JPWO2019065050A1 - 観察装置、観察方法および観察プログラム - Google Patents

Abstract

再撮像をすることなく、整合した部分画像を取得できる観察装置、観察方法および観察プログラムを提供する。収容部２２に観察対象を収容した容器２０および観察対象を、予め定められた撮像位置で収容部２２よりも小さい視野により撮像し、一連の部分画像を取得する撮像部３７と、容器２０および撮像部３７の少なくとも一方を他方に対して相対的に移動させる移動部１２と、撮像部３７により撮像して得られた部分画像から、容器２０の部分形状を表す部分形状情報を算出する算出部４４と、容器２０の形状を表す基準形状情報とを記憶する記憶部４５と、部分形状情報と基準形状情報とに基づいて、一連の部分画像の取得の中で次に撮像が予定されている部分画像を撮像する際の撮像位置を補正し、補正された撮像位置に基づいて、撮像部３７に撮像させる制御部４０と、を含む観察装置。

Description

開示の技術は、観察対象が収容された容器および撮像部の少なくとも一方を他方に対して相対的に移動させて、観察対象を観察する観察装置、観察方法および観察プログラムに関する。

近年、各種細胞等の被写体を撮像し、取得した画像を解析する技術が種々提案されている。たとえば、ＥＳ（Embryonic Stem）細胞およびｉＰＳ（Induced Pluripotent Stem）細胞などの多能性幹細胞または分化誘導された細胞などを顕微鏡などで撮像し、その画像の特徴を捉えることで細胞の分化状態などを判定する方法が提案されている。

ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞は、種々の組織の細胞に分化する能力を備えたものであり、再生医療、薬の開発、および病気の解明などにおいて応用が可能なものとして注目されている。

上述したように細胞を撮像する際、高倍率な広視野画像を取得することが好ましい。このために、たとえば、特許文献１には、ウェルプレートまたはディッシュなどの培養容器の範囲内を結像光学系によって走査し、予め定めらされた一連の撮像位置で画像を撮像した後、撮像位置毎に得られた部分画像を結合する撮像手法が提案されている。部分画像を結合することにより、結果として、広視野に細胞全体が画像化される。このような撮像手法は、タイリング撮像と呼ばれ、各部分画像は、タイル画像とも呼ばれる。

一方で、結像光学系を培養容器に対して相対的に走査する際、速度変動または振動などにより、位置ずれが生じてしまい、正確な部分画像を出力することは難しい。

そこで、特許文献２には、タイリング撮像において、一部のタイル画像に不良が発生した場合に、再撮像を行う技術が開示されている。

特開２０１６−０７１１１７号公報 特開２０１６−１２５９１３号公報

しかしながら、特許文献２記載の技術では、一部のタイル画像に不良が発生する度に、撮像をし直さなくてはならない。これでは、再撮像の分、最終的な細胞等の全体画像を得るまでの処理時間が長くなってしまう。

開示の技術は、上記の点に鑑みてなされたものであり、再撮像をすることなく、整合した部分画像を取得できる観察装置、観察方法および観察プログラムを提供することを目的とする。

開示の技術に係る観察装置は、収容部に観察対象を収容した容器および観察対象を、予め定められた撮像位置で収容部よりも小さい視野により撮像し、一連の部分画像を取得する撮像部と、容器および撮像部の少なくとも一方を他方に対して相対的に移動させる移動部と、撮像部により撮像して得られた部分画像から、容器の部分形状を表す部分形状情報を算出する算出部と、容器の形状を表す基準形状情報とを記憶する記憶部と、部分形状情報と基準形状情報とに基づいて、一連の部分画像の取得の中で次に撮像が予定されている部分画像を撮像する際の撮像位置を補正し、補正された撮像位置に基づいて、移動部および撮像部を制御して、隣り合う部分画像が整合する一連の部分画像を撮像させる制御部と、を備える。

ここで、予め定められた撮像位置は、撮像部の焦点方向（Ｚ方向）の位置ではなく、容器が載置される平面（ＸＹ平面）における位置である。部分画像は、予め定められた複数の撮像位置のそれぞれにおいて、撮像部が自身の視野により撮像して得られる画像である。部分形状は、部分画像の撮像視野に含まれる、容器の収容部の形状の特徴を表す部分である。部分形状は、たとえば、収容部が凹部を構成するウェルである場合、ウェルの縁の部分の形状である。部分形状情報は、部分画像に含まれる容器の部分形状を表す形状情報であり、部分画像に含まれる収容部の形や位置を示す情報である。容器の基準形状情報は、部分画像の撮像の前に予め取得されて記憶部に記憶される情報であり、たとえば、容器全体における収容部の形状および収容部の位置など、基準となる容器の形状（基準形状）を表す情報である。整合とは、隣り合う部分画像の境界部分において、容器の部分形状の位置が一致すること、あるいは、一致できないまでも、位置ズレを低減することである。

上記の観察装置において、算出部は、一連の部分画像の予め定められた撮像位置に基づいて、基準形状情報から各部分画像の撮像視野に対応する基準部分形状情報を算出し、制御部は、隣り合う部分画像の一方の部分画像における部分形状情報と、一方の部分画像の次に撮像が予定されている他方の部分画像の撮像視野に対応する基準部分形状情報とに基づいて、他方の部分画像の撮像位置を予め定められた撮像位置から補正して、他方の部分画像を一方の部分画像に整合させうる。ここで、基準部分形状情報は、基準形状情報により示される容器全体における基準形状を、予め定められた各撮像位置において、撮像部による部分画像の撮像視野単位で切り取った、各撮像視野の容器の基準形状（基準部分形状）を示す情報である。

上記の観察装置において、制御部は、他方の部分画像の撮像位置を予め定められた撮像位置から補正して、隣り合う部分画像の境界部分において、一方の部分画像に含まれる収容部の部分形状の位置と、他方の部分画像に含まれる収容部の部分形状の位置とのズレを低減させうる。ここで、境界部分は、隣り合う部分画像の隣接する辺を含み、たとえば、隣接する辺から所定の割合だけ内側に入った領域であっても良いし、隣り合う部分画像の境界線同士であってもよい。

