CN105849615A - 用于渐逝照明和点状扫描照明的显微镜 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种显微镜(30)，具有物镜(1)和照明单元(31)，用于选择性地产生通过物镜(1)延伸的用于物体的点状扫描照明的无畸变的光束路径(14)和通过物镜(1)延伸的用于物体的渐逝照明的圆锥光束路径(13)，其中，所述照明单元包括：用于产生沿着照明光束路径(32)的照明光束的光源(10)，用于偏转照明光束路径(32)的调节单元(7)，放置在调节单元(7)下游的用于将照明光束聚焦在扫描目镜(8)的成像平面(11)中的扫描目镜(8)，以及布置在扫描目镜(8)的成像平面(11)中的反射镜表面(6)，该反射镜表面具有用于产生无畸变的光束路径(14)的透光区域(27)并且具有用于从照明光束路径(32)产生圆锥光束路径(13)的、面向扫描目镜(8)的至少部分反射区域(28)，其中，相对于圆锥光束路径(13)，扫描目镜(8)的成像平面(11)位于与物镜(1)的出射光瞳(2)共轭的平面中。

Description

用于渐逝照明和点状扫描照明的显微镜

技术领域

本发明涉及一种用于渐逝照明和点状扫描照明的显微镜，其中能够在这两种照明方式之间转换。本发明还涉及一种用于在所述照明方式之间转换的方法。

背景技术

从现有技术已知允许在物体的渐逝照明与点状扫描照明之间转换的显微镜。

WO 2005/031428 A1公开了一种具有渐逝样本照明的显微镜，该显微镜附加地包括用于操作样本的光学设备。在此，激光器用于产生照明光束，照明光束被聚焦到显微镜物镜的后光瞳面中。光束偏转装置用于调整该激光光束的焦点相对于物镜的光轴的横向距离，该光束偏转装置包括安装万向节的旋转镜。当焦点相对于物镜光轴的距离足够时，在样本固定器(例如盖玻片)与样本之间的界面上出现全反射。由此产生的渐逝场仅穿透样本的界面并且随着与该界面的距离指数地减小。由此激励位于样本界面中的荧光团，而背景荧光可以明显减小。由此改善了图像对比度。这种方法一般被称为全内反射荧光显微术(TIRFM，Total Internal ReflectionFluorescence Microscopy)。

用于操作样本的设备包括例如多线激光器，从其发射光谱中，可以使用声光可调滤波器(AOTF)选择具有期望波长的分量。通过另一光束偏转装置调整聚焦在样本中的操作光束的位置。

在实施例中，为了在操作照明与TIRF照明之间转换，铰链式反射镜被枢转至TIRF照明光束路径，以使得TIRF照明光束路径遇到铰链式反射镜的非反射背面并且被阻止进一步传播。铰链式反射镜在其枢转位置被配置以使得操作光束在铰链式反射镜处被反射并由此耦合至照明光束路径中。在另一实施例中，具有可选择的波长的单个激光光源不仅用于TIRF照明而且用于操作照明。在这种情况下，在两个照明模式之间转换通过仅仅将适应光学器件加入照明光束路径中来实现。该适应光学器件的作用是，针对TIRF照明，使激光束聚焦至显微镜物镜的后光瞳面中。在没有适应光学器件的情况下，相反地，激光束被聚焦至样本中。操作光束通常是用于(共焦)扫描显微术的激光扫描光束。

因此，在该文献中，为了在TIRF照明与操作照明之间转换，将光学组件(铰链式反射镜或者适应光学器件)加入照明光束路径中或者从该照明光束路径中移除。

共焦扫描显微镜一般包括光源、聚焦光学器件(通过它使光源的光聚焦在孔径(被称为“激励针孔”)上)、分束器、用于光束控制的光束偏转装置、显微光学器件、检测针孔、以及用于检测由样本发出的检测光/荧光的检测器。照明光经由分束器耦合。由物体发出的荧光或检测光经由光束偏转装置返回到分束器，通过分束器，并且之后被聚集在检测针孔上，检测器位于检测针孔后面。这种检测布置称为“退扫描(descan)”布置。不直接来自聚焦区的检测光不通过检测针孔，由此得到点信息，其通过利用照明光束的焦点顺序地扫描物体可以组成三维图像。三维图像通常通过在不同的焦面上分层地获取图像数据来实现。

