JP2009092772A - 顕微鏡、培養装置 - Google Patents

Abstract

【課題】照明光学系と標本との間のスペースを十分に確保しながら、標本の培養液に生じるレンズ効果を解消することが可能な顕微鏡等を提供する。
【解決手段】光源２３と、コンデンサレンズ２８と、リング絞り２５とを有する照明光学系と、対物レンズ２０と、該対物レンズ２０の瞳面に配置されたリング形状の位相膜２０ａとを有する観察光学系と、標本２の培養液３に生じるレンズ効果を解消するために、前記照明光学系の光源２３とコンデンサレンズ２８との間に、複数枚のミラー３１，３２，３３，３４からなり光路長を延長する補正光学系２６とを有することを特徴とする。
【選択図】図２

Description

本発明は、顕微鏡、培養装置に関する。

従来、培養容器内の標本を位相差顕微鏡によって観察する際には、培養液の液面が表面張力によって湾曲することでレンズの役割を果たし（以下、「レンズ効果」という。）、位相差顕微鏡の光学系に対して大きな影響を及ぼしていた。
位相差顕微鏡は、照明光学系の開口絞りの位置にリング絞りを備え、さらに標本を通過した直接光を減衰してその位相を１／４波長遅らせるための位相膜を、リング絞りと共役になるように観察光学系の対物レンズ内の瞳面に備えてなる。これにより、直接光と標本で回折した回折光とを干渉させて標本の位相差像を形成することができ、無色透明な細胞等の標本を観察することが可能となる。

斯かる構成の位相差顕微鏡では、前述のように標本の培養液にレンズ効果が生じると、照明光学系のリング絞りと対物レンズ内の位相膜との共役関係が崩れてしまう。このため、直接光と回折光との干渉のバランスが崩れ、標本の位相差像の像質が劣化してしまう。
また位相差顕微鏡は、標本の培養液にレンズ効果が生じると、照明光学系におけるコンデンサレンズの焦点位置がずれてしまう。このため、照明の均一性が崩れ、標本の位相差像の明るさが不均一になってしまう。

特に、近年では創薬の分野において、標本の増殖率等の観察や測定を、標本に対して非侵食な位相差顕微鏡を用いて行うことが求められており、ＨＴＳ（High Throughput Screening）等の大量スクリーニングが盛んになりつつある。大量スクリーニングにおいては、１つの培養容器にできるだけ多くの培養槽を設け、各培養槽で様々に条件を変えて培養した多数の標本を高速に処理することが求められる。また、斯かる構造の培養容器としてはウェルプレートが知られており、培養槽（ウェル）を６個備えた所謂６ウェルプレートの他に、１２、２４、４８、９６、３８６ウェルプレートがよく用いられている。また各ウェルプレートの外形は、処理をしやすくするべくいずれも同様に作られているため、ウェルの数が多いほど１個当たりのウェルの大きさは小さくなる。

例えば、２４ウェルプレートにおける１個当たりのウェルの直径は１６ｍｍ前後であるが、９６ウェルプレートでは５ｍｍ程度にまで小さくなる。ここで、ウェルの直径が小さいほど、表面張力による培養液の液面の湾曲が大きくなるため、レンズ効果も大きくなり、標本の位相差像への影響も大きくなる。おおよそ、２４ウェルプレートから標本の低倍の位相差像に歪みが生じ、９６ウェルプレート以上では低倍から高倍にわたって標本の位相差像を殆ど観察することができなくなってしまう。なお、培養液の液面の湾曲具合（液面の曲率）は、培養容器の形状、素材、コーティング、及び培養液の組成等によっても様々である。

斯かる背景の下、従来、標本の培養液に生じるレンズ効果を解消するためのレンズ系を、照明光学系と標本との間に備えた顕微鏡光学系が提案されている（例えば、特許文献１を参照。）。
特許第３４３７２５７号公報

