JP2016161610A - 撮像装置および方法 - Google Patents

Abstract

【課題】位相差像の蛍光像の両方を撮像し、かつタイリング撮像を行う撮像装置および方法において、培養液などの動揺に起因する位相差像のムラを抑制し、かつ撮像の効率化を図ることが可能な撮像装置および方法を提供する。
【解決手段】観察対象を含む撮像領域に照明光および励起光をそれぞれ照射し、撮像領域内において撮像対象範囲を移動させ、撮像対象範囲毎に、照明光の照射による位相差像と励起光の照射による蛍光像をそれぞれ撮像する撮像する際、撮像対象範囲毎に、予め設定されたパターンを有するオートフォーカス用照明光を照射してオートフォーカス用の像の撮像を行い、そのオートフォーカス用の像に基づいてオートフォーカス制御を行い、そのオートフォーカス制御された焦点位置で蛍光像の撮像を行った後、その焦点位置を維持したままで位相差像の撮像を行う。
【選択図】図１

Description

本発明は、観察対象の位相差像および蛍光像を撮像する撮像装置および方法に関するものである。

従来、細胞群などの観察対象の位相差像と蛍光像との両方を撮像する顕微鏡装置が提案されている（たとえば特許文献１参照）。

このような顕微鏡装置において、たとえば蛍光像を撮像した後に位相差像を撮像する場合、蛍光像は微弱な蛍光を撮像したものであるため、これに基づいてオートフォーカス制御を行うと、高精度に合焦させることが難しく、その焦点位置を位相差像の撮像においてそのまま用いることができない。

これに対し、位相差像を撮像した後に蛍光像を撮像する場合、位相差像を用いて画像コントラストによるオートフォーカス制御を行うことができるので、高精度に合焦させることができ、その焦点位置を蛍光像の撮像でもそのまま用いることができる。したがって、蛍光像の撮像の際に、オートフォーカス制御を行う必要がなく、その分、撮像処理を高速化することができる。

特開２００５−３１６３８３号公報 特開２００３−０１５０４８号公報

ここで、顕微鏡装置を用いた撮像では、いわゆるタイリング撮像を行う場合がある。タイリング撮像とは、狭視野画像をオーバラップしないように複数撮像し、後処理においてその複数の狭視野画像を連結して広視野画像を生成する撮像方法である。

このようなタイリング撮像では、１枚の狭視野画像を撮像する毎に、観察対象が設置されたステージが移動するが、このステージの移動によって培養液液面が動揺し、位相差像を撮像するタイミングでも動揺が収まらずに、透過照明光の乱反射が起こることで視野内または視野間で明るさのムラが生じる問題がある。

この問題を解決するには、ステージの移動速度を培養液液面の動揺が発生しない程度まで遅くするか、または培養液液面の動揺が収まるまで位相差像の撮像を待てば良いが、このようにして位相差像を撮像した後に蛍光像を撮像したのでは、非効率であり、撮像時間が長くなってしまう。したがって、ステージを移動した後、蛍光像を撮像し、その後、培養液液面の動揺が収まった後に位相差像を撮像することが考えられるが、この場合、上述したように、蛍光像に基づいてオートフォーカス制御した焦点位置を位相差像の撮像においてそのまま用いることができないので、やはり非効率であり、撮像時間が長くなってしまう。なお、蛍光像は、位相差像のように透過照明光を撮像するものではないので、培養液液面の動揺の影響が少ない。

なお、特許文献２においては、観察対象の蛍光像を撮像する装置が提案されているが、位相差像と蛍光像との両方を撮像する際の効率的な撮像方法については、何も提案されていない。

本発明は、上記の問題に鑑み、位相差像と蛍光像の両方を撮像し、かつ上述したようなタイリング撮像を行う撮像装置および方法において、上述した培養液の動揺に起因する位相差像の明るさのムラを抑制することができ、かつ撮像処理の効率化を図ることができる撮像装置および方法を提供することを目的とする。

本発明の撮像装置は、観察対象を含む撮像領域に照明光を照射する照明光照射部と、撮像領域に励起光を照射する励起光照射部と、撮像領域に、予め設定されたパターンを有するオートフォーカス用照明光を照射するオートフォーカス用照明光照射部と、撮像領域内において撮像対象範囲を移動させ、撮像対象範囲毎に、照明光の照射による位相差像と励起光の照射による蛍光像とオートフォーカス用照明光によるオートフォーカス用の像とをそれぞれ撮像する撮像部であって、オートフォーカス制御される光学系を有する撮像部と、照明光照射部、励起光照射部、オートフォーカス用照明光照射部および撮像部を制御することによって、撮像対象範囲毎に、オートフォーカス用照明光を照射してオートフォーカス用の像の撮像を行い、そのオートフォーカス用の像に基づいて光学系のオートフォーカス制御を行い、そのオートフォーカス制御された焦点位置で蛍光像の撮像を行った後、焦点位置を維持したままで位相差像の撮像を行う制御部とを備えたことを特徴とする。