US 7,187,494 B2的主题是具有激光源的显微镜，其中显微镜包括用于使激光束从光轴偏心的偏转单元和物镜，激光束穿过物镜。在示例性实施例中，为了在扫描显微术与TIRF显微术之间转换，提出了所谓的聚光透镜布置，它被配置为可加入到照明光束路径中并且从照明光束路径中移除。当聚光透镜布置在照明光束路径中时，激光光束偏心地聚焦在物镜的光瞳中(TIRF照明)，而当聚光透镜布置从照明光束路径中移除时，激光光束被聚焦在样本上并且扫描样本。

利用这种显微镜，已经证实不利的是，在TIRF显微术与扫描显微术之间的转换对于许多应用来说太慢，并且如果要实现在两种显微模式中的精确的光束引导，针对加入到照明光束路径中的元件的对准费用非常高。

WO 2007/020251 A1公开了一种用于TIRF显微术的显微镜，其中激光源的激光首先经由反射镜中的孔，并且之后经由调节单元朝向显微镜物镜引导。针对激光光束，在反射镜的非反射侧面上的孔作为普通的孔径开口，其直径对应于照明光线在反射镜的位置处的直径。反射表面位于反射镜的另一侧面上。通过调节单元，激光束得到其对于TIRF照明所必需的偏心。结果，激光束可以以临界角度入射到样本载体与物体之间的界面上。对于从折射率n₁＝1.518的盖玻片过渡到折射率n₂＝1.33的水，该临界角度的值例如为61°(全反射角)。

在实施例中，激光束利用调节单元相对于物体的主轴可旋转对称地引导，以使得在物体中由于全反射产生渐逝场。只有当已知样本的折射率时，可以计算为此所需的全反射角。然而，经常涉及通常具有未知折射率的不同样本。因此为了允许给出全反射角的经验指示，即允许自动地建立渐逝照明，该文献建议，检测在达到临界全反射角之前发生的反射光。该光通过显微镜物镜返回到调节单元，并且从调节单元进入到布置在照明光束路径中的反射镜的反射表面上。反射光从反射表面被反射到检测器中。当达到全反射角时，反射光的比例急剧减小，因为激光束现在在样本载体中在与物体的界面处被全反射，并且激励渐逝场。可以从该过渡确定全反射的位置，即为此必需的通过调节单元的偏转的程度。

目前在现代的、尤其倒置显微镜中，为了检查诸如细胞的生命系统，对于单个样本需要各种照明方法。为此通常，在时间顺序上以非常短的时间间隔切换具有不同波长的激光，以激励或操作样本并用于随后测量和评价。利用用于TIRF显微术和激光扫描显微术的上述系统，反射镜元件和/或透镜元件必须被机械地加入到照明光束路径中，或者从照明光束路径中移除。当借助这些可移动的光学元件将各个照明模块耦合在一起时，每个模块具有其特有的激光照明系统，并且它们为了实验必须经常费力地相互同步。光学元件的机械的加入和移除对在激励/操作与测量/评价之间的所期望的短的时间间隔具有负面的影响。此外，具有应用必需的精度的这种机械的切换和移动布置在机械上是复杂的并且相应地是昂贵的。

除了上述照明方法以外，下面还将提到光漂白之后的荧光恢复(FRAP)和荧光共振能量转移(FRET)。在FRAP中，在样本中的染料以高强度利用X-Y精度被破坏(漂白)，并且之后经由适合的照明(例如TIRF照明)激励相邻的隔间。如果被漂白和激励的隔间被连接，则染料可以通过扩散进入到漂白区域中。为了检测这一点，需要高的转换速率。

FRET方法使用荧光团，其中由于共振能量转移，供体被激励，并且受体发光。利用适合频率的精确的点激光扫描照明允许受体选择地被破坏(漂白)，而保留供体。

共振能量转移的强度尤其取决于供体与受体之间的距离。如果距离太大或者受体被漂白，则供体本身辐射能量作为荧光发射。共振能量转移所需的距离在大约0.5至10nm的范围内。在不存在和存在受体染料的情况下对供体染料的辐射强度的测量允许推断在样本中的生物化学过程。例如，供体或受体染料可以耦合至其物理相互作用将要被研究的物质。如果发生基于上述辐射强度可测量的能量转移，则两种物质是物理上相互作用的。与FRAP方法相比，在FRET方法需要更低的转换率，但是为了研究正在被检查的细胞中的生物化学过程，在分辨率方面存在更高的需求。

