KR102293757B1

KR102293757B1 - 세포 화상 평가 장치 및 방법과, 프로그램

Info

Publication number: KR102293757B1
Application number: KR1020197023860A
Authority: KR
Inventors: 다카시 와쿠이
Original assignee: 후지필름 가부시키가이샤
Priority date: 2017-03-30
Filing date: 2018-03-20
Publication date: 2021-08-24
Also published as: JPWO2018180813A1; EP3604495B1; WO2018180813A1; US20190370973A1; US11030751B2; EP3604495A4; JP6873231B2; EP3604495A1; KR20190107096A

Abstract

용기 내의 각 관찰 영역의 촬영 화상이, 메니스커스의 영향을 받아 콘트라스트가 낮은 화상이었다고 해도, 보다 정확하고, 또한 신뢰성이 높은 평가를 행할 수 있는 세포 화상 평가 장치 및 방법과, 프로그램을 제공한다. 세포가 수용된 용기 내를 촬영한 촬영 화상이, 용기 내의 메니스커스 영역을 촬영한 화상인지 비메니스커스 영역을 촬영한 화상인지를 판별하는 영역 판별부(21)와, 촬영 화상에 포함되는 세포의 상태를 평가하는 화상 평가부(22)를 구비하고, 화상 평가부(22)가, 메니스커스 영역의 화상과 비메니스커스 영역의 화상에서 다른 평가 방법으로 평가한다.

Description

세포 화상 평가 장치 및 방법과, 프로그램

본 발명은, 세포를 촬영한 촬영 화상을 이용하여, 촬영 화상에 포함되는 세포의 상태를 평가하는 세포 화상 평가 장치 및 방법과, 프로그램에 관한 것이다.

ES(Embryonic Stem) 세포 및 iPS(Induced Pluripotent Stem) 세포 등의 다능성 줄기 세포는, 다양한 조직의 세포로 분화하는 능력을 구비하고, 재생 의료, 약의 개발, 및 병의 해명 등에 있어서 응용이 가능한 것으로서 주목받고 있다.

그리고, ES 세포 및 iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포나 분화 유도된 세포 등을 현미경 등으로 촬상하고, 그 화상의 특징을 파악함으로써 세포의 분화 상태 등을 평가하는 방법이 제안되고 있다.

한편, 상술한 바와 같이 세포를 현미경으로 촬상할 때, 고배율의 광시야 화상을 취득하기 위하여, 이른바 타일링 촬영을 행하는 것이 제안되고 있다. 구체적으로는, 예를 들면 웰 플레이트 등이 설치된 스테이지를, 결상광학계에 대하여 이동시킴으로써 웰 내의 각 관찰 영역을 주사하고, 관찰 영역마다의 화상을 촬영한 후, 그 관찰 영역마다의 화상을 연결하는 방법이 제안되고 있다.

특허문헌 1: 일본 공개특허공보 2016-127342호 특허문헌 2: 일본 공개특허공보 2013-057595호

여기에서, 상술한 웰 플레이트 등을 이용하여 세포를 배양할 때, 웰 내에는 세포와 함께, 배양액 등의 액체가 수용되지만, 그 액체의 표면에는 메니스커스가 형성되는 것이 알려져 있다.

그리고, 특히, 위상차 현미경 장치를 이용하여 세포의 화상을 촬영하는 경우에는, 촬영 화상에 대한 메니스커스의 영향이 커, 메니스커스가 형성되어 있지 않은 비메니스커스 영역의 촬영 화상과 비교하면 콘트라스트가 낮은 화상이 되어 버린다.

따라서, 메니스커스 영역을 촬영한 촬영 화상에 대해서는, 개개의 세포의 화상을 고정밀도로 추출할 수 없기 때문에, 예를 들면 개개의 세포의 상태를 나타내는 특징량을 이용하여 평가를 행하도록 한 것으로는, 평가 결과의 정밀도가 낮아져, 신뢰성도 낮은 평가 결과가 되는 경우가 있다. 즉, 비메니스커스 영역의 화상과 메니스커스 영역의 화상을 동일하게 평가한 것으로는 정확한 평가 결과를 얻을 수 없는 경우가 있다.

또한, 특허문헌 1에서는, 메니스커스를 고려하여 오토포커스 제어를 행하는 것이 제안되어 있으며, 특허문헌 2에서는, 웰의 측면의 그림자의 영향을 고려하여 농도 보정을 실시하는 것이 제안되어 있지만, 메니스커스 영역의 콘트라스트가 낮은 화상의 평가 방법에 대해서는, 제안되어 있지 않다.

본 발명은, 상기의 문제를 감안하여, 용기 내의 각 관찰 영역의 촬영 화상이, 메니스커스의 영향을 받아 콘트라스트가 낮은 화상이었다고 해도, 보다 정확하고, 또한 신뢰성이 높은 평가를 행할 수 있는 세포 화상 평가 장치 및 방법과, 프로그램을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양태에 의한 세포 화상 평가 장치는, 세포가 수용된 용기 내를 촬영한 촬영 화상이, 용기 내의 메니스커스 영역을 촬영한 화상인지 비메니스커스 영역을 촬영한 화상인지를 판별하는 영역 판별부와, 촬영 화상에 포함되는 세포의 상태를 평가하는 화상 평가부를 구비하고, 화상 평가부가, 메니스커스 영역의 화상과 비메니스커스 영역의 화상에서 다른 평가 방법으로 평가한다.

또, 상기 본 발명의 일 양태에 의한 세포 화상 평가 장치에 있어서, 영역 판별부는, 촬영 화상의 특징량에 근거하여, 메니스커스 영역의 화상인지 비메니스커스 영역의 화상인지를 판별해도 된다.

또, 상기 본 발명의 일 양태에 의한 세포 화상 평가 장치에 있어서, 영역 판별부는, 미리 설정된 용기 내에 있어서의 위치 정보에 근거하여, 메니스커스 영역의 화상인지 비메니스커스 영역의 화상인지를 판별해도 된다.

또, 상기 본 발명의 일 양태에 의한 세포 화상 평가 장치에 있어서, 영역 판별부는, 촬영 화상의 특징량 및 미리 설정된 용기 내에 있어서의 위치 정보에 근거하여, 메니스커스 영역의 화상인지 비메니스커스 영역의 화상인지를 판별해도 된다.

