御される。このような反射ミラー部３２２としては、例えば表示装置に用いられるＤＭＤ（Digital Mirror Device）を使用することができる。また、光源３２１および反射ミラー部３２２としては、第１実施形態のような二次元（面光源）タイプのもの、第２実施形態のような一次元（線光源）タイプのもののいずれも使用可能である。一次元タイプでは、第２実施形態と同様に、少なくとも反射ミラー部３２２の撮像素子の走査移動に同期した走査移動が必要となる。

このような構成では、光源３２１から入射される光の反射方向を反射ミラー部３２２によって位置ごとに変化させることで、ウェルＷに入射する光Ｌ32の光量分布を制御し、ウェル底面における入射光量の均一化を図ることが可能である。

図１０はこの発明にかかる撮像装置の第４実施形態の主要部を示す図である。上記各実施形態では、本スキャン動作に先立ってプリスキャン動作を行うことで事前撮像画像を取得し、その輝度分布から照射光量分布を設定している。これに対して、第４実施形態の装置では、照明光の光量分布を、予め試料表面での屈折に起因する照射光量ムラを想定したものとして設定しておくことで、個々の撮像におけるプリスキャン動作を省略している。このような態様は、例えばウェルＷに注入される流動体の粘度が低く、またその注入が自動化されているなど、試料の表面状態のばらつきが小さい場合に適している。

図１０（ａ）に示すように、この実施形態の照明部４２では、ウェルＷの上方に、二次元的に略一様な光量分布を有する面光源４２ａが配置される。そして、面光源４２ａとウェルＷとの間に、図１０（ｂ）に示すような濃淡パターンが形成された透過光量調整部材４２ｂが配置される。透過光量調整部材４２ｂは、光透過性を有するシート状または平板状の部材であり、図１０（ｂ）に示すように、ウェルＷの中心に対応する部分で色が濃く、これから離れるほど色が薄くなっている。

そのため、透過光量調整部材４２ｂがウェルＷ上方に配置されたとき、面光源４２ａから出射される光Ｌ41は略一様な光量分布を有する一方、透過光量調整部材４２ｂを通過してウェルＷに入射する光Ｌ42では、ウェルＷの中央部で光量が少なく、周縁部ほど光量が多くなるような光量分布が与えられる。これにより、中央部に比べて入射光が届きにくい周縁部における入射光量を増大させ、ウェル底面における光量を均一なものに近付けることができる。このとき、透過光量調整部材４２ｂの濃淡パターンの中心をウェルＷの中心と一致させやすい構成となっていることが望ましい。例えば、透過光量調整部材４２ｂとマイクロプレートＭとに位置合わせ用のマークを予め設けてもよい。また例えば、マイクロプレートＭに係合してウェルＷ上部を覆う蓋として透過光量調整部材４２ｂを形成することで、係合により自動的に位置合わせが行われるような構造としてもよい。

図１１は第４実施形態における透過光量調整部材の作成方法の一例を示すフローチャートである。最初に、ウェル内における照明光の光量分布を取得するための較正用試料を準備する（ステップＳ３０１）。この較正用試料は、撮像動作の対象物たる試料そのものであってもよく、また該試料と同種類、同量の流動体を別のウェルに注入することにより別途作成されたものであってもよい。こうして用意された較正用試料を用いて第１実施形態と同様に撮像を行い、事前撮像画像を取得する（ステップＳ３０２）。

続いて、こうして得られた事前撮像画像に対して、ウェルＷを横切るような複数本の線分を設定し（ステップＳ３０３）、事前撮像画像中のウェルＷに対応するウェル領域のうち、設定された各線分上に位置する各画素の輝度値を画像データから算出する（ステップＳ３０４）。

図１２は線分の設定例を示す図である。図１２（ａ）に示すように、ここでは１つのウェルＷの画像に対して４本の線分Ａ−Ａ’、Ｂ−Ｂ’、Ｃ−Ｃ’、Ｄ−Ｄ’を設定する。各線分は、ウェルＷの中心近傍で互いに交わるように等角度間隔で設定される。したがってこの例では、隣接する線分がなす角度は４５度となる。