多光子显微术代表另一扫描成像方法。在此，借助于聚焦高能激光束产生非线性光学效应。多光子显微镜的构造和工作方式类似于共焦激光扫描显微镜的构造和工作方式。然而，共焦激光扫描显微镜(根据样本)实现50至80μm的穿透深度，而通过多光子显微术可以实现几百μm的穿透深度。这允许图像再现延伸至更深的组织区域中。在多光子荧光显微术中，两个或多个同时入射的光子被染料的电子吸收，并且随着短波光子的发射，实现至基态的过渡。另一方面，激励光子具有较长的波长。利用双光子激励，激励波长大致为在荧光显微术中通常使用的激励波长的两倍。

为了实现两个或多个光子的同时吸收，需要高光子密度，其可以通过使用高强度脉冲激光器来提供。如在共焦激光扫描显微镜的情况中那样，激光束通过显微镜的物镜被聚焦在样本中的一个点上。利用扫描单元在样本上扫描聚焦的激光束。发出的荧光辐射经由物镜和二向色分束器被引导到检测器。在两个激光脉冲之间的停歇时间足够长，以使得引入到样本中的能量可以在该时间的一部分中作为荧光辐射再次发射。因此，检测器测量每个图像点的亮度，以使得可以在扫描样本以后组成样本的完整图像。

与共焦激光扫描显微术相比，多光子显微术的优点是更高的穿透深度。在双光子显微术中，例如，用于激励的光是红外光，它在生物组织中比可见光少得多地被散射和吸收。与共焦激光扫描显微术相比，利用多光子显微术，所有被物镜收集的荧光都用于要创建的图像；因此不需要针孔来滤除来自其它平面的光。这是因为，在焦平面以外的光强不足以在其中引起荧光染料的多光子激励。因此也无需通过扫描反射镜捕捉荧光辐射(非退扫描检测)。利用短脉冲激光器和集成的检测器，这种系统可以组合作为TIRF和多光子系统。

本发明的目的是描述一种显微镜，该显微镜可以在无需光学元件至照明光束路径的机械引入或从照明光束路径的机械移除的情况下，在点状扫描照明(或“图像扫描”)与渐逝照明(或“光瞳扫描”)之间进行快速转换。下面针对点状扫描照明的照明光束路径被称为“无畸变的光束路径”，针对渐逝照明的照明光束路径被称为“圆锥光束路径”。

发明内容

该目的通过根据权利要求1所述的根据本发明的显微镜以及根据权利要求15所述的方法实现。根据本发明的显微镜包括物镜和照明单元，用于选择性地产生通过物镜延伸的用于物体的点状扫描照明的无畸变的光束路径和通过物镜延伸的用于物体的渐逝照明的圆锥光束路径。所述显微镜的照明单元包括用于产生沿着照明光束路径的照明光线的光源；用于偏转照明光束路径的调节单元；以及放置在调节单元的后面的扫描目镜，用于将照明光线聚焦在扫描目镜的成像平面中。所述调节单元(扫描器)从光轴引导照明光线，其中偏转的照明光线被扫描目镜聚焦在扫描目镜的成像平面中。

放置在调节单元后面的是静止的反射镜表面，其具有(至少部分)透光区域和(至少部分)反射区域。所述透光区域用于在照明光线穿过反射镜表面的透光区域以后产生无畸变的光束路径，而反射区域用于在照明光束路径在反射表面处偏转以后从照明光束路径产生圆锥光束路径。相对于圆锥光束路径，所述扫描目镜的成像平面位于与物镜的出射光瞳共轭的平面中。

根据本发明，利用所述的显微镜构造，可以通过以下产生无畸变的光束路径：利用调节单元偏转照明光束路径，以使得照明光束路径穿过反射镜表面的透光区域，而通过以下生成圆锥光束路径：利用调节单元偏转照明光束路径，以使得照明光束路径遇到反射镜表面的反射区域。