また、本発明の撮像装置においては、上記予め設定されたパターンは、縞状のパターンであることが好ましい。

また、本発明の撮像装置においては、制御部は、オートフォーカス用照明光の照射によるオートフォーカス用の像に基づくオートフォーカス制御を行い、そのオートフォーカス制御された焦点位置で蛍光像の撮像を行った後、焦点位置を維持したままで位相差像の撮像を行う第１の制御と、照明光照射部、励起光照射部および撮像部を制御することによって、照射範囲毎に、照明光を照射してコントラストオートフォーカス用の像の撮像を行い、そのコントラストオートフォーカス用の像に基づいて光学系のオートフォーカス制御を行い、そのオートフォーカス制御された焦点位置で位相差像の撮像を行った後、焦点位置を維持したままで蛍光像の撮像を行う第２の制御とを切り替え可能であることが望ましい。

また、上記本発明の撮像装置においては、観察対象と容器に収容される液体の液面の変動情報を取得する液面変動情報取得部を備え、制御部は、変動情報に基づいて、上記第１の制御と上記第２の制御とを切り替えることができる。

また、上記本発明の撮像装置においては、液面の変動を検出するセンサ部を備え、液面変動情報取得部は、センサ部による検出結果を変動情報として取得することができる。

また、上記本発明の撮像装置においては、液面変動情報取得部は、撮像対象範囲が移動した後から撮像開始までの時間情報を液面変動情報として取得することができる。

また、上記本発明の撮像装置においては、時間情報の設定入力を受け付ける時間情報受付部を備えることができる。

また、上記本発明の撮像装置においては、上記第１の制御と上記第２の制御とを切り替える指示信号を受け付ける制御切替指示受付部を備えることができる。

また、上記本発明の撮像装置においては、制御部が、オートフォーカス用の像に基づいてオートフォーカス制御を行う場合、観察対象が収容された容器の底面に焦点位置を合わせることができる。

本発明の撮像方法は、観察対象を含む撮像領域に照明光および励起光をそれぞれ照射し、撮像領域内において撮像対象範囲を移動させ、撮像対象範囲毎に、照明光の照射による位相差像と励起光の照射による蛍光像をそれぞれ撮像する撮像方法であって、撮像対象範囲毎に、照明光および励起光とは異なるオートフォーカス用照明光を照射してオートフォーカス用の像の撮像を行い、そのオートフォーカス用の像に基づいてオートフォーカス制御を行い、そのオートフォーカス制御された焦点位置で蛍光像の撮像を行った後、焦点位置を維持したままで位相差像の撮像を行うことを特徴とする。

本発明の撮像装置および方法によれば、観察対象を含む撮像領域に照明光および励起光をそれぞれ照射し、撮像領域内において撮像対象範囲を移動させ、撮像対象範囲毎に、照明光の照射による位相差像と励起光の照射による蛍光像をそれぞれ撮像する際、まず、照明光および励起光とは異なるオートフォーカス用照明光を照射してオートフォーカス用の像の撮像を行い、そのオートフォーカス用の像に基づいてオートフォーカス制御を行う。これにより微弱な光の蛍光像に基づいてオートフォーカス制御を行う場合と比較すると高精度に焦点位置を合わせることができる。そして、そのオートフォーカス制御された焦点位置で蛍光像の撮像を行った後、その焦点位置を維持したままで位相差像の撮像を行うので、焦点位置を流用することができ、その分、撮像時間を短縮することができる。さらに、位相差像を撮像する前に蛍光像を撮像するので、上述した培養液液面の動揺による位相差像の明るさのムラを抑制することができる。

すなわち、本発明の撮像装置および方法によれば、培養液液面の動揺に起因する位相差像の明るさのムラを抑制することができ、かつ撮像の効率化を図ることができる。

本発明の撮像装置の一実施形態を用いた顕微鏡システムにおける顕微鏡装置の概略構成を示す図 スリット板の構成を示す図 位相差レンズの位相板の構成を示す図 観察対象Ｓを含む撮像領域Ｒおよびその撮像領域Ｒ内における撮像対象領域ＩＲの一例を示す模式図 本発明の撮像装置の一実施形態を用いた顕微鏡システムの概略構成を示すブロック図 本発明の撮像装置の一実施形態を用いた顕微鏡システムの作用を説明するためのフローチャート 位相差像のコントラストに基づくオートフォーカス制御と縞状のオートフォーカス用の像に基づくオートフォーカス制御とを切り替える場合の作用を説明するためのフローチャート 位相差像のコントラストに基づくオートフォーカス制御と縞状のオートフォーカス用の像に基づくオートフォーカス制御とを自動的に切り替える実施形態を用いた顕微鏡システムの概略構成を示すブロック図 培養液の液面を検出するセンサ部の一例を示す模式図