또, 상기 본 발명의 일 양태에 의한 세포 화상 평가 장치에 있어서, 화상 평가부는, 비메니스커스 영역의 화상에 대해서는, 촬영 화상에 포함되는 세포의 상태를 나타내는 특징량을 이용하여 평가하고, 메니스커스 영역의 화상에 대해서는, 화상 특징량을 이용하여 평가해도 된다.

또, 상기 본 발명의 일 양태에 의한 세포 화상 평가 장치에 있어서, 세포의 상태를 나타내는 특징량은, 개개의 세포의 상태의 특징량, 세포 내에 포함되는 핵소체의 특징량, 흰색 줄의 특징량, 세포 내에 포함되는 핵의 특징량 및 세포의 NC비(Nucleocytoplasmic ratio) 중 적어도 하나를 포함해도 된다.

또, 상기 본 발명의 일 양태에 의한 세포 화상 평가 장치에 있어서, 화상 평가부는, 용기 내의 메니스커스 영역의 화상의 평가 결과와 비메니스커스 영역의 화상의 평가 결과를 통합하여 용기에 대한 평가 결과를 산출해도 된다.

또, 상기 본 발명의 일 양태에 의한 세포 화상 평가 장치에 있어서, 화상 평가부는, 용기에 대한 평가 결과를 산출할 때, 메니스커스 영역의 화상의 평가 결과와 비메니스커스 영역의 화상의 평가 결과에 가중값을 부가해도 된다.

또, 상기 본 발명의 일 양태에 의한 세포 화상 평가 장치에 있어서, 비메니스커스 영역의 화상의 평가 결과에 부가되는 가중값은, 메니스커스 영역의 화상의 평가 결과에 부가되는 가중값보다 크게 하는 것이 바람직하다.

또, 상기 본 발명의 일 양태에 의한 세포 화상 평가 장치에 있어서, 촬영 화상은, 용기가 설치되는 스테이지 및 용기 내의 세포의 상을 결상하는 결상광학계 중 적어도 한쪽을 이동시킴으로써, 용기 내의 각 관찰 영역을 촬영한 화상으로 하고, 영역 판별부는, 관찰 영역마다의 촬영 화상에 대하여, 메니스커스 영역의 화상인지 비메니스커스 영역의 화상인지를 판별해도 된다.

또, 상기 본 발명의 일 양태에 의한 세포 화상 평가 장치에 있어서, 영역 판별부는, 촬영 화상이, 용기 내의 액체의 물결 영역을 촬영한 화상인지 여부를 판별할 수 있으며, 화상 평가부는, 물결 영역을 촬영한 화상을, 메니스커스 영역의 화상을 평가하는 평가 방법과 동일한 평가 방법으로 평가해도 된다.

본 발명의 일 양태에 의한 세포 화상 평가 방법은, 세포가 수용된 용기 내를 촬영한 촬영 화상이, 용기 내의 메니스커스 영역을 촬영한 화상인지 비메니스커스 영역을 촬영한 화상인지를 판별하고, 촬영 화상에 포함되는 세포의 상태를 평가할 때, 메니스커스 영역의 화상과 비메니스커스 영역의 화상에서 다른 평가 방법으로 평가한다.

본 발명의 일 양태에 의한 세포 화상 평가 프로그램은, 컴퓨터를, 세포가 수용된 용기 내를 촬영한 촬영 화상이, 용기 내의 메니스커스 영역을 촬영한 화상인지 비메니스커스 영역을 촬영한 화상인지를 판별하는 영역 판별부와, 촬영 화상에 포함되는 세포의 상태를 평가하는 화상 평가부로서 기능시키는 세포 화상 평가 프로그램으로서, 화상 평가부가, 메니스커스 영역의 화상과 비메니스커스 영역의 화상에서 다른 평가 방법으로 평가한다.

본 발명의 세포 화상 평가 장치 및 방법과, 프로그램에 의하면, 세포가 수용된 용기 내를 촬영한 촬영 화상이, 용기 내의 메니스커스 영역을 촬영한 화상인지 비메니스커스 영역을 촬영한 화상인지를 판별하고, 촬영 화상에 포함되는 세포의 상태를 평가할 때, 메니스커스 영역의 화상과 비메니스커스 영역의 화상에서 다른 평가 방법으로 평가한다. 이로써, 메니스커스 영역의 화상이, 메니스커스의 영향을 받아 콘트라스트가 낮은 화상이었다고 해도, 그 화상에 적합한 평가 방법으로 평가함으로써, 보다 정확하고, 또한 신뢰성이 높은 평가를 행할 수 있다.

도 1은 본 발명의 세포 화상 평가 장치의 일 실시형태를 이용한 세포 화상 평가 시스템의 개략 구성을 나타내는 블록도이다.
도 2는 웰 플레이트에 있어서의 각 관찰 영역의 주사 궤적을 나타내는 도이다.
도 3은 웰의 측단면도 및 상면도를 나타내는 도이다.
도 4는 웰 내의 각 관찰 영역의 촬영 화상의 일례를 나타내는 도이다.
도 5는 웰 단위로 통합된 평가 결과의 표시예를 나타내는 도이다.
도 6은 본 발명의 세포 화상 평가 장치의 일 실시형태를 이용한 세포 화상 평가 시스템의 작용을 설명하기 위한 플로 차트이다.

이하, 본 발명의 세포 화상 평가 장치 및 방법과, 프로그램의 일 실시형태를 이용한 세포 화상 평가 시스템에 대하여, 도면을 참조하면서 상세하게 설명한다. 도 1은, 본 실시형태의 세포 화상 평가 시스템의 개략 구성을 나타내는 블록도이다.

본 실시형태의 세포 화상 평가 시스템은, 도 1에 나타내는 바와 같이, 현미경 장치(10)와, 세포 화상 평가 장치(20)와, 표시 장치(30)와, 입력 장치(40)를 구비하고 있다.