１つの線分（例えば線分Ａ−Ａ’）上における各画素の輝度値のデータ列から求まる輝度プロファイルの一例を示すのが図１２（ｂ）である。ウェルＷの底面に達する照明光の光量がその中央部分で高く周縁部で低いことに対応して、同図に示すように、ウェルＷに対応するウェル領域ＷＲの中央部分では各画素の輝度が比較的高い一方、ウェル領域ＷＲの周縁部分では各画素の輝度が比較的低い。

図１２（ｂ）に示される輝度プロファイルには細かい変動やスパイク状のノイズが含まれるが、前述した通り、照明光に起因する輝度の変化はより緩やかなものであると考えられる。そこで、得られた輝度プロファイルを平滑化処理する（ステップＳ３０５）。平滑化処理としては、例えば隣接データ間での移動平均処理や、波形の上側包絡線を抽出する処理などを用いることができる。

次に、こうして各線分上で求められた輝度プロファイルから、ウェルＷ全体の輝度分布を算出する（ステップＳ３０６）。ここでは各線分上での輝度プロファイルからの内挿計算によってウェル内各画素の輝度値を算出する方法を説明するが、第１実施形態と同様の方法によって輝度分布を求めることももちろん可能である。また、本実施形態の輝度分布算出方法を第１実施形態等に適用することも可能である。

図１３はウェル内画素の輝度値の算出原理を説明するための図である。この方法では、ウェルＷ内の任意の１点Ｑにおける輝度値を、既知の輝度プロファイルから内挿により算出する。まず、ウェルＷの中心Ｏを原点とするＸＹ平面を設定する。図１３の例では、互いに直交する線分Ａ−Ａ’および線分Ｂ−Ｂ’がそれぞれＸ軸およびＹ軸と一致するように座標軸が設定されている（より正確には、座標軸と一致するようにこれらの線分が予め設定される）。

そして、先に設定した線分のうち、輝度値を算出する点Ｑを挟む２つを特定する。この特定に際しては、原点Ｏと点Ｑとを結ぶ線分ＯＱの回転角と、先に設定された各線分Ａ−Ａ’等の回転角とを用いることができる。具体的には、１つの軸、例えばＸ軸からの、原点Ｏを中心とした線分ＯＱの回転角をθとしたとき、線分Ａ−Ａ’、Ｂ−Ｂ’、Ｃ−Ｃ’、Ｄ−Ｄ’のうち、原点Ｏを中心としたＸ軸からの回転角の値が角度θに最も近い線分およびそれに次いで近い線分が、点Ｑを挟む線分として特定される。図１３の例では線分Ｂ−Ｂ’と線分Ｄ−Ｄ’とがこれに該当する。線分Ｂ−Ｂ’、Ｄ−Ｄ’それぞれの原点Ｏを中心とするＸ軸からの回転角をそれぞれ符号α、βにより表す。なお、点Ｑがいずれかの線分上の点であるケースは除外してよい。当該点Ｑの輝度値は上記した輝度プロファイル導出時に既に求められているからである。

次に、点Ｑを挟む線分Ｂ−Ｂ’、Ｄ−Ｄ’上の点でいずれも原点Ｏからの距離が点Ｑと同じである点Ｒ、Ｓをそれぞれ特定する。これらの点Ｒ、Ｓにおける輝度値は既に求められており、その値をそれぞれＬｒ、Ｌｓとする。照明光源およびメニスカスの影響によるウェルＷ内での光量変化は緩やかなものであるから、原点Ｏを中心とし点Ｑ、Ｒ、Ｓを通る円弧上において輝度値が連続的かつ緩やかに変化するものと考えることができる。例えば、当該円弧上における輝度値が原点Ｏを中心とする動径の回転角に比例するものと考えれば、線分Ｂ−Ｂ’上の点Ｒにおける輝度値Ｌｒ、線分Ｄ−Ｄ’上の点Ｓにおける輝度値Ｌｓと、線分ＯＱも含めた各線分の回転角α、β、θの値とから、点Ｑにおける輝度値Ｌｑを次のようにして求めることができる。