以下、本発明の撮像装置の一実施形態を用いた顕微鏡システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、本実施形態の顕微鏡システムにおける顕微鏡装置１の概略構成を示す図である。

顕微鏡装置１は、図１に示すように、照明光照射部１０と、励起光照射部２０と、オートフォーカス用照明光照射部３０と、光学系５０およびオートフォーカス光検出部６０を有する撮像部４０と、制御部７０とを備えている。

顕微鏡装置１の照明光照射部１０は、観察対象Ｓを含む撮像領域に対して、いわゆる位相差計測のための照明光Ｌ１を照射するものであり、本実施形態では、その位相差計測用照明光としてリング状の照明光Ｌ１を照射するものである。具体的には、本実施形態の照明光照射部１０は、白色光を出射する位相差計測用白色光源１１と、リング形状のスリットを有し、位相差計測用白色光源１１から出射された白色光が入射されてリング状の照明光Ｌ１を出射するスリット板１２と、スリット板１２から射出されたリング状の照明光Ｌ１が入射され、その入射されたリング状の照明光Ｌ１を観察対象Ｓに対して照射する第１の対物レンズ１３とを備えている。

図２は、スリット板１２の具体的な構成を示す図である。図２に示すように、スリット板１２は、位相差計測用白色光源１１から出射された白色光を遮光する遮光板１２ｂに対して白色光を透過するリング形状のスリット１２ａが設けられたものであり、白色光がスリット１２ａを通過することによってリング状の照明光Ｌ１が形成される。

励起光照射部２０は、観察対象Ｓを含む撮像領域に対して、励起光Ｌ２を照射するものである。具体的には、励起光照射部２０は、励起光Ｌ２を出射する励起光源２１と、励起光源２１から出射された励起光Ｌ２を平行光とするコリメートレンズ２２とを備えている。励起光源２１としては、たとえば発光ダイオード、レーザダイオード、高圧水銀光源およびハロゲン光源などを用いることができる。励起光源２１から射出される励起光Ｌ２は、位相差計測用白色光源１１から出射される白色光とは異なる分光特性を有する光であり、観察対象Ｓを励起して蛍光を発生させる光である。具体的には、たとえば細胞群から自家蛍光を発生させる励起光や細胞群に標識された蛍光物質から蛍光を発生させる励起光などがある。

オートフォーカス用照明光照射部３０は、観察対象Ｓを含む撮像領域に対して、照明光Ｌ１および励起光Ｌ２とは異なるオートフォーカス用照明光Ｌ３を照射するものである。オートフォーカス用照明光Ｌ３は、撮像部４０におけるオートフォーカス制御を行う際に用いられる光である。本実施形態のオートフォーカス用照明光照射部３０は、オートフォーカス用照明光Ｌ３として、縞状のパターンを有する照明光を照射するものである。具体的には、オートフォーカス用照明光照射部３０は、白色光を出射するオートフォーカス用白色光源３１と、オートフォーカス用白色光源３１から出射された白色光を透過する線状部分と遮光する線状部分とから構成されるグリッド３２と、グリッド３２から出射された縞状の明暗のパターンを有するオートフォーカス用照明光Ｌ３を反射するミラー３３とを備えている。

なお、本実施形態においては、グリッド３２を用いることによって縞状の明暗のパターンを有するオートフォーカス用照明光Ｌ３を形成するようにしたが、オートフォーカス用照明光Ｌ３を形成する方法としては、これに限らず、たとえば空間光変調素子などを用いて縞状の明暗のパターンを形成するようにしてもよい。また、オートフォーカス用照明光Ｌ３が有する明暗のパターンとしては、縞状に限らず、２次元状に明暗のパターンが周期的に配列された格子パターンを用いるようにしてもよい。また、同心円状に明暗のパターンが配列された光または２次元状にドットパターンが配列された光をオートフォーカス用照明光Ｌ３として用いるようにしてもよい。また、オートフォーカス用照明光Ｌ３が有するパターンは、白黒のパターンでなくてもよく、互いに異なる色からなるカラーのパターンでもよい。

また、上述した励起光照射部２０とオートフォーカス用照明光照射部３０は、光源移動部２５（図５参照）によって図１に示す矢印Ｂ方向に移動するものであり、観察対象Ｓの蛍光像を撮像する際には、励起光照射部２０から出射された励起光Ｌ２が後述する第１のハーフミラー５４に入射されるように移動し、オートフォーカス用の像を撮像する際には、オートフォーカス用照明光照射部３０から出射されたオートフォーカス用照明光Ｌ３が第１のハーフミラー５４に入射されるように移動する。

撮像部４０は、観察対象Ｓを含む撮像領域内において撮像対象範囲を移動させ、その撮像対象範囲毎に、照明光Ｌ１の照射による位相差像と励起光Ｌ２の照射による蛍光像とオートフォーカス用照明光Ｌ３によるオートフォーカス用の像とをそれぞれ撮像するものである。

