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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur simultanen Fluoreszenz-Kontrastgebung in Durchlicht und Auflicht mit einem Auflichtstrahlengang zur Fokussierung des Anregungslichtes über ein Objektiv auf eine Probe.
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In den Biowissenschaften spielt die Mikroskopie eine wichtige Rolle. Biologische Proben können auf unterschiedlichsten Probenträgern vorliegen, beispielsweise zwischen Objektträger und Deckglas, in Petrischalen oder Mikrotiterplatten. Sie können noch lebend oder fixiert, ungefärbt oder gefärbt sein.
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Grundsätzlich können sie im Durchlicht oder Auflicht beobachtet werden.
Bei Durchlichtbeleuchtung durchstrahlt das von einer Lichtquelle ausgesandte Licht die Probe und wird vom Objektiv aufgefangen und weiter zu einem Detektor geleitet. Ein Teil des Lichts wird durch die Probe absorbiert, gestreut oder gebrochen, was sich in einem Intensitätskontrast auf dem Detektor äußert. Absorbiert die Probe kein oder kaum Licht, was bei dünnen biologischen Präparaten häufig der Fall ist, insbesondere wenn sie ungefärbt sind, kann durch eine Reihe von Kontrastverfahren (Phasenkontrast, Differenzieller Interferenzkontrast - DIC, etc.) die Phasenstruktur der Probe sichtbar gemacht werden. All diesen Verfahren ist gemein, dass sie zwar die Form von biologischen Proben wie beispielsweise Zellen sowie einige ihrer Bestandteile (Zellkern u.a.) darstellen können, häufig jedoch keine funktionellen Aussagen möglich sind.
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Fluoreszenzfarbstoffe erlauben es dagegen, gezielt bestimmte Zellbestandteile anzufärben. Zur Bildgebung werden die Farbstoffe mit Licht geeigneter Wellenlänge angeregt, was üblicherweise durch eine Auflichtbeleuchtung geschieht, bei der das Beleuchtungslicht durch das Objektiv auf den beobachteten Probenbereich fokussiert wird.
Das Fluoreszenzsignal - rotverschoben gegenüber dem Anregungslicht - wird durch dasselbe Objektiv aufgenommen, mittels eines Dichroiten und passenden Filtern vom Anregungslicht getrennt und zur Kamera oder den Okularen geführt. Aus den Fluoreszenzbildern lassen sich Aussagen über Funktionen und Funktionsänderungen in den Zellen ableiten. Hierbei fehlt jedoch meist eine Auskunft über die Zellform als Ganzes.
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Vorteilhaft ist deshalb, Durchlicht- und Fluoreszenzaufnahmen miteinander zu kombinieren, da die entsprechenden Bilder sich in ihren Aussagen ergänzen. Dazu sind üblicherweise zwei voneinander getrennte Beleuchtungssysteme notwendig, die sequenziell betrieben werden. So kann beispielsweise zunächst ein Durchlichtbild einer Probe aufgenommen werden und anschließend ein Fluoreszenzbild. Um Zeit zu sparen, können Durchlicht- und Fluoreszenzaufnahmen auch parallel ausgeführt werden. Dazu sind zum einen zwei Kameras erforderlich. Zum anderen muss die Wellenlänge des Durchlichts eine andere sein als die des Fluoreszenzsignals, damit beide Signale mittels eines dichroitischen Spiegels voneinander getrennt werden können. Der zeitliche Gewinn wird also mit einem erheblich komplexeren Aufbau erkauft.
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Von Vorteil wäre es, Durchlicht- und Fluoreszenzaufnahmen miteinander zu kombinieren, ohne dabei Zeitverluste oder deutlich komplexere Aufbauten in Kauf nehmen zu müssen.
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In
US 4 515 445 A ist beispielsweise ein Verfahren offenbart, bei dem eine Auflichtbeleuchtung auf die Probe gelenkt wird.