しかしながら従来の顕微鏡光学系は、前述のレンズ系を備えているために、照明光学系と標本との間に、観察のための種々の装置（例えば、標本の搬送装置等）を配置するためのスペースを十分に確保することができないという問題があった。

そこで本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、照明光学系と標本との間のスペースを十分に確保しながら、標本の培養液に生じるレンズ効果を解消することが可能な顕微鏡、培養装置を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために本発明は、
光源と、コンデンサレンズと、リング絞りとを有する照明光学系と、
対物レンズと、該対物レンズの瞳面に配置されたリング形状の位相膜とを有する観察光学系と、
標本の培養液に生じるレンズ効果を解消するために、前記照明光学系の前記光源と前記コンデンサレンズとの間に、複数枚のミラーからなり光路長を延長する補正光学系と、
を有することを特徴とする顕微鏡を提供する。

また本発明は、
標本を培養する培養容器を収容する恒温装置と、
本発明の顕微鏡とを有することを特徴とする培養装置を提供する。

本発明によれば、照明光学系と標本との間のスペースを十分に確保しながら、標本の培養液に生じるレンズ効果を解消することが可能な照明装置、顕微鏡、培養装置を提供することができる。

以下、本願の実施形態に係る培養装置を添付図面に基づいて詳細に説明する。
はじめに、本願の実施形態に係る培養装置の全体的な構成について簡単に説明する。
図１に示すように培養装置１は、標本２及び培養液３が注入された培養容器（ウェルプレート４）を収容して恒温及び恒湿の雰囲気に維持する恒温装置５と、培養した標本２を観察するための位相差顕微鏡６とからなる。

恒温装置５内には、複数のウェルプレート４を収容するスタッカー７と、ウェルプレート４を位相差顕微鏡６へ搬送するための搬送装置８が備えられている。
スタッカー７は、ウェルプレート４を載置するための複数の棚９からなる。
搬送装置８は、上下方向へ延びた支柱１０と、駆動部１１により支柱１０に沿って上下動可能な搬送アーム１２とからなる。なお、この搬送アーム１２は駆動部１３によって水平方向への移動も可能である。この構成により搬送アーム１２は、スタッカー７に収容されているウェルプレート４を上下水平方向へ搬送することが可能となる。

位相差顕微鏡６は、恒温装置５の下側に設けられており、照明装置１５と、ステージ１６と、顕微鏡本体１７とを有してなる。図１に示すように本実施形態では、位相差顕微鏡６の一部が恒温装置５の内部へ延在しており、この部分に照明装置１５が配置されている。また、位相差顕微鏡６において顕微鏡本体１７は、恒温装置５よりも下側であって照明装置１５と対向する位置に備えられている。そしてステージ１６は、恒温装置５内の底面上であって、照明装置１５と顕微鏡本体１７の間の位置に配置されている。なお、恒温装置５及び位相差顕微鏡６において、位相差顕微鏡６の光路に対応する各々の筐体の壁面は透明部材で構成されている。

以上の構成により本培養装置１では、恒温装置５に複数のウェルプレート４を収容して多数の標本２を培養し、これを位相差顕微鏡６によって観察することができる。なお、本培養装置１では、恒温装置５の外部に位相差顕微鏡６、及び搬送装置８の駆動部１１,１３が設けられているため、恒温装置５への熱的影響を低減することができる。

次に、本願の実施形態に係る培養装置１において、最も特徴的な照明装置１５を備えた位相差顕微鏡６について詳細に説明する。
位相差顕微鏡６の顕微鏡本体１７は、図１に示すようにステージ１６側から順に、対物レンズ２０と、結像レンズ２１と、撮像部２２とを備えている。また対物レンズ２０は、図２（ｂ）に示すようにその瞳面にリング形状の位相膜２０ａを有している。

