JP6411294B2 - 位相差顕微鏡および撮像方法 - Google Patents

Description

本発明は、液体中の観察対象を位相差計測する位相差顕微鏡および撮像方法に関するものである。

近年、幹細胞などの培養された透明な細胞を非染色に観察する方法として位相差計測が広く使われ始めている。そして、このような位相差計測を行うものとして位相差顕微鏡が使用されている。

一般的な位相差顕微鏡においては、リング状の照明光が観察対象に照射され、観察対象を通過した直接光と回折光が位相板に入射される。そして、直接光は位相板のリング部分によって減光され、回折光は位相板の透明な部分を通過し、この直接光と回折光とが結像されることによって明暗のコントラストのついた像を撮像することができる。

ここで、たとえば位相差顕微鏡によって培養液中の細胞などを観察する場合、培養液の表面張力の影響によって培養液の液面にメニスカスが形成される。そして、このメニスカスのレンズ作用によってリング状の照明光の光軸がシフトし、位相板に入射される直接光と回折光とに影響を及ぼして明瞭な位相差像が得られない問題がある。

このような培養液のメニスカスの影響を抑制するため、種々の方法が提案されている。たとえば、特許文献１においては、対物レンズの瞳位置のリング状の位相膜の形状と、光学素子によって形成されるリング状の照明光の形状とを瞳像検出器によって検出し、その検出された座標データに基づいて、光学素子のリング状開口の形状を制御することが提案されている。

また、特許文献２においては、メニスカスの影響ではないが、培養容器の底面の湾曲や培養容器の傾斜によって照明光の光軸がずれることを考慮し、照明光の光軸ずれを検出し、その光軸ずれに応じて位相板を移動させることが提案されている。

また、特許文献３においては、メニスカスの影響を抑制するため、スリット板または位相板を移動させることが提案されている。

特開２０１０−２７１５３７号公報 特開２００７−２９３２６７号公報 特開２００９−１２２３５６号公報

しかしながら、メニスカスの形状は、培養容器の素材および培養容器内に収容される液体の性質などによって決定し、様々な形状となる可能性がある。特に、経時的に複数回の撮影を行うタイムラプス撮影を行う場合には、培養液の蒸発によって培養容器内の培養液の水位も経過時間に応じて変化するため、メニスカスの形状も時間の経過に応じて変化することになる。

したがって、メニスカスの形状をできるだけ正確に把握し、その形状に応じた光学系の調整が必要となるが、特許文献１〜特許文献３には、様々なメニスカスの形状を正確に把握する方法については何も提案されていない。

本発明は、上記の問題に鑑み、容器内に収容された液体の液面に形成されるメニスカスの形状を正確に把握し、そのメニスカスに起因する照明光の屈折の影響を高精度に取り除くことができる位相差顕微鏡および撮像方法を提供することを目的とする。

本発明の位相差顕微鏡は、液体および観察対象が収容された容器に対して位相差計測のための位相差計測用照明光を照射する位相差計測用照明光照射部と、位相差計測用照明光を照射した観察対象を撮像する撮像部と、容器内の液体の液面形状を計測するための液面計測用照明光を液体の液面に対して照射する液面計測用照明光照射部と、液面計測用照明光の照射によって容器内の液体を透過した透過光を検出する透過光検出部と、透過光を透過光検出部の検出面に集光する結像光学系の焦点面と容器との相対的な位置関係を変更する焦点面変更部と、焦点面の位置毎の透過光の検出信号に基づいて、液体の液面形状を推定する液面形状推定部と、容器内の液体の液面形状に起因する位相差計測用照明光の屈折を調整する調整光学系と、液面形状推定部によって推定された液面形状に基づいて、調整光学系の光学特性を調整するための調整情報を取得する調整情報取得部とを備えたことを特徴とする。

また、本発明の位相差顕微鏡において、調整情報取得部によって取得された調整情報に基づいて、調整光学系の光学特性を調整する調整光学系制御部を備えることができる。

また、本発明の位相差顕微鏡において、焦点面変更部は、結像光学系に含まれる光学素子を光軸方向に移動させることによって、焦点面と容器との相対的な位置関係を変更することができる。

また、本発明の位相差顕微鏡において、焦点面変更部は、容器を結像光学系の光軸方向に移動させることによって、焦点面と容器との相対的な位置関係を変更することができる。

また、本発明の位相差顕微鏡において、焦点面変更部は、結像光学系に設けられた焦点距離の異なる複数の光学素子の交換によって、焦点面と容器との相対的な位置関係を変更することができる。

また、本発明の位相差顕微鏡において、液面形状推定部は、液体の液面上の液面計測用照明光の照射位置の情報および予め設定された液面の曲面を表す情報と、液体の液面上の少なくとも１点に対して液面計測用照明光を照射した場合の透過光の検出信号とに基づいて、液面形状を推定することができる。

また、本発明の位相差顕微鏡において、液面形状推定部は、液体の液面上の液面計測用照明光の照射位置の情報および予め設定された液面の曲面を表す情報のうちのいずれか一方の情報と、液体の液面上の少なくとも３点に対して液面計測用照明光を照射した場合の透過光の検出信号とに基づいて、液面形状を推定することができる。

また、本発明の位相差顕微鏡において、液面形状推定部は、液体の液面上の少なくとも９点に対して液面計測用照明光を照射した場合の透過光の検出信号に基づいて、液面形状を推定することができる。

また、本発明の位相差顕微鏡において、液面形状推定部は、液体の液面の重心位置からの距離が異なる各周上についてそれぞれ１回のみ液面形状の推定を行うことができる。

また、本発明の位相差顕微鏡において、液面計測用照明光照射部は、液体の液面上の複数の点に液面計測用照明光を照射する場合、点毎に異なる形状パターンを有する液面計測用照明光を照射することができる。

また、本発明の位相差顕微鏡において、液面計測用照明光照射部は、液体の液面上の複数の点に液面計測用照明光を照射する場合、点毎に異なるタイミングで液面計測用照明光を照射することができる。

また、本発明の位相差顕微鏡において、液面計測用照明光照射部は、液体の液面上の複数の点に液面計測用照明光を照射する場合、点毎に異なる波長を有する液面計測用照明光を照射することができる。

また、本発明の位相差顕微鏡において、液面形状推定部は、液面計測用照明光が照射された液面上の点の液面形状の推定結果を用いて補間することによって、液面計測用照明光が照射されていない液面上の点の液面形状の推定を行うことができる。

また、本発明の位相差顕微鏡において、液面形状推定部は、液面形状の推定結果を記憶することができ、液面計測用照明光照射部は、上記推定結果の記憶よりも後の時点で再び液面の液面形状の推定を行う場合には、前の時点で液面形状の推定を行った場合よりも液面計測用照明光の液面上の照射点の数を減らすことができ、液面形状推定部は、その減らされた照射点の透過光の検出信号に基づく液面形状の推定結果と記憶した液面形状の推定結果とに基づいて、後の時点での液面形状の推定を行うことができる。

