CN104797925B - 用于不需要光学透镜而光学分析样品的容器及系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种在样品(5)的光学分析时用于接收样品(5)的容器(4)，其中，容器(4)包括底部(19)，底部(19)至少部分地透明，以使可以通过图像传感器(6)从底部(19)的下面对容器(4)内的样品(5)进行光学分析，其中，底部(19)非常薄从而改善由图像传感器(6)生成的图像的对比度和清晰度。进一步地，本发明涉及一种用于光学分析样品(5)的系统。
Description
技术领域
本发明涉及一种在样品(诸如细胞培养物之类的生物样品)的光学分析时用于接收样品的容器。进一步地，本发明涉及一种用于光学分析样品(诸如细胞培养物之类的生物样品)的系统。
背景技术
现有技术的状况包括用于生命细胞成像的所谓的时差显微术(time-lapsemicroscopy)。传统的时差显微系统包括光学显微镜、数码相机、计算机软件和控制样品的细胞环境的恒温箱。但是，传统的时差显微系统非常昂贵及复杂。进一步地，将时差显微系统集成到实验室的工作环境中是困难的，因为就集成到传统的恒温箱中而言，时差显微系统太庞大且太复杂。最后，临床应用中要求将传统的时差显微系统与自动细胞培养(“细胞养殖”)一起使用，而这是困难的。
进一步地，现有技术的状况包括所谓的皮氏培养皿(Petri dishes)，皮氏培养皿是在对样品进行光学分析(例如在先前提到的时差显微术期间)时用于接收样品的容器。
此外，在Zheng等人所著“The ePetri dish,an on-chip cell imaging platformbased on sub-pixel perspective sweeping microscopy(SPSM)”(美国国家科学院院刊(PNAS)，2011)中公开所谓的伊皮氏培养皿(ePetri dishes)。根据该观点，将细胞培养物直接放置在CMOS图像传感器的表面而不需要任何光学透镜在中间。但是，CMOS图像传感器因与细胞培养物的直接接触而被污染。因此，每次细胞培养物的测量均需要新的CMOS图像传感器或者需要对使用过的CMOS图像传感器进行彻底清洁。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种用于光学分析样品(诸如细胞培养物之类的生物样品)的改进的系统。
进一步地，本发明的目的是提供一种改进的容器，该容器适合于用于光学分析样品的新型系统。
通过根据独立权利要求的系统和容器来实现这些目的。
首先，本发明提供一种在样品的光学分析时用于接收样品的新型容器，其中，该容器包括底部，底部至少部分地透明，以使可以通过图像传感器从底部的下面对容器内的样品进行光学分析。
相对于传统的皮氏培养皿，根据本发明的容器包括厚度小于500μm、200μm、150μm或甚至小于120μm的非常薄的底部。容器的薄底部有利地允许使用所谓的“阴影成像(shadow imaging)”来对容器内的样品进行光学分析。在所谓的阴影成像时，将具有样品的容器直接放置在图像传感器(诸如CCD传感器或CMOS传感器)的光感区域上而不需要任何光学透镜在容器和图像传感器之间。为了改善阴影成像的对比度和清晰度，使容器的底部具有非常低的厚度是重要的。在Zheng等人所著“The ePetri dish,an on-chip cellimaging platform based on sub-pixel perspective sweeping microscopy(SPSM)”(美国国家科学院院刊(PNAS)，2011)中对所谓的阴影成像的原理进行了说明。因此，该出版物的内容通过引用包括在本文中。
进一步地，容器的薄底部还允许气体扩散经过容器的底部，以使不必提供传统的隔膜用于CO2交换(碳酸盐缓冲液)。
