CN1160216A - 入射光荧光显微镜 - Google Patents

Abstract

本发明的入射光荧光显微镜包括透射照射光学系统、观测光学系统和入射光荧光照射光学系统透射照射光学系统具有接收光源(1)的光并分离透射过来的光(10)的第一光学元件(2)，并把光(10)照射到样品(6)上，观测光学系统具有物镜(7)和第二光学元件(12)，且位置比样品更靠近物镜，而入射光荧光照射光学系统配置在观测光学系统中，其中，第一光学元件在比荧光波长更长的波长处具有一个透射率的峰值，而第二光学元件只是选择地调制透射过第一光学元件的波长。

Description

入射光萤光显微镜

本发明涉及一种入射光萤光显微镜，这种显微镜在医学和生物学领域中用于观测细胞或组织的状态。具体地说，本发明涉及一种入射光萤光显微镜，借助这种显微镜，利用差示干涉观测方法或采用调制差显(modulation contrast)(霍夫曼调制差显)显微镜的光瞳调制显微方法来观测细胞或组织的外形，并且同时利用入射光萤光观测方法检测例如一种物质的位置。

下面将说明第一种常规技术。一般来说，萤光显微镜广泛用于各种领域，例如，用于医学和生物学，以便检测例如在活组织或细胞中的萤光标记的蛋白质或基因。特别是近年来，已可能用差示干涉观测方法来检测细胞或组织的外形，并且同时用入射光萤光观测方法未检则萤光标记的蛋白质或基因，由此检查该蛋白质或基因在所述细胞或组织中的位置。

遗憾的是，要同时进行差示干涉观测和入射光萤光观测，就必须在观测光学系统中安置检偏器(起偏振片)，而且，因为光通过这个检偏器，光的损失会增加。由于萤光图象的光极弱，这尤其是一个问题。因此，为了获得必需的萤光，必须使强烈的激发光辐照在样品上。不过，如果是这种情况，不仅较早地出现萤光光褪色，而且如果样品是活的话，另外还损坏该样品。

要解决这些问题，在“用于生物学的光学显微术”一书的第513到522页中(1989年6月4日到7日在北加利福尼亚的Chapel Hill举行的视频信号显微术国际会议的会议文集，A JOHN WILEY&SONS公司，出版：Brian Herman，Ken Jacobson)，公开了一种显微镜的构造，这种显微镜装置利用分色镜的偏振和透射特性，该分色镜依赖于波长，并且能同时进行差示干涉观测和入射光萤光观测。在这种装置中，分色镜只是在某一特定的波长范围内起到检偏器(起偏振片)的作用。由于对于比所述特定的波长更长的波长透射率高，在这个波长范围中的萤光图象并不变暗。因此，可以高效率地同时进行差示干涉观测和入射光萤光观测。

下面将说明第二种常规技术。近来，已可能通过采用例如调制差显显微镜的光瞳调制显微方法来检测细胞或组织的状态，并且同时通过入射光萤光观测方法来检测萤光标记的蛋白质或基因，由此，检查该蛋白质或基因在所述细胞或组织中的位置，而且还检查该蛋白质或基因的移动。

图12A显示了公开号为51-128548的日本专利申请中所公开的一种装置，通过给通常的显微镜添加一些用于调制差显观测的元件而获得这种装置。如图12A所示，一个调制器102安置在一个物镜103的出射光瞳平面上。如图12B所示，这个调制器102是一个具有三个不同透射率区域的波光片。在这个波光片中，参考标号108表示一个几乎不透光的黑暗部分(D)；109表示一个大约15％透射率的半透明部分(G)；而110表示完全透光的一个光亮部分(B)。

一个光阑106安置在一个聚光镜105的前焦面上。加到光阑106的一侧的P1和安置在P1下面的P2是起偏振片。可通过旋转起偏振片P2来控制穿过光阑106的透射光的量。有调制器102安置在上面的透镜103的出射光瞳平面和有光阑106安置在上面的聚光镜105的前焦面是共轭的。因此，光阑106的像形成在调制器102的表面上。

类似于把相衬显微镜的一个环形光阑调整为相移片的一个环，操作者预先把光阑图像调整到在调制器102上的半透明部分(G)109，而同时利用一个望远镜监控在物镜103的出射光瞳平面上的调制器102。