현미경 장치(10)는, 배양 용기 내에 수용된 세포를 촬영하고, 촬영 화상을 출력한다. 본 실시형태에 있어서는, 구체적으로는, CCD(Charge-Coupled Device) 이미지 센서나 CMOS(Complementary Metal-Oxide Semiconductor) 이미지 센서 등의 촬상 소자를 구비한 위상차 현미경 장치를 이용한다. 촬상 소자로서는, RGB(Red Green Blue)의 컬러 필터가 마련된 촬상 소자를 이용해도 되고, 모노크롬의 촬상 소자를 이용하도록 해도 된다. 배양 용기 내에 수용된 세포의 위상차상이 촬상 소자에 결상되고, 촬상 소자로부터 촬영 화상으로서 위상차 화상이 출력된다. 또한, 현미경 장치(10)로서는, 위상차 현미경 장치에 한정하지 않고, 미분 간섭 현미경 장치 및 명시야 현미경 장치 등의 그 외의 현미경 장치를 이용하도록 해도 된다.

촬영 대상으로서는, 복수의 세포가 응집한 세포 콜로니여도 되고, 분산하여 분포한 복수의 세포여도 된다. 또, 촬영 대상의 세포로서는, 예를 들면 iPS 세포 및 ES 세포와 같은 다능성 줄기 세포, 줄기 세포로부터 분화 유도된 신경, 피부, 심근 및 간장의 세포와, 인체로부터 취출된 장기의 세포 및 암세포 등이 있다.

또, 본 실시형태에 있어서는, 배양 용기로서, 복수의 웰을 갖는 웰 플레이트를 이용한다. 또한, 웰 플레이트를 이용하는 경우, 각 웰이, 본 발명의 용기에 상당한다. 그리고, 현미경 장치(10)는, 웰 플레이트가 설치되는 스테이지를 구비하고 있다. 스테이지는, 수평면 내에 있어서 직교하는 X 방향 및 Y 방향으로 이동한다. 이 스테이지의 이동에 의하여, 웰 플레이트의 각 웰 내에 있어서의 각 관찰 영역이 주사되어, 관찰 영역마다의 촬영 화상이 촬영된다. 관찰 영역마다의 촬영 화상은 세포 화상 평가 장치(20)에 출력된다.

도 2는, 6개의 웰(51)을 갖는 웰 플레이트(50)를 이용한 경우에 있어서의 각 관찰 영역의 주사 궤적을 실선(Sc)으로 나타낸 도이다. 도 2에 나타내는 바와 같이, 웰 플레이트(50) 내의 각 관찰 영역은, 스테이지의 X 방향 및 Y 방향의 이동에 의하여 주사 개시점(S)으로부터 주사 종료점(E)까지의 실선(Sc)을 따라 주사된다.

또한, 본 실시형태에 있어서는, 스테이지를 이동시킴으로써 웰 내의 관찰 영역마다의 촬영 화상을 촬영하도록 했지만, 이것에 한정하지 않고, 세포의 위상차상을 촬상 소자에 결상하는 결상광학계를 스테이지에 대하여 이동시킴으로써 관찰 영역마다의 촬영 화상을 촬영하도록 해도 된다. 또는, 스테이지와 결상광학계 양쪽 모두를 이동시키도록 해도 된다.

또, 본 실시형태에 있어서는, 웰 플레이트를 이용하도록 했지만, 세포가 수용되는 용기로서는 이것에 한정하지 않고, 예를 들면 샬레 또는 디시 등 그 외의 용기를 이용하도록 해도 된다.

세포 화상 평가 장치(20)는, 도 1에 나타내는 바와 같이, 영역 판별부(21)와, 화상 평가부(22)와, 표시 제어부(23)를 구비하고 있다. 세포 화상 평가 장치(20)는, 중앙 처리 장치, 반도체 메모리 및 하드 디스크 등을 구비한 컴퓨터로 구성되며, 하드 디스크에 본 발명의 세포 화상 평가 프로그램의 일 실시형태가 인스톨되어 있다. 그리고, 이 세포 화상 평가 프로그램이 중앙 처리 장치에 의하여 실행됨으로써, 도 1에 나타내는 영역 판별부(21), 화상 평가부(22) 및 표시 제어부(23)가 기능한다. 또한, 본 실시형태에 있어서는, 세포 화상 평가 프로그램에 의하여, 각부의 기능을 실행하도록 했지만, 이것에 한정하지 않고, 예를 들면 복수의 IC(Integrated Circuit), 프로세서, ASIC(Application Specific Integrated Circuit), FPGA(Field-Programmable Gate Array), 및 메모리 등을 적절히 조합함으로써 각부의 기능을 실행하도록 해도 된다. 또한, 세포 화상 평가 프로그램은, 비일시적인 컴퓨터 독취 가능한 기록 매체에 저장되어, 세포 화상 평가 장치(20)를 구성하는 컴퓨터에 독취되어도 된다. 또, 세포 화상 평가 프로그램은, 네트워크를 통하여 배신(配信)되어도 된다.

영역 판별부(21)는, 현미경 장치(10)에 의하여 촬영된 관찰 영역마다의 촬영 화상이, 웰 내의 메니스커스 영역을 촬영한 화상인지 비메니스커스 영역을 촬영한 화상인지를 판별하는 것이다. 도 3은, 웰(51)의 측단면도 및 상면도를 나타낸 도이다. 또, 도 4는, 웰 내의 각 관찰 영역의 촬영 화상의 일례를 나타내는 도이다. 도 4에 있어서 직사각형 영역으로 분할된 각 영역(A)이, 각 관찰 영역에 상당한다.