在相应的应用权利要求中描述本发明的有利应用。

从各个从属权利要求和下面的描述给出本发明的有利实施例。

本发明的优点

本发明允许在两种上述照明模式(图像扫描与光瞳扫描)之间快速转换，为此交换在反射镜表面中图像位置与光瞳位置。所述反射镜表面例如布置在扫描目镜的成像平面中。针对图像扫描，照明光束路径被调节单元(扫描器)偏转，以使得照明光线的焦点位于静止的反射镜表面的透光区域内。在简单的情况下，所述透光区域是反射镜表面中的开口。替代地，所述反射镜表面可以在透光区域具有高反射抑制涂层来代替镜面(即，高反射)涂层(诸如在反射区域中施加至载体玻璃上的涂层)，并且为此有效地具有与最大图像扫描场相同的尺寸，最大图像扫描场的边界通过至渐逝照明的过渡来限定。原因是，如果显微镜物镜(在这里为TIRF物镜)的出射光瞳通过放大至全反射的限制孔径(在这里约为1.37)而经由圆锥光束路径成像至扫描目镜的成像平面中，从而使其与最大图像扫描场一致；以及如果反射镜表面通过其透光区域(其尺寸与最大图像扫描场相同)以不同于0°的角度、适宜地以45°放置在扫描目镜的成像平面中，则用于产生渐逝照明的光线之后在透光区域以外在反射区域处被反射到圆锥光束路径中。

由此可以通过利用扫描器(调节单元)简单地控制扫描角度来在图像扫描与光瞳扫描之间转换。原因是，只要扫描角度位于照明光线位于反射镜表面的透光区域以内的范围，图像扫描(即点状扫描照明)就可以发生直到最大扫描场。只有当扫描角度变大时，光源的照明光线入射在反射镜表面的反射区域上并且导引到圆锥光束路径中，并且被成像，以使得照明光线被聚焦在物镜的物镜光瞳的外部区域上。

可以仅通过修改扫描角度来实现从图像扫描至光瞳扫描、即渐逝照明的过渡，而无需将光学组件加入到照明光束路径中或者从照明光束路径送出光学组件。根据本发明的显微镜的所有光学组件可以最初以永久的方式对准并且在使用显微镜时不需要进一步修改。另外，单个光源可以用于两个光束路径，结果复杂的同步和对准是多余的；还存在相应的成本优势。根据本发明的显微镜在单个系统中实现两个光束路径，该系统尤其可以通过具有集中式软件的单个计算机来控制。根据本发明的显微镜的另一优点是，正常的图像扫描也可以没有限制地通过使用其它物镜(即非TIRF物镜)直到最大扫描场。

因此，本发明不仅适用于在渐逝照明与点状扫描照明之间的快速转换，而且作为用于照片操作的通用模块。对此，可以参考在说明书引言中描述的方法，例如FRAP或FRET。此外可以设想短脉冲激光器(例如便宜的光纤激光器)与集成的检测系统(具有所谓的非退扫描检测器)的组合作为便宜的多光子成像系统。图像扫描模式中样本的扫描允许以多光子显微术的方式三维地成像样本。在此同样地，如上所述，在反射镜表面中的开口限制最大扫描场的尺寸。多光子显微术同样已经在说明书引言中解释过。总之，本发明可以在不同的扫描成像方法中使用，它们可以被细分为以下分组：共焦显微术(具有Z分辨率)，具有操作激光器的宽场显微镜，多光子显微术，和非共焦图像采集(没有Z分辨率)。上述宽场显微术可以分别与多光子显微术或者与非共焦图像采集(没有z分辨率)组合。

尤其有利的是，如果反射镜表面的透光区域表示原本反射的反射镜表面中的简单开口，则该开口相对于照明光束路径的主轴居中地布置。“照明光束路径的主轴”在该申请中理解为未偏转的照明光束路径的轴，即光轴。

为了有效地解耦在反射镜表面的反射区域上反射的光线，所述反射镜表面被布置为倾斜于照明光束路径的主轴，其中倾斜角度特别地为45°。

特别有利的是，如果反射镜表面的透光区域具有几何形状，该几何形状在垂直于照明光束路径主轴的平面上的投影得到圆形。这通过椭圆形的几何形状实现。椭圆轴的尺寸被设计以使得所述投影得到圆形。