上記の観察装置において、記憶部は、容器に含まれる収容部の縁の形状を表す形状情報を基準形状情報として記憶しており、算出部は、部分画像に含まれる収容部の縁の形状を表す形状情報を部分形状情報として算出しうる。

上記の観察装置は、基準形状情報を入力する入力部をさらに備え、記憶部は、入力部に入力された基準形状情報を記憶しうる。

上記の観察装置は、容器の形状を測定して、基準形状情報を取得する測定部をさらに備え、記憶部は、測定部により測定して得られた基準形状情報を記憶しうる。

開示の技術に係る観察方法は、収容部に観察対象を収容した容器および観察対象を、予め定められた撮像位置で収容部よりも小さい視野により撮像し、一連の部分画像を取得する撮像工程と、撮像工程により撮像して得られた部分画像から、容器の部分形状を表す部分形状情報を算出する算出工程と、容器の形状を表す基準形状情報を記憶する記憶工程と、部分形状情報と基準形状情報とに基づいて、一連の部分画像の取得の中で次に撮像が予定されている部分画像を撮像する際の撮像位置を補正し、補正された撮像位置に基づいて、撮像工程により、隣り合う部分画像が整合する一連の部分画像を撮像させる制御工程と、備える。

開示の技術に係る観察プログラムは、収容部に観察対象を収容した容器および観察対象を、予め定められた撮像位置で収容部よりも小さい視野により撮像し、一連の部分画像を取得する撮像工程と、撮像工程により撮像して得られた部分画像から、容器の部分形状を表す部分形状情報を算出する算出工程と、容器の形状を表す基準形状情報を記憶する記憶工程と、部分形状情報と基準形状情報とに基づいて、一連の部分画像の取得の中で次に撮像が予定されている部分画像を撮像する際の撮像位置を補正し、補正された撮像位置に基づいて、撮像工程により、隣り合う部分画像が整合する一連の部分画像を撮像させる制御工程と、をコンピューターに実行させる。

開示の技術に係る他の観察装置は、コンピューターに実行させるための命令を記憶するメモリと、記憶された命令を実行するよう構成されたプロセッサとを備え、プロセッサは、収容部に観察対象を収容した容器および観察対象を、予め定められた撮像位置で収容部よりも小さい視野により撮像し、一連の部分画像を取得する撮像工程と、撮像工程により撮像して得られた部分画像から、容器の部分形状を表す部分形状情報を算出する算出工程と、容器の形状を表す基準形状情報を記憶する記憶工程と、部分形状情報と基準形状情報とに基づいて、一連の部分画像の取得の中で次に撮像が予定されている部分画像を撮像する際の撮像位置を補正し、補正された撮像位置に基づいて、撮像工程により、隣り合う部分画像が整合する一連の部分画像を撮像させる制御工程と、を実行する。

開示の技術によれば、制御部は、記憶部に記憶された容器の基準形状情報と、算出部により算出された部分形状情報とに基づいて、次に撮像が予定されている部分画像を撮像する際の撮像位置を補正し、補正した撮像位置に基づいて、隣り合う部分画像が整合する一連の部分画像を撮像させる。一連の部分画像の取得の中で撮像部による撮像位置を適切に補正し、移動部および撮像部を制御するので、一連の撮像が終わった後に再撮像したり、一連の撮像を中断して同じ位置の部分画像を再撮像したりすることがない。結果として、再撮像の必要がなく、整合した隣り合う部分画像を取得できる。

開示の技術の実施形態に係る観察装置の概略構成を示す図である。 載置台の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る制御部の構成を示すブロック図である。 培養容器内における走査経路を実線Ｍで示した図である。 培養容器内の任意の位置に視野がある場合における、第１の変位センサおよび第２の変位センサと、培養容器との位置関係を示す図である。 培養容器内の任意の位置に視野がある場合における、第１の変位センサおよび第２の変位センサと、培養容器との位置関係を示す図である。 顕微鏡装置の走査により取得される部分画像の例を示す図である。 観察装置により実行される観察方法の流れを示すフローチャートである。 部分画像の撮像の詳細な流れを示すフローチャートである。 部分形状と基準部分形状のズレを示す図である。 制御部による動作のタイミングを示す図ある。

以下、開示の技術の実施形態の一例を、図面を参照しつつ説明する。なお、各図面において同一または等価な構成要素および部分には同一の参照符号を付与している。また、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。

図１は、開示の技術の実施形態に係る観察装置の概略構成を示す図である。図２は、載置台の一例を示す図である。

観察装置は、載置台１０に載置された培養容器２０に収容される観察対象を、顕微鏡装置３０により観察するための装置である。載置台１０および顕微鏡装置３０は、制御部４０により制御される。各構成について、順に説明する。

載置台１０は、培養容器２０を載置可能なステージである。図２に示すように、載置台１０の中央には、矩形の開口１１が形成されている。この開口１１を形成する部材の上に培養容器２０が設置され、顕微鏡装置３０により観察するための光が通過するように構成されている。

載置台１０には、移動部１２が取り付けられている。移動部１２は、載置台１０を互いに直交するＸ方向およびＹ方向に自由に移動可能である。Ｘ方向およびＹ方向は、Ｚ方向に直交する方向であり、水平面内において互いに直交する方向である。本実施形態においては、Ｘ方向を主走査方向とし、Ｙ方向を副走査方向とする。移動部１２は、圧電素子などを有するアクチュエータから構成される。載置台１０のＸ−Ｙ平面における移動は、制御部４０によって制御される。載置台１０がＸ−Ｙ平面を移動することによって、載置台１０上の培養容器２０が顕微鏡装置３０に対して移動する。