图13显示了穿过一个透明状态的物体所透射的光通过一个调制器形成一个具有反差的图像的过程。1975年R.Hoffman和L.Gross发表了这个原理。

如图13所示，假定具有某一相位分布的一个透明样品115形成一个棱柱形状。当穿过光阑117并用聚光镜116会聚成平行光线的那些光线进入这个棱柱时，穿过图13左边的倾斜部分的一束光线从入射光线弯向左边，而穿过图13右边的倾斜部分的一束光线从该入射光线弯向右边。穿过上、下表面平行的上述棱柱中央部分的一束光线走直线，不弯曲。

这些光线穿过一个物镜113并进入一个调制器112。因为当光穿过调制器112的黑暗部分(D)121时光强减弱，所以在图13左边的光变为不可见光。这不可见光到达物镜113的成像位置124并形成一个中间图像。穿过上述中央部分的光通过调制器112的一个半透明部分(G)122，并且由于光强稍微减弱而形成一个中间图像。在右边的光穿过调制器112的一个光亮部分(B)123，并形成一个亮度不减弱的中间图像。具有某一相位分布的透明棱柱样品115的图像以这种方式形成为一个可见图像111，可见图像111按照倾角和厚度的变化具有一些亮和暗的部分。以上所述是霍夫曼调制差显观测的原理。

下面将说明由上述调制差显显微镜和入射光萤光显微镜组合而成的常规组合显微镜。

图14显示了常规组合显微镜的构造。用镜子134使发自透射光源131的光弯折，发自透射光源131的光穿过类似于上述光阑106的一个光阑136，并用聚光镜137引向样品138。穿过样品138所透射的光用物镜139聚集，并穿过类似于上述调制器102和112的一个调制器140。光透射过用于入射光萤光的一个分色镜141和一个吸收滤光片142，用成像透镜143形成这光的图象，并把该图象引导到目镜145。前面所述的是在调制差显方法中的照射和观测光路。

同时形成下述入射光萤光光路。发自入射光源146的光穿过一个会聚透镜147等被导向一个激发滤光片151。用分色镜141反射穿过激发滤光片151的激发光，这激发光穿过调制器140和物镜139，并辐照到样品138上。

以和用于调制差显方法所形成的图像相同的方式，用物镜139聚集发自样品138的萤光，这萤光穿过调制器140。光透射过分色镜141和吸收滤光片142，用成像透镜143形成该光的一个图像，并把这图像导向目镜145。

通过同时采用上述所形成的两个光路，也就是说，由调制差显方法所形成的光路和入射光萤光光路，由调制差显方法和入射光萤光观测方法所形成的两个图像彼此重叠，并可在目镜145观测到。

在前述第一种常规技术中，可同时高效率地进行差示干涉观测和入射光萤光观测。不过，对于由一个带通滤光器所形成的差示干涉观测的波状范围来说，光透射过一个分色镜和一个吸收滤光片。把所述带通滤光器的波长范围置于上述激发滤光片的波长范围和吸收滤光片的波长范围之间。因此，如果一种萤光染料具有接近激发波长的萤光波长，激发光易于在上述结构的观测光学系统中调制。这显著降低了萤光图像的反差，也就是说，萤光和背景的强度比。

另一方面，上述第二种常规技术采用了调制差显显微镜和入射光萤光显微镜的组合，并且能检测例如一种萤光标记的蛋白质或基因，且同时检测细胞或组织的状态，由此，检查该蛋白质或基因的位置或移动。

不过，由于把诸如调制器这样的一些光学元件插进观测光学系统，萤光图像的亮度关键性地降低，尤其是对于入射光萤光观测。此外，由采用例如调制差显显微镜的光瞳调制显微方法所观察到的细胞或组织一般具有无色背景。因此，如果要被同时观察的萤光具有类似的颜色，就难以分开细胞或组织的图像和萤光图像。

本发明的目的是提供下述入射光萤光显微镜。

(a)一种入射光萤光显微镜，这种显微镜结构简单，并且能同时高效率地进行差示干涉观测和入射光萤光观测(由此可获得一个明亮的萤光图像)，而且能同时获得一个高对比度萤光图像，并且能同时增加差示干涉观测所形成的图像和入射光萤光观测所形成的图像之间的区别。

