KR20180104041A

KR20180104041A - 세포 관찰 장치 및 방법

Info

Publication number: KR20180104041A
Application number: KR1020187023737A
Authority: KR
Inventors: 겐타 마츠바라
Original assignee: 후지필름 가부시키가이샤
Priority date: 2016-02-29
Filing date: 2016-12-05
Publication date: 2018-09-19
Also published as: JP2017156443A; US11061214B2; EP3425438A4; KR102066807B1; EP3425438A1; WO2017149880A1; US20180348493A1; JP6522535B2

Abstract

세포 전체의 3차원적인 구조를 관찰할 수 있고, 또한 쓸데없는 촬영을 방지할 수 있는 세포 관찰 장치 및 방법을 제공한다. 세포의 상을 결상하는 결상 광학계(30)와, 결상 광학계(30)의 초점 위치의 주사 범위를 제어하는 결상 광학계 제어부(51)와, 세포의 두께에 관련된 정보를 취득하는 두께 정보 취득부(53)와, 결상 광학계(30)에 의하여 결상된 상을 촬상하는 촬상부(40)를 구비하고, 결상 광학계 제어부(51)가, 두께에 관련된 정보에 근거하여, 초점 위치의 초기 주사 범위를 설정하고, 그 초기 주사 범위 내의 복수의 초점 위치에 있어서의 세포의 상을 각각 결상시키고, 이어서 촬상부(40)에 의하여 촬상된 복수의 초점 위치별 화상을 취득하며, 그 화상에 근거하여 세포의 두께를 추정하고, 그 추정한 세포의 두께에 근거하여, 초점 위치의 초기 주사 범위를 갱신하고, 그 갱신한 주사 범위 내의 복수의 초점 위치에 있어서의 세포의 상을 각각 결상시킨다.

Description

세포 관찰 장치 및 방법

본 발명은, 배양되는 세포의 상을 결상 광학계에 의하여 결상하여 관찰하는 세포 관찰 장치 및 방법에 관한 것이다.

최근, 줄기 세포 등의 배양된 세포를 관찰하는 현미경으로서, 위상차 현미경을 비롯한 다양한 현미경이 널리 사용되고 있다.

세포는 성장이 진행됨에 따라, 3차원적으로 적층되는 것이 알려져 있지만, 현미경의 대물 렌즈에는 초점 심도가 있기 때문에 적층된 세포의 3차원적인 구조를 한번에 관찰하는 것은 어렵다.

특허문헌 1에 있어서는, 두께 방향의 세포의 성장도에 따라 결정한 파라미터에 근거하여 오토 포커스 제어를 행하고, 이로써 세포의 두께에 따른 촬상을 행하는 것이 제안되고 있다.

또, 특허문헌 2에 있어서는, 3차원적으로 이간되어 배치된 복수의 세포의 화상을 촬상하는 방법이 제안되어 있으며, 대물 렌즈의 포커싱 위치를 광축 방향으로 미리 설정된 피치로 이동시켜, 각 포커싱 위치에서 촬상된 화상을 합성하는 방법이 제안되고 있다.

또, 특허문헌 3에 있어서는, 두께가 있는 세포를, 대물 렌즈의 포커싱 위치를 광축 방향으로 이동시키면서 관찰하는 경우에 있어서, 세포의 두께를 추정하고, 그 추정한 두께에 근거하여, 포커싱 위치의 주사 범위를 결정하는 것이 제안되고 있다.

일본 공개특허공보 2015-166829호 일본 공개특허공보 2015-108534호 일본 특허공보 제4937457호

그러나, 특허문헌 1에 기재된 방법에서는, 오토 포커스 제어에 의하여 최종적으로 결정되는 초점 위치는 하나이기 때문에, 적층된 세포의 3차원적인 구조를 관찰할 수 없다.

또, 특허문헌 2에서는, 3차원적으로 이간되어 배치된 복수의 세포를 촬상하는 방법에 대하여 기재되어 있을 뿐이며, 두께를 갖는 세포의 촬상 방법에 대해서는 제안되어 있지 않다.

또, 특허문헌 3에 있어서는, 유저에 의하여 설정 입력된 세포의 크기에 근거하여, 포커싱 위치의 주사 범위를 결정하는 것이 제안되고 있지만, 설정 입력된 세포의 크기와 실제로 배양된 세포의 크기의 사이에 상위가 있을 가능성이 있다. 예를 들어 실제로 배양된 세포의 크기에 대하여, 주사 범위가 과도하게 넓은 경우에는, 쓸데없는 촬영을 행하게 되고, 한편, 주사 범위가 과도하게 좁은 경우에는, 세포의 두께 방향에 대하여 촬영 부족이 발생하게 된다.

본 발명은, 상기의 문제를 감안하여, 세포 전체의 3차원적인 구조를 관찰할 수 있고, 또한 쓸데없는 촬영을 방지할 수 있는 세포 관찰 장치 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 세포 관찰 장치는, 배양 용기 내에서 배양되는 세포의 상을 결상하는 결상 광학계와, 결상 광학계의 초점 위치의 주사 범위를 제어하는 결상 광학계 제어부와, 세포의 배양 용기 내의 설치면으로부터의 두께에 관련된 정보를 취득하는 두께 정보 취득부와, 결상 광학계에 의하여 결상된 상을 수광하여, 세포의 화상을 촬상하는 촬상부를 구비하고, 결상 광학계 제어부가, 두께에 관련된 정보에 근거하여, 세포에 대한 초점 위치의 초기 주사 범위를 설정하고, 결상 광학계를 제어함으로써, 설정한 초기 주사 범위 내의 복수의 초점 위치에 있어서의 세포의 상을 각각 결상시키고, 이어서 촬상부에 의하여 촬상된 복수의 초점 위치별 화상을 취득하며, 그 취득한 화상에 근거하여 세포의 두께를 추정하고, 그 추정한 세포의 두께에 근거하여, 초점 위치의 초기 주사 범위를 갱신하고, 결상 광학계를 제어함으로써, 그 갱신한 주사 범위 내의 복수의 초점 위치에 있어서의 세포의 상을 각각 결상시키는 것을 특징으로 한다.