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Der durch die Probe transmittierte Teil des Lichts wird durch einen Spiegel in einer zur Probenebene konjugierten Ebene zurückreflektiert und fungiert damit beim zweiten Probendurchgang als Durchlicht. Im Ergebnis entsteht ein Bild, welches sowohl durch Durchlichtanteile als auch durch von der Probe reflektiertes Licht entsteht. Dieses Verfahren ist jedoch nicht für Fluoreszenzaufnahmen geeignet, da zwar ein dichroitischer Spiegel in den Strahlengang eingebracht werden kann, der das von den Fluorophoren emittierte Licht vom Anregungslicht trennt, aber auch das Durchlicht beim zweiten Probendurchgang herausfiltern würde. Der Vorteil eines solchen Verfahrens bestünde lediglich darin, das Licht, welches beim ersten Probendurchgang nicht zur Anregung der Fluorophore genutzt wurde, erneut auf die Probe zu lenken, um so die Anregungsintensität zu erhöhen. Das Ergebnis ist jedoch ein übliches Fluoreszenzbild.
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Eine andere Lösung wird in Ding et al., Optics Express 20, 14100-14108 (2012) beschrieben. In einer Laser-Scanning-Konfiguration wird die Probe Punkt für Punkt, aber jeweils schief beleuchtet. Hinter der Probe befindet sich eine fluoreszierende Schicht, die vom Laserlicht, welches die Probe passiert, angeregt wird und ihrerseits ein Fluoreszenzsignal aussendet. Dieses Signal wiederum dient als Durchlicht, wenn es durch die Probe vom Objektiv aufgefangen und Richtung Detektor geleitet wird. Dadurch, dass das Anregungslicht schief auf die Probe fällt, regt es in der Fluorophorschicht hinter der Probe auch eine Region an, die versetzt zur optischen Achse liegt. Das von dort ausgesandte Durchlicht passiert den gescannten Probenpunkt somit auch unter eben diesem Winkel. Im Ergebnis entsteht ein Bild, das dem einer klassischen schiefen Beleuchtung ähnelt. Wenn die Probe selbst auch fluoresziert, kommt zusätzlich noch das Fluoreszenzsignal der Probe zum Bild dazu. Allerdings ist ein solcher Aufbau sehr aufwändig und teuer.
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Weitere Lösungen, mittels denen, insbesondere in einem Mikroskop, sowohl eine Auflicht- als auch eine Durchlichtbeleuchtung realisiert werden können, sind beispielsweise aus der
DE 1 083 065 A1 und
WO 91/19218 A1 bekannt. Bei diesen sind polarisationsdrehende optische Bauteile im Auflichtstrahlengang erforderlich. Die Verwendung eines Spiegels ist beispielsweise in der
DE 199 42 998 B4 beschrieben. Die Möglichkeit einer Durchlicht-Dunkelfeldbeleuchtung in einem Auflichtfluoreszenzmikroskop ist in der
DE 25 46 079 A1 offenbart. Gemäß weiterer bekannter Lösungen kann zwischen den beiden Beleuchtungsarten wahlweise geschalten werden (zum Beispiel:
EP 1 273 952 A2 ).
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Ausgehend von den Nachteilen der Lösungen des Standes der Technik liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur simultanen Fluoreszenz-Kontrastgebung in Durchlicht und Auflicht dahingehend weiter zu entwickeln, dass der apparative Aufwand reduziert wird und die Lösung auch für Weitfeldsysteme einsetzbar ist.
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Diese Aufgabe wird mittels einer Vorrichtung der eingangs beschriebenen Art erfindungsgemäß mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen 2 bis 11 angegeben.
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Eine erste Ausführungsvariante verfügt über einen herkömmlichen Auflichtstrahlengang, bei dem das Anregungslicht durch das Objektiv auf die Probe fokussiert wird und das Fluoreszenzsignal der Probe durch dasselbe Objektiv aufgefangen wird, mittels eines Dichroiten und eines Emissionsfilters vom Anregungslicht getrennt und mit einer Detektionseinheit, vorteilhafterweise mit einer Kamera, detektiert wird.