(b)一种入射光萤光显微镜，这种显微镜能高效率地进行一种光瞳调制显微方法(由此可获得一个明亮的萤光图像)和一种入射光萤光观测(由此可获得一个明亮的萤光图像)的组合显微镜检查并且能增加由光瞳调制显微方法所形成的图像和入射光萤光图像之间的区别。

本发明的入射光萤光显微镜是一种包括一个透射照射光学系统的入射光萤光显微镜，该透射照射光学系统有一个第一光学元件，这个第一光学元件用于接收发自光源的光并分离透射过来的光，而且该透射照射光学系统把所述透射过来的光照射到一个样品上，本发明的入射光萤光显微镜还包括一个观测光学系统，这个观测光学系统具有一个物镜和一个第二光学元件，并且位置比上述样品更靠近所述物镜，本发明的入射光萤光显微镜还包括一个入射光萤光照射光学系统，这个入射光萤光照射光学系统配置在上述观测光学系统中，其中，上述第一光学元件在比萤光波长更长的波长处有透射率的峰值，而上述第二光学元件只是选择性地调制从所述第一光学元件透射过来的波长。

下面将要说明本发明的其它一些目的和优点，部分目的和优点从下面说明中看是显而易见的，或者可从实施本发明中获知。借助于所附的权利要求书中所指出的那些手段和组合可实现并获得本发明的那些目的和优点。

这里所附的作为说明书的一部分的那些附图目前显示了本发明的一些优选实施例，并且与上面所给出的一般性说明及下面所给出的那些优选实施例的详细说明一起用来说明本发明的原理。

图1是显示本发明的第一个实施例的入射光萤光显微镜的结构的一幅图；

图2A是显示本发明的第一个实施例的一个激发滤光片、一个分色镜、一个吸收滤光片和一个带通滤光器的光谱透射率特性曲线的一幅图；

图2B是显示一个激发滤光片、一个分色镜、一个吸收滤光片和一个锐截止滤光器的光谱透射率特性曲线的一幅图；

图3A是显示本发明的第二个实施例的一个分色镜的光谱透射率特性曲线的一幅图，该特性曲线与所述分色镜的后表面有关；

图3B是显示本发明的第二个实施例的上述分色镜的光谱透射率特性曲线的一幅图，该特性曲线与所述分色镜的前表面有关；

图4是显示本发明的第三个实施例的入射光萤光显微镜的结构的一幅图；

图5是显示本发明的第三个实施例的一个激发滤光片、一个分色镜、一个吸收滤光片、一个带通滤光器和一个调制器的光谱透射率特性曲线的一幅图；

图6是显示本发明的第三个实施例的调制器的结构的一幅图；

图7是显示本发明的第四个实施例的入射光萤光显微镜的结构的一幅图；

图8是显示本发明的第五个实施例的入射光萤光显微镜的结构的一幅图；

图9A是显示本发明的第五个实施例的一个相差调制器的一幅图；

图9B是显示本发明的第五个实施例的一个相差光阑的一幅图；

图10是显示本发明的第五个实施例的一个激发滤光片、一个分色镜、一个吸收滤光片、一个带通滤光器和一个调制器的光谱透射率特性曲线的一幅图；

图11是显示本发明的第六个实施例的入射光萤光显微镜的结构的一幅图；

图12A是显示了通过给通常的显微镜添加一些用于调制差显方法的元件所获得的一种常规技术的结构；

图12B是显示具有常规技术的、三个不同的透射率区域的一个滤光片的一幅图；

图13是另一种常规技术的一幅图，这幅图显示了透射过一个透明状态物体的光通过一个调制器形成一个具有反差的图像的过程；以及

图14是显示一种常规组合显微镜的结构的一幅图。

图1是显示本发明的第一个实施例的入射光萤光显微镜的结构的一幅图。图1所示的显微镜可同时进行差示干涉观测方法和入射光萤光观测方法。

首先说明涉及图1中的差示干涉观测的那些部分。只是某一特定波长的发自透射光源1的光透射过一个带通滤光器2并进入一个偏振器3。注意，下面将说明带通滤光器2的光谱透射率特性。