また、本発明の位相差顕微鏡において、液面計測用照明光照射部は、予め設定されたパターンを有するパターン光を液面計測用照明光として照射することができる。

また、本発明の位相差顕微鏡において、パターン光は、格子状のパターンであることが好ましい。

また、本発明の位相差顕微鏡において、パターン光は、同心円のパターンであることが好ましい。

また、本発明の位相差顕微鏡において、パターン光によって形成される像上の予め設定された複数の位置にそれぞれ異なる形状の像を形成することができる。

また、本発明の位相差顕微鏡において、パターン光によって形成される像上の予め設定された複数の位置にそれぞれ異なる色の像を形成することができる。

また、本発明の位相差顕微鏡において、調整情報取得部は、推定された液面形状に基づいて、液体の液面形状に起因する位相差計測用照明光の光路ずれを算出し、その算出した光路ずれに基づいて、調整光学系の調整情報を取得することができる。

また、本発明の位相差顕微鏡において、液面形状推定部は、液面の曲面情報および位置情報を算出することによって、液面形状を推定することができる。

本発明の撮像方法は、液体および観察対象が収容された容器内の液体の液面に対して、容器内の液体の液面形状を計測するための液面計測用照明光を照射し、液面計測用照明光の照射によって容器内の液体を透過した透過光を透過光検出部によって検出し、透過光を透過光検出部の検出面に集光する結像光学系の焦点面と容器との相対的な位置関係を変更して焦点面の位置毎の透過光の検出信号を取得し、焦点面の位置毎の透過光の検出信号に基づいて、液体の液面形状を推定し、その推定した液面形状に基づいて、液面形状に起因する光の屈折を調整する調整光学系の光学特性を調整するための調整情報を取得し、その調整情報に基づいて、調整光学系の光学特性が調整された後、容器に対して位相差計測のための位相差計測用照明光を照射し、位相差計測用照明光を照射した観察対象を撮像することを特徴とする。

本発明の位相差顕微鏡および撮像方法によれば、液体および観察対象が収容された容器内の液体の液面に対して、容器内の液体の液面形状を計測するための液面計測用照明光を照射し、液面計測用照明光の照射によって容器内の液体を透過した透過光を透過光検出部によって検出する。さらに、透過光を透過光検出部の検出面に集光する結像光学系の焦点面と容器との相対的な位置関係を変更して焦点面の位置毎の透過光の検出信号を取得し、焦点面の位置毎の透過光の検出信号に基づいて、液体の液面形状を推定するようにしたので、容器内に収容された液体の液面に形成されるメニスカスの形状を正確に把握することができる。

そして、その推定した液面形状に基づいて、液面形状に起因する光の屈折を調整する調整光学系の光学特性を調整するための調整情報を取得し、その調整情報に基づいて、調整光学系の光学特性が調整された後、容器に対して位相差計測のための位相差計測用照明光を照射し、位相差計測用照明光を照射した観察対象を撮像するようにしたので、メニスカスに起因する位相差計測用照明光の屈折の影響を高精度に取り除くことができ、より適切な位相差画像を取得することができる。

本発明の位相差顕微鏡の一実施形態を用いた顕微鏡システムの概略構成を示す図 スリット板の構成の一例を示す図 調整用光学素子の位置、光軸の回転および屈折力の調整を模式的に示す図 位相板の構成の一例を示す図 メニスカスが形成されていないと想定した場合に、撮像部の検出面上に結像される各照射点に対応するレーザ光の像Ｐ１〜Ｐ９の位置を示す図 メニスカスが形成されていると想定した場合に、撮像部の検出面上に結像される各照射点に対応するレーザ光の像Ｐ１〜Ｐ９の位置を示す図 液面形状の推定方法を説明するための図 本発明の位相差顕微鏡の一実施形態を用いた顕微鏡システムの作用を説明するためのフローチャート 撮像領域内の９つの照射点に液面計測用照明光を照射して液面形状を推定する場合を説明するための図 撮像領域内の３つの照射点に液面計測用照明光を照射して液面形状を推定する場合を説明するための図 撮像領域を渦巻き状に変更しながら位相差画像を撮像する方法を説明するための図 縞状のパターンを有する液面計測用照明光の一例を示す図 同心円のパターンを有する液面計測用照明光の一例を示す図 ９つの液面計測用照明光の照射点をウェル全体に設定してウェル全体の液面形状を推定する場合を説明するための図 ３つの液面計測用照明光の照射点をウェル全体に設定してウェル全体の液面形状を推定する場合を説明するための図

以下、本発明の位相差顕微鏡および撮像方法の一実施形態を用いた顕微鏡システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、本実施形態の顕微鏡システムの概略構成を示す図である。

本実施形態の顕微鏡システムは、図１に示すように、位相差計測用照明光照射部１０と、液面計測用照明光照射部１５と、調整光学系２０と、結像光学系３０と、撮像部４０と、顕微鏡制御装置５０と、表示装置７０と、入力装置８０とを備えている。

本実施形態の顕微鏡システムにおいては、調整光学系２０と結像光学系３０との間に、ステージ６１が設けられており、このステージ６１上に、液体である培養液Ｃおよび観察対象Ｓが収容された培養容器６０が設置される。そして、本実施形態の顕微鏡システムは、Ｘ方向、Ｙ方向およびＺ方向にステージ６１を移動させるステージ駆動部６２を備えている。Ｘ方向およびＹ方向は、観察対象設置面Ｐに平行な面上において互いに直交する方向であり、Ｚ方向は、Ｘ方向およびＹ方向に直交する方向である。

本実施形態の顕微鏡システムにおいては、上述した位相差計測用照明光照射部１０、液面計測用照明光照射部１５、調整光学系２０、結像光学系３０、撮像部４０、ステージ６１およびステージ駆動部６２から位相差顕微鏡本体が構成され、顕微鏡制御装置５０は、この位相差顕微鏡本体を制御するものである。以下、位相差顕微鏡本体の具体的な構成を説明する。

位相差計測用照明光照射部１０は、培養容器６０内に収容された観察対象Ｓに対して、いわゆる位相差計測のための照明光を照射するものであり、本実施形態では、その位相差計測用照明光としてリング状照明光を照射する。具体的には、本実施形態の位相差計測用照明光照射部１０は、白色光を出射する白色光源１１と、リング形状のスリットを有し、白色光源１１から出射された白色光が入射されてリング状照明光を出射するスリット板１２と、スリット板１２から射出されたリング状照明光が入射され、その入射されたリング状照明光を観察対象Ｓに対して照射するコンデンサレンズ１３とを備えている。

図２は、スリット板１２の具体的な構成を示す図である。図２に示すように、スリット板１２は、白色光源１１から出射された白色光を遮光する遮光板１２ｂに対して白色光を透過するリング形状のスリット１２ａが設けられたものであり、白色光がスリット１２ａを通過することによってリング状照明光が形成される。

なお、本実施形態においては、上述したようにスリット板１２を用いてリング状照明光を形成するようにしたが、リング状照明光を形成する方法としては、これに限らず、たとえば空間光変調素子などを用いてリング状照明光を形成するようにしてもよい。

また、本実施形態においては、位相差計測用照明光としてリング状照明光を用いるようにしたが、リング状以外の形状を有する照明光でもよく、後述する位相板と共役な形状となっていれば三角形状や四角形状などその他の形状でもよい。

ステージ６１上に設置された培養容器６０は、その底面が観察対象設置面Ｐであり、観察対象設置面Ｐには観察対象Ｓとして細胞群などが配置される。そして、培養容器６０内には培養液Ｃが満たされており、この培養液Ｃの液面には、凹形状のメニスカスが形成される。培養容器６０としては、シャーレおよび複数のウェルが配列されたウェルプレートなどがある。ウェルプレートの場合、各ウェルに観察対象Ｓおよび培養液Ｃが収容され、ウェル毎にメニスカスが形成される。