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Im Auflichtstrahlengang kann sich vorteilhafterweise ein Anregungsfilter befinden, der den Wellenlängenbereich des Anregungslichts kontrolliert. Zusätzlich verfügt die Vorrichtung über eine lumineszierende Schicht in einem geeigneten Abstand hinter der Probe, welcher ein ausreichend starkes, durch die lumineszierende Schicht verursachtes Signal zulässt. Zwischen Probe und Lumineszenzschicht liegt außerdem eine Blende, die jedoch den Strahlengang zur lumineszierenden Schicht hin nicht komplett abdeckt. Das Anregungslicht, das die Probe passiert, wird dann größtenteils von dieser Blende blockiert, aber ein kleiner Teil erreicht seitlich die Lumineszenzschicht.
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Die angeregten Teile der lumineszierenden Schicht emittieren Lumineszenzlicht, welches wiederum seitlich an der Blende vorbei die Probe erreicht. Dies geschieht unter einem gewissen Winkel, so dass dieses Licht ähnlich einer schiefen Durchlichtbeleuchtung wirkt. Da es sich aber um Lumineszenzlicht handelt, kann es den Dichroiten sowie den Emissionsfilter passieren und zur Kamera gelangen.
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Das aufgenommene Kamerabild weist Ähnlichkeiten zum Kontrast einer schiefen Beleuchtung sowie Fluoreszenzsignale der Probe selbst auf. Wenn die Probe selbst nicht fluoresziert, verbleibt lediglich der Eindruck einer schiefen Beleuchtung.
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Um den optimalen Kontrasteindruck einstellen zu können, ist die Blende in einer vorteilhaften Ausgestaltung verstellbar angeordnet (beispielsweise um eine geeignete Achse drehbar, verschiebbar oder beides), so dass sie einen mehr oder weniger großen Anteil des Beleuchtungslichts blockiert. Auf diese Weise lässt sich der Winkelbereich, unter dem das Beleuchtungslicht auf die lumineszierende Schicht trifft, sowie der Winkelbereich, unter dem das Lumineszenzlicht als Durchlicht die Probe passiert, beeinflussen. Diese Einstellung ist insbesondere abhängig von der numerischen Apertur des Objektivs. Diese gibt den maximalen Strahlwinkel zur optischen Achse an, der vom Objektiv aufgefangen werden kann. Je größer die numerische Apertur ist, desto größer ist dieser Grenzwinkel. In Abhängigkeit davon kann die Blende die Lumineszenzschicht so abdecken, dass größere Einfallswinkel genutzt werden können.
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Die Einstellung der Blende kann dabei manuell oder motorisch erfolgen.
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Als vorteilhaft erweist sich eine breitbandig lumineszierende Schicht, da sie für unterschiedliche Anregungswellenlängen verwendet werden kann. Wenn die Vorrichtung aber hauptsächlich für nicht lumineszierende Proben eingesetzt werden soll, kann auch eine Schicht verwendet werden, die nur von einem engen Wellenlängenbereich angeregt werden kann, und eine dazu passende Beleuchtungswellenlänge gewählt werden. Gleiches gilt, wenn die Proben nur in einem eng begrenzten Wellenlängenbereich fluoreszieren.
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Wird ein zweites Bild aufgenommen, bei dem die Blende die lumineszierende Schicht so weit abdeckt, dass kein Auflicht sie mehr erreicht, so enthält dieses Bild ausschließlich den Fluoreszenzanteil der Probe selbst. Weiterhin kann dieses Bild von dem Bild mit teilweise geöffneter Blende abgezogen werden, um ein Durchlichtbild mit schiefen Beleuchtungsanteilen zu erhalten.
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Eine zweite Ausführungsvariante ist für Mikroskope mit Auflicht- und Durchlichtstrahlengang geeignet und kommt völlig ohne zusätzliche Elemente im Strahlengang aus.