超过特定扫描角度，照明光到达反射镜表面的反射区域并且被反射到圆锥光束路径中。在这种情况下，适宜的是，设有附加光学器件，用于将圆锥光束路径耦合到显微镜物镜中。这个附加光学器件特别地被设计，以使得圆锥光束路径的照明光线的焦点现在位于物镜的出射光瞳中、特别地在其边缘上。有利地，所述附加光学器件包括反射镜系统和光学系统，特别地以伯特兰透镜的形式。在经由反射镜系统朝显微镜物镜导引圆锥光束路径时，伯特兰透镜的成像被实现，以使得照明光线被聚焦在显微镜物镜的出射光瞳的边缘上。

已经证实特别有利的是，所述附加光学器件包括分束器，该分束器布置在无畸变的光束路径中，并且在两个光束路径穿过显微镜物镜以前，组合圆锥光束路径和无畸变的光束路径。

因此，合适的附加光学器件包括下面的光学组件：第一透镜，跟随有偏转反射镜，其使圆锥光束路径在基本平行于无畸变的光束路径的方向上偏转。跟随这个偏转反射镜的另一偏转反射镜，另一偏转反射镜使圆锥光束路径基本以90°偏转，以通过第二透镜。接着圆锥光束路径遇到布置在无畸变的光束路径中的分束器，该分束器允许无畸变的光束路径通过，而反射圆锥光束路径，以使得两个光束路径一起被导引到显微镜物镜。

在分束器的特定实施例中，使用极化分束器。在这种情况下，偏振激光可以用于照明，其中在两个光束路径的一个光束路径中加入λ/2板，用于相反地偏振相关的光束路径。利用上述的附加光学器件的构造，例如，λ/2板可以在圆锥光束路径中布置在两个偏转反射镜之间。偏振分束器根据偏振是透光或反射的。结果是以相同的波长实现光束分离，并且在所考虑的情况下，以相同的波长实现两个光束路径的组合。如果对于两个照明模式要使用不同的波长，则作为分束器可以使用相应的波长敏感的分束器。

此外有利的是，一个或多个用于产生特定波长光谱的照明光线的激光器被提出作为根据本发明的显微镜的照明单元的光源，则波长选择器被不知在照明光束路径中以用于选择合适的波长。所述波长选择器特别地是声光可调滤波器(AOTF)。这种AOTF允许非常快速地转换并由此选择特定的波长。这是因为，如果利用不同的波长实施两种照明模式，则在这些照明模式之间的根据本发明快速转换随着必需波长的转换同时发生。同时，AOTF也可以用作快速快门，即对于一种特定照明模式，可以将所需的波长注入照明光束路径中，并且对于另一照明模式，可以没有激光注入到照明光束路径中。这在方法转换期间是有意义的，例如在扫描器朝向圆锥光束路径移动时关闭激光的情况下。此外，除了准确定位调节单元以外，精确地操作样本也要求在移动至操作区域期间抑制激光。

用于偏转照明光束路径的调节单元(扫描器)特别地被实现，以使得可以实施圆形偏转。在这种情况下，可以实现关于物镜的主轴可旋转地对称的TIRF照明。然而，此外，在图像扫描场内照明时，也可以实现斜照明(“落射照明”(epi-illumination))，它例如也可以沿着圆形轨迹实现，以使得出现随时间平均化的经典的落射照明。

关于根据本发明的方法，用于选择性地产生无畸变的光束路径和圆锥光束路径，特别地用于在这些光束路径之间快速转换，可以参照上面的描述。同样适用于根据本发明的显微镜的根据本发明应用和根据本发明的方法。在这里所述的本发明的特征对于前述本发明的方面具有相同的重要性。