웰(51) 내에는, 세포와 함께, 배양액 등의 액체가 수용되지만, 그 액체의 표면에는, 도 3에 나타내는 바와 같이 메니스커스(M)가 형성된다. 그리고, 도 3 및 도 4에 나타내는 바와 같이, 비메니스커스 영역(R1)을 촬영한 화상은 콘트라스트가 높은 화상이 되지만, 메니스커스 영역(R2)을 촬영한 화상은 콘트라스트가 낮은 화상이 된다. 따라서, 메니스커스 영역(R2)의 화상에 대해서는, 개개의 세포의 화상을 고정밀도로 추출할 수 없기 때문에, 예를 들면 개개의 세포의 상태를 나타내는 특징량을 이용하여 평가를 행하도록 한 것으로는, 평가 결과의 정밀도가 낮아져, 신뢰성도 낮은 평가 결과가 되는 경우가 있다. 즉, 비메니스커스 영역의 화상과 메니스커스 영역의 화상을 동일한 평가 방법으로 평가한 것으로는 정확한 평가 결과를 얻을 수 없는 경우가 있다. 또한, 메니스커스 영역의 영향은, 용기가 작을수록 커진다. 예를 들면, 6웰의 웰 플레이트의 경우, 각 웰의 중심으로부터 반경 60% 이상의 범위가 메니스커스 영역이 되고, 24웰의 웰 플레이트의 경우, 웰의 중심으로부터 반경 25% 이상의 범위가 메니스커스 영역이 된다.

따라서, 본 실시형태의 세포 화상 평가 시스템에 있어서는, 영역 판별부(21)에 있어서, 관찰 영역마다의 촬영 화상이, 메니스커스 영역의 화상인지 비메니스커스 영역의 화상인지를 판별하고, 그 판별 결과에 의하여, 평가 방법을 변경하도록 한다.

영역 판별부(21)는, 구체적으로는, 관찰 영역마다의 촬영 화상의 특징량을 산출하고, 그 특징량에 근거하여, 촬영 화상이, 메니스커스 영역의 화상인지 비메니스커스 영역의 화상인지를 판별한다. 촬영 화상의 특징량으로서는, 예를 들면 촬영 화상의 콘트라스트 및 휘도 등을 이용할 수 있다. 촬영 화상의 콘트라스트를 이용하여 판별하는 경우에는, 콘트라스트가 임곗값 이상인 촬영 화상을 비메니스커스 영역의 화상으로 판별하고, 임곗값 미만인 촬영 화상을 메니스커스 영역의 화상으로 판별하도록 하면 된다. 또, 촬영 화상의 휘도를 이용하여 판별하는 경우에는, 휘도가 임곗값 미만인 촬영 화상을 비메니스커스 영역의 화상으로 판별하고, 임곗값 이상인 촬영 화상을 메니스커스 영역의 화상으로 판별하도록 하면 된다. 또한, 여기에서 말하는 휘도란, 촬영 화상의 휘도의 평균값이어도 되고, 최댓값 또는 중앙값 등을 이용해도 된다.

화상 평가부(22)는, 관찰 영역마다의 촬영 화상을 취득하고, 그 촬영 화상에 포함되는 세포의 상태를 평가한다. 세포의 상태를 평가한다란, 예를 들면 촬영 화상에 포함되는 세포가 미분화 세포인지 분화 세포인지를 평가하거나, 공배양 시의 세포의 종류마다의 세포수를 카운트하거나, 촬영 화상에 포함되는 미분화 세포와 분화 세포의 비율을 평가하거나, 세포 또는 세포 콜로니의 성장도를 평가하거나, 또는 항암제에 의한 암세포의 축소율을 평가하거나 하는 것을 말한다. 단, 세포의 상태의 평가로서는, 이들에 한정하지 않고, 그 외의 평가여도 된다.

그리고, 화상 평가부(22)는, 메니스커스 영역의 화상과 비메니스커스 영역의 화상에서 다른 평가 방법으로 세포의 상태를 평가한다. 구체적으로는, 화상 평가부(22)는, 비메니스커스 영역의 화상에 대해서는, 그 촬영 화상에 포함되는 세포의 상태를 나타내는 특징량을 이용하여 평가하고, 메니스커스 영역의 화상에 대해서는, 화상 특징량을 이용하여 평가한다. 세포의 상태를 나타내는 특징량 및 화상 특징량에 대해서는, 후술한다.

또, 본 실시형태의 화상 평가부(22)는, 웰 내의 메니스커스 영역의 화상의 평가 결과와 비메니스커스 영역의 화상의 평가 결과를 통합하여, 그 웰에 대한 평가 결과를 산출한다. 즉 웰 단위에서의 평가 결과를 산출한다. 이와 같이 웰 단위(용기 단위)에서의 평가 결과를 산출함으로써, 계대 또는 세포의 출하 시 등에 있어서 웰 단위로 관리할 수 있다.

구체적으로는, 예를 들면 웰 내의 각 관찰 영역의 촬영 화상에 포함되는 분화 세포의 비율과 미분화 세포의 비율의 평균값을 각각 산출함으로써, 웰 단위에서의 분화 세포의 비율과 미분화 세포의 비율을 구하도록 해도 된다.

또는, 웰 내의 각 관찰 영역의 촬영 화상에 대하여 세포 또는 세포 콜로니의 성장도를 평가하는 경우에는, 그 각 관찰 영역의 성장도의 평균값을 웰 단위의 성장도로서 구하도록 해도 된다. 또, 웰 내의 전체 관찰 영역 중, 성장도가 임곗값 이상인 관찰 영역의 수의 비율을 산출하고, 그 비율을 웰 단위의 성장도로서 구하도록 해도 된다. 혹은, 상기 비율이 임곗값 이상인 경우에는, 웰 단위에서의 평가 결과를 "양호하다"고 하고, 임곗값 미만인 경우에는, 웰 단위에서의 평가 결과를 "양호하지 않다"고 해도 된다. 또는, 성장도가 임곗값 이상인 관찰 영역의 평가 결과를 "양호하다"고 하고, 임곗값 미만인 관찰 영역의 평가 결과를 "양호하지 않다"고 하며, 웰 내에 포함되는 평가 결과가 "양호하다"인 관찰 영역의 수가, 임곗값 이상인 경우에 웰 단위에서의 평가 결과를 "양호하다"고 하고, 임곗값 미만인 경우에 웰 단위에서의 평가 결과를 "양호하지 않다"고 해도 된다.