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Lichtquellen für Durchlichtbeleuchtungen sind zunehmend Weißlicht-LEDs. Diese bestehen aus einer LED, die im blauen oder UV-Spektralbereich emittiert, sowie einer lumineszierenden Schicht, die breitbandig emittiert. Das resultierende Licht ist dann eine Mischung aus der LED-Anregungswellenlänge und der Lumineszenz der Schicht. Diesen Aufbau macht sich die zweite Ausführungsvariante der erfindungsgemäßen Vorrichtung zunutze. Wird die Probe mittels Auflicht angeregt, passiert ein Großteil des Lichts die Probe und durchläuft den gesamten Durchlichtstrahlengang in umgekehrter Richtung, bis es auf die Weißlicht-LED trifft. Dort regt es die lumineszierende Schicht an, die wiederum Licht aussendet, welches dann als Durchlicht die Probe erneut passiert und zur Kamera geleitet wird. Dieser Weg wird üblicherweise durch eine Blende im Durchlichtstrahlengang blockiert, da die Reflexe der verschiedenen Grenzflächen im Durchlichtstrahlengang sowie die Lumineszenz der Weißlicht-LED Störquellen sind, die nach Möglichkeit unterdrückt werden. Wenn diese Blende jedoch nicht komplett geschlossen wird, kann ein Teil des Auflichts den Durchlichtstrahlengang passieren und die lumineszierende Schicht der Weißlicht-LED anregen. Das daraus resultierende Licht durchläuft dann in gewohnter Weise den Durchlichtstrahlengang, und ein kleiner Teil erreicht an der nicht komplett geschlossenen Blende vorbei die Probe ungefähr vergleichbar einer schiefen Beleuchtung und liefert schließlich auf der Kamera ein entsprechend kontrastiertes Durchlichtbild.
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In Analogie zur ersten Ausführungsvariante lässt sich der Kontrasteindruck auch hier optimieren, indem die Blende in Abhängigkeit von der numerischen Apertur des Objektivs und der Probe unterschiedlich weit geschlossen wird. Ebenso behalten auch die Überlegungen zur Separierung des Durchlichtkontrast- und des Proben-Fluoreszenzsignals ihre Gültigkeit. Selbstverständlich kann auch ein Bild mit komplett geschlossener Blende aufgenommen werden, das nur den Fluoreszenzanteil der Probe selbst enthält.
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Eine Möglichkeit der kontrollierten Auswahl von Durchlicht mit einem bestimmten Bereich der numerischen Apertur unter der Bedingung der herkömmlichen schiefen Beleuchtung besteht darin, eine entsprechend variable Blende in der Aperturblendenebene (oder einer hierzu konjugierten Ebene) des Durchlichtstrahlengangs einzusetzen. Diese Variante hätte gegenüber der Blendenposition unterhalb der Objektebene jedoch den Nachteil, dass unerwünschte Reflexe und möglicherweise sogar Eigenfluoreszenz durch die zwischen der Objektebene und der Blende für schiefe Beleuchtung durchstrahlten optischen Komponenten im Lichtweg nicht unterdrückt werden können.
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Es steht hier die Frage, weshalb man nicht die Weißlicht-LED in der üblichen Weise als Durchlichtquelle verwendet und stattdessen den Umweg geht, ihre lumineszierende Schicht durch die Auflichtbeleuchtung anzuregen.
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Natürlich wäre auch der direkte Weg möglich. Die Blende des Durchlichtstrahlenganges könnte in der beschriebenen Weise zum Teil geschlossen werden, um eine Art von schiefer Beleuchtung zu erzielen.
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Die Verwendung der Auflichtbeleuchtung hat demgegenüber einen Vorteil. Das Fluoreszenzsignal der Probe ist typischerweise viele Größenordnungen kleiner als die Intensität des Anregungslichts. Dadurch, dass dasselbe Anregungslicht sowohl für die Probe selbst als auch für die lumineszierende Schicht der Weißlicht-LED verwendet wird, liegen auch die daraus resultierenden Signale meist in derselben Größenordnung. Das ermöglicht die simultane Aufnahme beider Signale oder alternativ, falls die Blende einmal komplett geschlossenen ist und einmal einen begrenzten Zugang zum Durchlichtstrahlengang freigibt, die schnelle Aufnahme zweier Bilder, davon eins nur mit dem Fluoreszenzanteil der Probe selbst und eins mit beiden Fluoreszenzanteilen, ohne dass dazu irgendwelche weiteren Elemente im Strahlengang geschaltet werden müssen.