なお、本実施形態では、載置台１０を顕微鏡装置３０に対して移動することにより、顕微鏡装置３０により観察対象を観察する位置を変更する例を示すが、これに限定されない。顕微鏡装置３０を載置台１０に対して移動してもよいし、載置台１０および顕微鏡装置３０の両方を移動してもよい。載置台１０に載置された培養容器２０および顕微鏡装置３０の少なくとも一方が他方に対して相対的に移動すれば、いかなる態様を採用することもできる。なお、本開示において、たとえば、顕微鏡装置３０の位置が固定されており、培養容器２０だけが移動している場合でも、顕微鏡装置３０が培養容器２０に対して「相対的に移動」していると表現する。

また、培養容器２０を載置台１０に載置して移動するのではなく、培養容器２０の少なくとも一ヶ所を把持する把持部を用い、把持部を動かして、培養容器２０をＸ−Ｙ平面において移動させてもよい。

培養容器２０は、平板状のプレート２１に複数の収容部２２が形成されてなる。培養容器２０は、たとえば、シャーレ、ディッシュまたはウェルプレートなどを用いることができる。収容部２２は、たとえば、平面視すると円形の凹部であり、ウェルとも呼ばれる。収容部２２には、培養液に漬かった各種の細胞等の観察対象が収容される。収容部２２に収容される細胞としては、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞といった多能性幹細胞、幹細胞から分化誘導された神経、皮膚、心筋および肝臓の細胞、並びに人体から取り出された皮膚、網膜、心筋、血球、神経および臓器の細胞などがある。

顕微鏡装置３０は、観察対象の位相差画像を撮像するものである。顕微鏡装置３０は、高倍率の画像を得るために、培養容器２０の各収容部２２よりも小さい視野により、観察対象および培養容器２０の部分画像を撮像する。上述のように、培養容器２０が顕微鏡装置３０に対して移動することによって、顕微鏡装置３０が培養容器２０を走査し、一連の部分画像が得られる。部分画像は、予め定められた複数の撮像位置のそれぞれにおいて、顕微鏡装置３０が自身の視野により撮像して得られる画像である。なお、予め定められた撮像位置は、撮像装置の焦点方向（Ｚ方向）の位置ではなく、培養容器２０が載置される平面（ＸＹ平面）における位置である。焦点方向（Ｚ方向）の位置は、後述するオートフォーカス検出部３８の検出結果に基づいて、フォーカス調整機構３５により適宜調整される。

顕微鏡装置３０は、光源３１と、スリット３２と、コンデンサレンズ３３と、対物レンズ３４と、フォーカス調整機構３５と、結像レンズ３６と、撮像部３７と、オートフォーカス検出部３８とを備えている。

光源３１は、白色光を射出する。スリット３２は、光源３１から射出された白色光を遮光する遮光板に対して白色光を透過するリング形状のスリットが設けられて形成されている。白色光がスリットを通過することによってリング状の照明光Ｌが形成される。コンデンサレンズ３３は、リング状の照明光Ｌを、観察対象に集光させる。

対物レンズ３４は、培養容器２０を介して、コンデンサレンズ３３に対向して配置される。対物レンズ３４は、培養容器２０内の観察対象の像を結像させる。フォーカス調整機構３５は、光軸方向（Ｚ方向）に移動可能な位相差レンズを含む。位相差レンズが光軸方向に移動することによって、オートフォーカス制御が行われ、撮像部３７によって撮像される位相差画像のコントラストが調整される。なお、位相差レンズの光軸方向の移動は、たとえば、制御部４０からの信号に基づく圧電素子のようなアクチュエータの駆動により実現できる。ただし、位相差レンズの駆動は、圧電素子に限らず、位相差レンズをＺ方向に移動可能なものであればよく、その他の公知な構成を用いることができる。また、位相差レンズの倍率を変更可能な構成としてもよい。具体的には、異なる倍率を有する位相差レンズまたはフォーカス調整機構３５を交換可能に構成するようにしてもよい。交換は、自動的に行うようにしてもよいし、ユーザが手動で行うようにしてもよい。

結像レンズ３６は、フォーカス調整機構３５を通過した位相差画像が入射され、これを撮像部３７に結像する。

撮像部３７は、結像レンズ３６によって結像された位相差画像を撮像するものである。撮像部３７は、たとえば、ＣＣＤ（Charge-Coupled Device）イメージセンサまたはＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサなどの撮像素子である。撮像素子としては、ＲＧＢ（Red Green Blue）のカラーフィルタが設けられた撮像素子を用いてもよいし、モノクロの撮像素子を用いてもよい。

以下では、上記の対物レンズ３４、フォーカス調整機構３５、結像レンズ３６および撮像部３７を合わせて、結像光学系Ｃとも呼ぶ。

オートフォーカス検出部３８は、載置台１０に設置された培養容器２０のＺ方向の位置を検出するものである。オートフォーカス検出部３８は、具体的には、第１の変位センサ３８ａおよび第２の変位センサ３８ｂを備える。第１の変位センサ３８ａおよび第２の変位センサ３８ｂは、結像光学系Ｃを挟んで、図１に示すＸ方向に並べて設けられている。本実施形態における第１の変位センサ３８ａおよび第２の変位センサ３８ｂはレーザー変位計であり、培養容器２０にレーザー光を照射し、その反射光を検出することによって、培養容器２０の底面のＺ方向の位置を検出するものである。なお、培養容器２０の底面とは、培養容器２０の底部と観察対象である細胞との境界面であり、すなわち観察対象設置面である。

オートフォーカス検出部３８によって検出された培養容器２０のＺ方向の位置情報は、制御部４０に出力される。制御部４０は、入力された位置情報に基づいて、フォーカス調整機構３５を制御し、オートフォーカス制御を行う。なお、第１の変位センサ３８ａおよび第２の変位センサ３８ｂによる培養容器２０の位置の検出ならびにオートフォーカス制御については、後で詳述する。