また、本実施形態においては、培養液中で培養される細胞群を観察対象Ｓとしたが、観察対象Ｓとしてはこのような培養中のものに限らず、水、ホルマリン、エタノール、およびメタノールなどの液体中において固定された細胞を観察対象Ｓとしてもよい。この場合も、容器内のこれらの液体の液面にメニスカスが形成される。

調整光学系２０は、上述したメニスカスの液面形状に起因する位相差計測用照明光の屈折を調整するものである。本実施形態の調整光学系２０は、調整用光学素子２１と、調整光学系駆動部２２とを備えている。

調整用光学素子２１は、屈折力を有するものであり、具体的には、電圧印加によって屈折力が変化する液晶レンズ、レンズの曲率半径を変更可能な液体レンズ、および焦点距離を変更可能な空間光変調器などを用いることができる。調整用光学素子２１として、レンズを用いる場合には、入射面または出射面に曲率を有する平凸面レンズを用いてもよいし、入射面および出射面の両方に曲率を有する両凸面レンズを用いるようにしてもよい。

調整光学系駆動部２２は、後述する調整光学系制御部５１から出力された制御信号に基づいて、調整用光学素子２１の屈折力を変更して焦点距離を調整するものである。具体的には、調整用光学素子２１として液晶レンズまたは空間光変調器を用いる場合には、液晶レンズまたは空間光変調器に対して所望の焦点距離に応じた電圧を印加するものである。また、調整用光学素子２１として液体レンズを用いる場合には、所望の焦点距離に応じて液体レンズ内の液体の量を調整し、これにより液体レンズの曲率半径を調整するものである。

また、調整光学系駆動部２２は、調整光学系制御部５１から出力された制御信号に基づいて、調整用光学素子２１の位置および調整用光学素子２１の光軸方向を変更する機構を備えたものである。具体的には、調整光学系駆動部２２は、Ｘ方向、Ｙ方向およびＺ方向に調整用光学素子２１の位置を変更可能な機構を備えている。また、調整光学系駆動部２２は、調整用光学素子２１の光軸を回転させる機構を備えたものである。図３Ｉは、Ｘ方向、Ｙ方向およびＺ方向への調整用光学素子２１の位置の変更を模式的に示す図である。また、図３ＩＩは、調整用光学素子２１の光軸のＸ軸回り（θ）の回転調整、Ｙ軸回り（φ）の回転調整およびＺ軸回り（ρ）の回転調整を模式的に示す図である。また、図３ＩＩＩは、調整用光学素子２１の屈折力の調整を模式的に示すものである。なお、図３ＩＩＩでは、調整用光学素子２１の曲率半径を調整することによって屈折力を調整する例を示しているが、屈折力を調整する方法としては、これに限らず、たとえば、調整用光学素子２１として液晶レンズや空間光変調器を用いる場合には、印加電圧を調整することによって、屈折力を調整するようにすればよい。

また、本実施形態においては、調整用光学素子２１をＸ方向、Ｙ方向およびＺ方向に移動させるようにしたが、この調整用光学素子２１の移動による光学的な作用と同等の作用を得られるのであれば、必ずしも調整用光学素子２１を移動させなくてもよい。たとえば、調整用光学素子２１として液晶レンズや空間光変調器を用いる場合には、印加電圧を調整することによって、調整用光学素子２１の移動よる光軸のシフトと同様の作用効果を得るようにしてもよい。また、調整用光学素子２１の光軸方向についても同様に、必ずしも調整用光学素子２１自体を回転させる必要はなく、印加電圧を調整することによって、調整用光学素子２１自体の回転による光軸の回転と同様の作用効果を得るようにしてもよい。

また、本実施形態においては、調整用光学素子２１をＸ方向およびＹ方向に移動するようにしたが、これに限らず、ステージ６１をＸ方向およびＹ方向に移動させることによって、調整用光学素子２１と培養容器６０内に形成されたメニスカスとのＸ方向およびＹ方向についての相対的な位置関係を変更するようにしてもよい。

また、本実施形態においては、１つの調整用光学素子２１を用いるようにしたが、焦点距離の異なる複数の調整用光学素子２１を切り替えることによって屈折力を調整するようにしてもよい。その場合、調整用光学素子２１の交換は、自動で行うようにしてもよいし、手動で行うようにしてもよい。複数の調整用光学素子２１を手動で交換する場合には、たとえば後述する液面形状推定部５４によって推定された液面形状に基づいて、適切な調整用光学素子２１の種類の情報を表示装置７０に表示させ、その表示に基づいて、ユーザが手動で調整用光学素子２１を交換するようにしてもよい。

結像光学系３０は、対物レンズ３１と、位相板３２と、結像レンズ３３と、結像光学系駆動部３４とを備えたものである。図４は、位相板３２の具体的な構成を示す平面図である。図４に示すように、位相板３２は、リング状照明光の波長に対して透明な透明板３２ｂに対して位相リング３２ａを形成したものである。なお、上述したスリット１２ａの大きさは、この位相リング３２ａと共役な関係にある。

位相リング３２ａは、入射された光の位相を１／４波長ずらす位相膜と、入射された光を減光する減光フィルタとがリング状に形成されたものである。位相板３２に入射された直接光は位相リング３２ａを通過することによって位相が１／４波長ずれるとともに、その明るさが弱められる。一方、観察対象Ｓによって回折された回折光は大部分が位相板３２の透明板３２ｂを通過し、その位相および明るさは変化しない。

対物レンズ３１は、結像光学系駆動部３４によってＺ方向に移動するものである。観察対象Ｓの位相差画像を撮像する場合には、結像光学系駆動部３４によって対物レンズ３１をＺ方向へ移動させることによってオートフォーカス制御が行われ、撮像部４０によって撮像される画像のコントラストが調整される。

また、培養容器６０内の培養液Ｃの後述する液面形状の推定を行う場合には、結像光学系駆動部３４によって対物レンズ３１をＺ方向（対物レンズ３１の光軸方向）へ移動させることによって結像光学系３０の焦点面の位置が変更される。すなわち、結像光学系３０の焦点面と培養容器６０との相対的な位置関係が変更される。この液面形状の推定を行う場合における結像光学系３０の焦点面の位置の変更については、後で詳述する。なお、本実施形態においては、結像光学系駆動部３４が、本発明の焦点面変更部に相当するものである。

結像レンズ３３は、位相板３２を通過した直接光および回折光が入射され、これらの光を撮像部４０に結像するものである。なお、本実施形態においては、上述したように結像光学系３０に含まれる対物レンズ３１をＺ方向に移動させるようにしたが、結像レンズ３３をＺ方向に移動させることによって結像光学系３０の焦点面を変更するようにしてもよい。

結像光学系駆動部３４は、上述したように対物レンズ３１をＺ方向に移動させる機構を備えたものである。

撮像部４０は、結像レンズ３３によって結像された観察対象Ｓの位相差画像を撮像する撮像素子を備えたものである。撮像素子としては、ＣＣＤ（charge-coupled device）イメージセンサやＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサなどを用いることができる。

液面計測用照明光照射部１５は、レーザ光源１６と、ダイクロイックミラー１７とを備えている。レーザ光源１６は、調整光学系２０の調整用光学素子２１と培養容器６０との間に設置されたダイクロイックミラー１７に向けてレーザ光を出射するものである。このレーザ光は、培養容器６０内の培養液Ｃの液面形状を計測するための液面計測用照明光である。なお、このレーザ光の波長は、位相差計測用照明光の波長とは異なる波長である。