位相差顕微鏡６の照明装置１５は、図２（ａ）及び図２（ｂ）に示すように光源としてＬＥＤ２３を有しており、該ＬＥＤ２３側から順に、コリメートレンズ２４と、リング絞り２５と、補正光学系２６と、光路をステージ１６側へ折り曲げる反射ミラー２７と、コンデンサレンズ２８とを備えている。なお、リング絞り２５は対物レンズ２０中の位相膜２０ａに対して共役となるように配置されている。

補正光学系２６は、標本２の培養液３で生じるレンズ効果を解消するための光学系であって、図２（ａ）に示すようにＬＥＤ２３からの光路をコの字状に引き回すように配置された４つの反射ミラー３１，３２，３３，３４と、後述する補助レンズ３０と、同じく後述するハービングガラス３５（図６に図示）とを備えてなる。
この補正光学系２６は、ＬＥＤ２３の射出光軸に対して垂直に延在する案内軸３６ａに沿って移動可能に設けられており、これを駆動するためのモータ３６ｂを有している。これにより、補正光学系２６全体を図３（ａ）に示すように光路外へ退避、及び図２（ａ）に示すように光路内へ復帰させることができる。

斯かる構成の本実施形態の位相差顕微鏡６は、例えばシャーレや６ウェルプレート等に注入されており培養液３でレンズ効果を生じない標本２を観察する場合には、図３（ａ）に示すように補正光学系２６を光路外へ退避させて用いられる。
このため、照明装置１５のＬＥＤ２３から発せられた光は、コリメートレンズ２４を経てリング絞り２５へ入射する。そしてこのリング絞り２５を通過した光は、反射ミラー２７、及びコンデンサレンズ２８を順に経由し、ステージ１６に載置されたウェルプレート４内の標本２へ入射する。

標本２へ入射した光のうち、標本２を通過した直接光は、顕微鏡本体１７の対物レンズ２０へ入射し、さらに位相膜２０ａへ入射する。ここで、直接光は位相膜２０ａを通過することによって減衰され、位相が１／４波長遅くなる。そしてこの直接光は、結像レンズ２１を介して撮像部２２へ導かれる。一方、標本２へ入射した光のうち、標本２によって回折された回折光は、顕微鏡本体１７の対物レンズ２０へ入射した後、位相膜２０ａへ入射することなく対物レンズ２０から射出される。そしてこの回折光は、直接光と同様に結像レンズ２１を介して撮像部２２へ導かれる。
これにより、斯かる直接光と回折光は干渉し、撮像部２２の撮像面には標本２の位相差像が形成されることとなる。したがって撮像部２２は、この位相差像を撮像して不図示のモニタに表示し、これによって観察者は標本２を観察することが可能となる。

ここで、本実施形態の位相差顕微鏡６において、補正光学系２６を光路外へ退避させたまま、例えば２４〜９６ウェルプレート等に注入された標本２を観察しようとする場合には、培養液３でレンズ効果が生じて照明装置１５に不要なレンズが挿入された状態となってしまうため、照明装置１５の焦点距離が変化してしまう。そしてこれにより、照明装置１５のリング絞り２５と対物レンズ２０内の位相膜２０ａとの共役関係が崩れ、標本２からの直接光が対物レンズ２０の瞳位置で結像せず、位相膜２０ａに適切に入射しなくなるため、直接光と回折光の干渉のバランスが崩れてしまう。また、コンデンサレンズ２８の焦点位置がずれることとなってしまう。したがって光学的には、図４（ｂ）に示すようにリング絞り２５の位置がずれたことと同等であり、標本２の位相差像の像質が劣化し、標本２を観察しにくくなってしまう。また、照明の均一性が崩れ、標本２の位相差像の明るさが不均一になってしまう。