또, 상기 본 발명의 세포 관찰 장치에 있어서, 결상 광학계 제어부는, 복수의 초점 위치별 화상에 근거하여, 세포의 두께 방향에 대하여 그 세포 전체가 촬상되었는지 여부를 판정하고, 세포 전체가 촬상되어 있지 않다고 판정한 경우에, 세포의 두께를 추정하며, 그 추정한 세포의 두께에 근거하여, 초점 위치의 초기 주사 범위의 갱신을 행하는 것이 바람직하다.

또, 상기 본 발명의 세포 관찰 장치에 있어서, 결상 광학계 제어부는, 세포의 두께 방향에 대하여 그 세포 전체가 촬상되어 있지 않다고 판정한 경우에, 그 촬상되어 있지 않은 범위를 새로운 초점 위치의 주사 범위로서 갱신할 수 있다.

또, 상기 본 발명의 세포 관찰 장치에 있어서, 결상 광학계 제어부는, 초점 위치별 화상의 에지 정보에 근거하여, 세포의 두께 방향에 대하여 그 세포 전체가 촬상되었는지 여부를 판정할 수 있다.

또, 상기 본 발명의 세포 관찰 장치에 있어서, 결상 광학계 제어부는, 세포의 설치면으로부터 가장 이간된 초점 위치의 화상 내에 세포의 에지가 존재하지 않는 경우에, 세포의 두께 방향에 대하여 그 세포 전체가 촬상되어 있다고 판정할 수 있다.

또, 상기 본 발명의 세포 관찰 장치에 있어서, 결상 광학계 제어부는, 과거에 다른 시점에서 촬상된 세포의 화상에 근거하여, 다음의 세포의 촬상 시점에 있어서의 초점 위치의 초기 주사 범위를 설정할 수 있다.

또, 상기 본 발명의 세포 관찰 장치에 있어서, 두께 정보 취득부는, 세포의 종류, 세포의 배양 기간, 세포의 배양 조건 및 세포의 크기 중 적어도 하나를 두께에 관련된 정보로서 취득할 수 있다.

또, 상기 본 발명의 세포 관찰 장치에 있어서, 결상 광학계 제어부는, 두께에 관련된 정보에 근거하여 설정한 초기 주사 범위 내에 있어서, 적어도 3개 이상의 초점 위치에 있어서의 세포의 상을 각각 결상시킬 수 있다.

또, 상기 본 발명의 세포 관찰 장치에 있어서는, 세포에 대하여 위상차 계측용 조명광을 조사하는 조명광 조사부를 마련하고, 결상 광학계에 의하여, 세포의 위상차상을 결상할 수 있다.

본 발명의 세포 관찰 방법은, 배양 용기 내에서 배양되는 세포의 상을 결상 광학계를 이용하여 결상하여 관찰하는 세포 관찰 방법으로서, 세포의 배양 용기 내의 설치면으로부터의 두께에 관련된 정보를 취득하고, 그 취득한 두께에 관련된 정보에 근거하여, 세포에 대한 초점 위치의 초기 주사 범위를 설정하고, 결상 광학계를 제어함으로써, 설정한 초기 주사 범위 내의 복수의 초점 위치에 있어서의 세포의 상을 각각 결상시켜 촬상하며, 이어서 그 촬상한 복수의 초점 위치별 화상을 취득하고, 그 취득한 화상에 근거하여 세포의 두께를 추정하며, 그 추정한 세포의 두께에 근거하여, 초점 위치의 초기 주사 범위를 갱신하고, 그 갱신한 주사 범위 내의 복수의 초점 위치에 있어서의 세포의 상을 각각 결상시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 세포 관찰 장치 및 방법에 의하면, 세포의 두께에 관련된 정보를 취득하고, 그 취득한 두께에 관련된 정보에 근거하여, 세포에 대한 초점 위치의 초기 주사 범위를 설정한다. 이와 같이 초기 주사 범위를 설정함으로써, 세포의 두께에 따라 주사 범위를 좁힐 수 있어, 쓸데없는 촬영을 방지할 수 있다.

그리고, 초기 주사 범위 내의 복수의 초점 위치에 있어서의 세포의 상을 각각 결상시켜 촬상하고, 이어서 그 촬상한 복수의 초점 위치별 화상을 취득하며, 그 취득한 화상에 근거하여 세포의 두께를 추정한다. 이로써, 실제로 배양된 세포의 두께를 추정할 수 있다.

이어서, 추정한 세포의 두께에 근거하여, 초점 위치의 초기 주사 범위를 갱신하고, 그 갱신한 주사 범위 내의 복수의 초점 위치에 있어서의 세포의 상을 각각 결상시키도록 했기 때문에, 세포 전체의 3차원적인 구조를 관찰할 수 있고, 또한 쓸데없는 촬영을 방지할 수 있다.

도 1은 본 발명의 세포 관찰 장치의 일 실시형태를 이용한 현미경 시스템의 개략 구성을 나타내는 도이다.
도 2는 배양 용기의 종류, 배양 기간 및 배양 조건과 초기 주사 범위를 대응시킨 테이블의 일례를 나타내는 도이다.
도 3은 초기 주사 범위의 설정을 설명하기 위한 도이다.
도 4는 초기 주사 범위의 갱신을 설명하기 위한 도이다.
도 5는 세포의 두께의 추정을 설명하기 위한 도이다.
도 6은 본 발명의 세포 관찰 장치의 일 실시형태를 이용한 현미경 시스템의 작용을 설명하기 위한 플로차트이다.
도 7은 과거의 화상에 근거하여 초기 주사 범위를 설정하는 방법을 설명하기 위한 도이다.