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Würde die Weißlicht-LED selbst als Lichtquelle für das Durchlicht fungieren, lieferte sie eine deutlich höhere Intensität als die Fluoreszenz der Probe, und es müsste entweder ein zusätzlicher Absorptionsfilter in den Durchlichtstrahlengang eingebracht werden oder man müsste die Belichtungszeit der Kamera separat anpassen.
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Die Stärke des Absorptionsfilters müsste darüber hinaus auch an jede Wellenlänge der Auflichtbeleuchtung separat angepasst werden. Dieser gesamte Aufwand entfällt durch die erfindungsgemäße Vorrichtung, da die Auflichtbeleuchtung selbst die lumineszierende Schicht der Weißlicht-LED anregt.
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Der einzige apparative Eingriff, der nötig ist, um ein solches Standardmikroskop mit Durchlicht- und Auflichtstrahlengang im Sinne der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu nutzen, besteht darin, die Blende im Durchlichtstrahlengang so abzuwandeln, dass diese den Durchlichtstrahlengang seitlich öffnen, aber auch zunehmend bis zur vollständigen Abdeckung blockieren kann.
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Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung besteht darin, an geeigneter Stelle eine variable, drehbare Blende zu verwenden, um aus dem Durchlichtstrahlengang einen Strahlengang nach Art einer schiefen Beleuchtung oder dazu ähnlich mit einem variabel großen Lichtbündel aus unterschiedlichen Richtungen erhalten zu können, um damit wiederum je nach Struktur des Präparats den bestmöglichen Bildeindruck zu erzielen. Die drehbare Blende könnte beispielsweise so ausgestaltet sein, dass sie sich einerseits in einem Einsatz befindet, in welchem sie um ihren Mittelpunkt gedreht werden kann, und dass sie andererseits innerhalb der Ebene, in welcher sie angeordnet ist, in x- und y-Richtung aus der Mitte, die der optischen Achse entspricht, heraus verschoben werden kann. Der äußere Teil der Blende muss dabei so gestaltet sein, dass dieser an einer Seite - je nach Verschiebung aus der Mitte heraus - unterschiedlich viel Fläche zur lumineszierenden Schicht hin freigibt. Durch die Verschiebung der Blende kann der Lichtweg zur Schicht auch ganz abgedeckt werden.
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In einer anderen vorteilhaften Ausführung könnte die gesamte Blende exzentrisch um eine Achse geschwenkt werden, die nicht der optischen Achse entspricht. Durch entsprechend angepasste Blendenkonturen und geeignete Positionierung der Blende im Strahlengang kann man somit ebenfalls erreichen, dass ein Lichtbündel nach Art einer schiefen Beleuchtung oder davon abgewandelt aus unterschiedlichen Richtungen (aber nicht symmetrisch zur optischen Achse) auf das Präparat gelangt. Auch in dieser Variante kann durch eine entsprechende Blendenform der Lichtweg zur lumineszierenden Schicht vollständig unterbrochen werden.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Dazu zeigen:
- 1: eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einer lumineszierenden Schicht,
- 2: eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einer lumineszierenden Schicht als Bestandteil einer Durchlichtbeleuchtung,
- 3: die schematische Darstellung eines Hirnschnittes nach der Vorrichtung nach 2,
- 4: eine schematische Darstellung des Intensitätsprofils,
- 5: eine schematische Darstellung der Blende und
- 6: schematische Darstellungen der Abdeckung des Strahlenbündels.