具体的には、撮像部４０は、オートフォーカス制御される光学系５０と、撮像素子４１と、ステージ４２およびステージ駆動部４３（図５参照）とを備えている。

光学系５０は、位相差レンズ５１と、第１のハーフミラー５４と、結像レンズ５５とを備えている。

位相差レンズ５１は、第２の対物レンズ５２および位相板５３を備えている。図３は、位相板５３の具体的な構成を示す平面図である。図３に示すように、位相板５３は、照明光Ｌ１の波長に対して透明な透明板５３ｂに対して位相リング５３ａを形成したものである。なお、上述したスリット１２ａの大きさは、この位相リング５３ａと共役な関係にある。

位相リング５３ａは、入射された光の位相を１／４波長ずらす位相膜と、入射された光を減光する減光フィルタとがリング状に形成されたものである。位相リング５３ａに入射された直接光は、位相リング５３ａを通過することによって位相が１／４波長ずれるとともに、その明るさが弱められる。一方、観察対象Ｓによって回折された回折光は大部分が位相板５３の透明板５３ｂを通過し、その位相および明るさは変化しない。

位相差レンズ５１は、光学系駆動部４４（図５参照）によってＺ方向（矢印Ａ方向）に移動するものである。この位相差レンズ５１のＺ方向への移動によってオートフォーカス制御が行われ、撮像部４０によって撮像される画像のコントラストが調整される。

第１のハーフミラー５４は、観察対象Ｓの位相差像と蛍光像とオートフォーカス用の像とを透過し、かつオートフォーカス用照明光照射部３０から出射されたオートフォーカス用照明光Ｌ３および励起光照射部２０から出射された励起光Ｌ２を観察対象Ｓの方向に反射する光学特性を有するものである。

結像レンズ５５は、第１のハーフミラー５４を通過した位相差像および蛍光像が入射され、これらを撮像素子４１に結像するものである。

撮像素子４１は、結像レンズ５５によって結像された位相差像および蛍光像を撮像するものである。撮像素子４１としては、ＣＣＤ（Charge-Coupled Device）イメージセンサやＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサなどが用いられる。撮像素子としては、ＲＧＢ（Red Green Blue）のカラーフィルタが設けられた撮像素子を用いてもよいし、モノクロの撮像素子を用いるようにしてもよい。

ステージ４２は、照明光照射部１０と光学系５０との間に設けられており、このステージ４２上に観察対象Ｓが収容された培養容器８０が設置される。ステージ４２は、ステージ駆動部４３によって互いに直交するＸ方向およびＹ方向に移動するものである。なお、Ｘ方向およびＹ方向は、観察対象Ｓの設置面に平行な面上において互いに直交する方向である。

そして、ステージ４２がＸ方向およびＹ方向へ移動することによって、観察対象Ｓを含む撮像領域内における撮像対象範囲が移動して変更される。図４は、観察対象Ｓを含む撮像領域Ｒおよびその撮像領域Ｒ内における撮像対象領域ＩＲの一例を模式的に示した図である。ステージ４２のＸ方向およびＹ方向への移動によって撮像対象領域ＩＲの位置が変更され、撮像対象領域ＩＲ毎に位相差像、蛍光像およびオートフォーカス用の像が撮像される。

培養容器８０としては、シャーレ、ディッシュまたはウェルプレートなどを用いることができる。また、培養容器８０およびステージ４２は、照明光照射部１０から出射された照明光、励起光照射部２０から出射された励起光およびオートフォーカス用照明光照射部３０から出射されたオートフォーカス用照明光を透過する材料から形成されるものであり、たとえばガラスまたは透明な樹脂などから形成されるものである。

観察対象Ｓとしては、たとえば培養される細胞群があり、具体的には、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞といった多能性幹細胞、幹細胞から分化誘導された神経、皮膚、心筋または肝臓の細胞、もしくは人体から取り出された皮膚、網膜、心筋、血球、神経または臓器の細胞などがある。なお、観察対象Ｓは、上述したような細胞に限らず、微生物、食品または結晶などでもよい。また、培養容器８０内には、観察対象Ｓとともに、観察対象Ｓを培養するための培養液Ｃとが収容される。

オートフォーカス光検出部６０は、第２のハーフミラー６１と、光路差プリズム６２と、ラインセンサ６３とを備えている。

第２のハーフミラー６１は、オートフォーカス用照明光Ｌ３の培養容器８０への照射によって培養容器８０の底面から反射されたオートフォーカス用の像を光路差プリズム６２の方向に反射し、かつ位相差像および蛍光像を透過するものである。