用一个Wollaston棱镜(双折射元件)4把从偏振器3出射的线偏振光分为两束在正交方向上振动的线偏振光线。这两束线偏振光线用一个聚光透镜5聚光，并转向在一个样品6上横移(横向移动)。使这两束光线透射过一个物镜7，并通过一个第二Wollaston棱镜8和一个分色镜12的偏振器的作用(以后将要说明)使这两束光线互相干涉。通过成像透镜9观察由这两个波前所形成的干涉图像是一些亮暗条纹，或者是通过区分样品6的相位变化所得到的一些颜色的反差。

其次说明涉及图1中的入射光萤光观测的那些部分。由一个激发光源10，例如，由一个超高压水银灯发射的那些波长中，只有对于激发样品6所必需的那个波长透射过一个激光滤光片11。用分色镜12选择性地反射透射过激发滤光片11的波长。注意，分色镜12有一层具有以后要说明的光谱透射率特性的涂层，因此，透射比某一指定波长范围更长的那些波长。被分色镜12反射的激发光穿过Wollaston棱镜8，并通过物镜7照射在样品6上。

结果，由萤光染料染色的一部分样品6被激发而发射波长比激发光波长更长的萤光。这萤光由物镜7聚光。该萤光透射过Wollaston棱镜8和分色镜12。透射过分色镜12的萤光透射过一个吸收滤光片13，吸收滤光片13只透射波长比某一指定波长范围更长的萤光图像。把透射过吸收滤光片13的萤光引导到成像透镜9，并通过它观察这萤光。

图2A是显示上述激发滤光片11、分色镜12、吸收滤光片13和带通滤光器2的光谱透射率特性曲线的一幅图。注意，激发滤光片11和吸收滤光片13的光谱透射率特性是类似于常规入射光萤光显微镜的光谱透射率特性的普通特性。这样给分色镜12涂层，使得反射激发光并透射萤光的光谱透射率T在某一波长范围Tu突然增加而与偏振光无光，在波长范围Tu中光谱透射率T上升，而P偏振光在一个比波长范围TD中的S偏振光更长波长处下降，在波长范围TD中光谱透射率T下降。

如图2A所示，当把带通滤光器2的光谱透射率特性的峰值置于分色镜12的P偏振光和S偏振光的后沿时，在这个波长范围中，分色镜12的P偏振光透射过去，而它的S偏振光并不透射。也就是说，当把带通滤光器2安置在一个透射照射系统中从而在这个波长范围中进行差示干涉观测时，分色镜12起到一个起偏振片的作用。因此，可把这个分色镜12用作一个用于差示干涉观测的检偏器。另一方面，萤光波长范围D可有效地透射过分色镜12和吸收滤光片13，因此，萤光图像并不变暗。因而，可极高效率地同时观测差示干涉和入射光萤光。

进而，在分色镜12的上升波长范围Tu和吸收滤光片13的上升波长范围中，并不依赖于偏振光，而且透射率急剧上升。因此，激发光被分色镜12和吸收滤光片13完全遮断，并且因此并不参与进萤光图像。结果，可获得高反差的萤光图像。对于采用具有靠近激发波长的萤光波长的萤光染料的观测来说，这一点特别有效。

图3A和3B是显示本发明的第二个实施例的分色镜12的光谱透射率特性曲线的图。在这个第二实施例中，具有图3A和3B所示的光谱透射率特性的一些涂层分别形成在分色镜12的后表面(在透射光源1和激发光源10的那侧)和前表面(在成像透镜9的那侧。通过组合这些涂层，得到图2所示的光谱透射率特性曲线。结果，优点是比在第一个实施例中更易设计涂层。

图4是显示本发明的第三个实施例的入射光萤光显微镜的结构的一幅图。图4所示的显微镜可同时进行作为一种光瞳调制显微方法的霍夫曼调制差显观测方法和入射光萤光观测方法。

首先，下面将说明涉及图4中霍夫曼调制差显观测的那些部分。透射光源21例如是一个卤素灯。发自透射光源21的照射光通过一个聚光透镜22、穿过一个视场光阑23、并被一个反射镜24反射。这光穿过一个观察窗透镜25，而且只有某一特定的波长透射过带通滤光器26。这个特定的波长进入一个定位在聚光透镜28的前焦面上的光阑27。注意，以后将会说明带通滤光器26的光谱透射率特性。