次に、顕微鏡装置３０を制御する制御部４０の構成について説明する。図３は、開示の技術の実施形態に係る制御部の構成を示すブロック図である。

制御部４０は、上述のように顕微鏡装置３０の全体を制御し、かつ各種の処理を実行する。制御部４０は、顕微鏡装置制御部４１、走査制御部４２、表示制御部４３、算出部４４、記憶部４５、入力部４６および表示部４７を有する。制御部４０は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）、および半導体メモリ等を備えたコンピューターから構成される。制御部４０は、記憶部４５に本発明の観察プログラムの一実施形態がインストールされている。そして、この観察プログラムがＣＰＵに実行されることによって、図３に示す顕微鏡装置制御部４１、走査制御部４２、および表示制御部４３が機能する。

顕微鏡装置制御部４１は、上述したようにオートフォーカス検出部３８によって検出された培養容器２０のＺ方向の位置情報に基づいて、フォーカス調整機構３５を制御する。そして、フォーカス調整機構３５の駆動によって位相差レンズが光軸方向に移動し、オートフォーカス制御が行われる。

また、顕微鏡装置制御部４１は、培養容器２０を走査する際に、撮像部３７による撮像を制御する。基本的には、予め記憶部４５に走査中の撮像のタイミングが記憶されており、このタイミングに従って、顕微鏡装置制御部４１は撮像を行う。

走査制御部４２は、移動部１２を駆動制御し、載置台１０をＸ方向およびＹ方向に移動させる。

表示制御部４３は、顕微鏡装置３０によって撮像された一連の部分画像を結合することによって、１枚の合成画像を生成し、合成画像を表示部４７に表示させる。

算出部４４は、撮像部３７により撮像して得られた培養容器２０および観察対象の部分画像から、培養容器２０の部分形状の形状情報である部分形状情報を算出する。ここで、部分形状は、部分画像の撮像視野に含まれる、培養容器２０の収容部２２の形状の特徴を表す部分であり、本実施形態では、部分画像の各撮像視野に含まれる、収容部２２の形状および位置の特徴を表す部分である。部分形状情報は、部分画像に含まれる収容部２２の形状または位置を示す情報である。本実施形態では、算出部４４は、特に、部分画像に含まれる培養容器２０の収容部２２の縁の形状から部分形状情報を算出する。

記憶部４５は、各機能部を実現させる観察プログラムを記憶している。また、記憶部４５は、培養容器２０の形状を事前に測定して得られた基準形状情報を予め記憶している。基準形状情報は、部分画像の撮像の前に予め取得される情報であり、収容部２２に観察対象が収容されていない培養容器２０を、レーザー測長器などの測定部により予め測定して得られる。基準形状情報は、たとえば、培養容器２０全体における収容部２２の形状および収容部２２の位置を表す情報である。本実施形態では、基準形状情報は、培養容器２０の収容部２２の縁の形状である。なお、測定に用いる測定部は、顕微鏡装置３０とは異なる精度を有する装置が好ましく、特に、顕微鏡装置３０よりも高精度に収容部２２の縁の形状を測定できる装置がより好ましい。一方、顕微鏡装置３０を測定部として用いて、培養容器２０の形状を事前に測定してもよい。

記憶部４５に記憶される培養容器２０の基準形状情報は、基準部分形状情報を含む。基準部分形状情報は、基準形状情報により示される培養容器２０全体の基準形状を、予め定められた撮像位置において撮像部３７の撮像視野単位で切り取った各撮像視野の培養容器２０の基準形状（基準部分形状）を示す情報である。具体的には、走査により撮像部３７が一連の撮像位置に到達したと想定して、撮像部３７の各撮像視野に入る培養容器２０の収容部２２の縁の形状が基準部分形状であり、基準部分形状の形状情報が基準部分形状情報である。全ての撮像位置に対応して、一連の基準部分形状情報が得られる。基準部分形状情報は、記憶部４５に記憶されずに、必要に応じて、制御部４０により基準形状情報に基づいて算出されてもよい。

記憶部４５には、撮像部３７による一連の撮像位置が、載置台１０と顕微鏡装置３０との相対的な座標位置として記憶されている。

入力部４６は、マウスおよびキーボードなどを備えたものであり、各種の必要なデータおよびユーザによる種々の設定入力を受け付ける。本実施形態の入力部４６は、たとえば、上述の培養容器２０の容器情報、基準形状情報、基準部分形状情報、撮像位置に関する情報の入力を受け付ける。撮像位置は、入力部４６に入力された基準形状情報に基づいて、制御部４０が予め定めてもよい。

表示部４７は、たとえば液晶ディスプレイなどを備え、上述したように表示制御部４３によって生成された合成位相差画像を表示する。また、表示部４７をタッチパネルによって構成し、入力部４６と兼用するようにしてもよい。

次に、走査制御部４２による載置台１０の移動制御および顕微鏡装置制御部４１による顕微鏡装置３０の制御について、詳細に説明する。

図４は、培養容器内における走査経路を実線Ｍで示した図である。図５および図６は、培養容器内の任意の位置に視野がある場合における、第１の変位センサおよび第２の変位センサと、培養容器との位置関係を示す図である。

本実施形態においては、走査制御部４２による制御によって載置台１０をＸ方向およびＹ方向に移動させ、顕微鏡装置３０を培養容器２０内において２次元状に走査する。走査の課程で、顕微鏡装置３０の各視野内において、培養容器２０および観察対象の部分画像を撮像する。なお、本実施形態においては、培養容器２０として６つの収容部２２を有するウェルプレートを用いる。

図４に示すように、顕微鏡装置３０の視野は、走査開始点Ｓから走査終了点Ｅまで実線Ｍに沿って移動する。すなわち、視野は、Ｘ方向の正方向（図４の右方向）に走査された後、Ｙ方向（図４の下方向）に移動し、逆の負方向（図４の左方向）に走査される。次いで、視野は、再びＹ方向に移動し、再び正方向に走査される。このように、視野は、Ｘ方向についての往復移動とＹ方向への移動を繰り返し行うことによって、培養容器２０内を２次元状に走査される。