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1 zeigt die erfindungsgemäße Vorrichtung mit einem allgemein bekannten Auflichtstrahlengang zur Fokussierung des von einer Beleuchtungsquelle 1 ausgehenden und über ein Objektiv 2 in die Probenebene 3 gelangenden Anregungslichtes. Hinter der Probenebene 3 befindet sich eine breitbandig lumineszierende, beispielsweise eine fluoreszierende Schicht 4. Zum Zwecke der teilweisen Abdeckung des durch die Probenebene 3 auf die lumineszierende Schicht 4 treffenden Anregungslichtes befindet sich zwischen der Probenebene 3 und der lumineszierenden Schicht 4 eine um eine geeignete Achse drehbare und/oder in x- und y- Richtung, das heißt in der Ebene senkrecht zur Drehachse verschiebbare Blende 5, die zusätzlich auch in z-Richtung, das heißt parallel zur Drehachse verschiebbar ausgestaltet sein kann.
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Das Fluoreszenzsignal einer in der Probenebene 3 angeordneten Probe wird durch dasselbe Objektiv 2 aufgefangen, mittels eines Dichroiten 6 und eines Emissionsfilters 7 vom Anregungslicht getrennt und über eine Tubuslinse 8 von einer als Kamera 9 ausgebildeten Detektionseinheit detektiert. Im Auflichtstrahlengang befindet sich ein Anregungsfilter 10, der den Wellenlängenbereich des Anregungslichtes kontrolliert.
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Das Anregungslicht, das die Probe passiert, wird größtenteils von der Blende 5 blockiert, während ein kleiner Teil seitlich an der Blende 5 vorbei auf die lumineszierende Schicht 4 trifft. Die angeregten Teile der lumineszierenden Schicht 4 emittieren das Lumineszenzlicht, welches wiederum seitlich an der Blende 5 vorbei die Probe erreicht. Dies geschieht unter einem schematisch angedeuteten Winkel α in Abhängigkeit von der Ausgestaltung der Blende 5 und der numerischen Apertur des verwendeten Objektivs, so dass das Licht 11 ähnlich einer schiefen Durchlichtbeleuchtung wirkt.
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Bedingt durch die verstellbare Blende 5 lässt sich der Winkelbereich, unter dem das Beleuchtungslicht auf die lumineszierenden Schicht 4 trifft, sowie der Winkelbereich, unter dem das Lumineszenzlicht als Durchlicht die Probe passiert, beeinflussen.
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Da es sich um Lumineszenzlicht handelt, kann es zumindest teilweise den Dichroit 6 sowie den Emissionsfilter 7 passieren und zur Kamera 9 gelangen.
Das aufgenommene Kamerabild weist Ähnlichkeiten zum Kontrast einer schiefen Beleuchtung sowie Fluoreszenzsignale der Probe selbst auf. Wenn die Probe selbst nicht fluoresziert, verbleibt der Eindruck einer schiefen Beleuchtung.
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Die in 2 dargestellte Variante ist für Mikroskope mit Auflicht- und Durchlichtstrahlung geeignet und kommt völlig ohne zusätzliche Elemente im Strahlengang aus.
Sie zeigt die erfindungsgemäße Vorrichtung mit einem in Analogie zu 1 dargestellten Auflichtstrahlengang.
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In Abänderung zur Variante nach 1 befindet sich aus der Blickrichtung von der Probenebene 3 her nach der verstellbaren Blende 5 eine Durchlichtbeleuchtungsoptik 12, bestehend aus beispielsweise einem Kollektor und einem Kondensor.
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Als Lichtquelle für die Durchlichtbeleuchtungsoptik wird eine Weißlicht-LED 13, die im blauen und im UV-Spektralbereich emittiert und eine lumineszierende Schicht 14 aufweist, verwendet. Das resultierende Licht ist dabei eine Mischung aus der Anregungswellenlänge der Weißlicht-LED 13 und der Lumineszenz der Schicht 14.
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Wird die Probe mittels des Auflichtstrahlenganges angeregt, passiert ein Großteil des auf die Probenebene treffenden Lichtes die Probe und durchläuft den gesamten Durchlichtstrahlengang in umgekehrter Richtung, bis es auf die Weißlicht-LED trifft. Dort regt es die lumineszierende Schicht 14 an, die wiederum Licht aussendet, welches dann als Durchlicht die Probe erneut passiert und zur Kamera 9 geleitet wird.