すなわち、変数ｍ、ｎについて以下の連立方程式：
θ＝ｍα＋ｎβ
ｍ＋ｎ＝１
を解き、求められたｍ、ｎの値を次式：
Ｌｑ＝ｍＬｒ＋ｎＬｓ
に代入する。これにより、ウェルＷ内の任意の点Ｑにおける輝度値Ｌｑを求めることができる。ウェルＷ内の各位置において上記計算を行うことで、ウェルＷ全体における輝度分布を求めることができる。

図１１に戻って、透過光量調整部材の作成方法の説明を続ける。上記のようにしてウェルＷ全体での輝度分布が算出されると、続いて該輝度分布をキャンセルして均一な照明条件を得るための透過光量調整部材の濃度分布を算出する。すなわち、ウェルＷ内の各位置について、事前撮像画像において高輝度が検出された領域には比較的高濃度のマスクパターンを配することでウェルＷへの入射光量を制限する一方、低輝度のウェル領域には低濃度のマスクパターンを配してより多くの光が入射するようにすることで、ウェル内における照明光の光量分布の均一化を図ることができるようにする。

具体的には、ウェルＷの各位置において求められた輝度値を適宜にスケーリングし、また必要に応じて適宜のオフセット値を加算することで、各位置に対応する画素のマスクパターンの濃度値が求められる（ステップＳ３０７）。ウェルＷ内の照明光の光量分布を均一化するという観点からは、濃度値の絶対値よりも位置ごとの相対的な濃度差が重要である。すなわち、画像全体の明るさを制御する目的のために、事前撮像画像から求められた各画素の濃度値に適宜のオフセット値を加えてもよい。

そして、こうして求められた各画素ごとの濃度値に応じた濃度を有する濃淡パターンを透明シート上に作成することで（ステップＳ３０８）、例えば図１０（ｂ）に示すような透過光量調整部材４２ｂが作成される。濃淡パターンの作成は、例えばインクジェット印刷によって行うことが可能である。なお、ウェルＷと試料の流動性との組み合わせに起因してウェルＷごとに特性が異なり、個々に補正用の濃淡パターンを用意することが煩雑となる場合がある。このような場合には、輝度分布が類似する複数のケースをグルーピングし、該グループ内で統計的に算出した輝度分布に基づく濃淡パターンを求めてこれをグループ内で共通使用するようにしてもよい。

図１４はこの発明にかかる撮像装置の第５および第６実施形態の主要部を示す図である。図１４（ａ）に示す第５実施形態においては、光源５２ａおよび透過光量調整部５２ｂを有する照明部５２からの照射光Ｌ51が全反射ミラー５２０によって反射され、その反射光Ｌ52がウェルＷに入射する。このような構成は、光路を除けば実質的に第１実施形態のものと同じであり、第１実施形態と同様の効果を得ることが可能である。

また、図１４（ｂ）に示す第６実施形態は、上記各実施形態のようにウェルＷの下方に撮像ユニット１３を配置するのに代えて、ウェルＷの上方に撮像ユニット６１３を配置したものである。より具体的には、ウェルＷの上方にハーフミラー６２０を設け、その上方に撮像ユニット６１３を設けている。そして、光源６２ａおよび透過光量調整部６２ｂを有する照明部６２からの照射光Ｌ61をハーフミラー６２０に入射させ、その反射光Ｌ62をウェルＷに入射させる。一方、ウェルＷから上方に出射される光Ｌ63についてはハーフミラー６２０を透過させて撮像ユニット６１３に入射させる。このようにした場合でも、上記各実施形態と同様に、ウェルＷ内のオブジェクトに略均一な光を照射して、輝度ムラの少ない画像を得ることが可能である。なお、照明部６２、ハーフミラー６２０および撮像ユニット６１３をマイクロプレートＭの下方に配置しても撮像は可能である。