이하, 본 발명의 세포 관찰 장치 및 방법의 일 실시형태를 이용한 현미경 시스템에 대하여, 도면을 참조하면서 상세하게 설명한다. 도 1은, 본 실시형태의 현미경 시스템의 개략 구성을 나타내는 도이다.

본 실시형태의 현미경 시스템은, 도 1에 나타내는 바와 같이, 조명광 조사부(10)와, 결상 광학계(30)와, 촬상부(40)와, 현미경 제어 장치(50)와, 표시 장치(80)와, 입력 장치(90)를 구비하고 있다.

본 실시형태의 현미경 시스템에 있어서는, 조명광 조사부(10)와 결상 광학계(30)의 사이에, 스테이지(61)가 마련되어 있으며, 이 스테이지(61) 상에 배양 용기(60)가 재치되어, 지지된다. 배양 용기(60) 내에는, 배양액(C) 및 관찰 대상(S)이 수용되어 있다.

그리고, 본 실시형태의 현미경 시스템은, X방향, Y방향 및 Z방향으로 스테이지(61)를 이동시키는 스테이지 구동부(62)를 구비하고 있다. X방향 및 Y방향은, 관찰 대상(S)의 설치면(P)에 평행한 면 상에 있어서 서로 직교하는 방향이며, Z방향은, X방향 및 Y방향에 직교하는 방향이다.

본 실시형태의 현미경 시스템에 있어서는, 상술한 조명광 조사부(10), 결상 광학계(30), 촬상부(40), 스테이지(61), 스테이지 구동부(62) 및 결상 광학계 구동부(34)로부터 위상차 현미경 본체가 구성되고, 현미경 제어 장치(50)는, 이 위상차 현미경 본체를 제어하는 것이다. 또한, 본 실시형태에 있어서는, 위상차 현미경 본체와, 현미경 제어 장치(50)에 있어서의 후술하는 결상 광학계 제어부(51) 및 두께 정보 취득부(53)로 본 발명의 세포 관찰 장치가 구성되어 있다. 이하, 위상차 현미경 본체의 구체적인 구성을 설명한다.

조명광 조사부(10)는, 배양 용기(60) 내에 수용된 관찰 대상(S)에 대하여, 이른바 위상차 계측을 위한 조명광을 조사하는 것이며, 본 실시형태에서는, 그 위상차 계측용 조명광으로서 링 형상 조명광을 조사한다. 구체적으로는, 본 실시형태의 조명광 조사부(10)는, 위상차 계측용 백색광을 출사하는 백색 광원(11)과, 링 형상의 슬릿을 갖고, 백색 광원(11)으로부터 출사된 백색광이 입사되어 링 형상 조명광을 출사하는 슬릿판(12)과, 슬릿판(12)으로부터 출사된 링 형상 조명광이 입사되어, 그 입사된 링 형상 조명광을 관찰 대상(S)에 대하여 조사하는 콘덴서 렌즈(13)를 구비하고 있다.

슬릿판(12)은, 백색 광원(11)으로부터 출사된 백색광을 차광하는 차광판에 대하여 백색광을 투과하는 링 형상의 슬릿이 마련된 것이며, 백색광이 슬릿을 통과함으로써 링 형상 조명광이 형성된다.

또한, 본 실시형태에 있어서는, 상술한 바와 같이 슬릿판(12)을 이용하여 링 형상 조명광을 형성하도록 했지만, 링 형상 조명광을 형성하는 방법으로서는, 이에 한정하지 않고, 예를 들어 공간 광변조 소자 등을 이용하여 링 형상 조명광을 형성하도록 해도 된다.

또, 본 실시형태에 있어서는, 위상차 계측용 조명광으로서 링 형상 조명광을 이용하도록 했지만, 링 형상 이외의 구조를 갖는 조명광이어도 되고, 후술하는 위상판(32)과 공액인 형상이면 삼각 형상이나 사각 형상 등 그 외의 형상이어도 된다.

스테이지(61) 상에 설치된 배양 용기(60) 내에는, 관찰 대상(S)으로서, 배양되는 세포가 배치된다. 배양되는 세포로서는, iPS(induced pluripotent stem) 세포 및 ES(embryonic stem) 세포와 같은 다능성 줄기 세포, 줄기 세포로부터 분화 유도된 신경, 피부, 심근 및 간장의 세포와, 인체로부터 취출된 피부, 망막, 심근, 혈구, 신경 및 장기의 세포 등이 있다. 또한, 본 명세서에 있어서 세포와 같은 경우, 하나의 세포뿐만 아니라, 복수의 세포가 집합한 세포군(세포 콜로니)도 포함하는 것으로 한다. 또 본 실시형태에서는, 배양 용기(60)의 바닥부와 관찰 대상(S)의 경계면을 관찰 대상(S)의 설치면(P)이라고 한다. 배양 용기(60)로서는, 샬레 및 복수의 웰이 배열된 웰 플레이트 등을 이용할 수 있다. 웰 플레이트의 경우, 각 웰에 관찰 대상(S) 및 배양액(C)이 수용된다.

결상 광학계(30)는, 배양 용기(60) 내의 관찰 대상(S)의 상을 촬상부(40)에 결상하는 것이며, 대물 렌즈(31)와, 위상판(32)과, 결상 렌즈(33)를 구비한다.

위상판(32)은, 링 형상 조명광의 파장에 대하여 투명한 투명판에 대하여 위상 링을 형성한 것이다. 또한, 상술한 슬릿판(12)의 슬릿의 크기는, 이 위상링과 공액인 관계에 있다.