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Dieser Weg wird üblicherweise durch eine Blende 5 im Durchlichtstrahlengang blockiert, da die Reflexe der verschiedenen Grenzflächen im Durchlichtstrahlengang sowie die Lumineszenz der Weißlicht-LED 13 Störquellen sind, die nach Möglichkeit unterdrückt werden.
Wenn die Blende 5 nicht komplett geschlossen ist, kann ein Teil des Auflichts den Durchlichtstrahlengang passieren, um die lumineszierende Schicht 14 der Weißlicht-LED 13 anzuregen. Das daraus resultierende Licht durchläuft dann den Durchlichtstrahlengang, wobei ein kleiner Teil des Lichtes 11 an der nicht komplett geschlossenen Blende 5 vorbei die Probe erreicht. Dies ist in etwa vergleichbar mit einer schiefen Beleuchtung und liefert in Analogie zur ersten Ausgestaltungsvariante ein kontrastiertes Durchlichtbild auf der Kamera 9.
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Ähnlich zur ersten Ausführungsvariante lässt sich der Kontrasteindruck auch hier optimieren, indem die Blende 5 in Abhängigkeit von der numerischen Apertur des Objektivs 2 und der Probe unterschiedlich weit geschlossen wird. Ebenso behalten auch die Überlegungen zur Separierung des Durchlichtkontrast- und des Proben-Fluoreszenzsignals ihre Gültigkeit. Selbstverständlich kann auch ein Bild mit komplett geschlossener Blende 5 aufgenommen werden, das nur den Fluoreszenzanteil der Probe selbst enthält.
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3 zeigt die Darstellung eines ursprünglich als herkömmliches Graustufenbild aufgenommenen Hirnschnitts nach der zweiten Ausgestaltungsvariante in einem invertierten, reinen Schwarz-Weiß-Kontrast, in welchem schwarze Bildbestandteile die jeweils hellsten Signale im Originalbild kennzeichnen, wobei in der Abbildung a das Bild mit einer geschlossenen Blende 5 aufgenommen wurde, während in der Abbildung b die Blende 5 teilweise geöffnet war.
In der Abbildung b sind deutlich feinere Details zu erkennen, als im reinen Fluoreszenzbild nach Abbildung a.
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Liegt nur ein Graustufen-Bild, das mit teilweise geöffneter Blende 5 aufgenommen wurde, vor, so lassen sich auch daraus noch weitere Informationen gewinnen. In einem solchen Bild ist die Information aus der Durchlichtbeleuchtung der lumineszierenden Schicht und der Probenfluoreszenz überlagert. Dennoch lassen sich in begrenztem Maße beide Signale separieren. Die Stärke des Durchlichtkontrastes hängt wesentlich von den Absorptionseigenschaften der Probe sowie ihrem Phasengradienten ab. Insbesondere ungefärbte Proben absorbieren nur einen sehr geringen Anteil des Lichts. Der Durchlichtkontrast entsteht dann durch den Phasengradienten der Probe und fällt umso stärker aus, je stärker dieser Gradient an jedem Probenpunkt ist. Je nachdem, welches Vorzeichen er hat, erscheint der entsprechende Teil des Bildes heller oder dunkler als der Mittelwert. Fluoreszierende Strukturen in der Probe können jedoch sehr starke Signale aussenden. Eine Möglichkeit der Trennung beider Anteile besteht darin, einen Intensitätsbereich um das Intensitätsmittel des Bildes zu bestimmen, der den zu erwartenden Kontrast aufgrund der Durchlichtbeleuchtung umfasst. Alle Punkte, die heller sind als dieser Bereich, stammen dann von fluoreszierenden Stellen der Probe selbst und können somit separat dargestellt werden. Schwach fluoreszierende Probenstrukturen werden dabei allerdings nicht erfasst.
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4 veranschaulicht diese Variante anhand eines Profils der Intensität I in Abhängigkeit von der Profilkoordinate PK mit der Darstellung des Intensitätsbereiches des Durchlichtbildes ID und der Fluoreszenzspitze FS.