通过说明书和附图给出本发明的其它优点和实施例。

可以理解，在不背离本发明的范围的情况下，以上详述的和下面还要解释的特征不仅在所给出的相应组合中使用，而且也可以以其它的组合或者单独地使用。

本发明基于示例性实施例在附图中示意性地示出，并且在下文参考附图详细描述。

附图说明

图1示出根据本发明的显微镜的照明单元的示意构造；

图2示出具有用于宽场显微术的照明单元的根据本发明的显微镜；以及

图3示出具有用于共焦显微术的照明单元的根据本发明的显微镜。

具体实施方式

图1示出用于选择性地产生无畸变的光束路径14和圆锥光束路径13的照明单元的特别优选的实施例，其可以在相应的照明模式之间进行快速转换。为此，照明单元31包括激光器10作为光源，跟随声光可调滤波器(AOTF)作为波长选择器9。根据具体的应用，可以利用AOTF 9从激光器10的波长光谱中选择期望波长。照明光线(激光)沿着照明光束路径32传播并且入射到调节单元7，调节单元7也称为“扫描器”。由现有技术已知用于照明光束路径32的高度精确的调节的X-Y扫描器。图1示意性地示出两个可能的照明光束路径32，其中两个照明光束路径32的一个照明光束路径沿着主轴33(光轴)传播，而另一照明光束路径在最大可能的图像扫描场的边缘处延伸。照明光线由扫描目镜8聚焦在扫描目镜8的成像平面11中，在那里布置反射镜表面6，也称为扫描反射镜或环形反射镜。

在这个实施例中，反射镜表面6由环形反射镜、即反射环形表面28组成，它包围透光开口27。因此，穿过该开口27的照明光线沿着无畸变的光束路径14传播。它们(基本上)无阻碍地通过分束器3并且通过扫描透镜15和显微镜30(在这里仅初步地示出)的物镜1在物体平面中聚焦在物体上。可以利用照明光束路径32的X-Y调节来扫描最大图像扫描场以及由此物体上的相应场。因此，无畸变的光束路径能够实现物体的点状扫描照明。最大图像扫描场通过反射镜6中的开口27确定。

如果扫描角超过特定值，则照明光束路径在开口27外部到达环形反射镜6的反射区域28。激光束12在反射表面处反射以后，经由附加光学器件29沿着圆锥光束路径的主轴13传播。附加光学器件29包含反射镜系统5和光学系统4a、4b，通过附加光学器件29，圆锥光束路径再次与无畸变的光束路径在扫描透镜15的上游组合。光学系统4a、4b被设计以使得显微镜物镜1(在该情况下为TIRF物镜)的出射光瞳2通过放大至全反射的限制孔径(在这里约为1.37)而成像至扫描目镜8的成像平面11中，从而使其与最大图像扫描场一致。这确保了，只要调节单元7的扫描角度达到照明光束路径32遇到反射镜表面6的反射区域28的值，就发生渐逝照明。在最大图像扫描场内，也可以通过使用不同的物镜1没有限制地进行正常的图像扫描。

附加光学器件29有利地包含在此由两个偏转反射镜组成的反射镜系统5，以及具有伯特兰透镜单元的功能的光学系统4a和4b，。

在反射镜表面6中的开口27有利地是椭圆形的，以使得开口27在垂直于主轴33的平面上的投影得到圆形的图像扫描场。在该示例性实施例中，所有反射表面相对于各自的主轴倾斜45°，由此在反射镜表面处发生光束路径的基本90°反射。

在许多应用情况下，点状扫描照明以不同于渐逝照明的波长实现。在这种情况下，在必需的波长之间的转换通过AOTF 9以非常短的转换时间进行。也可以设想其中两个照明模式以相同波长实施的应用。此外可以设想实施例，其中(可能除了其它照明模式)间歇地需要仅点状扫描照明，或者仅渐逝照明。对于这种情况，AOTF 9可以作为快门操作，其根据需要选择或阻挡合适的波长。

分束器3可以是波长特定分束器或者偏振分束器。如果对于光束路径13和14需要不同的波长，则波长特定分束器3是合适的。相反，如果也需要提供可能的相同波长的情况，则可以使用偏振分束器作为分束器3。为此使用偏振激光，其偏振方向例如在沿着无畸变的光束路径14传播时无阻碍地通过分束器3。另一方面，在圆锥光束路径13中，优选地在反射镜系统5的两个偏转反射镜之间加入λ/2板。这导致偏振方向的90°旋转。构成偏振分束器的分束器3针对该偏振方向是反射的。这两个光束路径由此再次组合，如图1所示。