위상링은, 입사된 광의 위상을 1/4 파장 어긋나게 하는 위상막과, 입사된 광을 감광하는 감광 필터가 링 형상으로 형성된 것이다. 위상판(32)에 입사된 직접광은 위상링을 통과함으로써 위상이 1/4 파장 어긋남과 함께, 그 밝기가 약해진다. 한편, 관찰 대상(S)에 의하여 회절된 회절광은 대부분이 위상판(32)의 투명판의 부분을 통과하고, 그 위상 및 밝기는 변화하지 않는다.

결상 렌즈(33)는, 위상판(32)을 통과한 직접광 및 회절광이 입사되어, 이들 광을 촬상부(40)에 결상하는 것이다.

결상 광학계 구동부(34)는, 후술하는 결상 광학계 제어부(51)로부터 출력된 제어 신호에 근거하여, 대물 렌즈(31)를 도 1에 나타내는 Z방향으로 이동시키는 기구를 구비한 것이며, 결상 광학계 구동부(34)에 의한 대물 렌즈(31)의 이동에 의하여 결상 광학계(30)의 초점 위치가 변경된다.

결상 광학계(30)는, 그 광학 배율을 변경 가능하게 구성하도록 해도 된다. 광학 배율을 변경하는 방법으로서는, 예를 들어 서로 다른 배율을 갖는 복수의 대물 렌즈(31)를 결상 광학계(30)에 마련하고, 이 복수의 대물 렌즈(31)를 자동적으로 전환하도록 하면 된다. 이때, 위상판(32)도 대물 렌즈(31)의 변경에 따라 변경된다. 또 유저가 대물 렌즈(31)를 수동으로 교환함으로써 변경하도록 해도 된다.

촬상부(40)는, 결상 렌즈(33)에 의하여 결상된 관찰 대상(S)의 상을 수광하고, 관찰 대상(S)의 위상차 화상을 촬상하는 촬상 소자를 구비한 것이다. 촬상 소자로서는, CCD(charge-coupled device) 이미지 센서나 CMOS(Complementary Metal-Oxide Semiconductor) 이미지 센서 등을 이용할 수 있다.

현미경 제어 장치(50)는, CPU(Central Processing Unit), 반도체 메모리 및 하드 디스크 등을 구비한 컴퓨터로 구성되는 것이다.

현미경 제어 장치(50)는, 위상차 현미경 본체 전체의 동작을 제어하는 것이며, 구체적으로는 도 1에 나타내는 바와 같이, 결상 광학계 구동부(34)를 제어하는 결상 광학계 제어부(51)와, 스테이지 구동부(62)를 제어하는 스테이지 제어부(52)와, 두께 정보 취득부(53)를 구비하고 있다.

결상 광학계 제어부(51)는, 결상 광학계 구동부(34)를 제어하여 대물 렌즈(31)를 Z방향으로 이동시키고, 이로써 결상 광학계(30)의 초점 위치를 변경하는 것이다. 본 실시형태에 있어서의 결상 광학계 제어부(51)는, 관찰 대상(S)의 위상차 화상을 촬상할 때, Z방향에 대하여 복수의 초점 위치를 설정하고, 그 초점 위치별 위상차 화상을 촬상한다. 이로써 관찰 대상(S)의 두께 방향에 대하여, 복수의 위상차 화상을 촬상할 수 있어, 관찰 대상(S)의 3차원적인 구조를 관찰할 수 있다. 또한, 관찰 대상(S)의 두께란, 관찰 대상(S)(세포)의 배양 용기(60)의 설치면(P)으로부터의 두께를 말한다.

또, 결상 광학계 제어부(51)는, 두께 정보 취득부(53)에 의하여 취득된 관찰 대상(S)의 두께에 관련된 정보에 근거하여, 그 관찰 대상(S)에 대한 초점 위치의 초기 주사 범위와 초기 주사 피치를 설정한다. 그리고, 결상 광학계(30)를 제어함으로써, 그 설정한 초기 주사 범위 내의 복수의 초점 위치에 있어서의 관찰 대상(S)의 상을 각각 결상시키는 것이다. 또한, 초기 주사 피치란, 초기 주사 범위 내에 있어서의 복수의 초점 위치 간의 거리이다. 초기 주사 범위 내의 초점 위치의 수는 적어도 3개 이상인 것이 바람직하다. 또 관찰 대상(S)의 두께에 관련된 정보에 근거하는 초기 주사 범위의 설정에 대해서는, 나중에 상세하게 설명한다.

스테이지 제어부(52)는, 스테이지 구동부(62)를 구동 제어하고, 이로써 스테이지(61)를 X방향, Y방향 및 Z방향으로 이동시키는 것이다. 스테이지(61)가, X방향 및 Y방향으로 이동함으로써, 예를 들어 1개의 셀 내가 위상차 계측용 조명광으로 주사되어, 1개의 셀 내에서 분할된 복수의 촬상 영역(시야)별 위상차 화상이 촬상된다.

두께 정보 취득부(53)는, 관찰 대상(S)(세포)의 두께에 관련된 정보를 취득하는 것이다. 두께에 관련된 정보로서는, 예를 들어 세포의 종류의 정보, 세포의 배양 기간의 정보, 세포의 배양 조건의 정보, 및 세포의 크기의 정보 등이 있지만, 본 실시형태에 있어서는, 세포의 종류의 정보, 세포의 배양 기간의 정보 및 세포의 배양 조건의 정보를 취득한다. 또한, 세포의 크기의 정보란, 세포의 X-Y방향의 크기를 나타내는 정보이다.

또, 세포의 종류의 정보란, 상술한 다능성 줄기 세포, 분화 유도 후의 신경 세포 및 분화 유도 후의 피부 세포 등과 같은 배양 대상의 세포의 종류를 나타내는 정보이다. 세포의 종류의 정보는, 유저가 입력 장치(90)를 이용하여 설정 입력해도 되고, 예를 들어 배양 용기(60)에 대하여 세포의 종류의 정보가 기록된 바코드 또는 IC(Integrated Circuit)칩 등의 기록 매체를 마련해 두고, 그 기록 매체로부터 독출함으로써 취득하도록 해도 된다.