ダイクロイックミラー１７は、レーザ光源１６から出射されたレーザ光を培養液Ｃの液面に向けて反射し、かつ位相差計測用照明光を透過する光学特性を有するものである。なお、必ずしも位相差計測用照明光を透過するダイクロイックミラーを用いる必要はなく、レーザ光源１６から出射されたレーザ光を反射する単なるミラーを用いるようにしてもよい。その場合、位相差計測を行う場合には、位相差計測用照明光の光路上からミラーを退避させるようにすればよい。

液面計測用照明光照射部１５のレーザ光源１６から出射されたレーザ光は、ダイクロイックミラー１７によって反射された後、培養容器６０内の培養液Ｃを透過し、さらに結像光学系３０を透過して撮像部４０によって検出される。撮像部４０によって検出された透過光の検出信号は、顕微鏡制御装置５０の後述する液面形状推定部５４に出力される。なお、本実施形態においては、撮像部４０が、本発明の透過光検出部に相当するものである。すなわち、本実施形態では、観察対象Ｓを撮像する撮像部４０を、液面計測用照明光を検出する透過光検出部として兼用するようにしているが、このような構成に限らず、透過光検出部を撮像部４０とは別個に設けるようにしてもよい。具体的には、位相板３２と結像レンズ３３との間に配置され、位相差計測用照明光を透過し、液面計測用照明光を反射するダイクロイックミラーと、そのダイクロイックミラーによって反射された液面計測用照明光を検出する撮像素子とを透過光検出部として別に設けるようにしてもよい。

そして、本実施形態においては、液面形状計測用照明光であるレーザ光は、培養液Ｃの液面上における複数の照射点に照射される。ここで、本実施形態では、後述するようにステージ６１をＸ方向およびＹ方向に移動させることによって、たとえばウェルなど培養容器６０内を位相差計測用照明光で走査し、１つのウェル内で分割された複数の撮像領域毎の位相差画像を撮像する。そして、本実施形態では、この各撮像領域内において、少なくとも９個の照射点にレーザ光が照射される。９個の照射点は、３行×３列でそれぞれ予め設定された間隔で配置される。９個の照射点は、撮像領域内において均一に分散させて配置することが望ましい。

図５は、たとえば培養液Ｃの液面上にメニスカスが形成されていないと想定した場合に、撮像部４０の検出面Ｄ上に結像される各照射点に対応するレーザ光の像Ｐ１〜Ｐ９の位置を示している。これに対し、図６は、培養液Ｃの液面上にメニスカスが形成されている場合に、撮像部４０の検出面Ｄ上に結像される各照射点に対応するレーザ光の像Ｐ１〜Ｐ９の位置を示している。図６に示すように、培養液Ｃの液面上に形成されたメニスカスの形状に起因してレーザ光が培養液Ｃの液面で屈折し、これにより検出面Ｄに結像される各照射点に対応するレーザ光の像Ｐ１〜Ｐ９の位置関係は、図５に示す位置関係から矢印方向にずれることになる。

本実施形態においては、ステージ駆動部６２によってステージ６１をＸ方向およびＹ方向に移動させることによって、図５に示す各照射点にレーザ光が順次照射される。すなわち、照射点毎に異なるタイミングでレーザ光が照射される。ただし、これに限らず、たとえばレーザ光源１６およびダイクロイックミラー１７の位置をＸ方向およびＹ方向に移動させることによって、図５に示す各照射点にレーザ光を順次照射するようにしてもよい。また、本実施形態においては、３行×３列の９個の照射点にレーザ光を照射するようにしたが、照射点の数はこれに限らず、４行×４列の１６個としてもよいし、５行×５列の２５個としてもよい。

レーザ光の照射点の数は、撮像領域の大きさまたは培養液Ｃの液面の大きさに応じて変更するようにしてもよく、たとえば撮像領域の大きさの情報または培養容器６０の大きさもしくは種類の情報に基づいて照射点の数を自動的に変更するようにしてもよい。撮像領域の大きさの情報および培養容器６０の大きさまたは種類の情報については、たとえばユーザが入力装置８０を用いて設定入力するようにしてもよい。

顕微鏡制御装置５０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）やストレージデバイスを備えたコンピュータから構成されるものである。

顕微鏡制御装置５０は、具体的には、図１に示すように、調整光学系駆動部２２を制御する調整光学系制御部５１と、結像光学系駆動部３４を制御する結像光学系制御部５２と、ステージ駆動部６２を制御するステージ制御部５３と、上述した液面形状計測用照明光であるレーザ光の照射によって撮像部４０により検出された透過光の検出信号に基づいて、培養容器６０内の培養液Ｃの液面形状を推定する液面形状推定部５４と、液面形状推定部５４によって推定された液面形状に基づいて、調整光学系２０の光学特性を調整するための調整情報を取得する調整情報取得部５５とを備えている。

ここで、本実施形態の液面形状推定部５４による液面形状の推定について、詳細に説明する。

本実施形態においては、上述したように液面形状計測用照明光であるレーザ光が、培養液Ｃの液面上の撮像領域内の９個の照射点に照射される。そして、この際、各照射点について、それぞれ結像光学系３０の焦点面の位置が変更され、焦点面の位置を変更する毎にレーザ光が照射され、ぞれぞれの透過光が撮像部４０によって検出される。液面形状推定部５４は、この焦点面の位置毎に検出された透過光の像の検出面上におけるずれ量に基づいて、各照射点の位置における培養液Ｃの水位の情報を算出し、その算出した水位の情報に基づいて撮像領域内の培養液Ｃの液面形状を推定する。なお、本実施形態においては、上述したように照射点毎にそれぞれ異なるタイミングでレーザ光を照射するので、焦点面の位置を変更する前の透過光の結像位置と、焦点面の位置を変更した後の透過光の結像位置との対応関係を容易に認識することができる。

具体的には、図７に示すように、対物レンズ３１を含む結像光学系３０の焦点面がＳ１の位置に設定されている場合、任意の照射点に対してレーザ光Ｌａを照射すると、メニスカスに起因する液面の傾きによって透過光の光路は角度θだけ屈折し、焦点面Ｓ１上における透過光の結像位置はＦ１となり、照射位置に対してｘだけずれることになる。

次に、対物レンズ３１をＺ方向に移動させることによって結像光学系３０の焦点面をＳ２の位置に変更し、同一の照射点に対してレーザ光Ｌａを照射した場合、同様に液面の傾きによって透過光の光路は角度θだけ屈折するが、このとき焦点面Ｓ２上における透過光の結像位置はＦ２となり、焦点面Ｓ１上における透過光の結像位置Ｆ１からΔｘだけずれることになる。このずれ量Δｘが、撮像部４０によって検出される。すなわち、焦点面をＳ１に設定してレーザ光を照射した場合における撮像部４０の検出面上の透過光の結像位置と、焦点面をＳ２に設定してレーザ光を照射した場合における撮像部４０の検出面上の透過光の結像位置とに基づいて、上述したずれ量Δｘを算出することができる。なお、ここでは、実際に撮像部４０の検出面上において検出されたずれ量がΔｘであるとして説明を進める。また、ここでは、分かりやすくするためＸ方向についてのみ説明するが、実際にはＹ方向へのずれ量も含めて液面形状の推定を行うものとする。