以上説明したように、これらの実施形態においては、マイクロプレートＭが本発明の「試料保持プレート」に相当しており、ウェルＷが本発明の「窪部」に相当している。そして、ホルダ１１が本発明の「保持手段」として機能する一方、撮像ユニット１３が本発明の「撮像手段」として機能している。また、第１および第２実施形態における一次元撮像素子１３３が、本発明の「ラインセンサ」に相当している。また、各実施形態における照明部１２、２２、３２、４２、５２および６２が本発明の「光照射手段」として機能している。また、第２実施形態における発光素子２２１、またこれをグループ化した場合はその各グループが本発明の「発光モジュール」に相当している。

また、上記第１ないし第３実施形態においては制御部１０、より詳しくは第１実施形態におけるシャッター制御部１１２ｂ、第２実施形態における光源制御部１２２および第３実施形態におけるミラー制御部３３２が本発明の「制御手段」として機能しており、第４実施形態においては透過光量調整部材４２ｂが本発明の「制御手段」として機能している。

また、図４のフローチャートにおけるステップＳ１０１およびＳ１０２が本発明の「事前撮像工程」に相当する一方、ステップＳ１０３およびＳ１０４が本発明の「輝度分布検出工程」に相当している。また、ステップＳ１０５およびＳ１０６が本発明の「光量分布設定工程」に相当し、ステップＳ１０７が本発明の「画像取得工程」に相当している。

なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて上述したもの以外に種々の変更を行うことが可能である。例えば、上記第１実施形態では面光源と液晶シャッターとの組み合わせにより任意の二次元光量分布を得られるようにしているが、第２実施形態にその思想を示したように、多数の発光素子を二次元的に配列した光源を用いて各発光素子を個別に点灯制御することによっても、同様に光量分布を任意に設定することが可能である。

逆に、第２実施形態においても、光量分布の固定された光源と液晶シャッター等の透過光量調整部との組み合わせによって任意の光量分布を創出するようにすることが可能である。

また、上記第１実施形態では、面光源と液晶シャッターとが一体化された液晶表示パネルを照明部として用いているが、光源と透過光量調整部とは別体に構成されたものであってもよい。また、光源と透過光量調整部との間に、光量分布を均一化させるための拡散板等をさらに備えてもよい。

また上記実施形態の説明においては特に言及していないが、事前撮像画像を取得するためのプリスキャン動作では、照明光の光量分布が反映されたバックグラウンド画像が得られれば足りる。この意味において必要な解像度は本スキャン動作におけるものよりもかなり低くてもよい。したがって、プリスキャン動作では撮像素子の走査速度を高くして処理時間の短縮を図る一方、本スキャン動作ではより低速で撮像素子を走査することで解像度の高い画像を取得する、というように、走査速度を切り換えて実行してもよい。また、プリスキャン動作とその結果に基づく光量分布の調整を複数回繰り返すことで、より均一な照明条件を求めるようにしてもよい。

同じ考え方から、プリスキャン動作では複数のウェルを一括して撮像する一方、本スキャン動作では１つ１つのウェルを個別に撮像する、というように、撮像対象領域を切り換えて実行するようにしてもよい。

また、本発明の透過光量調整部としてカラー液晶表示パネルを用いた場合、色ごとに透過パターンを変えることで、次のような使い方が可能である。例えば、分析の対象とする細胞の色彩に合わせて照明光の色を変えることにより、特定種の細胞のコントラストを強調した画像を取得することができる。

また、上記第４実施形態における透過光量調整部材として、第１実施形態として示したような液晶シャッターを用いてもよい。また第２実施形態に示したように、光源からの出射光量自体に変化を付けることで所定の光量分布を創出するようにしてもよい。

また、上記各実施形態の撮像装置は、撮像された画像に対して種々の画像処理による解析を実行可能な装置であるが、単に撮像のみを行う装置に対しても、本発明を適用することが可能である。

また、上記各実施形態では、ウェルＷに入射する光の光量分布を管理することで、ウェルＷ内に分布するオブジェクトに均一な照明光が当たるようにしている。一方、撮像された画像において輝度ムラを生じさせない、という観点からは、次に説明するように、ウェルＷから出射された光が撮像ユニットに入射するまでの光路上において光量分布の調整を行うことも可能である。