此外，为了改善成像的光学对比度，根据本发明的容器可以发挥作用。在一个实施例中，上偏振滤光片布置在样品之上且在样品和从上面照射容器内的样品的光源之间。进一步地，下偏振滤光片布置在样品之下且在样品和从下面观察样品的图像传感器之间。此外，光学波导结构布置在上偏振滤光片和下偏振滤光片之间。上偏振滤光片和下偏振滤光片相互垂直对齐，从而将来自光源被图像传感器接收的光限制为特定的光学模式，从而与传统的成像方法相比，实现了光学对比度的改善。
上偏振滤光片可以布置在容器的盖中，而下偏振滤光片可以布置在容器的底部中。进一步地，先前提到的波导结构也可以布置在容器的底部中面向样品的表面上。
在本发明的另一个实施例中，上滤色片布置在样品之上且在样品和从上面照射样品的光源之间，其中，来自光源的照射的波长优选地在上滤色片的通带内，以使来自光源的照射穿过上滤色片。进一步地，下滤色片可以布置在样品之下且在样品和从下面观察样品的图像传感器之间，其中，样品响应于光源的照射的光而发射的波长优选地在下滤色片的通带内，以使由样品发射的光经过下滤色片。
上滤色片可以布置在容器的盖中，而下滤色片可以布置在容器的底部。
在先前提到的包括上滤色片和下滤色片的容器的实施例中，容器的底部的上侧面优选地涂布有pH敏感性荧光染料，pH敏感性荧光染料响应于光源的照射而发射光。pH敏感性荧光染料的不接触样品的那些部分以在下滤色片的通带之外的发射波长来发射光，而pH敏感性荧光染料的接触样品的那些部分被样品进行pH改变，从而改变pH敏感性荧光染料的发射波长，其中pH敏感性荧光染料的被改变后的发射波长在下滤色片的通带内。就是说，光源穿过上滤色片以pH敏感性荧光染料的激发波长照射样品，以及图像传感器检测被样品覆盖的那些部分中的荧光。在这点上，应指出的是，上滤色片的通带与pH敏感性荧光染料的激发波长匹配，而下滤色片的通带与pH敏感性荧光染料的被改变后的发射波长匹配。
在本发明的另一个实施例中，容器包括用于容器的光学校准的至少一个校准元件。校准元件可以用于确定光学系统的转移函数，转移函数允许对容器内的样品进行更精确的分析。
在本发明优选的实施例中，光源集成在容器中以从上面照射容器内的样品。例如，光源可以至少部分地布置在容器的盖中。进一步地，应指出的是，光源优选地为点状的，从而改善样品的图像的光学对比度和清晰度。
在本发明的一个实施例中，光源包括灯，例如发光二极管(LED)或者有机发光二极管(OLED)，灯优选地布置在容器的盖中。在本发明的另一个实施例中，光源包括在容器的盖中的孔，其中，经由在容器的盖中的孔从上面照射样品。
可选地，光源包括在样品之上的反射元件和灯，反射元件特别地在盖的下侧面处，灯用于从下面照射反射元件，其中，反射元件优选地为圆形或为半球形。
进一步地，应指出的是，本发明还要求保护一种用于光学分析样品的系统，其中，根据本发明的系统包括图像传感器，图像传感器具有光感区域，光感区域具有多个光感像素，图像传感器特别地为CCD传感器或CMOS传感器。
此外，根据本发明的系统包括在样品的分析时用于接收样品的容器，其中，所述容器优选地按照上面所述那样来设计。相比于最初提到的传统时差显微术，该容器直接布置在图像传感器的光感区域上而不需要任何光学透镜在容器和图像传感器之间。因此，根据本发明的系统优选地允许所谓的阴影成像而不需要复杂的光学器件。
应指出的是，容器的底部下表面和图像传感器的光感区域之间的空气间隙会造成多次反射，进而恶化成像过程的质量。这些空气间隙可以通过将容器压到光感区域上而避免。因此，根据本发明的系统优选地包括压制装置，压制装置用于将容器压到图像传感器的光感区域上，从而避免容器和图像传感器之间的空气间隙。
进一步地，容器的底部和图像传感器的光感区域之间的空气间隙还可以通过用液体至少部分地填充这些间隙来避免，液体优选的为浸没油或聚合物膜。