用聚光透镜28聚集发自光阑27的光，以便照射样品29。透射过样品29的光用一个物镜30会聚并透射过一个调制器31，调制器31定位在物镜30的出射光瞳平面上并具有三种不同的波长特性(以后要说明)。所述光透射过一个分色镜32和一个吸收滤光片33，并且通过一个成像透镜34和一个棱镜35被引导到目镜36。结果，观察到基于上述第二种常规技术中的前述原理的图像。

下面将说明涉及图4中入射光萤光观测的那些部分。发自一个激光光源37(例如，一个超高压水银灯)的光用一个聚光透镜38聚光，并通过一个孔径光阑39、一个视场光阑40和一个投影镜头41被引导到一个激发滤光片42。只有对于激发样品29所必需的某一波长的光才能透射过激发滤光片42。用分色镜32选择性地反射透射过激发滤光片42的波长。注意，分色镜32透射比某一指定波长范围更长的那些波长。被分色镜32反射的激发光通过调制器31，并通过物镜30照射在样品29上。

结果，用萤光染料染色的样品29的一部分被激发，发射波长比激发光的波长更长的萤光。物镜30聚集这样发射的萤光。该萤光透射过调制器31和分色镜32。使透射过分色镜32的萤光透射穿过吸收滤光片33，吸收滤光片33只透射波长比某一指定波长范围更长的萤光图像。使透射过吸收滤光片33的萤光通过成像透镜34和棱镜35引导到目镜36，并观察这萤光。

图5是显示激发滤光片42、分色镜32、吸收滤光片33、带通滤光器26和调制器31的光谱透射率特性曲线的一幅图。注意，激发滤光片42、分色镜32和吸收滤光片33的光谱透射率特性是类似于常规入射光萤光显微镜的光谱透射率特性的那些普通特性。

图6是显示调制器31的结构的一幅图。如图6所示，调制器31由三部分组成。由A和B所表示的每一部分的透射率特性如图5所示，透射率T从一预定的光谱波长以比较缓和的斜率朝向更长的波长降低。尽管图5中未示出，一个C部分对所有波长都具有接近100％的透射率。

如图5所示，使带通滤光器26的光谱透射率特性曲线的峰值置于这样两个位置之间，其中调制器31的A部分和B部分的透射率为零。在这个波长范围中，调制器31的A部分几乎不透射光，B部的透射率仅有百分之几十，而C部分几乎100％透射光。因此，这些部分A、B和C对应于图12B中所示的调制器的黑暗部分(D)108、半透明部分(G)109和光亮部分(B)110，这对于霍夫曼调制差显观测来说是必需的。结果，在带通滤光器26的透射波长范围内，获得霍夫曼调制差显观测的效果。

另一方面，调制器31在对于萤光观测所必需的那些波长范围中具有高透射率，也就是说，如图5所示，是在激发滤光片42具有100％的透射率和所发射的萤光的波长范围D这样的一个范围中。这样，调制器31不影响萤光观测，而因此萤光图像并不变暗。因此，在这个第三个实施例中，就可能以极高的效率同时观测霍夫曼调制差显及入射光萤光，而甚至在观测萤光时都不会有任何损失。

图7是显示本发明的第四个实施例的入射光萤光显微镜的结构的一幅图。注意，和图4中相同的参考标号在图7中表示同样的部件，而且略去它们的详细说明。就像在第三个实施例中那样，图7所示的显微镜可同时进行霍夫曼调制差显观测方法和入射光萤光观测方法。

如图4所示，在上述第三个实施例中，对于霍夫曼调制差显观测是必需的光阑27和调制器31一般分别安置在聚光透镜28的前焦面和物镜30的出射光瞳平面上。不过，这两个位置通常是在由许多透镜组成的两个透镜组之间，因此，没有大的空间。还有，有时由于结构的限制，不能使光阑27和调制器31安置在它们各自的正确位置上。如果是这种情况，只要不降低光学性能，就在光轴方向上移动这些元件。调制器31有时还形成为在构成透镜30的那些透镜之一的表面上的一种涂层。要改变类似这种情况下的特性，必须替换全部物镜。还有，涂层技术是有难度的。