図１５はウェルと撮像ユニットとの間で光量分布を調整する例を示す図である。この例では、ウェルＷを有するマイクロプレートＭの上方に適宜の面内光量分布を有する照明部７２を設け、ウェルＷの上方から照明光Ｌ71を入射させる。ウェルＷの底面の直下には、上記各実施形態で用いたのと同様の透過光量調整部７２０が配置され、その下方に撮像ユニット７１３が設けられる。このような構成では、たとえウェルＷから出射される光が照明光の不均一さに起因する光量分布を有していたとしても、透過光量調整部７２０を通過して撮像ユニット７１３に入射する光Ｌ72ではその不均一さが解消される。これにより、撮像された画像における輝度ムラが抑制される。

このように、最終的に撮像ユニット７１３に入射する光の光量分布を調整することにより、画像の輝度ムラを抑えることができる。光に対する感度が非線形性を有する受光素子を用いた撮像ユニットであっても、オブジェクトの背景部分の輝度をほぼ均一なレベルとしておくことにより、このような非線形性の影響の少ない画像を取得することが可能である。

なお、透過光量調整部材７２０についてはマイクロプレートＭの下面に密着させてもよく、特に、第４実施形態として示した濃淡パターンが予め形成されたシート状の部材を透過光量調整部７２０として用いる場合には、このようなシートをマイクロプレートＭの下面に貼り付けておくようにしてもよい。例えば、濃淡パターンが形成されたシートを予めマイクロプレートＭと一体化させたものを用いることもできる。

この発明は、例えば医療・生物科学分野で用いられるマイクロプレート上のウェルのような、窪部に流動体が注入されてなる試料の観察を必要とする分野に特に好適に適用することができるが、その応用分野は医療・生物科学分野に限定されない。

１ 撮像装置
１０ 制御部（制御手段）
１１ ホルダ（保持手段）
１３ 撮像ユニット（撮像手段）
４２ｂ 透過光量調整部材（制御手段）
１１２ｂ シャッター制御部（制御手段）
１２２ 光源制御部（制御手段）
１３３ 一次元撮像素子（ラインセンサ）
２２１ 発光素子（発光モジュール）
３３２ ミラー制御部（制御手段）
Ｍ マイクロプレート（試料保持プレート）
Ｓ１０１，Ｓ１０２ 事前撮像工程
Ｓ１０３，Ｓ１０４ 輝度分布検出工程
Ｓ１０５，Ｓ１０６ 光量分布設定工程
Ｓ１０７ 画像取得工程
Ｗ ウェル（窪部）

Claims (17)