次に、焦点面Ｓ１と焦点面Ｓ２とのＺ方向についての変更量をΔＬとすると、図７に示すように、ｘ、Δｘ、ＬおよびΔＬの関係は、下式の関係となるので、Ｌの値を算出することができる。
Δｘ／ｘ＝ΔＬ／Ｌ
Ｌ＝（ΔＬ／Δｘ）×ｘ
Ｌは、撮像部４０の検出面から培養液Ｃの液面までの距離であり、培養液Ｃの水位の情報を含むものであるので、各照射点について、それぞれＬの値を算出することによって、撮像領域内の培養液Ｃの液面形状を推定することができる。９個の照射点以外の点のＬについては、たとえば９個の照射点についてそれぞれ算出されたＬに基づいて内挿および外挿して算出するようにすればよい。内挿については線形補間を用いるようにしてもよい。また、メニスカスがなす曲面を表す関数を予め設定しておき、その関数にフィッティングすることによって、内挿および外挿するようにしてもよい。なお、メニスカスがなす曲面を表す関数についても、たとえば撮像領域の大きさの情報または培養容器６０の大きさもしくは種類の情報に基づいて自動的に変更するようにしてもよい。培養容器６０の大きさまたは種類の情報については、たとえばユーザが入力装置８０を用いて設定入力するようにしてもよい。

液面形状推定部５４は、上記のようにして撮像領域内の培養液Ｃの液面上の点のＺ方向の位置を算出することによって液面形状を推定し、その推定結果を調整情報取得部５５に出力する。

調整情報取得部５５は、上述したように液面形状推定部５４によって推定された液面形状に基づいて、調整光学系２０の光学特性を調整するための調整情報を取得するものである。具体的には、本実施形態の調整情報取得部５５は、液面形状推定部５４によって推定された液面形状に基づいて、撮像領域内の少なくとも１つの照射点における液面の傾斜角を取得し、その傾斜角と培養液Ｃの屈折率とに基づいて、撮像領域内の照射点における光の屈折角θを算出する。そして、調整情報取得部５５は、撮像領域内の照射点の光の屈折角θの情報を調整情報として調整光学系制御部５１に出力する。

調整光学系制御部５１は、調整情報取得部５５によって算出された照射点の光の屈折角θの情報に基づいて、調整光学系２０の光学特性を調整するものである。具体的には、調整光学系制御部５１には、照射点における屈折角θと、調整光学系２０の調整用光学素子２１の調整量とを対応付けたルックアップテーブルが予め設定されている。そして、調整光学系制御部５１は、入力された照射点の位置の屈折角θの情報に基づいて、上記ルックアップテーブルを参照して調整光学系２０の調整用光学素子２１の調整量を取得し、その調整量に応じた制御信号を調整光学系駆動部２２に出力するものである。なお、調整光学系２０の調整用光学素子２１の調整量としては、上述したように調整用光学素子２１のＸ方向、Ｙ方向およびＺ方向の位置、屈折力並びに光軸方向などがある。

調整光学系制御部５１から出力された制御信号は、調整光学系駆動部２２に入力され、調整光学系駆動部２２は、入力された制御信号に基づいて、調整用光学素子２１の屈折力、Ｘ方向、Ｙ方向およびＺ方向の位置、並びに光軸方向を調整することによって光学特性を調整する。

なお、複数の調整用光学素子２１を交換することによってメニスカスに起因する屈折を調整する場合には、調整情報取得部５５は、液面形状推定部５４によって推定された液面形状に応じた光学特性を有する調整用光学素子２１の種類を特定する情報を調整情報として取得する。調整情報取得部５５には、液面形状とその液面形状に対応する調整用光学素子２１の種類を特定する情報とが対応づけられたテーブルが予め設定されているものとする。

そして、調整情報取得部５５において取得された調整用光学素子２１の種類を特定する情報は、調整光学系制御部５１に出力され、調整光学系制御部５１は、入力された情報に基づいて、液面形状に応じた調整用光学素子２１に自動的に切り替える。なお、調整用光学素子２１の種類を特定する情報を表示装置７０に表示させてユーザに報知させることによって、ユーザが手動で調整用光学素子２１を交換するようにしてもよい。

結像光学系制御部５２は、結像光学系駆動部３４を駆動制御することによって対物レンズ３１をＺ方向に移動させるものである。具体的には、本実施形態の結像光学系制御部５２は、上述したように観察対象Ｓの位相差画像を撮像する場合には、結像光学系駆動部３４によって対物レンズ３１をＺ方向へ移動させることによってオートフォーカス制御するものである。

また、培養容器６０内の培養液Ｃの液面形状の推定を行う場合には、結像光学系駆動部３４によって対物レンズ３１をＺ方向へ移動させることによって、結像光学系３０の焦点面と培養容器６０との相対的な位置関係を変更するものである。

ここで、培養液Ｃの液面形状の推定を行う場合における対物レンズ３１のＺ方向への移動量ΔＬについて、図７を参照しながら説明する。移動量ΔＬは、培養液Ｃの液面の最大高さをＬ_ｍａｘ、撮像部４０の撮像素子の分解能をΔｘ_ｍｉｎとすると、メニスカスに起因する光路のずれを検出するために必要な対物レンズ３１のＺ方向への移動量ΔＬは、下式によって求めることができる。なお、θ_ｍａｘは、光路がｘだけずれたときの、Ｌとｘがなす角度の許容限界であり、調整用光学素子２１の性能によって決まるものである。
ｘ＝Ｌ_ｍａｘ×ｔａｎθ_ｍａｘ
ΔＬ＝Ｌ_ｍａｘ×（Δｘ_ｍｉｎ／ｘ）＝Δｘ_ｍｉｎ／ｔａｎθ_ｍａｘ
ステージ制御部５３は、ステージ駆動部６２を駆動制御することによってステージ６１をＸ方向、Ｙ方向およびＺ方向に移動させるものである。ステージ制御部５３は、上述したようにステージ６１をＸ方向およびＹ方向に移動させることによって、１つのウェル内を位相差計測用照明光で走査し、１つのウェル内で分割された複数の撮像領域毎の位相差画像を撮像するものである。

また、顕微鏡制御装置５０には、入力装置８０と表示装置７０とが接続されている。入力装置８０は、キーボードやマウスなどの入力デバイスを備えたものであり、ユーザによる設定入力を受け付けるものである。特に、本実施形態における入力装置８０は、上述したように培養容器６０の大きさまたは種類の情報の設定入力を受け付けるものである。

表示装置７０は、液晶ディスプレイなどの表示デバイスから構成されるものであり、撮像部４０において撮像された位相差画像などを表示するものである。なお、表示装置７０をタッチパネルで構成し、その画面を押圧することにより設定入力可能とすることによって、表示装置７０が入力装置を兼ねてもよい。

次に、本実施形態の顕微鏡システムの作用について、図８に示すフローチャートを参照しながら説明する。

まず、観察対象Ｓおよび培養液Ｃが収容された培養容器６０がステージ６１上に設置される。そして、ステージ６１が、ステージ駆動部６２によって、ウェル内の複数の撮像領域のうちの最初の撮像領域（たとえば図９に示す撮像領域Ｒ）に位相差計測用照明光が照射される位置まで移動し、位相差計測用照明光がその撮像領域に照射される（Ｓ１０）。位相差計測用照明光の照射によって最初の撮像領域の位相差画像が撮像部４０によって撮像される。そして、その位相差画像が結像光学系制御部５２に入力され、結像光学系制御部５２は、入力された位相差画像のコントラストが最大となるようにオートフォーカス制御を行う（Ｓ１２）。