표시 제어부(23)는, 화상 평가부(22)에 의한 평가 결과를 표시 장치(30)에 표시시킨다. 구체적으로는, 본 실시형태에 있어서는, 상술한 바와 같이 화상 평가부(22)에 있어서 웰 단위에서의 평가 결과가 산출되므로, 표시 제어부(23)는, 그 웰 단위에서의 평가 결과를 표시 장치(30)에 표시시킨다. 도 5는, 6웰의 웰 플레이트를 이용한 경우에, 웰 단위에서의 분화 세포의 비율과 미분화 세포의 비율을 산출하고, 통합된 평가 결과로서 표시한 예이다. 도 5의 예에 있어서, 상단 좌측의 웰에는, 분화 세포가 80% 존재하고, 미분화 세포가 20% 존재한다. 상단 중앙의 웰에는, 분화 세포가 70% 존재하고, 미분화 세포가 30% 존재한다. 상단 우측의 웰에는, 분화 세포가 60% 존재하고, 미분화 세포가 40% 존재한다. 하단 좌측의 웰에는, 분화 세포가 60% 존재하고, 미분화 세포가 40% 존재한다. 하단 중앙의 웰에는, 분화 세포가 30% 존재하고, 미분화 세포가 70% 존재한다. 하단 우측의 웰에는, 분화 세포가 40% 존재하고, 미분화 세포가 60% 존재한다.

또, 표시 제어부(23)는, 관찰 영역마다의 촬영 화상을 연결함으로써 합성 화상을 생성하고, 그 합성 화상을 표시 장치(30)에 표시시킨다.

표시 장치(30)는, 상술한 바와 같이 화상 평가부(22)에 의한 평가 결과 및 표시 제어부(23)에 의하여 생성된 합성 화상을 표시하고, 예를 들면 액정 디스플레이 등을 구비한다. 또, 표시 장치(30)를 터치 패널에 의하여 구성하고, 입력 장치(40)와 겸용하도록 해도 된다.

입력 장치(40)는, 마우스나 키보드 등을 구비하고, 유저에 의한 다양한 설정 입력을 접수한다.

다음으로, 세포의 상태를 나타내는 특징량 및 화상 특징량에 대하여 설명한다. 세포의 상태를 나타내는 특징량으로서는, 개개의 세포의 상태의 특징량, 세포 내에 포함되는 핵소체의 특징량, 흰색 줄의 특징량, 세포 내에 포함되는 핵의 특징량 및 세포의 NC비 중 적어도 하나를 이용할 수 있다.

개개의 세포의 상태의 특징량으로서는, 예를 들면 세포의 수, 세포의 밀도, 세포의 증가율 및 세포의 원형도(圓形度) 등이 있지만, 촬영 화상에 포함되는 개개의 세포를 인식하고, 그 인식한 세포에 근거하여 산출되는 특징량이면 그 외의 특징량이어도 된다. 촬영 화상에 포함되는 세포의 인식 방법으로서는, 예를 들면 세포의 화상의 에지를 검출하거나, 패턴 매칭 처리를 이용하여 검출하거나, 기계 학습에 의하여 생성된 판별기를 이용하여 검출하거나 하는 방법이 있지만, 그 외의 공지의 수법을 이용할 수 있다. 또한, 세포의 원형도에 대해서는, 미분화 세포는 원형도가 상대적으로 높아지지만, 분화 세포는, 예를 들면 길고 가느다란 형상이 되어, 원형도가 상대적으로 낮아진다. 따라서, 개개의 세포의 원형도를 산출함으로써 분화 세포인지, 또는 미분화 세포인지를 평가할 수 있다. 또, 다능성 줄기 세포에 있어서, 세포가 분화하면 핵 내의 크로마틴 구조가 변화되어 거뭇해지기 때문에, 핵을 검출한 후에 핵의 휘도를 평가함으로써 분화 또는 미분화를 평가할 수 있다. 단, 분화 세포나 미분화 세포인지를 평가하는 방법으로서는, 이것에 한정하지 않고, 그 외의 공지의 수법을 이용할 수 있다.

또, 세포 내에 포함되는 핵 또는 핵소체의 특징량으로서는, 예를 들면 핵 또는 핵소체의 수, 핵 또는 핵소체의 밀도 및 핵 또는 핵소체의 증가율 등이 있지만, 촬영 화상에 포함되는 핵 또는 핵소체를 인식하고, 그 인식한 핵 또는 핵소체에 근거하여 산출되는 특징량이면 그 외의 특징량이어도 된다. 촬영 화상에 포함되는 핵 또는 핵소체의 인식 방법으로서는, 세포의 인식 방법과 동일하게, 에지 검출, 패턴 매칭에 의한 검출 및 판별기를 이용한 검출 등을 이용할 수 있다.

또, 흰색 줄이란, 세포와 배경 간에 발생하는 회절광에 의한 광의 번짐(헤일로)이다. 그리고, 흰색 줄의 특징량으로서는, 예를 들면 흰색 줄의 총 면적, 흰색 줄의 밀도 및 흰색 줄의 분포 상태 등이 있지만, 촬영 화상에 포함되는 흰색 줄을 인식하고, 그 인식한 흰색 줄기에 근거하여 산출되는 특징량이면 그 외의 특징량이어도 된다. 흰색 줄의 인식 방법으로서는, 예를 들면 촬영 화상을 2치화하고, 임곗값 처리에 의하여 흰색 줄을 추출하도록 해도 된다. 또는, 흰색 줄의 인식 방법으로서, 패턴 매칭 처리를 이용하여 검출하거나, 기계 학습에 의하여 생성된 판별기를 이용하여 검출하거나 해도 되고, 그 외의 공지의 수법을 이용해도 된다. 또한, 흰색 줄의 특징량에 대해서는, 예를 들면 세포 콜로니 내에 미분화 세포가 많은 상태에서는 흰색 줄은 적지만, 분화가 진행되어 분화 세포가 많아지면 흰색 줄의 양이 많아진다. 따라서, 흰색 줄의 특징량에 근거하여, 세포 콜로니의 분화도 또는 미분화도, 혹은 세포 콜로니의 성장도 등을 평가할 수 있다.