또, 세포의 배양 기간의 정보는, 세포의 배양을 개시한 후의 기간 또는 배양되는 세포에 대하여 약제 등을 첨가한 후 경과한 기간 등을 나타내는 정보이다. 세포의 배양 기간의 정보는, 유저가 입력 장치(90)를 이용하여 설정 입력해도 되고, 타이머 등을 마련하여 자동 계측하도록 해도 된다.

또, 세포의 배양 조건의 정보로서는, 예를 들어 배양액(C)(배지)의 종류, 성장 인자의 종류 및 양과, 첨가되는 약제의 종류 및 양 등의 정보가 있지만, 세포의 성장 속도에 영향을 주는 조건이면 그 외의 조건이어도 된다. 세포의 배양 조건의 정보에 대해서도, 유저가 입력 장치(90)를 이용하여 설정 입력해도 되고, 예를 들어 배양 용기(60)에 대하여 세포의 배양 조건의 정보가 기록된 바코드 또는 IC(Integrated Circuit)칩 등의 기록 매체를 마련해 두고, 그 기록 매체로부터 독출함으로써 취득하도록 해도 된다.

그리고, 두께 정보 취득부(53)에 의하여 취득된 세포의 종류의 정보, 배양 기간의 정보 및 배양 조건의 정보는, 결상 광학계 제어부(51)에 의하여 취득된다. 결상 광학계 제어부(51)에는, 도 2에 나타내는 바와 같은, 세포의 종류의 정보, 배양 기간의 정보 및 배양 조건의 정보와, 결상 광학계(30)의 초점 위치의 초기 주사 범위의 정보를 대응시킨 테이블이 미리 설정되어 있다.

결상 광학계 제어부(51)는, 취득한 세포의 종류의 정보, 배양 기간의 정보 및 배양 조건의 정보에 근거하여, 도 2에 나타내는 테이블을 참조함으로써, 결상 광학계(30)의 초점 위치의 초기 주사 범위를 설정한다. 그리고, 결상 광학계 제어부(51)는, 결상 광학계(30)를 제어함으로써, 초기 주사 범위 내의 복수의 초점 위치에 초점을 맞추어, 각 초점 위치에 있어서의 관찰 대상(S)의 상을 각각 결상시킨다. 또한, 본 실시형태에 있어서는, 초기 주사 피치는 고정값으로 하지만, 초기 주사 피치에 대해서도, 두께에 관련된 정보에 근거하여 변경하도록 해도 된다. 예를 들어 세포의 두께가 커질수록 초기 주사 피치를 크게 하도록 하면 된다. 그 경우, 초기 주사 범위 내에 있어서의 복수의 초점 위치가 항상 동일한 수가 되도록 설정하도록 해도 된다. 즉, 관찰 대상(S)에 대하여 촬상되는 위상차 화상의 매수가 항상 동일한 매수가 되도록 해도 된다.

또, 관찰 대상(S)의 두께에 관련된 정보로서, 세포의 크기의 정보를 취득하는 경우에는, 세포의 크기와 초기 주사 범위를 대응시킨 테이블을 미리 설정해 두면 된다. 세포의 크기의 정보에 대해서는, 예를 들어 유저가 입력 장치(90)를 이용하여 설정 입력하면 된다.

상술한 바와 같이, 결상 광학계 제어부(51)가, 관찰 대상(S)의 두께에 관련된 정보에 근거하여, 결상 광학계(30)의 초점 위치의 초기 주사 범위를 설정함으로써, 예를 들면 도 3에 나타내는 바와 같이, 관찰 대상(S)의 두께에 따른 초기 주사 범위 R1을 설정할 수 있고, 이로써 두께 방향에 대하여 관찰 대상(S) 전체에 걸친 복수의 위상차 화상을 촬상할 수 있으며, 또한 쓸데없는 위상차 화상의 촬상을 줄일 수 있다.

여기에서, 상술한 두께에 관련된 정보는, 관찰 대상(S)의 두께를 직접 계측한 정보는 아니고, 관찰 대상(S)의 두께를 간접적으로 나타내는 정보이기 때문에, 반드시 도 3에 나타내는 바와 같이, 관찰 대상(S)의 실제의 두께와 초기 주사 범위 R1이 동등한 크기가 되는 것은 아니며, 이들이 다른 크기가 될 가능성도 있다. 즉, 관찰 대상(S)의 두께와 초기 주사 범위 R1의 관계가, 도 4에 나타내는 바와 같은 관계가 될 가능성도 있다.

이 경우, 초기 주사 범위 R1에 대응하는 관찰 대상(S)의 범위의 위상차 화상은 촬상할 수 있지만, 도 4에 나타내는 RX의 범위에 대해서는, 관찰 대상(S)의 위상차 화상을 촬상하지 못하고, 이로써 두께 방향에 대하여 관찰 대상(S) 전체에 걸친 위상차 화상을 촬상하지 못하여, RX의 범위의 관찰 대상(S)의 구조 등을 관찰할 수 없다. 또한, 여기에서 말하는 관찰 대상(S) 전체란, 예를 들어 관찰 대상(S)으로서 복수의 세포가 있는 경우에는, 그 복수의 세포의 모두를 포함시키는 것으로 한다.

따라서, 결상 광학계 제어부(51)는, 초기 주사 범위 R1 내에 있어서 초점 위치를 주사함으로써 촬상된 초점 위치별 위상차 화상을 취득하고, 그 취득한 위상차 화상에 근거하여, 관찰 대상(S) 전체에 걸친 위상차 화상이 촬상되었는지 여부를 판정한다. 그리고, 관찰 대상(S) 전체에 걸친 위상차 화상이 촬상되어 있지 않은 경우에는, 초점 위치별 위상차 화상에 근거하여, 관찰 대상(S)의 두께를 추정하고, 그 추정한 관찰 대상(S)의 두께에 근거하여, 초점 위치의 초기 주사 범위를 갱신한다. 이하, 관찰 대상(S) 전체에 걸친 위상차 화상이 촬상되었는지 여부를 판정하고, 관찰 대상(S)의 두께를 추정하는 방법에 대하여 상세하게 설명한다.