光路差プリズム６２は、入射されたオートフォーカス用の像を２つの光路に分け、ラインセンサ６３の異なる２箇所に結像するものである。ラインセンサ６３は、２箇所で撮像された第１のオートフォーカス用の像の画像信号と第２のオートフォーカス用の像の画像信号とを制御部７０に出力するものである。制御部７０は、１のオートフォーカス用の像の画像信号と第２のオートフォーカス用の像の画像信号とに基づいて、位相差レンズ５１をＺ方向に移動させてオートフォーカス制御を行うものである。なお、本実施形態では、ラインセンサ６３を用いて第１および第２のオートフォーカス用の像を検出するようにしたが、これに限らず、ＣＭＯＳイメージセンサまたはＣＣＤイメージセンサを用いてもよい。

なお、顕微鏡装置の構成については、図１に示す構成に限らず、観察対象Ｓに対して照明光Ｌ１、励起光Ｌ２およびオートフォーカス用照明光Ｌ３を照射できる構成であって、
照明光Ｌ１の照射による位相差像、励起光Ｌ２の照射による蛍光像およびオートフォーカス用照明光Ｌ３によるオートフォーカス用の像を撮像できる構成であれば、その他の構成を採用するようにしてもよい。

図５は、本実施形態の顕微鏡システムの概略構成を示すブロック図である。図５に示すように顕微鏡装置１は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）などを有する制御部７０を備えており、この制御部７０によって顕微鏡装置１全体が制御される。また、撮像部４０の撮像素子４１によって撮像された位相差像および蛍光像を表す画像信号は、制御部７０において所定の信号処理が施された後、表示装置２に出力される。表示装置２は、入力された画像信号に基づいて、位相差像および蛍光像を表示するものである。

次に、本実施形態の顕微鏡システムの作用について、図６に示すフローチャートを参照しながら説明する。

まず、ステージ４２上に観察対象Ｓおよび培養液Ｃが収容された培養容器８０が設置される（Ｓ１０）。そして、ステージ駆動部４３によってステージ４２が移動し、最初の撮像対象範囲ＩＲが撮像される位置に設置される。

そして、まず、オートフォーカス用照明光照射部３０からオートフォーカス用照明光Ｌ３が出射され、第１のハーフミラー５４によって培養容器８０に向けて反射される。オートフォーカス用照明光Ｌ３は位相差レンズ５１を透過し、培養容器８０内の撮像領域の最初の撮像対象範囲ＩＲに照射される（Ｓ１２）。

培養容器８０へのオートフォーカス用照明光Ｌ３の照射によって、オートフォーカス用照明光Ｌ３が有する縞状のパターンが培養容器８０の底面に投影され、その像が反射される。培養容器８０の底面で反射されたオートフォーカス用の像は、位相差レンズ５１および第１のハーフミラー５４を透過し、第２のハーフミラー６１によって反射される。第２のハーフミラー６１によって反射されたオートフォーカス用の像は、光路差プリズム６２に入射され、光路差プリズム６２によって２つの光路に分けられる。そして、ラインセンサ６３の異なる２箇所において、第１のオートフォーカス用の像と第２のオートフォーカス用の像とが撮像される（Ｓ１４）。第１のオートフォーカス用の像と第２のオートフォーカス用の像の画像信号は制御部７０に出力され、制御部７０は、第１のオートフォーカス用の像の画像信号と第２のオートフォーカス用の像の画像信号とに基づいて、位相差レンズ５１をＺ方向に移動させてオートフォーカス制御を行う（Ｓ１６）。具体的には、第１のオートフォーカス用の像のコントラスト（波形パターン）と第２のオートフォーカス用の像のコントラスト（波形パターン）が最も近似する位置に位相差レンズ５１を移動させる。

上述したように、オートフォーカス用照明光Ｌ３が有する縞状のパターンを培養容器８０の底面に投影し、その像に基づいてオートフォーカス制御を行うことによって、すなわち培養容器８０の底面に焦点位置を合わせるようにオートフォーカス制御を行うことによって、微弱な光の蛍光像に基づいてオートフォーカス制御を行う場合と比較すると高精度に焦点位置を合わせることができる。また、培養液の液面の動揺の影響も受けることがない。

そして、上記のようにしてオートフォーカス制御が終了した後、次に、オートフォーカス用照明光照射部３０と励起光照射部２０とが入れ替わり、励起光照射部２０から出射された励起光Ｌ２が第１のハーフミラー５４に入射される。励起光Ｌ２は、第１のハーフミラー５４によって培養容器８０に向けて反射され、位相差レンズ５１を透過して培養容器８０内の撮像領域の最初の撮像対象範囲ＩＲに照射される（Ｓ１８）。そして、励起光Ｌ２の照射によって撮像対象範囲ＩＲから発された蛍光像は、位相差レンズ５１、第１のハーフミラー５４および第２のハーフミラー６１を透過し、結像レンズ５５によって撮像素子４１の撮像面に結像されて撮像される（Ｓ２０）。撮像素子４１によって撮像された蛍光像の画像信号は、メモリなどの記憶媒体に記憶される。