图2示出宽场显微镜的实施例，具有与其适配的照明单元31，其中照明单元31的通常构造与图1的构造一致。因此不再说明相互一致的组成部分。

显微镜30的重要组成部分(除了照明单元31以外)在图2中示出显微镜物镜1、镜筒透镜19以及分束器20，分束器20将观察光束路径分割成视觉光束路径21和记录光束路径22。视觉光束路径21被导引到显微镜30的(未示出的)目镜，而记录光束路径22通常导引到照相机。在这里所考虑的应用情况下，为了使照明光束路径与观察光束路径分开，设有特定的荧光滤波器块17。数字16表示显微镜的标准荧光入射光轴，其经由接口18耦合至显微镜中。在18’提供另一接口，它可以用于耦合附加的照明单元。

通过荧光入射光轴16和反射镜24使激励光以常见的方式通过荧光滤波器块引导至显微镜物镜1。由物体发出的荧光再次通过显微镜物镜1和荧光滤波器块17到达镜筒透镜19，并且从那里进入视觉光束路径或记录光束路径。

圆锥的和无畸变的光束路径通过转换反射镜34引导至物镜1。反射镜34也可以在省略任何转换的情况下固定地实现为二向色或者偏振的分束器。两个光束路径的操作的方式已经被描述并且不再解释。荧光显微镜可以通过这种方式与TIRF显微镜、操作显微镜和多光子显微镜组合或扩展至包括TIRF显微镜、操作显微镜和多光子显微镜。

图3示出源自图1中所示的共焦显微镜的示意构造的另一可能的布置。

荧光轴仍然以16表示，荧光滤波器块以17表示。由物体发出的荧光仍然通过显微镜物镜1和荧光滤波器块17到达镜筒透镜19，并且从那里到达视觉光束路径或记录光束路径(参见图2的解释)。将光谱分束器25和共焦检测光束路径26加入照明单元31以扩展成共焦扫描显微镜。根据已知的共焦显微术原理，实现利用共焦成像的图像生成。在本实施例中，调节单元7具有共焦扫描反射镜和退扫描反射镜的功能，它将激励光以位置准确的方式导引到样本，并且使检测光经由光谱分束器25引导回至静止定位的共焦检测器26。

在通过圆锥光束路径13导引激励光的情况下，从样本发出的、散射或者反射的光的检测借助于传统的成像导引到记录光束路径22中。

以这种形式，荧光显微镜可以与TIRF显微镜、操作显微镜、多光子显微镜和共焦扫描显微镜组合或扩展至包括这些显微镜。

部件列表

1 物镜

2 出射光瞳

3 分束器

4a,4b 光学系统(伯特兰透镜单元)

5 反射镜系统

6 反射镜表面

7 调节单元，扫描器

8 扫描目镜

9 波长选择器，AOTF

10 光源，激光

11 扫描目镜的成像平面

12 激光束

13 圆锥光束路径

14 无畸变的光束路径

15 扫描透镜

16 荧光入射光轴

17 荧光滤波器块

18,18’ 用于其它照明单元的接口

19 镜筒透镜

20 分束器

21 视觉观察光束路径

22 记录光束路径

23 共焦接口

24 反射镜

25 光谱分束器

26 共焦检测光束路径

27 透光区域，开口

28 反射区域

29 附加光学器件

30 显微镜

31 照明单元

32 照明光束路径

33 照明光束路径的主轴

Claims (18)

1.一种显微镜(30)，包括物镜(1)和照明单元(31)，用于选择性地产生通过所述物镜(1)延伸的用于物体的点状扫描照明的无畸变的光束路径(14)和通过所述物镜(1)延伸的用于物体的渐逝照明的圆锥光束路径(13)，其中，所述照明单元包括：

光源(10)，用于产生沿着照明光束路径(32)的照明光线；

调节单元(7)，用于偏转所述照明光束路径(32)；

扫描目镜(8)，放置在所述调节单元(7)的后面，用于将照明光线聚焦在所述扫描目镜(8)的成像平面(11)中；以及

反射镜表面(6)，布置在所述扫描目镜(8)的成像平面(11)中，所述反射镜表面(6)具有用于产生无畸变的光束路径(14)的透光区域(27)并且具有用于从所述照明光束路径(32)产生圆锥光束路径(13)的、面向所述扫描目镜(8)的至少部分反射区域(28)，