결상 광학계 제어부(51)는, 먼저, 초점 위치별 위상차 화상에 포함되는 세포의 에지를 추출한다. 위상차 화상에 포함되는 세포의 에지의 추출 방법으로서는, 공지인 화상 처리를 이용할 수 있다. 그리고, 결상 광학계 제어부(51)는, 각 위상차 화상의 초점 위치(Z방향)를 가로축으로 하고, 각 위상차 화상의 에지의 양을 세로축으로 하여, 각 초점 위치의 위상차 화상의 에지양을 플롯하고, 보간(補間) 연산 등을 행함으로써, 도 5에 실선을 이용하여 나타내는 바와 같은 에지양의 프로파일을 취득한다. 또한, 도 5에 있어서의 가로축의 정방향(도면 상에서 우측 방향)은, 관찰 대상(S)의 설치면(P)으로부터 이간되는 방향이다.

여기에서, 관찰 대상(S)의 실제의 두께와 초기 주사 범위 R1의 관계가, 예를 들어 도 4에 나타내는 바와 같은 관계인 경우에는, 즉 초기 주사 범위 R1보다 관찰 대상(S)의 실제의 두께가 큰 경우에는, 에지양의 프로파일은, 도 5에 실선을 이용하여 나타내는 바와 같은 프로파일이 된다. 즉, 에지양의 프로파일은 제로에 수렴하지 않고, 에지양(E1)의 위치까지의 프로파일이 된다. 에지양(E1)은, 초기 주사 범위 R1 내에 있어서 관찰 대상(S)의 설치면으로부터 가장 이간된 초점 위치의 위상차 화상의 에지양이다.

결상 광학계 제어부(51)는, 이와 같이 에지양의 프로파일이 제로에 수렴하지 않는 경우에는, 관찰 대상(S) 전체에 걸친 위상차 화상이 촬상되어 있지 않다고 판정한다. 그리고, 외삽 처리 등을 행함으로써, 도 5에 점선을 이용하여 나타내는 바와 같이, 제로에 수렴하는 프로파일로 하고, 에지양이 제로에 수렴한 초점 위치까지의 범위를 관찰 대상(S)의 두께로서 추정한다. 즉, 도 5에 나타내는 바와 같은 프로파일의 경우, 초기 주사 범위 R1에 대하여 RX를 더한 범위를 관찰 대상(S)의 두께로서 추정한다.

그리고, 결상 광학계 제어부(51)는, 초점 위치의 주사 범위를 R1로부터 RX로 갱신하고, 앞의 위상차 화상의 촬상에 있어서 촬상되지 않았던 범위(도 4에 나타내는 RX의 범위)의 위상차 화상이 촬상되도록 결상 광학계(30)를 제어한다. 또한, 결상 광학계 제어부(51)는, 에지양의 프로파일이 제로에 수렴하는 경우, 즉 초기 주사 범위 R1 내에 있어서 관찰 대상(S)의 설치면(P)으로부터 가장 이간된 초점 위치의 위상차 화상 내에 세포의 에지가 존재하지 않는 경우에는, 관찰 대상(S) 전체에 걸친 위상차 화상이 촬상되어 있다고 판정하여, 추가적인 위상차 화상의 촬상은 행하지 않는다.

또한, 관찰 대상(S)으로서 복수의 세포가 있는 경우에는, 그 세포별에 대하여 전체에 걸친 위상차 화상이 촬상되어 있는지 여부를 판정해도 된다. 그리고, 전체에 걸친 위상차 화상이 촬상되어 있지 않은 세포에만 대하여 두께의 추정을 행하고, 그 세포의 촬상되지 않았던 범위의 위상차 화상이 촬상되도록 결상 광학계(30) 및 스테이지 구동부(62)를 제어해도 된다.

도 1로 되돌아와, 현미경 제어 장치(50)에는, 입력 장치(90)와 표시 장치(80)가 접속되어 있다. 입력 장치(90)는, 키보드나 마우스 등의 입력 디바이스를 구비한 것이며, 유저에 의한 설정 입력을 접수하는 것이다. 특히, 본 실시형태에 있어서의 입력 장치(90)는, 상술한 세포의 종류의 정보, 배양 기간의 정보 및 배양 조건의 정보 등의 설정 입력을 접수하는 것이다.

표시 장치(80)는, 액정 디스플레이 등의 표시 디바이스로부터 구성되는 것이며, 촬상부(40)에 있어서 촬상된 위상차 화상 등을 표시하는 것이다. 또한, 표시 장치(80)를 터치 패널에 의하여 구성함으로써, 입력 장치(90)를 겸용하도록 해도 된다.

다음으로, 본 실시형태의 현미경 시스템의 작용에 대하여, 도 6에 나타내는 플로차트를 참조하면서 설명한다.

먼저, 관찰 대상(S)이 수용된 배양 용기(60)가 스테이지(61) 상에 설치된다(S10). 그리고, 유저에 의한 설정 입력 등에 의하여, 세포의 종류의 정보, 배양 기간의 정보 및 배양 조건의 정보 등의 세포의 두께에 관련된 정보가 취득된다(S12).

세포의 종류의 정보, 배양 기간의 정보 및 배양 조건의 정보는 결상 광학계 제어부(51)에 의하여 취득되고, 결상 광학계 제어부(51)는, 이들 정보에 근거하여, 결상 광학계(30)의 초점 위치의 초기 주사 범위를 설정한다(S14).