次に、オートフォーカス制御が行われた後、ステージ６１が、撮像領域内の９個の液面計測用照明光の照射点のうちの最初の照射点（たとえば図９に示す照射点Ｐ１）に液面計測用照明光が照射される位置まで移動し、液面計測用照明光としてレーザ光が培養液Ｃの液面に対して照射される（Ｓ１４）。そして、培養液Ｃおよび結像光学系３０を透過した透過光が撮像部４０によって検出され、その検出信号に基づいて、透過光の像の結像位置の情報が取得される（Ｓ１６）。

次に、結像光学系駆動部３４により対物レンズ３１がＺ方向に移動することによって、結像光学系３０の焦点面と培養容器６０との相対的な位置関係が変更され（Ｓ１８）、再び液面計測用照明光としてレーザ光が培養液Ｃの液面に対して照射される（Ｓ２０）。そして、培養液Ｃおよび結像光学系３０を透過した透過光が撮像部４０によって再び検出され、その検出信号に基づいて、透過光の像の結像位置の情報が取得される（Ｓ２２）。

そして、焦点面の位置を変更する前の透過光の結像位置の情報と、焦点面の位置を変更した後の透過光の結像位置の情報とが液面形状推定部５４によって取得され、結像位置のずれ量が算出され、そのずれ量に基づいて、上述した演算により培養液Ｃの水位の情報Ｌが算出される。

次いで、Ｓ１４〜Ｓ２２までの処理が、残りの８個（図９に示す照射点Ｐ２〜Ｐ９）の照射点についても同様に行われ、各照射点について、透過光の結像位置のずれ量が算出され、そのずれ量に基づいて、培養液Ｃの水位の情報Ｌが算出される。そして、液面形状推定部５４は、上述したようにして取得された各照射点に対応する培養液Ｃの水位の情報Ｌに基づいて、最初の撮像領域内の培養液Ｃの液面形状を推定する（Ｓ２４）。

液面形状の推定結果は調整情報取得部５５に出力され、調整情報取得部５５は、推定された液面形状に基づいて、調整光学系２０の光学特性を調整するための調整情報を取得する（Ｓ２６）。そして、調整情報取得部５５によって取得された調整情報は調整光学系制御部５１に出力され、調整光学系制御部５１は、入力された調整情報に基づいて、調整光学系２０の光学特性を調整する（Ｓ２８）。

そして、上記のようにして調整光学系２０の光学特性が調整されて、これにより培養液Ｃの液面に形成されたメニスカスによる屈折の影響が取り除かれた後、再び最初の撮像領域に位相差計測用照明光が照射される（Ｓ３０）。そして、位相差計測用照明光の照射によって最初の撮像領域の最終的な位相差画像が撮像部４０によって撮像される（Ｓ３２）。

そして、その位相差画像が、顕微鏡制御装置５０におけるメモリなどからなる記憶部（図示省略）に記憶される。

次いで、ステージ駆動部６２によりステージ６１がＸ方向およびＹ方向に移動することによって撮像領域が移動し、各撮像領域について、上記と同様にして、オートフォーカス制御、液面形状の推定、調整光学系２０の調整および位相差画像の撮像が行われ、各撮像領域の位相差画像が、顕微鏡制御装置５０における記憶部に順次記憶される。

そして、顕微鏡制御装置５０において各撮像領域の位相差画像が合成されることによって、１つのセル全体の合成位相差画像が生成され、その合成位相差画像が表示装置７０に表示される（Ｓ３４）。

上記実施形態の顕微鏡システムによれば、培養液Ｃおよび観察対象Ｓが収容された培養容器６０内の液面に対して液面計測用照明光を照射し、その液面計測用照明光の照射によって培養容器６０内の培養液Ｃを透過した透過光を撮像部４０によって検出する。さらに、結像光学系３０の焦点面と培養容器６０との相対的な位置関係を変更して焦点面の位置毎の透過光の検出信号を取得し、焦点面の位置毎の透過光の検出信号に基づいて、液体の液面形状を推定するようにしたので、培養容器６０内に収容された培養液Ｃの液面に形成されるメニスカスの形状を正確に把握することができる。

そして、その推定した液面形状に基づいて、液面形状に起因する光の屈折を調整する調整光学系２０の光学特性を調整するための調整情報を取得し、その調整情報に基づいて、調整光学系２０の光学特性が調整された後、培養容器６０に対して位相差計測用照明光を照射し、位相差計測用照明光を照射した観察対象を撮像するようにしたので、メニスカスに起因する位相差計測用照明光の屈折の影響を高精度に取り除くことができ、より適切な位相差画像を取得することができる。

なお、上記実施形態の顕微鏡システムにおいては、対物レンズ３１をＺ方向に移動させることによって、結像光学系３０の焦点面と培養容器６０との相対的な位置関係を変更するようにしたが、これに限らず、ステージ６１をＺ方向に移動させることにより培養容器６０をＺ方向に移動させることによって、結像光学系３０の焦点面と培養容器６０との相対的な位置関係を変更するようにしてもよい。

また、上記実施形態の顕微鏡システムにおいては、撮像領域内の９個の照射点に液面計測用照明光を照射するようにしたが、照射点の数はこれに限らず、たとえば撮像領域内の少なくとも１つの照射点に液面計測用照明光を照射し、その照射点が含まれる撮像領域の位置情報（本発明における照射点の位置情報に相当する）と、透過光の検出信号と、予め設定された液面の曲面を表す情報とに基づいて、液面形状を推定するようにしてもよい。具体的には、たとえば撮像領域内の重心位置に液面計測用照明光を照射し、上述したように結像光学系３０の焦点面の位置を変更して透過光の結像位置のずれ量を取得することによって上記重心位置における水位の情報Ｌを取得し、その水位の情報Ｌを予め設定された液面の曲面の頂点に設定することによって、液面全体の形状を推定するようにしてもよい。予め設定された液面の曲面を表す情報としては、たとえば曲面を表す関数などがある。この液面の曲面を表す情報は、照射点が含まれる撮像領域の位置情報に応じて変更することが望ましい。

また、図１０に示すように、撮像領域Ｒ内の少なくとも３つの照射点に液面計測用照明光を照射し、その照射点が含まれる撮像領域の位置情報と、透過光の検出信号とに基づいて、液面形状を推定するようにしてもよい。具体的には、たとえば、図１０に示すように、ウェルｗ（液面）の重心位置から外周に向けて伸びる直線上の撮像領域内の位置に３つの照射点を設定し、その３つの照射点に対して液面計測用照明光を照射する。なお、このとき３つの照射点の間隔を等間隔にすることによって液面形状の推定の精度を上げることができる。

そして、各照射点について、上述したように結像光学系３０の焦点面の位置を変更して透過光の結像位置のずれ量を取得することによって各照射点における水位の情報Ｌを取得する。液面上に形成されるメニスカスの曲面はウェルｗの中心Ｇに対して点対称な形状であるので、３つの照射点に対応する水位の情報Ｌを結んで得られた曲線を回転させることによって撮像領域内Ｒの液面の形状を推定することができる。なお、上記曲線の求め方については、照射点が含まれる撮像領域の位置情報に応じて変更することが望ましい。