此外，可以通过垂直于光学轴(即在图像传感器的光感区域的平面中)相对于容器移动图像传感器来改善光学分辨率。接着，可以在容器相对于图像传感器的不同位置拍摄若干个图像。这些单个图像接着可以用于生成具有改善的光学分辨率的图像。因此，根据本发明的系统优选地包括驱动器，诸如压电驱动器，驱动器用于在图像传感器的光感区域的平面中相对于容器移动图像传感器，以提高测量的光学分辨率。在这点上，应指出的是，容器和图像传感器之间相对移动的幅度优选地小于图像传感器的相邻像素之间的距离。
进一步地，还可以通过改变容器内的样品的照射方向来改善光学分辨率。例如，可以通过提供灯或镜的阵列来改变照射方向，其中灯或镜位于样品之上的不同地方以从不同角度连续地照射样品。
根据本发明的光学系统优选地允许对相当大面积的样品进行分析。因此，图像传感器的光感区域优选地大于200mm2或1cm2。
进一步地，应指出的是穿过样品的光通量比在光学显微镜中穿过样品的光通量小得多，以使样品的曝光量降低。这对于活细胞的长期分析可以是重要的，活细胞可以通过强烈的长期照射而被损坏。
本发明的理念允许整个系统有小尺寸，以使整个系统可以集成到实验室中已有的工作环境中。例如，系统可以集成在传统的恒温箱中。
最后，本发明优选地包括评估单元，评估单元用于对由图像传感器记录的图像进行基于图像的评估。评估单元优选地执行以下步骤中的至少一个：
-检测图像传感器记录的图像中的生物细胞。
-追踪图像内的生物细胞的位置。
-检测生物细胞的凋亡。
-检测生物细胞的坏死。
-检测生物细胞的有丝分裂。
-确定图像传感器记录的图像的图像熵。
-确定细胞计数数据，诸如，图像内的生物细胞的总数，图像内的细胞的细胞增殖，图像内的生物细胞中的有丝分裂的频率、生物细胞的形态参数，特别地为生物细胞的大小、长度和/或亮度或细胞周期的持续时间。
在Rapoport等人所著“A novel validation algorithm allows for automatedcell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters”，PLoSONE 6(11)：e27315.doi:10.1371/-Journal.pone.0027315(公共科学图书馆·综合6(11)：e27315.doi:10.1371/-Journal.pone.0027315)中对评估单元的细节也有说明。因此，该出版物的内容通过引用被包括在本文中。
本发明及其特别的特征和优点从以下参考附图考虑的详细描述中将变得更明显。
附图说明
图1为说明根据本发明的用于生物样品的分析的系统的方案图；
图2为根据本发明的容器的剖视图，该容器包括用于从上面照射样品的点状光源；
图3为对根据图2的容器的变型，该变型包括在盖中用于照射样品的镜；
图4示出容器的另一个变型的剖视图，该变型包括在容器的盖和底部中的偏振滤光片；
图5为根据图3的实施例的另一个变型的剖视图，该变型包括用于容器的光学校准的校准元件；
图6示出容器的另一个变型的剖视图，该变型包括在盖中的孔，该孔用于经由该孔照射样品；
图7A示出在容器的底部和图像传感器之间的空气间隙；
图7B示出为了避免多次反射而填充有液体的间隙；
图8示出说明根据本发明的系统的操作过程的流程图。
具体实施方式
图1示出根据本发明的用于光学分析生物样品(例如细胞培养物)的系统。该系统包括图像获取系统1和评估单元3，图像获取系统1用于生成样品的光学图像2，评估单元3用于分析图像2和生成细胞计数数据。
图像获取系统1包括容器4，容器4包括待分析的光学样品5，其中，容器4包括透明的底部，以使可以由图像传感器6从容器4的下面通过“阴影成像”对容器4内的样品5进行光学分析，“阴影成像”如在Zheng等人所著“The ePetri dish,an on-chip cell imagingplatform based on subpixel perspective sweeping microscopy(SPSM)”(美国国家科学院院刊(PNAS)，2011)中所说明的。因此，该出版物的内容通过引用被包括在本文中。