本実施形態においては、図５および図６に示すように、第１の変位センサ３８ａと第２の変位センサ３８ｂが結像光学系Ｃを挟んでＸ方向に並べて設けられている。そして、結像光学系Ｃの視野Ｒは、上述したように培養容器２０内を２次元状に走査される。この際、培養容器２０に対する結像光学系Ｃの視野Ｒの位置よりも視野Ｒの移動方向前側の位置において培養容器２０のＺ方向の位置が検出される。具体的には、視野Ｒが、図５に示す矢印方向（図５の右方向）に移動している場合には、第１の変位センサ３８ａおよび第２の変位センサ３８ｂのうち、視野Ｒの移動方向前側の第１の変位センサ３８ａによって培養容器２０のＺ方向の位置が検出される。そして、視野Ｒが、図５に示す位置から第１の変位センサ３８ａの位置まで移動した場合に、前もって検出された培養容器２０のＺ方向の位置情報が用いられてオートフォーカス制御が行われ、部分画像の撮像が行われる。

一方、視野Ｒが、図６の矢印方向（図６の左方向）に移動している場合には、第１の変位センサ３８ａおよび第２の変位センサ３８ｂのうち、視野Ｒの移動方向前側の第２の変位センサ３８ｂによって培養容器２０のＺ方向の位置が検出される。そして、視野Ｒが、図６に示す位置から第２の変位センサ３８ｂの位置まで移動した場合に、前もって検出された培養容器２０のＺ方向の位置情報が用いられてオートフォーカス制御が行われ、位相差画像の撮像が行われる。

このように第１の変位センサ３８ａを用いた培養容器２０の検出と第２の変位センサ３８ｂを用いた培養容器２０の検出とを視野Ｒの移動方向に応じて切り替える。これによって、常に、視野Ｒの位相差画像の撮像に先行して、その視野Ｒの位置における培養容器２０のＺ方向の位置情報を取得できる。

そして、顕微鏡装置制御部４１は、上述したように先行して検出された培養容器２０のＺ方向の位置情報に基づいて、フォーカス調整機構３５を駆動制御することによって、オートフォーカス制御を行う。具体的には、顕微鏡装置制御部４１には、培養容器２０のＺ方向の位置情報と結像光学系Ｃの光軸方向の移動量との関係が予め設定されている。顕微鏡装置制御部４１は、入力された培養容器２０のＺ方向の位置情報に基づいて、結像光学系Ｃの光軸方向の移動量を求め、その移動量に応じた制御信号をフォーカス調整機構３５に出力する。フォーカス調整機構３５は、入力された制御信号に基づいて駆動し、これにより位相差レンズが光軸方向に移動し、培養容器２０のＺ方向の位置に応じたフォーカス調整が行われる。

図７は、顕微鏡装置の走査により取得される部分画像の例を示す図である。

以上のように走査が行われた場合、たとえば、図７に示すように、一点鎖線で区切られる９つの部分画像Ｐにより、培養容器２０の一つの収容部２２がカバーされる。図７に示すように、隣り合う部分画像Ｐにズレがなく、整合していることが理想的である。しかし、走査方向が主走査方向および副走査方向間で転換される際の加減速、または載置台１０または顕微鏡装置３０の振動によって、部分画像が整合しない場合がある。これは、振動の有無に関わらず、予め決まっている撮像位置で撮像を行うからである。隣り合う部分画像が整合するように、本実施形態の観察装置は、以下の制御を行う。以下に示すアルゴリズムは、記憶部４５に記憶されたプログラムを、ＣＰＵが実行することにより実現される。

図８は、観察装置により実行される観察方法の流れを示すフローチャートである。各工程は、特に制御部４０により実行される。

まず、制御部４０は、入力部４６において、培養容器２０に関する容器情報について入力を受け付ける（ステップＳ１０１）。培養容器２０の容器情報は、たとえば、培養容器の仕様（収容部２２の大きさ、数、間隔等）、培養容器の型番、およびメーカー等である。容器情報から、今回使用される培養容器２０の収容部２２の数、収容部２２の間隔、および収容部２２の径等の情報が得られる。また、同じ仕様でもメーカーによっては、収容部２２の配列の位置等が違う場合があるので、メーカーの情報も、培養容器２０の形状を特定する上では、有用である。

次に、制御部４０は、収容部２２に観察対象が収容されていない培養容器２０の形状を、測定部により測定する（ステップＳ１０２）。ここで、測定部は、上述の通り、観察装置の構成に含まれず、外部の装置であってもよいし、顕微鏡装置３０であってもよい。ただし、培養容器２０の形状の測定に際し、ステップＳ１０１で取得された容器情報が用いられる。たとえば、レーザー測長器により、培養容器２０に対してレーザー光を照射し、反射したレーザー光により、容器の立体形状を測定する。この際、容器情報を用いて、レーザー測長器による測定結果を補正できる。これにより、培養容器２０の立体形状の測定結果をより正確なものとすることができる。

制御部４０は、ステップＳ１０２で得られた培養容器２０の形状を表す形状情報を、基準形状情報として記憶部４５に記憶する（ステップＳ１０３）。上記のステップＳ１０１〜ステップＳ１０３は、観察装置による観察の前処理である。したがって、ステップＳ１０４以降とは別に、事前に実行されていてもよい。

制御部４０は、走査制御部４２により載置台１０を移動させつつ、顕微鏡装置３０による撮像を開始することによって、走査を開始する（ステップＳ１０４）。

制御部４０は、顕微鏡装置３０の走査により培養容器２０および観察対象の部分画像を撮像する（ステップＳ１０５）。部分画像は、原則として、予め決まっている撮像位置に顕微鏡装置３０の結像光学系Ｃが到達すると撮像される。しかし、振動または加減速等により、隣り合う部分画像が整合しない場合がある。このような場合には、制御部４０は、撮像部３７および移動部１２を制御して、次に撮像する部分画像の撮像位置を変更する。部分画像を撮像する処理について、詳細は後述する。