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5 zeigt eine schematische Darstellung der Blende 5 mit den Verstellmöglichkeiten hinsichtlich der Verschiebung in x- und y- Richtung sowie der Drehung um eine Drehachse. Ferner ist hier die äußere Grenze des Strahlenbündels GSB zu sehen.
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Die Verwendung der variablen, drehbaren Blende 5 bewirkt, dass man aus dem Durchlichtstrahlengang einen Strahlengang nach Art einer schiefen Beleuchtung oder dazu ähnlich mit einem variabel großen Lichtbündel aus unterschiedlichen Richtungen erhalten kann, um damit wiederum je nach Struktur der Probe den bestmöglichen Bildeindruck zu erzielen.
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Die drehbare Blende 5 könnte beispielsweise so ausgestaltet sein, dass sie sich einerseits in einem Einsatz befindet, in welchem sie um ihren Mittelpunkt gedreht werden kann, und dass sie andererseits innerhalb der Ebene, in welcher sie angeordnet ist, in x- und y-Richtung aus der Mitte, die der optischen Achse entspricht, heraus verschoben werden kann. Der äußere Teil der Blende 5 muss dabei so gestaltet sein, dass dieser an einer Seite - je nach Verschiebung aus der Mitte heraus - unterschiedlich viel Fläche zur lumineszierenden Schicht 14 hin freigibt. Durch die Verschiebung der Blende 5 in x- und y- Richtung kann der Lichtweg zur lumineszierenden Schicht 14 auch ganz abgedeckt werden.
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Die Blende 5 könnte dabei exzentrisch um eine Achse geschwenkt werden, die nicht der optischen Achse entspricht. Durch entsprechend angepasste Blendenkonturen und geeignete Positionierung der Blende 5 im Strahlengang kann man somit ebenfalls erreichen, dass ein Lichtbündel nach Art einer schiefen Beleuchtung oder davon abgewandelt aus unterschiedlichen Richtungen (aber nicht symmetrisch zur optischen Achse) auf das Präparat gelangt. Auch in dieser Variante kann durch eine entsprechende Blendenform der Lichtweg zur lumineszierenden Schicht 14 vollständig unterbrochen werden.
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6 zeigt schematische Darstellungen der Abdeckung des Strahlenbündels mit der Blende 5.
In Abbildung a sind als DP der Drehpunkt der Blende 5, GSB die äußere Grenze des Strahlenbündels und 15, 16 und 17 drei verschiedene Stellungen der Blende 5 mit:
- 15: Strahlenbündel frei für Durchlichtaufnahmen,
- 16: Strahlenbündel teilweise abgedeckt für kombinierte Fluoreszenz- und Durchlichtaufnahmen und
- 17: Strahlenbündel komplett abgedeckt für Fluoreszenzaufnahmen
dargestellt, während in der Abbildung b variable, teilweise Abdeckungen des Strahlenbündels durch die Blende 5 zur Kontrolle der Einfallsrichtung des Strahlenbündels zu sehen sind.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Beleuchtungsquelle
- 2
- Objektiv
- 3
- Probenebene
- 4
- lumineszierende Schicht
- 5
- Blende
- 6
- Dichroit
- 7
- Emissionsfilter
- 8
- Tubuslinse
- 9
- Detektionseinheit/Kamera
- 10
- Anregungsfilter
- 11
- Licht
- 12
- Durchlichtbeleuchtungsoptik
- 13
- Beleuchtungsquelle/Weißlicht-LED
- 14
- lumineszierende Schicht
- 15,16,17
- Abdeckung Strahlenbündel
- x, y, z
- Koordinatenrichtung/Verschiebung
- α
- Winkel
- I
- Intensität
- PK
- Profilkoordinate
- ID
- Intensitätsbereich Durchlicht
- FS
- Fluoreszenzspitze
- DP
- Drehpunkt Blende
- GSB
- äußere Grenze des Strahlenbündels