进一步地，应注意的是，容器4包括透明的薄底部，该薄底部具有小于150μm的厚度。
首先，这允许所谓的阴影成像，其中，容器4直接放置在图像传感器6的光感区域上而不需要在容器4和图像传感器6之间的任何光学透镜。容器4的薄底部造成由图像传感器6生成的图像2的改善的对比度和清晰度。
进一步地，容器4的薄底部允许经由底部进行气体扩散，以使不必提供传统的隔膜用于CO2交换。
此外，图像获取系统1包括压制装置(pressing mechanism)7，压制装置7将容器4压到图像传感器6的光感区域上，从而最小化容器4的底部的下表面和图像传感器6的光感区域之间的空气间隙。由于容器4和图像传感器6之间的任何空气间隙会造成多次反射，从而损害图像2的质量，故这是重要的。
进一步地，图像获取系统1包括点状光源8，点状光源8布置在容器4的可拆除的盖9之上，以使光源8从上面照射容器4内的样品5。
此外，图像获取系统1包括驱动器10(诸如压电驱动器)，驱动器10在图像传感器6的光感区域的平面中相对于容器4移动图像传感器6，即垂直于光学轴。接着，图像传感器6在图像传感器6相对于容器4的不同位置拍摄样品5的若干个图像。这允许评估单元3计算具有更高的光学分辨率的生成图像。就是说，图像传感器6相对于容器4的亚像素移动提高了有效的光学分辨率。
图2示出经由图1的图像获取系统1的容器4的剖视图，容器4具有点状光源8。
图3示出图2的变型，故请参考以上描述，其中，相同的标号用于表示相应的细节。
取代点状光源8，图3的实施例包括反射元件11(即镜)，镜布置在容器4的盖9的下侧面上，其中，反射元件11被两个光源12和13照射，这两个光源12和13布置在容器4的相对立的侧面上。因此，容器4内的样品5可以被光源12或被光源13从不同的方向照射。图像获取系统1从不同的照射方向拍摄样品5的图像，这允许评估单元3计算具有改善的光学分辨率的生成图像。
图4示出如图2所示的容器4的另一个变型，故请参考以上描述，其中，相同的标号用于表示相应的细节。
在本发明的该实施例中，上偏振滤光片14布置在容器4的盖9中。另外，下偏振滤光片15布置在容器4的底部中，其中，上偏振滤光片14和下偏振滤光片15相互垂直对齐。进一步地，光学波导结构16施加到容器4的底部的上表面。下偏振滤光片15、上偏振滤光片14以及光学波导结构16的组合改善光学对比度，如在Nazirizadeh,Y.所著“Photonic crystalslabs for surface contrast enhancement in microscopy of transparent objects”(光学快报，第20卷，第13期,页码14451-14459(2012))中说明的。因此，该出版物的内容通过引用被包括在本文中。
进一步地，图4的容器4包括校准元件17，校准元件17被布置在容器4的底部的上侧面上。校准元件17允许测量图像获取系统1的转移函数，转移函数进而允许改善光学分辨率。
图5很大程度上与图3相对应，但是额外地包括如上提到的校准元件17。
图6示出如在图2-5中所示的容器4的进一步的变型。取代光源8，容器4包括在盖9的中心的孔18，以使容器4中的样品5经由孔18被环境光照射。
图7A示出容器4的底部19的剖视图，容器4布置在图像传感器6的感光表面20上。该剖视图示出容器4的底部19和图像传感器6的感光表面20之间有空气间隙21。但是，空气间隙21造成多次反射，从而损害图像2的质量。
图7B示出对图7A的改进，其中空气间隙21填充有浸没油22，以使避免多次反射，从而改善图像的质量。
图8示出说明如图1所示的系统的操作方法的流程图。
在步骤一S1中，将生物样品5放置在容器4中的容器4的底部上。
在下一步骤S2中，将容器4放置在恒温箱中的图像传感器6的感光表面20上。其中，恒温箱未示出在图中。
接着，在步骤S3中，照射容器4中的生物样品5，以及在步骤S4中，通过图像传感器6记录生物样品5的图像2。