1. 液体を保持可能な窪部が形成された試料保持プレートを略水平状態に保持する保持手段と、
   前記保持手段に保持された前記試料保持プレートの上方から、前記窪部に流動体が注入されてなる試料の表面に光を入射させる光照射手段と、
   前記試料を撮像して前記試料の画像を取得する撮像手段と、
   前記光照射手段から前記試料の表面に入射させる光の光量分布を制御する制御手段と
   を備え、
   前記制御手段は、予め前記光量分布を所定の標準状態に設定して前記撮像手段が前記試料を撮像した事前撮像画像における輝度分布に基づいて、前記試料の表面に入射させる光の光量分布を設定し、
   前記撮像手段は、前記制御手段により設定された光量分布での光照射下で、前記試料の画像を取得する
   ことを特徴とする撮像装置。
2. 前記制御手段は、前記事前撮像画像から所定の空間周波数以上の高周波成分を除去したバックグラウンド画像における輝度が低い位置ほど入射光量を大きくする請求項１に記載の撮像装置。
3. 液体を保持可能な窪部が形成された試料保持プレートを略水平状態に保持する保持手段と、
   前記保持手段に保持された前記試料保持プレートの上方から、前記窪部に流動体が注入されてなる試料の表面に向けて光を出射する光照射手段と、
   前記光照射手段から出射されて前記試料の表面に入射する光の光量分布を制御して、前記試料の表面を透過して前記窪部の内部に入射する光の光量分布を均一化させる制御手段と、
   前記制御手段により制御された光量分布での光照射下で、前記試料を撮像して前記試料の画像を取得する撮像手段と
   を備えることを特徴とする撮像装置。
4. 前記光照射手段は、光源と、該光源と前記試料との間に配置されて光の透過量を位置ごとに設定可能な透過光量調整部とを有し、前記制御手段が前記透過光量調整部を制御する請求項１ないし３のいずれかに記載の撮像装置。
5. 前記透過光量調整部は、前記光源からの光に含まれる複数の波長成分に対して異なる透過量を設定可能である請求項４に記載の撮像装置。
6. 前記透過光量調整部が液晶シャッターである請求項４または５に記載の撮像装置。
7. 前記光照射手段は、複数の発光モジュールを配列してなる光源を有し、前記制御手段が前記複数の発光モジュールの発光量を個別に制御する請求項１ないし３のいずれかに記載の撮像装置。
8. 前記光照射手段は、光源と、該光源からの光を反射して前記試料の表面に入射させるとともにその反射方向を互いに独立して変更可能な複数の反射ミラーとを備え、前記制御手段は前記複数の反射ミラーそれぞれの反射方向を制御する請求項１ないし３のいずれかに記載の撮像装置。
9. 前記撮像手段は、前記試料保持プレートに対し相対的に走査移動して前記試料の画像を取得するラインセンサを有する請求項１ないし８のいずれかに記載の撮像装置。
10. 前記光照射手段は、前記試料保持プレートに対する前記ラインセンサの走査移動に伴って前記ラインセンサと一体的に前記試料保持プレートに対し相対移動する請求項９に記載の撮像装置。
11. 前記制御手段は、前記試料保持プレートに対する前記光照射手段の相対移動に同期させて前記試料の表面に入射させる光の光量分布を変化させる請求項１０に記載の撮像装置。
12. 試料保持プレートに設けられた窪部に流動体を注入してなる試料を撮像する撮像方法において、
    略水平に保持した前記試料保持プレートの上方から前記試料の表面に向けて、光量分布が所定の標準状態である光を照射し、前記試料を撮像して事前撮像画像を取得する事前撮像工程と、
    前記事前撮像画像の輝度分布を検出する輝度分布検出工程と、
    前記検出工程での検出結果に基づき前記試料に入射させる光の光量分布を設定する光量分布設定工程と、
    前記光量分布設定工程で設定された光量分布での光照射下で、前記試料の画像を取得する画像取得工程と
    を備えることを特徴とする撮像方法。
13. 前記輝度分布検出工程では、前記事前撮像画像から所定の空間周波数以上の高周波成分を除去したバックグラウンド画像における輝度分布を求め、前記光量分布設定工程では、前記バックグラウンド画像における輝度が低い位置ほど入射光量を大きくする請求項１２に記載の撮像方法。
14. 前記事前撮像工程および前記画像取得工程では、ラインセンサを前記試料保持プレートに対し相対的に走査移動させて前記試料を撮像する請求項１２または１３に記載の撮像方法。
15. 前記試料に光を照射する光照射手段を、前記試料保持プレートに対する前記ラインセンサの走査移動に伴って前記ラインセンサと一体的に前記試料保持プレートに対し相対移動させる請求項１４に記載の撮像方法。
16. 前記画像取得工程では、前記光照射手段から前記試料の表面に入射させる光の光量分布を、前記光量分布工程での設定に基づいて前記試料保持プレートに対する前記光照射手段の相対移動に同期させて変化させながら撮像を行う請求項１５に記載の撮像方法。
17. 前記試料保持プレートに設けられた複数の前記窪部のそれぞれに保持された試料のそれぞれについて、前記事前撮像工程、前記輝度分布検出工程、前記光量分布設定工程および前記画像取得工程を実行する請求項１２ないし１６のいずれかに記載の撮像方法。

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