また、液面の曲面を表す関数などの情報が予め設定されている場合には、その関数に３つの照射点に対応する水位の情報Ｌをフィッティングして液面の形状を推定するようにしてもよい。この場合、照射点が含まれる撮像領域の位置情報は必ずしも必要ない。

また、図１１に示すように、１つのウェルｗ内において撮像領域Ｒを外周から中心に向けて渦巻き状に変更しながら各撮像領域の位相差画像を撮像する場合には、ウェルｗ（液面）の重心位置からの距離が異なる各周上についてそれぞれ１つの撮像領域について１回のみ液面形状の推定を行うようにしてもよい。

また、上記実施形態の顕微鏡システムにおいては、９個の照射点に対して、それぞれ異なるタイミングで液面計測用照明光を照射するようにしたが、９個の照射点に対して同時に液面計測用照明光を照射するようにしてもよい。この場合、各照射点について、結像光学系３０の焦点面の位置の変更前後での透過光の結像位置の対応付けを容易にするため、照射点毎にそれぞれ異なる形状パターンを有する液面計測用照明光を照射するようにしてもよい。そして、各照射点について、同じ形状パターンを有する透過光の像同士を対応付けることによって、透過光の結像位置のずれ量を取得するようにしてもよい。

また、各照射点について、結像光学系３０の焦点面の位置の変更前後の透過光の結像位置の対応付けを容易にするため、照射点毎にそれぞれ異なる色（波長）を有する液面計測用照明光を照射するようにしてもよい。そして、各照射点について、同じ色の透過光の像同士を対応付けることによって、透過光の結像位置のずれ量を取得するようにしてもよい。なお、この場合、撮像部４０の撮像素子としては、カラーフィルタを有する撮像素子が用いられる。

また、上記実施形態の顕微鏡システムを用いて、経時的に複数枚の位相差画像の撮像を行ういわゆるタイムラプス撮影を行う場合には、時間の経過とともに培養液Ｃの量や粘度などが変化してメニスカスの形状が変化することが考えられる。したがって、位相差画像の撮像を行う度に上述した液面形状の推定を行い、その推定結果に基づいて調整光学系２０の光学特性を調整することが望ましい。そして、このように経時的に複数回の液面形状の推定を行う場合には、過去の液面形状の推定結果を用いることによって、今回の液面形状を推定する際に設定する液面計測用照明光の照射点の数を減らすようにしてもよい。

具体的には、液面形状推定部５４に過去の液面形状の推定結果を記憶しておき、今回、過去に液面形状の推定を行った際に設定した照射点の数よりも少ない数の照射点を設定すする。そして、その照射点に液面計測用照明光を照射することによって、各照射点について液面の水位の情報Ｌを取得し、過去に推定した液面形状を今回取得した水位の情報Ｌにフィッティングすることによって今回の液面形状の推定結果を取得するようにしてもよい。

また、上記実施形態の顕微鏡システムにおいては、液面計測用照明光としてスポット光であるレーザ光を照射するようにしたが、これに限らず、予め設定されたパターンを有するパターン光を液面計測用照明光として照射するようにしてもよい。

具体的には、図１２に示すような、格子状のパターンを有する液面計測用照明光を照射するようにしてもよい。この場合、格子の交点を上述した照射点とし、結像光学系３０の焦点面の位置の変更前後における交点の結像位置のずれ量を取得し、そのずれ量に基づいて、交点の位置に対応する液面上の位置の水位の情報Ｌを取得するようにすればよい。

なお、図１２に示すような格子状のパターンを有する液面計測用照明光を照射する場合、結像光学系３０の焦点面の位置の変更前後での交点の結像位置の対応付けを容易にするため、格子状のパターン光の交点の位置に、それぞれ異なる形状の像を形成するマークのパターンを形成するようにしてもよい。マークのパターンとしては、たとえば星形状や円形状のパターンなどがある。または、格子状のパターン光の交点の位置の色（波長）を異なるものとしてもよい。

また、パターンを有する液面計測用照明光としては、格子状のパターンに限らず、図１３に示すような同心円のパターンを有する液面計測用照明光を照射するようにしてもよい。この場合、同心円とＸ方向およびＹ方向に延びる直線との交点を上述した照射点とし、結像光学系３０の焦点面の位置の変更前後における上記交点の結像位置のずれ量を取得し、そのずれ量に基づいて、上記交点の位置に対応する液面上の位置の水位の情報Ｌを取得するようにすればよい。

なお、同心円のパターンを有する液面計測用照明光を照射する場合にも、結像光学系３０の焦点面の位置の変更前後での交点の結像位置の対応付けを容易にするため、同心円のパターン光の上記交点の位置に、それぞれ異なる形状の像を形成するマークのパターンを形成するようにしてもよい。または、同心円のパターン光の上記交点の位置の色（波長）を異なるものとしてもよい。

また、上記実施形態の顕微鏡システムにおいては、撮像領域毎にそれぞれ液面形状の推定を行うようにしたが、これに限らず、たとえば、図１４に示すように、１つのウェルｗ内に少なくとも９個の液面計測用照明光の照射点を均一に設定し、その透過光の検出信号に基づいて、各照射点の位置における水位の情報Ｌを取得し、その水位の情報からウェルｗ全体の液面形状の推定を行うようにしてもよい。

また、図１５に示すように、ウェルｗの重心位置から外周に向けて伸びる直線上の位置に等間隔で３つの照射点を設定し、その透過光の検出信号に基づいて、各照射点の位置における水位の情報Ｌを取得し、その各照射点に対応する水位の情報Ｌを結んで得られた曲線を３６０度回転させることによってウェルｗ全体の液面形状の推定を行うようにしてもよい。

なお、上述したようにウェルｗ全体の液面形状の推定を行う場合も、ウェルｗ内の撮像領域毎に屈折角θを求め、その屈折角θに基づいて調整光学系２０の光学特性を調整するようにすればよい。

また、上記実施形態の顕微鏡システムにおいては、液面上に形成されたメニスカスに起因する位相差計測用照明光の屈折の影響を取り除くために調整用光学素子２１を設けるようにしたが、必ずしもこのような調整用光学素子２１を設けなくてもよく、たとえば、調整情報に基づいて、スリット板１２をＸ方向およびＹ方向に移動させたり、位相板３２をＸ方向およびＹ方向に移動させたりして、メニスカスに起因する位相差計測用照明光の屈折の影響を取り除くようにしてもよい。すなわち、本発明における調整光学系として、スリット板１２や位相板３２を用いるようにしてもよい。

また、上記実施形態の顕微鏡システムにおいては、調整用光学素子２１をコンデンサレンズ１３と培養容器６０との間に設けるようにしたが、調整用光学素子２１の位置はこの位置に限らず、たとえば白色光源１１とスリット板１２との間、位相板３２とコンデンサレンズ１３との間、および培養容器６０と対物レンズ３１との間などその他の位置に設けるようにしてもよい。

１０ 位相差計測用照明光照射部
１１ 白色光源
１２ スリット板
１２ａ スリット
１２ｂ 遮光板
１３ コンデンサレンズ
１５ 液面計測用照明光照射部
１６ レーザ光源
１７ ダイクロイックミラー
２０ 調整光学系
２１ 調整用光学素子
２２ 調整光学系駆動部
３０ 結像光学系
３１ 対物レンズ
３２ 位相板
３２ａ 位相リング
３２ｂ 透明板
３３ 結像レンズ
３４ 結像光学系駆動部
４０ 撮像部
５０ 顕微鏡制御装置
５１ 調整光学系制御部
５２ 結像光学系制御部
５３ ステージ制御部
５４ 液面形状推定部
５５ 調整情報取得部
６０ 培養容器
６１ ステージ
６２ ステージ駆動部
７０ 表示装置
８０ 入力装置