在步骤S5中，评估单元3接着检测图像2中的生物细胞。
在接下来的步骤S6中，评估单元3检测图像2中的细胞的有丝分裂、凋亡和坏死。
在另外的步骤S7中，评估单元3确定与图像2中示出的细胞有关的细胞计数数据。
最后，在步骤S8中，将细胞计数数据通过图表表示。
尽管已经参考部件、特征等的特定布置描述了本发明，但这些并不意欲详尽无遗地论述特征的所有可能布置，很多其它的修改及变型对本领域技术人员而言确实将是可确定的。
参考标号列表：
1 图像获取系统
2 图像
3 评估单元
4 容器
5 样品
6 图像传感器
7 压制装置
8 光源
9 盖
10 驱动器
11 反射元件
12 光源
13 光源
14 上偏振
15 下偏振滤光片
16 光学波导结构
17 校准元件
18 盖中的孔
19 容器的底部
20 光学传感器的感光表面
21 空气间隙
22 浸没油
Claims (17)
1.一种对样品(5)进行光学分析时用于接收所述样品(5)的容器(4)，其中，所述容器(4)包括底部(19)，所述底部(19)至少部分地透明，以使通过图像传感器(6)从所述底部(19)的下面对所述容器(4)内的所述样品(5)进行光学分析，其中，所述容器(4)的所述底部(19)包括小于500μm的厚度；其特征在于，所述容器(4)的所述底部(19)的所述厚度足够小，以允许气体扩散经过所述底部(19)；
其中，
a)上偏振滤光片(14)被布置在所述样品(5)之上且在所述样品(5)和从上面照射所述样品(5)的光源之间，
b)下偏振滤光片(15)被布置在所述样品(5)之下且在所述样品(5)和从下面观察所述样品(5)的所述图像传感器(6)之间，
c)光学波导结构(16)被布置在所述上偏振滤光片(14)和所述下偏振滤光片(15)之间，
d)所述上偏振滤光片(14)和所述下偏振滤光片(15)相互垂直对齐，从而将所述图像传感器(6)从所述光源接收的光限制为特定的光学模式；
其中，所述上偏振滤光片(14)被布置在所述容器(4)的盖(9)中，以及所述下偏振滤光片(15)被布置在所述容器(4)的所述底部(19)中。
2.根据权利要求1所述的容器(4)，进一步包括：
a)布置在所述样品(5)之上且在所述样品(5)和从上面照射所述样品(5)的光源(8)之间的上滤色片，以及
b)布置在所述样品(5)之下且在所述样品(5)和从下面观察所述样品(5)的所述图像传感器(6)之间的下滤色片。
3.根据权利要求2所述的容器(4)，其中，
a)来自所述光源(8)的所述照射的波长在所述上滤色片的通带内，以使来自所述光源(8)的所述照射经过所述上滤色片，以及
b)所述样品(5)响应于所述光源(8)的所述照射而发射的光的波长在所述下滤色片的通带内，以使所述样品(5)发射的所述光经过所述下滤色片。
4.根据权利要求3所述的容器(4)，其中，
a)所述容器(4)的所述底部(19)的上侧面涂布有pH敏感性荧光染料，所述pH敏感性荧光染料响应于所述光源的所述照射而发射光，以及
b)所述pH敏感性荧光染料的不接触所述样品(5)的那些部分以在所述下滤色片的所述通带之外的发射波长来发射光，
c)所述pH敏感性荧光染料的接触所述样品(5)的那些部分被所述样品进行pH改变，从而改变所述pH敏感性荧光染料的发射波长，其中所述pH敏感性荧光染料的经改变后的发射波长在所述下滤色片的所述通带内。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的容器(4)，其中，
c)所述上滤色片被布置在所述容器(4)的盖(9)中，和/或
d)所述下滤色片被布置在所述容器(4)的所述底部(19)中。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的容器(4)，进一步包括用于光学校准的校准元件(17)。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的容器(4)，其中，