또, 세포의 NC비란, 핵/세포질 면적비이다. NC비에 대해서는, 세포질과 핵의 각각의 검출기를 사용함으로써 구할 수 있다. 세포질은, 일반적으로 그레이이고 또한 플랫인 외형을 가지며, 이에 반하여, 핵은 비교적 둥글고 또한 내부에 핵소체 등의 구조를 포함한다. 따라서, 각각의 검출기를 기계 학습에 의하여 작성하고, 촬영 화상에 적용함으로써 세포질 영역과 핵 영역이 얻어진다. 이와 같이 하여 얻어진 세포질 영역과 핵 영역의 면적의 비를 산출함으로써, NC비를 산출할 수 있다. NC비는, 세포 콜로니 단위로 산출해도 되고, 미리 지정된 영역 내에서의 NC비를 산출하도록 해도 된다.

한편, 메니스커스 영역의 화상을 평가할 때에 이용되는 화상 특징량이란, 촬영 화상 자체의 특징량으로서, 구체적으로는, 촬영 화상의 평균 휘도, 촬영 화상의 휘도의 분산, 촬영 화상의 휘도의 최댓값과 최솟값의 차, 촬영 화상의 콘트라스트, 촬영 화상의 엔트로피, 촬영 화상의 공간 주파수 분포, 촬영 화상의 방향성 및 촬영 화상의 제르니케 특징 등을 이용할 수 있다. 메니스커스 영역의 화상을 평가할 때에, 화상 특징량을 이용하는 것은, 메니스커스 영역의 화상은, 상술한 바와 같이 콘트라스트가 낮기 때문에, 개개의 세포의 화상 또는 핵소체의 화상 등의 검출 정밀도가 낮아진다. 따라서, 비메니스커스 영역의 화상과 같이 개개의 세포의 상태를 나타내는 특징량을 이용하여 평가하는 것보다도, 촬영 화상 자체의 화상 특징량을 이용하여 평가한 편이, 평가 정밀도가 향상되기 때문이다.

이와 같은 화상 특징량을 이용하여 촬영 화상에 포함되는 세포의 상태를 평가하는 방법으로서는, 예를 들면 화상 특징량과 그 화상 특징량에 대응하는 평가 결과의 관계를 미리 실험 등에 의하여 구해 두고, 촬영 화상의 화상 특징량과 상기 관계에 근거하여, 평가 결과를 얻도록 하면 된다. 또, 화상 특징량과 그 화상 특징량에 대응하는 평가 결과의 관계를, 예를 들면 기계 학습을 이용하여 학습시켜 평가기를 생성하고, 촬영 화상의 화상 특징량을 그 평가기에 입력함으로써 평가 결과를 얻도록 해도 된다.

다음으로, 본 실시형태의 세포 화상 평가 시스템의 작용에 대하여, 도 6에 나타내는 플로 차트를 참조하면서 설명한다.

먼저, 세포 및 배양액이 수용된 웰 플레이트가 현미경 장치(10)의 스테이지 상에 설치된다(S10). 그리고, 스테이지가 X 방향 및 Y 방향으로 이동함으로써, 웰 플레이트의 각 웰 내의 관찰 영역이 주사되어, 각 관찰 영역의 촬영 화상이 촬영된다(S12).

그리고, 현미경 장치(10)에 있어서 촬영된 관찰 영역마다의 촬영 화상은, 세포 화상 평가 장치(20)에 순차 출력되고, 영역 판별부(21) 및 표시 제어부(23)에 순차 입력된다(S12). 영역 판별부(21)는, 입력된 관찰 영역의 촬영 화상이 메니스커스 영역의 화상인지 비메니스커스 영역의 화상인지를 판별한다(S14).

그리고, 영역 판별부(21)에 의하여, 촬영 화상이 메니스커스 영역의 화상이라고 판별된 경우에는, 화상 평가부(22)는, 그 촬영 화상에 대하여, 메니스커스 영역의 화상의 평가 방법을 이용하여 평가한다(S16). 구체적으로는, 그 촬영 화상에 대하여 화상 특징량을 산출하고, 그 화상 특징량을 이용하여 촬영 화상에 포함되는 세포의 상태를 평가한다.

한편, 영역 판별부(21)에 의하여, 촬영 화상이 비메니스커스 영역의 화상이라고 판별된 경우에는, 화상 평가부(22)는, 그 촬영 화상에 대하여, 비메니스커스 영역의 화상의 평가 방법을 이용하여 평가한다(S18). 구체적으로는, 그 촬영 화상에 대하여, 세포의 상태를 나타내는 특징량을 산출하고, 그 특징량을 이용하여 촬영 화상에 포함되는 세포의 상태를 평가한다.

그리고, 모든 관찰 영역이 주사되어, 모든 관찰 영역의 촬영 화상의 평가가 종료될 때까지 S12~S18까지의 처리가 반복된다(S20, NO).

모든 관찰 영역의 촬영 화상의 평가가 종료된 경우에는(S20, YES), 화상 평가부(22)는, 각 관찰 영역의 촬영 화상의 평가 결과를 웰 단위로 통합하고, 웰 단위의 평가 결과를 취득한다(S22).

그리고, 표시 제어부(23)는, 각 관찰 화상의 촬영 화상을 이용하여 합성 화상을 생성하며, 합성 화상을 표시 장치(30)에 표시시키고, 또한 웰 단위에서의 통합 평가 결과를 표시 장치(30)에 표시시킨다(S24).

상기 실시형태의 세포 화상 평가 시스템에 의하면, 관찰 영역마다의 촬영 화상이, 용기 내의 메니스커스 영역을 촬영한 화상인지 비메니스커스 영역을 촬영한 화상인지를 판별하고, 촬영 화상에 포함되는 세포의 상태를 평가할 때, 메니스커스 영역의 화상과 비메니스커스 영역의 화상에서 다른 평가 방법으로 평가하도록 했으므로, 메니스커스 영역의 화상이, 메니스커스의 영향을 받아 콘트라스트가 낮은 화상이었다고 해도, 그 화상에 적합한 평가 방법으로 평가함으로써, 보다 정확하고, 또한 신뢰성이 높은 평가를 행할 수 있다.