次に、上述したように蛍光像の撮像を行った後、位相差レンズ５１を動かすことなく焦点位置を維持したままで位相差像の撮像が行われる。具体的には、照明光照射部１０から位相差計測用のリング状の照明光Ｌ１が出射され、最初の撮像対象範囲ＩＲに照明光Ｌ１が照射される（Ｓ２２）。

そして、撮像対象範囲ＩＲを通過した照明光Ｌ１の直接光および回折光が位相差レンズ５１に入射される。

そして、位相差レンズ５１に入射された直接光は、対物レンズ５２によって集光されて位相リング５３ａを通過する。これにより直接光は、位相リング５３ａの位相膜によって位相が１／４波長ずらされるとともに、減光フィルタによって減光される。一方、回折光は、その大部分が位相板５３の透明板５３ｂを通過する。

そして、直接光と回折光は、第１のハーフミラー５４および第２のハーフミラー６１を透過し、結像レンズ５５によって撮像素子４１の撮像面に結像されて撮像される。撮像素子４１によって撮像された位相差像の画像信号は、メモリなどの記憶媒体に記憶される。

次いで、全ての撮像対象範囲ＩＲの蛍光像および位相差像の撮像が終了していない場合には（Ｓ２６，ＮＯ）、ステージ駆動部４３によってステージ４２が移動し、次の撮像対象範囲ＩＲが撮像される位置に設置される（Ｓ２８）。

そして、再び、Ｓ１２〜Ｓ２４までの処理が繰り返して行われ、次の撮像対象範囲ＩＲの蛍光像と位相差像とが撮像され、その画像信号が記憶される。

全ての撮像対象範囲ＩＲの蛍光像および位相差像の撮像が終了するまで、Ｓ１２〜Ｓ２４までの処理が繰り返して行われ、各撮像対象範囲ＩＲの蛍光像と位相差像とが撮像され、その画像信号が記憶される。そして、全ての撮像対象範囲ＩＲの蛍光像および位相差像の撮像が終了した時点で撮像処理を終了する（Ｓ２６，ＹＥＳ）。

上述したようにして撮像された各撮像対象範囲ＩＲの蛍光像の画像信号は、制御部７０によってタイリングされて撮像領域全体の蛍光像が生成され、表示装置２に表示される。また、各撮像対象範囲ＩＲの位相差像の画像信号も、制御部７０によってタイリングされて撮像領域全体の位相差像が生成され、表示装置２に表示される。

上記実施形態の顕微鏡システムによれば、撮像領域Ｒ内において撮像対象範囲ＩＲを移動させ、撮像対象範囲ＩＲ毎に、照明光の照射による位相差像と励起光の照射による蛍光像をそれぞれ撮像する際、まず、オートフォーカス用照明光を照射してオートフォーカス用の像の撮像を行い、そのオートフォーカス用の像に基づいてオートフォーカス制御を行うようにしたので、微弱な光の蛍光像に基づいてオートフォーカス制御を行う場合と比較すると高精度に焦点位置を合わせることができる。そして、そのオートフォーカス制御された焦点位置で蛍光像の撮像を行った後、焦点位置を維持したままで位相差像の撮像を行うので、焦点位置を流用することができ、その分、撮像時間を短縮することができる。さらに、位相差像を撮像する前に蛍光像を撮像するので、上述した培養液の液面の動揺による位相差像の明るさのムラを抑制することができる。

ここで、上記実施形態においては、上述したようにオートフォーカス用照明光Ｌ３を培養容器８０の底面に照射し、その底面に投影された像を検出することによってオートフォーカス制御を行うようにしている。すなわち培養容器８０の底面に焦点位置を合わせるようにオートフォーカス制御を行っている。このようにオートフォーカス制御を行った場合、観察対象Ｓが培養容器８０の底面近傍に固定された細胞群などである場合には問題ないが、たとえば観察対象Ｓの細胞群が浮遊細胞である場合には、培養容器８０の底面近傍に存在しない場合があり、細胞群に焦点のあった蛍光像や位相差像を撮像できない可能性がある。

そこで、たとえば観察対象Ｓの位相差像のコントラストに基づくオートフォーカス制御（第２の制御）と、上述した縞状のオートフォーカス用の像に基づくオートフォーカス制御（第１の制御）とを切り替え可能に構成するようにしてもよい。以下、位相差像のコントラストに基づくオートフォーカス制御の場合について、図７に示すフローチャートを参照しながら説明する。

ユーザによって入力装置３（図５参照）を用いて位相差像のコントラストに基づくオートフォーカス制御（第２の制御）を選択する指示信号が入力された場合（Ｓ３０，第２の制御）には、まず、照明光照射部１０から位相差計測用のリング状の照明光Ｌ１が出射され、最初の撮像対象範囲ＩＲに照明光Ｌ１が照射され（Ｓ３２）、上記と同様にして、撮像素子４１によって位相差像が撮像され、その位相差像の画像信号が制御部７０に出力される（Ｓ３４）。なお、ここでは、入力装置３は、本発明の制御切替指示受付部に相当するものである。