制御部４０は、算出部として、ステップＳ１０５において撮像した部分画像から、培養容器２０の部分形状を表す部分形状情報を算出する（ステップＳ１０６）。本実施形態においては、算出した部分形状情報は、培養容器２０の収容部２２の円形の縁を示す情報である。部分画像には、円形の縁の一部が含まれる蓋然性が高く、縁の形状が、隣り合う部分画像の整合を確認するためには有用である。たとえば、図７に示すように、９つの部分画像が得られる場合、真ん中の部分画像以外は、収容部２２の円形の形状の一部を含む。このように、ステップＳ１０６では、部分画像に含まれる特徴として、収容部２２の縁の形状および位置を示す部分形状情報を算出する。

制御部４０は、算出した部分形状情報を、記憶部４５に記憶する（ステップＳ１０７）。

制御部４０は、顕微鏡装置３０により全ての撮像位置において撮像が終了したか否かにより、走査が完了したか否かを判断する（ステップＳ１０８）。走査が完了していない場合（ステップＳ１０８：ＮＯ）、ステップＳ１０５からの処理が繰り返される。走査が完了した場合（ステップＳ１０８：ＹＥＳ）、制御部４０は、観察方法の処理を終了する。

次に、ステップＳ１０５の部分画像撮像の処理について、詳細に説明する。

図９は、部分画像の撮像の詳細な流れを示すフローチャートである。

制御部４０は、次の撮像位置を特定する（ステップＳ２０１）。撮像位置は、記憶部４５に予め記憶されており、走査の進行に従って、順次特定される。

制御部４０は、ステップＳ２０１で特定した次の撮像位置が、一連の撮像位置のうち、最初の撮像位置か判断する（ステップＳ２０２）。最初の撮像位置である場合（ステップＳ２０２：ＹＥＳ）、予め決まっている撮像位置において、部分画像を撮像し（ステップＳ２０３）、図８のフローチャートに戻る。最初の撮像位置でない場合（ステップＳ２０２：ＮＯ）、制御部４０は、ステップＳ２０４の処理に進む。

制御部４０は、次の撮像位置に対応する位置の基準部分形状情報を記憶部４５から読み出す（ステップＳ２０４）。あるいは、制御部４０は、記憶部４５に記憶されている基準形状情報と、次の撮像位置に基づいて、基準形状情報から次の撮像位置に対応する基準部分形状情報を算出してもよい。

制御部４０は、ステップＳ２０１で特定した次の撮像位置に隣接する撮影済の部分画像の部分形状情報を、記憶部４５から読み出す（ステップＳ２０５）。これにより、撮像済の部分画像の部分形状と、この部分形状と隣り合いかつ次に撮像する撮像位置に対応する基準部分形状情報とが読み出されたことになる。

制御部４０は、読み出された部分形状情報と基準部分形状情報とに基づいて、撮像済の部分画像の撮像位置と次の撮像位置との位置ズレを算出し、次の撮像位置を補正する（ステップＳ２０６）。具体的には、制御部４０は、撮像済の部分画像と、予め定められている次の撮像位置の撮像視野との境界部分において、撮像済の部分画像の収容部２２の縁の位置に対して、次の撮像位置の撮像視野での収容部２２の縁の位置がズレている程度を算出する。境界部分とは、隣り合う部分画像の隣接する辺、または、部分画像と次の撮像位置での撮像視野との隣接する辺を含み、たとえば、隣接する辺から所定の割合だけ内側に入った領域であっても良いし、隣り合う部分画像の境界線同士であってもよい。そして、制御部４０は、境界部分において、撮像済の部分画像の部分形状の位置と、次の撮像位置の撮像視野での基準部分形状の位置が整合して並ぶように、次の撮像位置をいずれの方向にずらす補正をすればよいか決定する。制御部４０は、ズレを全くなくすように撮像位置を補正することが好ましい。しかし、ズレが全くないように撮像位置を補正すると、移動部１２を停止あるいは無理に駆動する必要があったり、撮像部３７の撮像タイミングとして無理が生じたりする場合、必ずしもズレを全く無くさなくてもよい。この場合、制御部４０は、ズレをできるだけ低減する方向に撮像位置を補正する。

制御部４０は、移動部１２および撮像部３７を制御して、ステップＳ２０６で補正した撮像位置により、培養容器２０および観察対象を撮像する（ステップＳ２０７）。すなわち、補正した撮像位置で撮像部３７が撮像できるように、走査の方向および撮像部３７による撮像のタイミングの少なくとも一方を調整する。部分画像の部分形状に対して、次の撮像位置の基準部分形状がズレていない場合、制御部４０は、走査の方向および撮像のタイミングは調整しない。

図１０を参照して、具体的な例について説明する。

図１０は、部分形状と基準部分形状のズレを示す図である。

図１０に示す例では、走査により左から右に順に一連の部分画像が得られる様子を示している。図中、左と真ん中の部分画像Ｐ１、Ｐ２は、既に撮像済の部分画像を示す。右の部分画像Ｂ１は、次の撮像位置において容器の基準形状を撮像したと想定した場合に得られる部分画像を示す。