또한, 상기 실시형태에 있어서는, 화상 평가부(22)에 있어서, 웰 내의 메니스커스 영역의 화상의 평가 결과와 비메니스커스 영역의 화상의 평가 결과를 통합하여, 웰 단위에서의 평가 결과를 산출하도록 했지만, 이와 같이 통합된 평가 결과를 산출할 때, 메니스커스 영역의 화상의 평가 결과와 비메니스커스 영역의 화상의 평가 결과에 가중값을 부가하도록 해도 된다. 가중값으로서는, 비메니스커스 영역의 화상의 평가 결과에 부가되는 가중값이, 메니스커스 영역의 화상의 평가 결과에 부가되는 가중값보다 커지도록 설정하는 것이 바람직하다. 이것은, 비메니스커스 영역의 화상 쪽이 메니스커스의 영향이 적어, 콘트라스트가 높은 화상이므로, 평가 결과의 정밀도가 높다고 생각되기 때문이다.

구체적으로는, 예를 들면 웰 내의 각 관찰 영역의 성장도의 평균값을 웰 단위의 성장도로서 구하는 경우, 메니스커스 영역의 관찰 영역의 성장도에 대하여 0.5보다 작은 가중값을 부가하고, 비메니스커스 영역의 관찰 영역의 성장도에 대하여 0.5 이상의 가중값을 부가하도록 하면 된다.

또는, 성장도가 임곗값 이상인 관찰 영역의 평가 결과를 "양호하다"고 하고, 임곗값 미만인 관찰 영역의 평가 결과를 "양호하지 않다"고 하는 경우, 메니스커스 영역의 관찰 영역의 성장도에 대하여 0.5보다 작은 가중값을 부가하여 "양호하다" 또는 "양호하지 않다"를 평가하고, 비메니스커스 영역의 관찰 영역의 성장도에 대하여 0.5 이상의 가중값을 부가하여 "양호하다" 또는 "양호하지 않다"를 평가하도록 해도 된다. 그리고, 상술한 바와 같이 웰 내에 포함되는 평가 결과가 "양호하다"인 관찰 영역의 수가, 임곗값 이상인 경우에 웰 단위에서의 평가 결과를 "양호하다"고 하고, 임곗값 미만인 경우에 웰 단위에서의 평가 결과를 "양호하지 않다"고 해도 된다.

또, 상기 실시형태에 있어서는, 촬영 화상의 콘트라스트 등의 특징량에 근거하여, 그 촬영 화상이, 메니스커스 영역의 화상인지 비메니스커스 영역의 화상인지를 판별하도록 했지만, 판별 방법으로서는 이것에 한정하지 않고, 미리 설정된 웰 내에 있어서의 위치 정보에 근거하여, 메니스커스 영역의 화상인지 비메니스커스 영역의 화상인지를 판별하도록 해도 된다.

상술한 바와 같이 웰 내에 형성되는 메니스커스의 범위는, 웰의 크기 등에 의하여 미리 알 수 있다. 따라서, 촬영 화상이 촬영된 관찰 영역의 웰 내에 있어서의 위치가 웰의 주변부에 해당하는지 여부에 의하여, 그 촬영 화상이, 메니스커스 영역의 화상인지 비메니스커스 영역의 화상인지를 판별하도록 해도 된다. 또는, 상기 실시형태와 같이 촬영 화상의 콘트라스트 등의 특징량에 근거하여, 그 촬영 화상이, 메니스커스 영역의 화상인지 여부를 판별하여, 메니스커스 영역의 화상이라고 판별되고, 또한 그 관찰 영역의 웰 내에 있어서의 위치가 웰의 주변부에 해당하는 경우에, 메니스커스 영역의 화상이라고 판별하도록 해도 된다.

구체적으로는, 예를 들면 웰 내에 있어서의 관찰 영역의 위치 정보와, 메니스커스 영역인지 비메니스커스 영역인지를 나타내는 영역 특정 정보를 대응지은 테이블 등을 미리 설정해 두면 된다. 그리고, 웰 내에 있어서의 임의의 관찰 영역의 촬영 화상을 촬영했을 때에, 상기 테이블을 참조하여, 그 관찰 영역의 위치 정보에 대응지어진 영역 특정 정보를 취득하고, 그 영역 특정 정보와 촬영 화상을 연관시켜 기억하도록 하면 된다. 그리고, 영역 판별부(21)에 의하여 판별을 행할 때에는, 촬영 화상에 연관된 영역 특정 정보를 참조하도록 하면 된다.

또한, 웰 내에 있어서의 관찰 영역의 위치 정보에 대해서는, 예를 들면 스테이지의 위치 정보와 웰 내에 있어서의 관찰 영역의 위치 정보와의 관계를 미리 설정해 두고, 스테이지의 위치 정보에 근거하여, 관찰 영역의 위치 정보를 취득하도록 하면 된다. 또는, 웰 플레이트 전체의 화상을 촬영하고, 그 화상 내에 있어서의 웰의 위치를 에지 검출 등에 의하여 산출하며, 그 웰의 위치 정보에 근거하여, 웰 내에 있어서의 관찰 영역의 위치 정보를 취득하도록 해도 된다.

또, 상술한 바와 같이, 웰 내에 형성되는 메니스커스의 범위는, 웰 플레이트의 웰수에 따라 다르다. 또, 웰 플레이트뿐만 아니라, 그 외의 배양 용기를 이용하는 경우에는, 배양 용기의 종류에 따라 메니스커스의 범위는 다르다.

따라서, 배양 용기 내에 있어서의 관찰 영역의 위치 정보와 영역 특정 정보를 대응지은 테이블을 배양 용기의 종류마다 설정하도록 해도 된다. 그리고, 예를 들면 유저가 입력 장치(40)를 이용하여 배양 용기의 종류의 정보를 설정 입력하고, 그 종류에 따른 테이블을 사용하도록 해도 된다. 또, 배양 용기의 종류의 정보에 대해서는, 유저가 설정 입력하는 것이 아니라, 배양 용기에 대하여 바코드 등의 식별 정보를 부여하고, 그 식별 정보를 독취하여 취득하도록 해도 된다.