在这个第四个实施例中，如图7所示，通过采用一个光瞳投影透镜51和一个中继透镜52，可使物镜30的出射光瞳平面的一个光学共轭位置形成在观测光路中。由于该位置是光学共轭的，甚至是在调制器31安置在被投影的光瞳的位置时，也能进行霍夫曼调制差显观测。在照射那一侧的光阑27也可安置在聚光透镜28的前焦面的光学共轭位置。

图7显示的结构是光阑27和调制器31安置在上述那些光学共轭的位置。采用这种结构，可把光阑27和调制器31安置在具有较大空间的那些位置，因此，可易于替换光阑27和调制器31。因而，通过用一个具有如图5所示的光谱透射率特性的调制器替换调制器31，就可以根据样品的特性把透射率改变到带通滤光器26的透射波长范围，并可调整霍夫曼调制差显观测的效果。

还有在同时观测霍夫曼调制差显和入射光萤光时，就像在第三个实施例中那样，可以高效率地同时观测霍夫曼调制差显和入射光萤光。

图8是显示本发明的第五个实施例的入射光萤光显微镜的结构的一幅图。注意，和图4中相同的参考标号在图8中表示相同的部件，而且略去了它们的详细说明。图8所示的显微镜可同时进行作为一种光瞳调制显微方法而不是第三个实施例中的霍夫曼调制差显观测方法的一种相差观测方法以及一种入射光萤光观测方法。因此，由于基本光学结构和诸如此类的东西都与第三个实施例中的类似，下面将说明作为相差观测的主要元件的光阑61和调制器62。

图9A和9B分别是显示图8中的安置在物镜30的出射光瞳平面上的相差调制器62和在聚光透镜28的前焦面上的相差光阑61的两幅图。在图9A中，参考标号91表示调制器62的一个相位膜部分。在图9B中，参考标号92表示在光阑61中的那些孔。

下面将简述相差观测的原理，尽管这原理是众所周知的。光通过光阑61，而平面波经由聚光透镜28到达样品29。如果没有样品29，孔92的一个图像就被物镜30形成在调制器62的相位膜部分91的内部。样品29所衍射的光传播出相位膜部分91，而且只有未被衍射的零级光穿过相位膜部分91。注意，由于样品29所衍射的光的相位滞后于零级光的相位，该零级光的相位被相位膜部分91延迟了

入或 入。同时，零级光强减弱，以便使该零级光与上述衍射光干涉，由此，给与要被观测的图象反差。一般来说；相位膜部分91的透射率从百分之几到约百分之四十。因此，当同时进行入射光萤光观测时，损失相当大量的萤光。

图10是显示上述激发滤光片42、分色镜32、吸收滤光片33、带通滤光器26和调制器62的光谱透射率特性曲线的一幅图。如图10所示，调制器62的相位膜部分91的光谱透率特性是这样的，在比某一预定波长短的波长处透射率高，而在比该预定波长更长的波长处透射率低。

如图10中那样，带通滤光器26的光谱透射率特性曲线的峰值置于调制器62(即相位膜部分91)的透射率低的一个范围中。结果，带通滤光器26的透射率在这个波长范围内降低。这给予带通滤器26减弱对于相差观测所需要的零级光强的功能。因而，通过把这个功能与延迟相位的功能结合在一起，就可以在带通滤光器26的透射波长范围中获得相差观测的效果。

另外，相位膜部分91的光谱透射率特性曲线如图10所示，在对于萤光观测所必需的一些波长范围内，也就是说，在激发滤光片42具有100％的透射率和一个所发射的萤光的波长范围D这样的一个范围内，透射率高。因此，由于相位膜部分91对萤光观测没影响，萤光图像并不变暗。因而，在这个第五个实施例中，就可能极高效率地同时观测相差和入射萤光，而甚至在萤光观测中也不会有任何损失。

图11是显示本发明的第六个实施例的入射光萤光显微镜的结构的一幅图。注意，和图8中相同的参考标号在图11中表示相同的部件，而且略去了详细说明。如在上述第五个实施例中那样，图11所示的显微镜可同时进行相差观测方法和入射光萤光观测方法。