部分画像Ｐ２まで撮像済なので、ステップＳ２０４において、部分画像Ｐ２の次の撮像位置に対応する部分画像Ｂ１に含まれる基準部分形状ＢＳを示す基準部分形状情報が読み出される。そして、ステップＳ２０５において、部分画像Ｂ１に隣接する部分画像Ｐ２に含まれる部分形状ＰＳを示す部分形状情報が読み出される。図１０に示すように、算出部分形状ＰＳに対して、基準部分形状ＢＳが−Ｙ方向にズレている場合、このまま撮像位置において撮像すると、同じように位置がズレた部分形状を含む部分画像が撮像されてしまう。つまり、部分画像同士の境界部分において、部分形状の位置がズレてしまう。これでは、隣り合う部分画像が整合しない。部分画像Ｐ２に整合した次の部分画像を撮像するためには、部分形状ＰＳに対して、基準部分形状ＢＳがズレている分だけ、撮像位置をＹ方向に補正すればよい。このように、制御部４０は、ステップＳ２０６において、撮像位置を補正し、補正した撮像位置に撮像部３７が到達するように、移動部１２および撮像部３７を制御する。

図１１は、制御部４０による動作のタイミングを示す図ある。

図１１に示すように、撮像位置の特定と、基準部分形状と部分形状との比較と、撮像部３７による撮像とが、順に繰り返し行われる。撮像タイミングの合間に、撮像位置が特定され、かつ、基準部分形状と部分形状との比較に基づいて、撮像位置が補正される。つまり、制御部４０は、事前に準備された容器の基準部分形状と、リアルタイムで算出部４４により算出された部分形状とに基づいて、隣り合う部分画像が整合するように順次定まる撮像位置において、撮像部に撮像させる。一連の撮像中に撮像部３７による撮像位置を適切に決定し、移動部１２および撮像部３７を制御するので、一連の撮像が終わった後に再撮像したり、一連の撮像を中断して同じ部分画像を再撮像したりすることがない。結果として、再撮像の必要がなく、整合した隣り合う部分画像を取得できる。整合する部分画像を結合して、細胞等の良好な全体画像を取得できる。

また、培養容器２０の形状を事前に測定する際には、予め容器情報を入力している。したがって、容器情報を用いて培養容器２０を測定でき、より精度良く培養容器２０の形状が得られる。ただし、容器情報は必ずしも入力しなくてもよい。容器情報がなくても、ユーザによる種々の入力に基づいたり、あるいは、以前に使用された撮像位置の情報に基づいたりして、事前に培養容器２０を測定することもできる。

以上、本開示の一実施形態について説明したが、本開示の技術的思想は上記に限定されない。種々の改変が可能である。

上記実施形態においては、培養容器２０全体の形状を含む基準形状から一連の撮像位置に対応する基準部分形状情報を算出して、撮像位置として隣り合う撮像済の部分形状を示す部分形状情報と比較していた。しかし、撮像位置として隣り合う基準部分形状情報と部分形状情報とを比較する代わりに、撮像位置として同じ場所に対応する基準部分形状情報と部分形状情報とを比較してもよい。この場合でも、部分形状の位置に対して基準部分形状の位置のズレ量を判定し、ズレ量の分、次の撮像位置を補正できる。また、基準部分形状情報を用いなくても、基準形状情報と、部分形状情報とを直接比較することもできる。この場合、たとえば、基準形状情報が示す基準形状において部分形状が対応する位置が特定され、特定された位置と実際に部分形状が撮像された撮像位置とを比較することにより、部分形状と基準形状の位置のズレを判定できる。判定したズレに基づいて、次の撮像位置を補正できる。

また、上記実施形態では、培養容器２０の収容部２２の縁を特徴として、部分形状情報および基準部分形状情報（基準形状情報）を算出している。しかし、収容部２２の縁ではなく、培養容器２０全体の縁を特徴として算出したり、または、培養容器２０に凸部または凹部の特定の形状の印を設け、印の形状を特徴として算出したりすることもできる。

また、上記実施形態では、基準部分形状と部分形状との比較に基づいて、撮像位置を補正している。しかし、図７に示す一つの収容部２２で考えると、中央に位置する画像には、培養容器２０の部分形状が含まれない。したがって、図７の中央に位置する画像については、比較する部分形状がないため、比較結果に基づいて撮像位置を補正できない。一方で、中央の画像を撮像する前には、中央の画像から見て上側の部分画像Ｐ２と、右側の部分画像とは撮像が完了している。撮像が完了している部分画像については、撮像位置の補正量も既知である。したがって、既知の補正量を考慮して、少なくとも撮像済の画像に対して隙間が少なくなるように、中央の画像の撮像位置を補正してもよい。すなわち、培養容器２０の部分形状が視野に含まれない撮像位置で撮像する場合、撮像済の画像を撮像した際の撮像位置の補正量から、これまでの撮像位置が補正により当初からどれだけズレたかを判断する。そして、ズレた分だけ、中央の画像の撮像位置も補正すれば、少なくともこれまでの補正に合った撮像位置となり、中央の画像だけ、他の画像と大きくズレることがない。撮像済の撮像位置間でＸ方向およびＹ方向の補正量が異なる場合、平均値を用いて、中央の画像の撮像位置を補正してもよい。なお、図７の例では、中央の画像だけが部分形状を含まないが、これは一例に過ぎない。中央でなくても、部分形状を含まない画像を撮像する際には、上述のように、他の撮像済の撮像位置の補正量を考慮して、今回の撮像位置を補正できる。

なお、上記各実施形態でＣＰＵがソフトウェア（プログラム）を読み込んで実行した観察処理を、ＣＰＵ以外の各種のプロセッサが実行してもよい。この場合のプロセッサとしては、ＦＰＧＡ（Ｆｉｅｌｄ−Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｇａｔｅ Ａｒｒａｙ）等の製造後に回路構成を変更可能なＰＬＤ（Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｌｏｇｉｃ Ｄｅｖｉｃｅ）、及びＡＳＩＣ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｃｉｒｃｕｉｔ）等の特定の処理を実行させるために専用に設計された回路構成を有するプロセッサである専用電気回路等が例示される。また、観察処理を、これらの各種のプロセッサのうちの１つで実行してもよいし、同種又は異種の２つ以上のプロセッサの組み合わせ（例えば、複数のＦＰＧＡ、及びＣＰＵとＦＰＧＡとの組み合わせ等）で実行してもよい。また、これらの各種のプロセッサのハードウェア的な構造は、より具体的には、半導体素子等の回路素子を組み合わせた電気回路である。