Claims (22)

1. 液体および観察対象が収容された容器に対して位相差計測のための位相差計測用照明光を照射する位相差計測用照明光照射部と、
   前記位相差計測用照明光を照射した前記観察対象を撮像する撮像部と、
   前記容器内の液体の液面形状を計測するための液面計測用照明光を前記液体の液面に対して照射する液面計測用照明光照射部と、
   前記液面計測用照明光の照射によって前記容器内の液体を透過した透過光を検出する透過光検出部と、
   前記透過光を前記透過光検出部の検出面に集光する結像光学系の焦点面と前記容器との相対的な位置関係を変更する焦点面変更部と、
   前記焦点面の位置毎の前記透過光の検出信号に基づいて、前記液体の液面形状を推定する液面形状推定部と、
   前記位相差計測用照明光照射部と前記観察対象との間に設けられ、前記容器内の液体の液面形状に起因する前記位相差計測用照明光の屈折を調整する調整光学系と、
   前記液面形状推定部によって推定された液面形状に基づいて、前記調整光学系の光学特性を調整するための調整情報を取得する調整情報取得部とを備えたことを特徴とする位相差顕微鏡。
2. 前記調整情報取得部によって取得された調整情報に基づいて、前記調整光学系の光学特性を調整する調整光学系制御部を備えた請求項１記載の位相差顕微鏡。
3. 前記焦点面変更部が、前記結像光学系に含まれる光学素子を光軸方向に移動させることによって、前記焦点面と前記容器との相対的な位置関係を変更する請求項１または２記載の位相差顕微鏡。
4. 前記焦点面変更部が、前記容器を前記結像光学系の光軸方向に移動させることによって、前記焦点面と前記容器との相対的な位置関係を変更する請求項１または２記載の位相差顕微鏡。
5. 前記焦点面変更部が、前記結像光学系に設けられた焦点距離の異なる複数の光学素子の交換によって、前記焦点面と前記容器との相対的な位置関係を変更する請求項１または２記載の位相差顕微鏡。
6. 前記液面形状推定部が、前記液体の液面上の前記液面計測用照明光の照射位置の情報および予め設定された前記液面の曲面を表す情報と、前記液体の液面上の少なくとも１点に対して前記液面計測用照明光を照射した場合の前記透過光の検出信号とに基づいて、前記液面形状を推定する請求項１から５いずれか１項記載の位相差顕微鏡。
7. 前記液面形状推定部が、前記液体の液面上の前記液面計測用照明光の照射位置の情報および予め設定された前記液面の曲面を表す情報のうちのいずれか一方の情報と、前記液体の液面上の少なくとも３点に対して前記液面計測用照明光を照射した場合の前記透過光の検出信号とに基づいて、前記液面形状を推定する請求項１から５いずれか１項記載の位相差顕微鏡。
8. 前記液面形状推定部が、前記液体の液面上の少なくとも９点に対して前記液面計測用照明光を照射した場合の前記透過光の検出信号に基づいて、前記液面形状を推定する請求項１から５いずれか１項記載の位相差顕微鏡。
9. 前記液面形状推定部が、前記液体の液面の重心位置からの距離が異なる各周上についてそれぞれ１回のみ前記液面形状の推定を行う請求項１から８いずれか１項記載の位相差顕微鏡。
10. 前記液面計測用照明光照射部が、前記液体の液面上の複数の点に前記液面計測用照明光を照射する場合、前記点毎に異なる形状パターンを有する前記液面計測用照明光を照射する請求項１から９いずれか１項記載の位相差顕微鏡。
11. 前記液面計測用照明光照射部が、前記液体の液面上の複数の点に前記液面計測用照明光を照射する場合、前記点毎に異なるタイミングで前記液面計測用照明光を照射する請求項１から９いずれか１項記載の位相差顕微鏡。
12. 前記液面計測用照明光照射部が、前記液体の液面上の複数の点に前記液面計測用照明光を照射する場合、前記点毎に異なる波長を有する前記液面計測用照明光を照射する請求項１から９いずれか１項記載の位相差顕微鏡。
13. 前記液面形状推定部が、前記液面計測用照明光が照射された前記液面上の点の液面形状の推定結果を用いて補間することによって、前記液面計測用照明光が照射されていない前記液面上の点の液面形状の推定を行う請求項１から１２いずれか１項記載の位相差顕微鏡。
14. 前記液面形状推定部が、前記液面形状の推定結果を記憶し、
    前記液面計測用照明光照射部が、前記推定結果の記憶よりも後の時点で再び前記液面の液面形状の推定を行う場合には、前の時点で前記液面形状の推定を行った場合よりも前記液面計測用照明光の前記液面上の照射点の数を減らし、
    前記液面形状推定部が、前記減らされた照射点の前記透過光の検出信号に基づく液面形状の推定結果と前記記憶した液面形状の推定結果とに基づいて、前記後の時点での液面形状の推定を行う請求項１から１３いずれか１項記載の位相差顕微鏡。
15. 前記液面計測用照明光照射部が、予め設定されたパターンを有するパターン光を前記液面計測用照明光として照射する請求項１から５いずれか１項記載の位相差顕微鏡。
16. 前記パターン光が、格子状のパターンを有する請求項１５記載の位相差顕微鏡。
17. 前記パターン光が、同心円のパターンを有する請求項１５記載の位相差顕微鏡。
18. 前記パターン光によって形成される像上の予め設定された複数の位置にそれぞれ異なる形状の像が形成される請求項１５から１７いずれか１項記載の位相差顕微鏡。
19. 前記パターン光によって形成される像上の予め設定された複数の位置にそれぞれ異なる色の像が形成される請求項１５から１７いずれか１項記載の位相差顕微鏡。
20. 前記調整情報取得部が、前記推定された液面形状に基づいて、前記液体の液面形状に起因する前記位相差計測用照明光の光路ずれを算出し、該算出した光路ずれに基づいて、前記調整光学系の調整情報を取得する請求項１から１９いずれか１項記載の位相差顕微鏡。
21. 前記液面形状推定部が、前記液面の曲面情報および位置情報を算出することによって、前記液面形状を推定する請求項１から２０いずれか１項記載の位相差顕微鏡。
22. 液体および観察対象が収容された容器内の前記液体の液面に対して、前記容器内の液体の液面形状を計測するための液面計測用照明光を照射し、
    前記液面計測用照明光の照射によって前記容器内の液体を透過した透過光を透過光検出部によって検出し、
    前記透過光を前記透過光検出部の検出面に集光する結像光学系の焦点面と前記容器との相対的な位置関係を変更して該焦点面の位置毎の前記透過光の検出信号を取得し、
    前記焦点面の位置毎の前記透過光の検出信号に基づいて、前記液体の液面形状を推定し、
    該推定した液面形状に基づいて、位相差計測のための位相差計測用照明光を照射する照射部と前記観察対象との間に設けられ、前記液面形状に起因する光の屈折を調整する調整光学系の光学特性を調整するための調整情報を取得し、
    該調整情報に基づいて、前記調整光学系の光学特性が調整された後、前記容器に対して前記位相差計測用照明光を照射し、
    前記位相差計測用照明光を照射した前記観察対象を撮像することを特徴とする撮像方法。