そこで、本実施形態の位相差顕微鏡６は、培養液３でレンズ効果が生じる標本２を観察する場合には、図２（ａ）及び図４（ｃ）に示すように補正光学系２６を光路上へ配置して用いられる。
これにより、照明装置１５においてＬＥＤ２３から発せられてリング絞り２５を通過した光は、反射ミラー２７で反射される前に補正光学系２６を経由することとなり、照明装置１５の光路長を延長することができる。そしてこれにより、レンズ効果で変化した照明装置１５の焦点距離を補正することができ、前述の不具合を解消することが可能となる。なお、補正光学系２６を構成する各反射ミラー３１，３２，３３，３４は、照明装置１５の焦点距離の補正に適した間隔をもって予め配置されている。
以上より、本実施形態の位相差顕微鏡６は、補正光学系２６を照明装置１５内に設けることで、照明装置１５と標本２との間のスペースを十分に確保しながら、標本２の培養液３に生じるレンズ効果を解消することができる。

ここで、先に述べたように標本２の培養液３の液面の湾曲具合は、標本２及び培養液３を注入したウェルプレート４のウェルの直径等によって異なるため、レンズ効果の大きさも様々であり、したがって照明装置１５の焦点距離の変化量も様々である。
そこで本実施形態の位相差顕微鏡６は、図２（ａ）に示すように補正光学系２６の反射ミラー３２，３３が、案内軸３６ａと同じ方向に延在する案内軸３７ａに沿って一体的に移動可能に設けられており、これを駆動するためのモータ３７ｂを有している。このため、図３（ｂ）に示すように反射ミラー３２，３３を反射ミラー３１，３４から遠ざけたり、図２（ａ）に示すように近づけたりすることが可能となり、即ち補正光学系２６の光路長を調整することができる。なお、本実施形態では、反射ミラー３２，３３の移動に際して、補助レンズ３０（及び後述するターレット３０ａ）も一体的に移動するように構成されている。

本実施形態の位相差顕微鏡６は、このようにして補正光学系２６の光路長を調整することで、レンズ効果の大小に応じて様々に変化した照明装置１５の焦点距離を適切に補正することができる。具体的には、例えば図２（ａ）及び図４（ｃ）に示す状態よりもレンズ効果の大きな標本２を観察する場合には、図３（ｂ）及び図５に示すように反射ミラー３２，３３を反射ミラー３１，３４から遠ざけて光路長を延長することで、大きなレンズ効果を解消することが可能となる。以上より本実施形態の位相差顕微鏡６は、レンズ効果をその大小にかかわらず適切に解消することができる。

またここで、標本２の培養液３の液面の湾曲具合が同じであっても、顕微鏡本体１７の対物レンズ２０が切り替えられて倍率が変われば、レンズ効果の大きさは変化する。したがって、このことによっても照明装置１５の焦点距離の変化量は様々である。
そこで、本実施形態の位相差顕微鏡６における補助光学系２６は、図２（ａ）に示すように反射ミラー３１と反射ミラー３２との間に、補助レンズ３０を備えている。この補助レンズ３０は、対物レンズ２０の切り替えによってレンズ効果が変化しこれに伴って変化した照明装置１５の焦点距離を適切に補正するためのレンズであって、対物レンズ２０の倍率毎に複数個切り替え可能に備えられている。

なお、本実施形態において複数個の補助レンズ３０は、ターレット３０ａに保持されており、このターレット３０ａを回転させることで所望の補助レンズ３０を選択的に切り替えて光路内へ配置することができる。
以上より本実施形態の位相差顕微鏡６は、顕微鏡本体１７の対物レンズ２０の切り替えに伴い、補助レンズ３０も対物レンズ２０の倍率に対応するものへ切り替えることで、対物レンズ２０の倍率にかかわらずレンズ効果を適切に解消することができる。