また、上記各実施形態では、観察処理のプログラムが記憶部４５に予め記憶（インストール）されている態様を説明したが、これに限定されない。プログラムは、ＣＤ−ＲＯＭ（Ｃｏｍｐａｃｔ Ｄｉｓｋ Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＤＶＤ−ＲＯＭ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｄｉｓｋ Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、及びＵＳＢ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｓｅｒｉａｌ Ｂｕｓ）メモリ等の記録媒体に記録された形態で提供されてもよい。また、プログラムは、ネットワークを介して外部装置からダウンロードされる形態としてもよい。

１０ 載置台
１１ 移動部
２０ 培養容器
２１ プレート
２２ 収容部
３０ 顕微鏡装置
３１ 光源
３２ スリット
３３ コンデンサレンズ
３４ 対物レンズ
３５ フォーカス調整機構
３６ 結像レンズ
３７ 撮像部
３８ オートフォーカス検出部
３８ａ 第１の変位センサ
３８ｂ 第２の変位センサ
４０ 制御部
４１ 顕微鏡装置制御部
４２ 走査制御部
４３ 表示制御部
４４ 算出部
４５ 記憶部
４６ 入力部
４７ 表示部
Ｂ１ 部分画像
ＢＳ 基準部分形状
Ｃ 結像光学系
Ｅ 走査終了点
Ｌ 照明光
Ｍ 走査経路
Ｐ、Ｐ１、Ｐ２ 部分画像
ＰＳ 部分形状
Ｒ 視野
Ｓ 走査開始点

Claims (8)

1. 収容部に観察対象を収容した容器および前記観察対象を、予め定められた撮像位置で前記収容部よりも小さい視野により撮像し、一連の部分画像を取得する撮像部と、
   前記容器および前記撮像部の少なくとも一方を他方に対して相対的に移動させる移動部と、
   前記撮像部により撮像して得られた前記部分画像から、前記容器の部分形状を表す部分形状情報を算出する算出部と、
   前記容器の形状を表す基準形状情報を記憶する記憶部と、
   前記部分形状情報と前記基準形状情報とに基づいて、前記一連の部分画像の取得の中で次に撮像が予定されている部分画像を撮像する際の撮像位置を補正し、前記補正された撮像位置に基づいて、前記移動部および前記撮像部を制御して、隣り合う部分画像が整合する一連の部分画像を撮像させる制御部と、
   を備える観察装置。
2. 前記算出部は、前記一連の部分画像の予め定められた前記撮像位置に基づいて、前記基準形状情報から各前記部分画像の撮像視野に対応する基準部分形状情報を算出し、
   前記制御部は、隣り合う部分画像の一方の部分画像における部分形状情報と、前記一方の部分画像の次に撮像が予定されている他方の部分画像の撮像視野に対応する基準部分形状情報とに基づいて、前記他方の部分画像の撮像位置を前記予め定められた撮像位置から補正して、前記他方の部分画像を前記一方の部分画像に整合させる請求項１に記載の観察装置。
3. 前記制御部は、前記他方の部分画像の撮像位置を前記予め定められた撮像位置から補正して、前記隣り合う部分画像の境界部分において、前記一方の部分画像に含まれる前記収容部の部分形状の位置と、前記他方の部分画像に含まれる前記収容部の部分形状の位置とのズレを低減させる、請求項２に記載の観察装置。
4. 前記記憶部は、前記容器に含まれる前記収容部の縁の形状を表す形状情報を前記基準形状情報として記憶しており、
   前記算出部は、前記部分画像に含まれる前記収容部の縁の形状を表す形状情報を前記部分形状情報として算出する、請求項１から３のいずれか一項に記載の観察装置。
5. 前記基準形状情報を入力する入力部をさらに備え、
   前記制御部は、前記入力部に入力された前記基準形状情報に基づいて、前記予め定められた撮像位置を決定する請求項１から４のいずれか一項に記載の観察装置。
6. 前記容器の形状を測定して、前記基準形状情報を取得する測定部をさらに備え、
   前記制御部は、前記測定部により測定して得られた前記基準形状情報に基づいて前記予め定められた撮像位置を決定する請求項１から４のいずれか一項に記載の観察装置。
7. 収容部に観察対象を収容した容器および前記観察対象を、予め定められた撮像位置で前記収容部よりも小さい視野により撮像し、一連の部分画像を取得する撮像工程と、
   前記撮像工程により撮像して得られた前記部分画像から、前記容器の部分形状を表す部分形状情報を算出する算出工程と、
   前記容器の形状を表す基準形状情報を記憶する記憶工程と、
   前記部分形状情報と前記基準形状情報とに基づいて、前記一連の部分画像の取得の中で次に撮像が予定されている部分画像を撮像する際の撮像位置を補正し、前記補正された撮像位置に基づいて、撮像工程により、隣り合う部分画像が整合する一連の部分画像を撮像させる制御工程と、
   を備える観察方法。
8. 収容部に観察対象を収容した容器および前記観察対象を、予め定められた撮像位置で前記収容部よりも小さい視野により撮像し、一連の部分画像を取得する撮像工程と、
   前記撮像工程により撮像して得られた前記部分画像から、前記容器の部分形状を表す部分形状情報を算出する算出工程と、
   前記容器の形状を表す基準形状情報を記憶する記憶工程と、
   前記部分形状情報と前記基準形状情報とに基づいて、前記一連の部分画像の取得の中で次に撮像が予定されている部分画像を撮像する際の撮像位置を補正し、前記補正された撮像位置に基づいて、撮像工程により、隣り合う部分画像が整合する一連の部分画像を撮像させる制御工程と、をコンピューターに実行させる観察プログラム。