또, 상술한 바와 같이 웰 내에 있어서의 관찰 영역의 위치 정보에 근거하여, 메니스커스 영역의 화상인지 비메니스커스 영역의 화상인지를 판별하고, 또한 촬영 화상의 콘트라스트 등의 특징량에 근거하여 배양액의 "물결"의 영역을 판별하며, 이 물결의 영역에 대해서도, 메니스커스 영역과 동일한 평가 방법으로 평가하도록 해도 된다. 배양액의 "물결"은, 배양액의 표면에 형성되고, 메니스커스와는 별도로, 웰 내에 있어서의 위치가 웰의 주변부 이외의 범위인 경우에도 발생할 수 있다. 그리고, 광학적인 현상으로서는, 메니스커스 영역과 동일하기 때문에, 메니스커스 영역과 동일한 평가 방법으로 평가함으로써, 보다 적절한 평가 결과를 얻을 수 있다.

10 현미경 장치
20 세포 화상 평가 장치
21 영역 판별부
22 화상 평가부
23 표시 제어부
30 표시 장치
40 입력 장치
50 웰 플레이트
51 웰
A 영역(관찰 영역)
E 주사 종료점
M 메니스커스
Sc 주사 궤적을 나타내는 실선
R1 비메니스커스 영역
R2 메니스커스 영역
S 주사 개시점

Claims

세포가 수용된 용기 내를 촬영한 촬영 화상이, 상기 용기 내의 메니스커스 영역을 촬영한 화상인지 비메니스커스 영역을 촬영한 화상인지를 판별하는 영역 판별부와,
상기 촬영 화상에 포함되는 세포의 상태를 평가하는 화상 평가부를 구비하고,
상기 화상 평가부가, 상기 메니스커스 영역의 화상과 상기 비메니스커스 영역의 화상에서 다른 평가 방법으로 평가하고,
상기 영역 판별부가, 상기 촬영 화상의 특징량에 근거하여, 상기 메니스커스 영역의 화상인지 상기 비메니스커스 영역의 화상인지를 판별하는, 세포 화상 평가 장치.
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청구항 1에 있어서,
상기 영역 판별부가, 상기 촬영 화상의 특징량 및 미리 설정된 상기 용기 내에 있어서의 위치 정보에 근거하여, 상기 메니스커스 영역의 화상인지 상기 비메니스커스 영역의 화상인지를 판별하는, 세포 화상 평가 장치.
청구항 1 또는 청구항 4에 있어서,
상기 화상 평가부가, 상기 비메니스커스 영역의 화상에 대해서는, 상기 촬영 화상에 포함되는 세포의 상태를 나타내는 특징량을 이용하여 평가하고, 상기 메니스커스 영역의 화상에 대해서는, 화상 특징량을 이용하여 평가하는, 세포 화상 평가 장치.
청구항 5에 있어서,
상기 세포의 상태를 나타내는 특징량이, 개개의 세포의 상태의 특징량, 세포 내에 포함되는 핵소체의 특징량, 흰색 줄의 특징량, 세포 내에 포함되는 핵의 특징량 및 세포의 NC비(Nucleocytoplasmic ratio) 중 적어도 하나를 포함하는, 세포 화상 평가 장치.
청구항 1 또는 청구항 4에 있어서,
상기 화상 평가부가, 상기 용기 내의 상기 메니스커스 영역의 화상의 평가 결과와 상기 비메니스커스 영역의 화상의 평가 결과를 통합하여 상기 용기에 대한 평가 결과를 산출하는, 세포 화상 평가 장치.
청구항 7에 있어서,
상기 화상 평가부가, 상기 용기에 대한 평가 결과를 산출할 때, 상기 메니스커스 영역의 화상의 평가 결과와 상기 비메니스커스 영역의 화상의 평가 결과에 가중값을 부가하는, 세포 화상 평가 장치.
청구항 8에 있어서,
상기 비메니스커스 영역의 화상의 평가 결과에 부가되는 가중값이, 상기 메니스커스 영역의 화상의 평가 결과에 부가되는 가중값보다 큰, 세포 화상 평가 장치.
청구항 1 또는 청구항 4에 있어서,
상기 촬영 화상이, 상기 용기가 설치되는 스테이지 및 상기 용기 내의 세포의 상을 결상하는 결상광학계 중 적어도 한쪽을 이동시킴으로써, 상기 용기 내의 각 관찰 영역을 촬영한 화상이며,
상기 영역 판별부가, 상기 관찰 영역마다의 촬영 화상에 대하여, 상기 메니스커스 영역의 화상인지 상기 비메니스커스 영역의 화상인지를 판별하는, 세포 화상 평가 장치.
청구항 1 또는 청구항 4에 있어서,
상기 영역 판별부가, 상기 촬영 화상이, 상기 용기 내의 액체의 물결 영역을 촬영한 화상인지 여부를 판별하고,
상기 화상 평가부가, 상기 물결 영역을 촬영한 화상을, 상기 메니스커스 영역의 화상을 평가하는 평가 방법과 동일한 평가 방법으로 평가하는, 세포 화상 평가 장치.
세포가 수용된 용기 내를 촬영한 촬영 화상이, 상기 용기 내의 메니스커스 영역을 촬영한 화상인지 비메니스커스 영역을 촬영한 화상인지를 판별하고,
상기 촬영 화상에 포함되는 세포의 상태를 평가할 때, 상기 메니스커스 영역의 화상과 상기 비메니스커스 영역의 화상에서 다른 평가 방법으로 평가하고,
상기 촬영 화상을 판별할 때, 상기 촬영 화상의 특징량에 근거하여, 상기 메니스커스 영역의 화상인지 상기 비메니스커스 영역의 화상인지를 판별하는, 세포 화상 평가 방법.
컴퓨터를,
세포가 수용된 용기 내를 촬영한 촬영 화상이, 상기 용기 내의 메니스커스 영역을 촬영한 화상인지 비메니스커스 영역을 촬영한 화상인지를 판별하는 영역 판별부와,
상기 촬영 화상에 포함되는 세포의 상태를 평가하는 화상 평가부로서 기능시키는 세포 화상 평가 프로그램을 저장한 비일시적인 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체로서,
상기 화상 평가부가, 상기 메니스커스 영역의 화상과 상기 비메니스커스 영역의 화상에서 다른 평가 방법으로 평가하고,
상기 영역 판별부가, 상기 촬영 화상의 특징량에 근거하여, 상기 메니스커스 영역의 화상인지 상기 비메니스커스 영역의 화상인지를 판별하는, 세포 화상 평가 프로그램을 저장한 비일시적인 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체.