制御部７０は、入力された位相差像の画像信号のコントラストを算出する。そして、制御部７０は、位相差像の画像信号のコントラストが最大となるように位相差レンズ５１をＺ方向に移動させてオートフォーカス制御を行う（Ｓ３６）。

そして、上記のようにしてオートフォーカス制御が終了した時点で、最終的な位相差像の撮像が行われ、その位相差像の画像信号が記憶される（Ｓ３８）。

次に、上述したように位相差像の撮像を行った後、位相差レンズ５１を動かすことなく焦点位置を維持したままで蛍光像の撮像が行われる。具体的には、励起光照射部２０から励起光Ｌ２が出射され、最初の撮像対象範囲ＩＲに励起光Ｌ２が照射され（Ｓ４０）、上記と同様にして、撮像素子４１によって蛍光像が撮像され、その蛍光像の画像信号が記憶される（Ｓ４２）。

そして、全ての撮像対象範囲ＩＲの位相差像および蛍光像の撮像が終了するまで、撮像対象範囲ＩＲを移動させて上記と同様の処理が繰り返して行われる（Ｓ４４、Ｓ４６）。

そして、オートフォーカス用の像に基づくオートフォーカス制御（第１の制御）の場合と同様に、各撮像対象範囲ＩＲの位相差像および蛍光像の画像信号は、制御部７０によってタイリングされて撮像領域全体の位相差像および蛍光像が生成され、表示装置２に表示される。

上記のように、たとえば観察対象が浮遊細胞である場合、位相差像のコントラストに基づくオートフォーカス制御を行うようにすれば、浮遊細胞に高精度の焦点位置を合わせることができ、より鮮明な位相差像を取得することができる。

なお、上記説明では、ユーザが、縞状のオートフォーカス用の像に基づくオートフォーカス制御（第１の制御）を行うか、位相差像のコントラストに基づくオートフォーカス制御（第２の制御）を行うかを選択するようにしたが、これに限らず、自動的にこれらの制御を切り替えるようにしてもよい。

具体的には、図８に示すように、培養容器８０に収容された培養液Ｃの液面の変動情報を取得する液面変動情報取得部９０をさらに設け、制御部７０が、液面変動情報取得部９０によって取得された変動情報に基づいて、縞状のオートフォーカス用の像に基づくオートフォーカス制御（第１の制御）を行うか、位相差像のコントラストに基づくオートフォーカス制御（第２の制御）を行うかを選択するようにしてもよい。

液面変動情報取得部９０によって取得される変動情報としては、たとえば液面の変動を検出するセンサ部から出力された検出信号を用いるようにすればよい。具体的には、たとえば、図９に示すように、培養容器８０の上方に、培養液Ｃの液面の位置を光学的に検出するセンサ部９１を設け、このセンサ部９１による検出結果を用いるようにしてもよい。

センサ部９１によって検出された液面の位置の変動が予め設定された閾値以上である場合には、縞状のオートフォーカス用の像に基づくオートフォーカス制御（第１の制御）を行い、閾値未満である場合には、位相差像のコントラストに基づくオートフォーカス制御（第２の制御）を行うようにすればよい。センサ部９１としては、具体的には、レーザ変位計などを用いることができる。このようにオートフォーカス制御を切り替えることによって、液面の変動が少ない場合には、位相差像のコントラストに基づく高精度なフォーカス制御を行うことができ、液面の変動が大きい場合には、液面の変動に影響されない縞状のオートフォーカス用の像に基づくオートフォーカス制御を行うことができる。

なお、上述した位相差像のコントラストに基づくフォーカス制御と縞状のオートフォーカス用の像に基づくオートフォーカス制御との切り替えについては、撮像対象範囲ＩＲ毎に行うことが望ましい。

また、液面変動情報取得部９０によって取得される変動情報として、撮像対象範囲ＩＲが移動した後からその撮像対象範囲ＩＲの撮像開始までの時間情報を取得し、その時間情報に基づいて、位相差像のコントラストに基づくフォーカス制御と縞状のオートフォーカス用の像に基づくオートフォーカス制御とを切り替えるようにしてもよい。上記時間情報は、ユーザが撮像条件の１つとして入力装置３を用いて設定入力されるものである。なお、この場合、入力装置３が、本発明の時間情報受付部に相当するものである。

上記時間情報が予め設定された閾値以上である場合には、位相差像のコントラストに基づくオートフォーカス制御（第２の制御）を行い、閾値未満である場合には、縞状のオートフォーカス用の像に基づくオートフォーカス制御（第１の制御）を行うようにすればよい。これにより、上記時間情報が液面の状態が落ち着くほど十分に長い場合には、位相差像のコントラストに基づく高精度なフォーカス制御を行うことができ、上記時間情報が液面の状態が落ち着かない短い時間である場合には、縞状のオートフォーカス用の像に基づくオートフォーカス制御を行うことができる。