a)光源(8、11、12、13、18)被集成在所述容器(4)中，用于从上面照射所述容器(4)内的所述样品(5)，和/或
b)所述容器(4)包括盖(9)，其中所述光源(8、11、12、13、18)至少部分地被布置在所述盖(9)中，和/或
c)所述光源(8、11、18)为点状的。
8.根据权利要求7所述的容器(4)，其中，
a)所述光源(8、11、12、13、18)包括灯(8、12、13)，所述灯(8、12、13)被布置在所述容器(4)的所述盖(9)中，或
b)所述光源(8、11、12、13、18)包括在所述容器(4)的所述盖(9)中的孔(18)，或
c)所述光源(8、11、12、13、18)包括在所述样品(5)之上的反射元件(11)和灯(12、13)，所述灯(12、13)用于从下面照射所述反射元件(11)，其中所述反射元件(11)被塑形为圆形或为半球形状。
9.根据权利要求1所述的容器(4)，其中，所述厚度小于200μm。
10.根据权利要求1所述的容器(4)，其中，所述厚度小于150μm。
11.根据权利要求1所述的容器(4)，其中，所述厚度小于120μm。
12.一种用于光学分析样品(5)的系统，包括：
a)图像传感器(6)，所述图像传感器(6)包括具有多个光感像素的光感区域(20)，以及
b)在所述样品(5)的分析期间用于接收所述样品(5)的容器(4)，
c)其中所述容器(4)被直接布置在所述图像传感器(6)的所述光感区域(20)上而不需要在所述容器(4)和所述图像传感器(6)之间的任何光学透镜，
其特征在于
d)所述容器(4)的底部(19)的厚度足够小，以允许气体扩散经过所述底部(19)；
其中，上偏振滤光片(14)被布置在所述容器(4)的盖(9)中，以及下偏振滤光片(15)被布置在所述容器(4)的所述底部(19)中；
其中，进一步包括压制装置(7)，所述压制装置(7)用于将所述容器(4)压到所述图像传感器(6)的所述光感区域(20)上，以避免所述图像传感器(6)的所述光感区域(20)与所述容器(4)的所述底部(19)之间的空气间隙(21)。
13.根据权利要求12所述的系统，其中，所述容器(4)的所述底部(19)和所述图像传感器(6)的所述光感区域(20)之间的任何间隙(21)至少部分地填充有液体(22)。
14.根据权利要求12或13所述的系统，进一步包括驱动器(10)，所述驱动器(10)用于在所述图像传感器(6)的所述光感区域(20)的平面中相对于所述容器(4)移动所述图像传感器(6)，以提高测量的光学分辨率，
其中，所述相对移动的幅度小于所述图像传感器(6)的相邻像素之间的距离。
15.根据权利要求12或13所述的系统，进一步包括器件(11、12、13)，所述器件(11、12、13)用于改变所述容器(4)内的所述样品(5)的照射方向。
16.根据权利要求15所述的系统，其中，所述用于改变所述照射方向的所述器件(11、12、13)包括灯(12、13)和/或镜(11)的阵列，其中，所述灯(12、13)或镜(11)位于所述样品(5)之上的不同地方，以从不同角度连续地照射所述样品(5)。
17.根据权利要求12所述的系统，其中，
a)所述上偏振滤光片(14)被布置在所述样品(5)之上且在所述样品(5)和从上面照射所述样品(5)的光源之间，
b)所述下偏振滤光片(15)被布置在所述样品(5)之下且在所述样品(5)和从下面观察所述样品(5)的所述图像传感器(6)之间，
c)光学波导结构(16)被布置在所述上偏振滤光片(14)和所述下偏振滤光片(15)之间，
d)所述上偏振滤光片(14)和所述下偏振滤光片(15)相互垂直对齐，从而将所述图像传感器(6)从所述光源接收的光限制为特定的光学模式。
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