如在第四个实施例中所述的那样，这种显微镜可利用光瞳投影透镜51和中继透镜52的功能，在观测光路中形成物镜30的出射光瞳平面的一个光学共轭位置。由于形成了这个光学共轭位置，甚至通过把相差调制器62安置在投影光瞳的位置就可进行相差观测。

如在霍夫曼调制差显观测中那样，相差调制器62一般安置在组成物镜30的那些透镜中。因此，要改变调制器62，就必需替换全部物镜30。不过，特别是在相差观测中，相位膜部分91的透射率和相位延迟根据反差有许多种组合。因而，就必需与组合数目同样数目的物镜。

因此，在这个第六个实施例中，调制器62安置在被投影的光瞳的位置，并用一个调制器替代，在这个调制器中，改变在图10所示的带通滤波器26的透射波长范围内的相位膜部分91的透射率，或者用这样一个调制器替代，在这个调制器中，改变相位膜部分91的相位延迟宽度。结果，可通过一个物镜30观测到由于相差造成的许多反差。另外，当把在照射那侧的相差光阑61安置在聚光透镜28的前焦面的光学共轭位置时，易于在较大的空间中替换相差光阑61。

此外，在同时观测入射光萤光时，可替换调制器62，而同时保持图10所示的光谱透射率特性。因而，就可能保持高效率，并在同时观测相差和入射光萤光时改变相差对比方法。

图2B是显示激发滤光片11、分色镜12、吸收滤光片13、和一个锐截止滤光器14的光谱透射率特性曲线的一幅图。在上述每个实施例中，可用锐截上滤光器14而不用带通滤光器2。如图2B所示，锐截止滤光器14具有这样的光谱透射率特性，锐截止滤光器14截断在分色镜12的S偏振光的后沿处的波长范围，并透射在分色镜12的P偏振光的后沿处的波长范围。

在上述本发明的入射光萤光显微镜中，配置在透射照射光学系统中以便分离透射过来的光的的一个第一光学元件在比萤光波长更长的某一波长处具有一个透射率的峰值，而配置在观测光学系统中的一个第二光学元件只是选择性地调制透射过上述第一光学元件的波长。因此，萤光波长范围可有效地透射过上述第二光学元件，因而萤光图像并不变暗。这使得极高效率的入射萤光观测实际可行。另外，可得到高反差的萤光图像，这是因为没有激发光参与进该萤光图像。本发明可特别有效地用于采用萤光波长靠近激发波长的一种萤光染料的观测。

此外，在本发明的入射光萤光显微镜中，透射照射光学系统和观测光学系统都基于差示干涉观测方法。因此，可清楚地观测由萤光图像所形成的颜色和由差示干涉观测所得到的图像形成的颜色之间的差别。结果，就可能极高效率地同时观测到差示干涉观测结果和入射光萤光观测结果。

此外，在本发明的入射光萤光显微镜中，透射照射光学系统和观测光学系统都基于光瞳调制显微方法。因而，可清楚地观测到由萤光图像所形成的颜色和由光瞳调制显微方法所得到的图像形成的颜色之间的差别。结果，就可能极高效率地同时进行光瞳调制显微观测和入射光萤光观测。

本领域普通技术人员易于看出其它优点和改进。因此，就广泛意义上来说，本发明并不限于这里所示和说明的特定细节及那些典型实施例。因而，可以做出各种改进而不会背离由所附的权利要求书及它们的等效物所确定的一般发明构思的精神和范围。

Claims (18)

1.一种入射光萤光显微镜，其特征是该显微镜包括：透射照射光学系统，该透射照射光学系统具有接收发自光源(1)的光并分离透射过来的光(10)的第一光学元件(2，14)，并且把透射过来的光(10)照射到一个样品(6)上；观测光学系统，该观测光学系统具有物镜(7)和第二光学元件(12)并定位于比样品(6)更靠近所述物镜(7)；及配置在所述观测光学系统中的入射光萤光照射光学系统，其中