其中相对于所述圆锥光束路径(13)，所述扫描目镜(8)的成像平面(11)位于与所述物镜(1)的出射光瞳(2)共轭的平面中。

2.根据权利要求1所述的显微镜，其中，所述反射镜表面(6)的透光区域(27)表示反射镜中的开口，其中所述开口相对于所述照明光束路径(32)的主轴(33)居中地布置。

3.根据权利要求1或2所述的显微镜，其中，所述反射镜表面(6)被布置为倾斜于所述照明光束路径(32)的主轴(33)。

4.根据权利要求3所述的显微镜，其中，所述反射镜表面(6)被布置为以45°倾斜于所述照明光束路径(32)的主轴(33)。

5.根据前述权利要求中任一项所述的显微镜，其中，所述反射镜表面(6)的透光区域(27)具有几何形状，该几何形状在垂直于所述照明光束路径(32)主轴的平面上的投影得到圆形。

6.根据权利要求5所述的显微镜，其中，所述反射镜表面(6)的透光区域具有椭圆形的几何形状。

7.根据权利要求5或6所述的显微镜，其中，所述透光区域(27)在所述平面上的投影在所述圆锥光束路径(13)中的全反射的限制孔径处与所述物镜(1)的出射光瞳(2)的图像一致。

8.根据前述权利要求中任一项所述的显微镜，其中，附加光学器件(29)被设置用于将所述圆锥光束路径(13)耦合至显微镜的物镜(1)中。

9.根据权利要求8所述的显微镜，其中，所述附加光学器件(29)包括反射镜系统(5)和匹配的光学系统(4a,4b)，其被设计为使得所述圆锥光束路径(13)的照明光线的焦点位于所述物镜(1)的出射光瞳(2)中。

10.根据权利要求9所述的显微镜，其中，所述匹配的光学系统包括两个伯特兰透镜(4a,4b)。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的显微镜，其中，所述附加光学器件包括分束器(3)，所述分束器(3)布置在所述无畸变的光束路径(14)中并且将所述圆锥光束路径(13)与所述无畸变的光束路径(14)组合。

12.根据权利要求11所述的显微镜，其中，所述分束器(3)是偏振分束器，其中λ/2板被布置在所述无畸变的或者在圆锥的光束路径(13；14)中。

13.根据前述权利要求中任一项所述的显微镜，其中，一个或多个用于产生特定波长光谱的照明光的激光器作为光源(10)存在，其中波长选择器(9)被布置在所述照明光束路径(32)中。

14.根据权利要求13所述的显微镜，其中，所述波长选择器(9)是声光可调滤波器(AOTF)。

15.一种方法，用于选择性地产生通过显微镜(30)的物镜(1)延伸的用于物体的点状扫描照明的无畸变的光束路径(14)和通过所述物镜(1)延伸的用于物体的渐逝照明的圆锥光束路径(13)，其中，

通过光源(10)产生沿着照明光束路径的照明光线；

通过调节单元(7)偏转照明光束路径(32)；

利用放置在所述调节单元(7)后面的扫描目镜(8)将所述照明光线聚焦在扫描目镜(8)的成像平面(11)中；以及

具有透光区域(27)并且具有面向所述扫描目镜(8)的至少部分反射区域(28)的反射镜表面(6)布置在所述扫描目镜(8)的成像平面(11)中，

所述扫描目镜(8)的成像平面(11)相对于所述圆锥光束路径(13)位于与所述物镜(1)的出射光瞳(2)共轭的平面中，以及

所述无畸变的光束路径(14)通过以下方式产生：利用所述调节单元(7)偏转照明光束路径，以使得照明光束路径穿过所述反射镜表面(6)的透光区域(27)，并且所述圆锥光束路径(13)通过以下方式产生：利用所述调节单元(7)偏转照明光束路径(32)以使得照明光束路径到达所述反射镜表面(6)的反射区域(28)。

16.根据权利要求1至14中任一项所述的显微镜或者根据权利要求15所述的方法用于在所述显微镜(30)中在物体的点状扫描照明与渐逝照明之间快速转换的应用。

17.根据权利要求16所述的应用，其用于扫描成像方法。

18.根据权利要求17所述的应用，其中所述扫描成像方法是以下方法中的至少一种方法：全内荧光显微术(TIRFM)、扫描显微术、共焦扫描显微术、FRAP(光漂白之后的荧光恢复)、FRET(荧光共振能量转移)和多光子显微术。