またここで、観察しようとする標本２が注入されているウェルの中心が照明装置１５の光軸に対して偏芯している場合には、培養液３の湾曲した液面の中心、即ちレンズ効果の中心も偏芯してしまい、これによって標本２の位相差像の乱れに偏りが生じて、像質が悪化することとなってしまう。
そこで、本実施形態の位相差顕微鏡６では、補正光学系２６における反射ミラー３１が、該反射ミラー３１への入射光軸に垂直な平面内の水平軸及び垂直軸を中心に縦チルト及び横チルト可能に構成されている。そしてさらに、補正光学系２６は図６に示すように反射ミラー３１のＬＥＤ２３側に、反射ミラー３１と同様に縦チルト及び横チルト可能な平板形状のハービングガラス３５を備えている。これにより、反射ミラー３１とハービングガラス３５の少なくとも一方を縦チルト、横チルトさせることで、照明装置１５の光軸の位置を微調整してレンズ効果の中心に合わせることができる。

以上より本実施形態の位相差顕微鏡６は、レンズ効果の中心が偏芯している場合でも、これを良好に解消することができる。なお、本実施形態では、前述のように縦チルト及び横チルト可能な反射ミラー３１とハービングガラス３５とを備えているが、いずれか一方のみを備える構成としてもよい。

以上に述べた本実施形態によれば、照明装置１５と標本２との間のスペースを十分に確保しながら、標本２の培養液３に生じるレンズ効果を解消することができ、標本２の観察や解析に適した良好な位相差像を得られる照明装置１５、位相差顕微鏡６、培養装置１を実現することができる。

本願の実施形態に係る培養装置の構成を示す図である。 （ａ）、及び（ｂ）はそれぞれ、本願の実施形態における照明装置の構成を示す上面図、及び側面図である。 （ａ）、及び（ｂ）はそれぞれ、本願の実施形態における照明装置の補正光学系を光路外へ退避させた様子、及び補正光学系を光路内へ配置し反射ミラー（３２，３３）によってその光路長を調整する様子を示す図である。 本願の実施形態における位相差顕微鏡の主要部を模式的に示した図であり、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）はそれぞれ、補正光学系を光路外へ退避させた様子（図３（ａ）に対応）、補正光学系を光路外へ退避させた状態においてレンズ効果が生じた様子、補正光学系を光路内へ配置した様子（図２（ａ）に対応）を示す図である。 本願の実施形態における位相差顕微鏡の主要部を模式的に示した図であり、反射ミラー（３２，３３）によってその光路長を調整する様子（図３（ｂ）に対応）を示す図である。 本願の実施形態における位相差顕微鏡の主要部を模式的に示した図であり、反射ミラー及びハービングガラスを縦横チルトさせる様子を示す図である。

符号の説明

１ 培養装置
２ 標本
３ 培養液
４ 培養容器（ウェルプレート）
５ 恒温装置
６ 位相差顕微鏡
２０ 対物レンズ
２０ａ 位相膜
２５ リング絞り
２６ 補正光学系
２８ コンデンサレンズ
３０ 補助レンズ
３５ ハービングガラス

Claims (6)

1. 光源と、コンデンサレンズと、リング絞りとを有する照明光学系と、
   対物レンズと、該対物レンズの瞳面に配置されたリング形状の位相膜とを有する観察光学系と、
   標本の培養液に生じるレンズ効果を解消するために、前記照明光学系の前記光源と前記コンデンサレンズとの間に、複数枚のミラーからなり光路長を延長する補正光学系と、
   を有することを特徴とする顕微鏡。
2. 前記補正光学系は、前記ミラーどうしの間隔を調整するために、前記ミラーを駆動する駆動手段を備えていることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
3. 前記補正光学系は、観察倍率に合わせて光路長を変更するために、観察倍率に対応した複数個の補助レンズと、前記複数個の補助レンズを切り替え可能に保持する保持手段とを備えていることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の顕微鏡。
4. 前記補正光学系における前記ミラーの少なくとも１つがチルト調整可能であることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の顕微鏡。
5. 前記補正光学系は、チルト調整可能なハービングガラスを備えていることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
6. 標本を培養する培養容器を収容する恒温装置と、
   請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の顕微鏡とを有することを特徴とする培養装置。

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