１ 顕微鏡装置
２ 表示装置
３ 入力装置
１０ 照明光照射部
１１ 位相差計測用白色光源
１２ スリット板
１２ａ スリット
１２ｂ 遮光板
１３ 第１の対物レンズ
２０ 励起光照射部
２１ 励起光源
２２ コリメートレンズ
２５ 光源移動部
３０ オートフォーカス用照明光照射部
３１ オートフォーカス用白色光源
３２ グリッド
３３ ミラー
４０ 撮像部
４１ 撮像素子
４２ ステージ
４３ ステージ駆動部
４４ 光学系駆動部
５０ 光学系
５１ 位相差レンズ
５２ 対物レンズ
５３ 位相板
５３ａ 位相リング
５３ｂ 透明板
５４ 第１のハーフミラー
５５ 結像レンズ
６０ オートフォーカス光検出部
６１ 第２のハーフミラー
６２ 光路差プリズム
６３ ラインセンサ
７０ 制御部
８０ 培養容器
９０ 液面変動情報取得部
９１ センサ部

Claims (10)

1. 観察対象を含む撮像領域に照明光を照射する照明光照射部と、
   前記撮像領域に励起光を照射する励起光照射部と、
   前記撮像領域に、予め設定されたパターンを有するオートフォーカス用照明光を照射するオートフォーカス用照明光照射部と、
   前記撮像領域内において撮像対象範囲を移動させ、該撮像対象範囲毎に、前記照明光の照射による位相差像と前記励起光の照射による蛍光像と前記オートフォーカス用照明光によるオートフォーカス用の像とをそれぞれ撮像する撮像部であって、オートフォーカス制御される光学系を有する撮像部と、
   前記照明光照射部、前記励起光照射部、前記オートフォーカス用照明光照射部および前記撮像部を制御することによって、前記撮像対象範囲毎に、前記オートフォーカス用照明光を照射して前記オートフォーカス用の像の撮像を行い、該オートフォーカス用の像に基づいて前記光学系のオートフォーカス制御を行い、該オートフォーカス制御された焦点位置で前記蛍光像の撮像を行った後、前記焦点位置を維持したままで前記位相差像の撮像を行う制御部とを備えたことを特徴とする撮像装置。
2. 前記予め設定されたパターンが、縞状のパターンである請求項１記載の撮像装置。
3. 前記制御部が、前記オートフォーカス用照明光の照射による前記オートフォーカス用の像に基づくオートフォーカス制御を行い、該オートフォーカス制御された焦点位置で前記蛍光像の撮像を行った後、前記焦点位置を維持したままで前記位相差像の撮像を行う第１の制御と、
   前記照明光照射部、前記励起光照射部および前記撮像部を制御することによって、前記照射範囲毎に、前記照明光を照射してコントラストオートフォーカス用の像の撮像を行い、該コントラストオートフォーカス用の像に基づいて前記光学系のオートフォーカス制御を行い、該オートフォーカス制御された焦点位置で前記位相差像の撮像を行った後、前記焦点位置を維持したままで前記蛍光像の撮像を行う第２の制御とを切り替え可能である請求項１または２記載の撮像装置。
4. 前記観察対象と容器に収容される液体の液面の変動情報を取得する液面変動情報取得部を備え、
   前記制御部が、前記変動情報に基づいて、前記第１の制御と前記第２の制御とを切り替える請求項３記載の撮像装置。
5. 前記液面の変動を検出するセンサ部を備え、
   前記液面変動情報取得部が、前記センサ部による検出結果を前記変動情報として取得する請求項４記載の撮像装置。
6. 前記液面変動情報取得部が、前記撮像対象範囲が移動した後から撮像開始までの時間情報を前記液面変動情報として取得する請求項４記載の撮像装置。
7. 前記時間情報の設定入力を受け付ける時間情報受付部を備えた請求項６記載の撮像装置。
8. 前記第１の制御と前記第２の制御とを切り替える指示信号を受け付ける制御切替指示受付部を備えた請求項４記載の撮像装置。
9. 前記制御部が、前記オートフォーカス用の像に基づいてオートフォーカス制御を行う場合、前記観察対象が収容された容器の底面に前記焦点位置を合わせる請求項１から８いずれか１項記載の撮像装置。
10. 観察対象を含む撮像領域に照明光および励起光をそれぞれ照射し、前記撮像領域内において撮像対象範囲を移動させ、該撮像対象範囲毎に、前記照明光の照射による位相差像と前記励起光の照射による蛍光像をそれぞれ撮像する撮像方法であって、
    前記撮像対象範囲毎に、前記照明光および前記励起光とは異なるオートフォーカス用照明光を照射してオートフォーカス用の像の撮像を行い、該オートフォーカス用の像に基づいてオートフォーカス制御を行い、該オートフォーカス制御された焦点位置で前記蛍光像の撮像を行った後、前記焦点位置を維持したままで前記位相差像の撮像を行うことを特徴とする撮像方法。