그리고, 조명광 조사부(10)로부터 배양 용기(60)를 향하여 링 형상 조명광이 조사되고, 상기 초기 주사 범위 내에 있어서 결상 광학계(30)의 초점 위치가 주사되어, 초점 위치별 관찰 대상(S)의 위상차 화상의 촬상이 행해진다(S16).

초점 위치별 위상차 화상은 결상 광학계 제어부(51)에 의하여 취득되고, 결상 광학계 제어부(51)는, 그 취득한 복수의 위상차 화상에 근거하여, 관찰 대상(S) 전체에 걸친 위상차 화상이 촬상되었는지 여부를 판정한다(S18).

결상 광학계 제어부(51)는, 관찰 대상(S) 전체에 걸친 위상차 화상이 촬상되어 있지 않다고 판정한 경우에는, 초점 위치별 위상차 화상에 근거하여, 관찰 대상(S)의 두께를 추정하고(S20), 그 추정한 관찰 대상(S)의 두께에 근거하여, 초점 위치의 초기 주사 범위를 갱신한다(S22).

그리고, 갱신된 주사 범위 내에 있어서 결상 광학계(30)의 초점 위치가 주사되어, 초점 위치별 관찰 대상(S)의 위상차 화상의 촬상이 행해져, 앞의 위상차 화상의 촬상에 있어서 촬상되지 않았던 범위의 위상차 화상이 취득된다(S24).

한편, S18에 있어서, 관찰 대상(S) 전체에 걸친 위상차 화상이 촬상되어 있다고 판정된 경우에는, 추가적인 위상차 화상의 촬상은 행해지지 않는다.

상기와 같이 하여 촬상된 관찰 대상(S)의 초점 위치별 위상차 화상은 표시 장치(80)에 출력되어 표시된다(S26). 초점 위치별 위상차 화상을 표시할 때, 이들 위상차 화상을 순차 전환하여 표시하도록 해도 되고, 나열하여 표시하도록 해도 된다.

상기 실시형태의 현미경 시스템에 의하면, 세포의 두께에 관련된 정보를 취득하고, 그 취득한 두께에 관련된 정보에 근거하여, 세포에 대한 초점 위치의 초기 주사 범위를 설정한다. 이와 같이 초기 주사 범위를 설정함으로써, 세포의 두께에 따라 주사 범위를 좁힐 수 있어, 쓸데없는 촬영을 방지할 수 있다.

그리고, 초기 주사 범위 내의 복수의 초점 위치에 있어서의 세포의 상을 각각 결상시켜 촬상하며, 이어서 그 촬상한 복수의 초점 위치별 위상차 화상을 취득하고, 그 취득한 위상차 화상에 근거하여 세포의 두께를 추정한다. 이로써, 실제로 배양된 세포의 두께를 추정할 수 있다.

이어서, 그 추정한 세포의 두께에 근거하여, 초점 위치의 초기 주사 범위를 갱신하고, 그 갱신한 주사 범위 내의 복수의 초점 위치에 있어서의 세포의 상을 각각 결상시키도록 했기 때문에, 세포 전체의 3차원적인 구조를 관찰할 수 있고, 또한 쓸데없는 촬영을 방지할 수 있다.

또한, 상기 실시형태의 현미경 시스템을 이용하여, 예를 들어 타임 랩스 촬영을 행하는 경우, 위상차 화상의 각 촬영 시점에 있어서, 상술한 바와 같이 세포의 두께에 관련된 정보에 근거하여, 초기 주사 범위를 설정하도록 해도 되지만, 이에 한정하지 않고, 예를 들어 3회째 이후의 촬상 시점에 있어서는, 적어도 2회의 과거의 촬상 시점에 있어서 촬상된 위상차 화상에 근거하여, 초기 주사 범위를 설정하도록 해도 된다.

구체적으로는, 예를 들어 결상 광학계 제어부(51)가, 도 7에 나타내는 바와 같이, 1회째의 촬상에 의하여 취득한 위상차 화상에 포함되는 세포의 크기 D1과, 2회째의 촬상에 의하여 취득한 위상차 화상에 포함되는 세포의 크기 D2를 산출하고, 이들 세포의 크기의 정보에 근거하여, 예를 들어 외삽 처리를 행하는 등 하여 3회째의 촬상 시점에 있어서의 세포의 크기 D3을 추정한다. 그리고, 이 3회째의 촬상 시점에 있어서의 세포의 크기 D3에 근거하여, 세포의 두께를 추정하고, 그 추정한 두께에 근거하여, 초기 주사 범위를 설정하도록 해도 된다.

또한, 이때 초기 주사 피치에 대해서도, 상기 실시형태와 마찬가지로, 세포의 두께에 따른 초기 주사 피치를 설정하도록 해도 된다. 또 3회째의 촬상 시점에 한정하지 않고, 4회째 이후의 촬상 시점에 있어서도, 마찬가지로 하여 4회째 이후의 시점에 있어서의 세포의 크기를 추정하고, 그 세포의 크기에 근거하여, 세포의 두께를 추정해도 된다.

또, 세포의 크기와 세포의 두께의 관계에 대해서는, 룩업 테이블 또는 함수 등에 의하여 미리 설정하면 된다. 또 이와 같은 룩업 테이블 또는 함수 등을 세포의 종류별, 배양 기간별 또는 배양 조건별로 설정하도록 해도 된다.

또, 상기 실시형태에 있어서, 초기 주사 범위와 초기 주사 피치에 대해서는, 사용하는 대물 렌즈(31)의 배율 및/또는 조명광의 파장에 따라 변경해도 된다. 구체적으로는, 대물 렌즈의 배율이 높을수록 피사계 심도가 얕아지므로 초기 주사 범위 및 초기 주사 피치를 좁게 해도 된다. 또 조명광의 파장이 짧을수록 피사계 심도가 얕아지므로 초기 주사 범위 및 초기 주사 피치를 좁게 해도 된다.