所述第一光学元件(2，14)在比萤光波长更长的波长处具有透射率的峰值，而且所述第二光学元件(12)只是选择性地调制透射过所述第一光学元件(2，14)的波长。

2.如权利要求1所述的一种显微镜，其特征是所述透射照射光学系统和所述观测光学系统都基于差示干涉观测方法。

3.如权利要求2所述的一种显微镜，其特征是所述第一光学元件(2)是一个带通滤光器(2)，而所述第二光学元件(12)是一个分色镜(12)。

4.如权利要求2所述的一种显微镜，其特征是所述第一光学元件(14)是一个锐截止滤光器(14)，而所述第二光学元件(12)是一个分色镜(12)。

5.如权利要求3所述的一种显微镜，其特征是所述带通滤光器(2)具有这样一种光谱透射率特性，其中峰值处于所述分色镜(12)的P偏振光和S偏振光的后沿之间。

6.如权利要求4所述的一种显微镜，其特征是所述锐截止滤光器(14)具有这样一种光谱透射率特性，即滤光器(14)在分色镜(12)的S偏振光的后沿截断一个波长范围，并在分色镜(12)的P偏振光的后沿透射该波长范围。

7.如权利要求3所述的一种显微镜，其特征是：

所述观测光学系统包括物镜(7)、一个双折射元件(4)、分色镜(12)、以及一个吸收滤光片(13)，

所述分色镜(12)具有这样一种光谱透射率特性，其中某一上升的透射波长与吸收滤光片(13)的上升的透射波长基本相同。

8.如权利要求1所述的一种显微镜，其特征是所述透射照射光学系统和所述观测光学系统都基于光瞳调制显微方法，而所述第一光学元件(2，14)在比萤光波长更长的波长处具有透射率的峰值，而且所述第二光学元件(12)只是调制透射过第一光学元件(2，14)的波长。

9.如权利要求8所述的一种显微镜，其特征所述观测光学系统基于作为上述光瞳调制显微方法的霍夫曼调制方法。

10.如权利要求9所述的一种显微镜，其特征是所述第一光学元件(2)是一个带通滤光器(2)，而所述第二光学元件(12)是一个分色镜(12)。

11.如权利要求10所述的一种显微镜，其特征是：

所述观测光学系统包括分色镜(12)、一个吸收滤光片(13)、和一个调制器(31)，并且

所述带通滤光器(2)具有这样一种光谱透射率范围，其中一个下降波长范围基本上与所述调制器(31)的下降波长范围相同。

12.如权利要求9所述的一种显微镜，其特征是：

所述观测光学系统包括一个光瞳投影透镜(51)，并且

所述光瞳投影透镜(51)安置在所述物镜(7)的出射光瞳平面的一个光学共轭位置。

13.如权利要求9所述的一种显微镜，其特征是：

所述透射照射光学系统包括一个光阑(61)和一个聚光透镜(28)，并且

所述光阑(61)安置在所述聚光透镜(28)的前焦面的一个光学共轭位置。

14.如权利要求8所述的一种显微镜，其特征是所述观测光学系统基于作为上述光瞳调制方法的相差显微方法，而所述第一光学元件(2，14)在比萤光波长更长的波长处具有一个透射率的峰值，并且所述第二光学元件(12)只是选择性地调制透射过第一光学元件(2，14)的波长。

15.如权利要求14所述的一种显微镜，其特征是所述第一光学元件(2)是一个带通滤光器(2)，而所述第二光学元件(12)是一个分色镜(12)。

16.如权利要求15所述的一种显微镜，其特征是：

所述观测光学系统包括一个具有一个相位膜(91)的调制器(62)、分色镜(12)、以及一个吸收滤光片(13)，并且

所述带通滤光器(2)在一个具有比所述调制器(62)的某一预定波长更长的波长范围内具有一个光谱透射率波长范围，并且具有比所述调制器(62)的某一预定透射率更低的透射率。

17.如权利要求14所述的一种显微镜，其特征是：

所述观测光学系统包括一个光瞳投影透镜(51)，并且

所述光瞳投影透镜(51)安置在所述物镜(7)的出射光瞳平面的一个光学共轭位置。

18.如权利要求14所述的一种显微镜，其特征是：

所述透射照射光学系统包括一个光阑(61)和一个聚光透镜(28)，并且

所述光阑(61)安置在所述聚光透镜(28)的前焦面的一个光学共轭位置。

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