또, 상기 실시형태는, 본 발명을 위상차 현미경에 적용한 것이지만, 본 발명은 위상차 현미경에 한정하지 않고, 미분 간섭 현미경 및 명시야 현미경 등의 그 외의 현미경에 적용하도록 해도 된다.

10 조명광 조사부
11 백색 광원
12 슬릿판
13 콘덴서 렌즈
30 결상 광학계
31 대물 렌즈
32 위상판
33 결상 렌즈
34 결상 광학계 구동부
40 촬상부
50 현미경 제어 장치
51 결상 광학계 제어부
52 스테이지 제어부
53 정보 취득부
60 배양 용기
61 스테이지
62 스테이지 구동부
80 표시 장치
90 입력 장치
C 배양액
P 설치면
R1 초기 주사 범위
RX 주사 범위
S 관찰 대상

Claims

배양 용기 내에서 배양되는 세포의 상을 결상하는 결상 광학계와,
상기 결상 광학계의 초점 위치의 주사 범위를 제어하는 결상 광학계 제어부와,
상기 세포의 상기 배양 용기 내의 설치면으로부터의 두께에 관련된 정보를 취득하는 두께 정보 취득부와,
상기 결상 광학계에 의하여 결상된 상을 수광하여, 상기 세포의 화상을 촬상하는 촬상부를 구비하고,
상기 결상 광학계 제어부가, 상기 두께에 관련된 정보에 근거하여, 상기 세포에 대한 초점 위치의 초기 주사 범위를 설정하고, 상기 결상 광학계를 제어함으로써, 상기 설정한 초기 주사 범위 내의 복수의 초점 위치에 있어서의 상기 세포의 상을 각각 결상시키고, 이어서 상기 촬상부에 의하여 촬상된 상기 복수의 초점 위치별 화상을 취득하며, 상기 취득한 화상에 근거하여 상기 세포의 두께를 추정하고, 상기 추정한 세포의 두께에 근거하여, 상기 초점 위치의 초기 주사 범위를 갱신하고, 상기 결상 광학계를 제어함으로써, 상기 갱신한 주사 범위 내의 복수의 초점 위치에 있어서의 상기 세포의 상을 각각 결상시키는 것을 특징으로 하는 세포 관찰 장치.
청구항 1에 있어서,
상기 결상 광학계 제어부가, 상기 복수의 초점 위치별 화상에 근거하여, 상기 세포의 두께 방향에 대하여 상기 세포 전체가 촬상되었는지 여부를 판정하고, 상기 세포 전체가 촬상되어 있지 않다고 판정한 경우에, 상기 세포의 두께를 추정하며, 상기 추정한 세포의 두께에 근거하여, 상기 초점 위치의 초기 주사 범위의 갱신을 행하는 세포 관찰 장치.
청구항 2에 있어서,
상기 결상 광학계 제어부가, 상기 세포의 두께 방향에 대하여 상기 세포 전체가 촬상되어 있지 않다고 판정한 경우에, 상기 촬상되어 있지 않은 범위를 새로운 상기 초점 위치의 주사 범위로서 갱신하는 세포 관찰 장치.
청구항 2 또는 청구항 3에 있어서,
상기 결상 광학계 제어부가, 상기 초점 위치별 화상의 에지 정보에 근거하여, 상기 세포의 두께 방향에 대하여 상기 세포 전체가 촬상되었는지 여부를 판정하는 세포 관찰 장치.
청구항 4에 있어서,
상기 결상 광학계 제어부가, 상기 세포의 설치면으로부터 가장 이간된 초점 위치의 화상 내에 상기 세포의 에지가 존재하지 않는 경우에, 상기 세포의 두께 방향에 대하여 상기 세포 전체가 촬상되어 있다고 판정하는 세포 관찰 장치.
청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
상기 결상 광학계 제어부가, 과거에 다른 시점에서 촬상된 상기 세포의 화상에 근거하여, 다음의 상기 세포의 촬상 시점에 있어서의 상기 초점 위치의 초기 주사 범위를 설정하는 세포 관찰 장치.
청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
상기 두께 정보 취득부가, 상기 세포의 종류, 상기 세포의 배양 기간, 상기 세포의 배양 조건 및 상기 세포의 크기 중 적어도 하나를 상기 두께에 관련된 정보로서 취득하는 세포 관찰 장치.
청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
상기 결상 광학계 제어부가, 상기 두께에 관련된 정보에 근거하여 설정한 초기 주사 범위 내에 있어서, 적어도 3개 이상의 초점 위치에 있어서의 상기 세포의 상을 각각 결상시키는 세포 관찰 장치.
청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포에 대하여 위상차 계측용 조명광을 조사하는 조명광 조사부를 구비하고,
상기 결상 광학계가, 상기 세포의 위상차상을 결상하는 세포 관찰 장치.
배양 용기 내에서 배양되는 세포의 상을 결상 광학계를 이용하여 결상하여 관찰하는 세포 관찰 방법으로서,
상기 세포의 상기 배양 용기 내의 설치면으로부터의 두께에 관련된 정보를 취득하고,
상기 취득한 두께에 관련된 정보에 근거하여, 상기 세포에 대한 초점 위치의 초기 주사 범위를 설정하고, 상기 결상 광학계를 제어함으로써, 상기 설정한 초기 주사 범위 내의 복수의 초점 위치에 있어서의 상기 세포의 상을 각각 결상시켜 촬상하며,
이어서 상기 촬상한 상기 복수의 초점 위치별 화상을 취득하고, 상기 취득한 화상에 근거하여 상기 세포의 두께를 추정하며, 상기 추정한 세포의 두께에 근거하여, 상기 초점 위치의 초기 주사 범위를 갱신하고, 상기 갱신한 주사 범위 내의 복수의 초점 위치에 있어서의 상기 세포의 상을 각각 결상시키는 것을 특징으로 하는 세포 관찰 방법.