JP2017198680A - 生細胞干渉法を介した急速超並列単細胞薬物反応測定法 - Google Patents
生細胞干渉法を介した急速超並列単細胞薬物反応測定法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された政府支援助成金第CA090571号、第CA107300号、第GM074509号を用いて行われた。政府が本発明で特定の権利を有する。
本願は、その内容が参照することにより本明細書に組み込まれる、「RAPID, MASSIVELY PARALLEL SINGLE−CELL DRUG RESPONSE MEASUREMENTS VIA LIVE CELL INTERFEROMETRY」と題された、2011年8月2日出願の同時係属米国仮特許出願第61/514,353号の利益を米国特許法第119条(e)項の下で主張するものである。本願は、その内容が参照することにより本明細書に組み込まれる、2009年5月6日に出願された米国特許出願第12/436,702号に関係する。
[本発明1001]
環境に対する細胞応答を観察するための方法であって、第1の環境に対する細胞応答が観察されるように、
(a)第1の環境内に少なくとも1つの細胞を配置する段階と、
(b)生細胞干渉法を含むプロセスを使用して、第1の環境内の細胞の質量特性を観察する段階と、
(c)(b)で観察される質量特性を、生細胞干渉法を含むプロセスを使用して第2の環境で観察される細胞の質量特性と比較する段階と、
を含む、方法。
[本発明1002]
質量特性が観察される前記少なくとも1つの細胞が、単離された単細胞として第1の環境内に存在する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
質量特性が観察される前記少なくとも1つの細胞が、細胞集合または集塊の中で第1の環境内に存在する、本発明1001の方法。
[本発明1004]
第1の環境内に存在する複数の細胞の質量特性が観察される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
第1の環境が試験組成物を含み、第2の環境は該試験組成物を含まない、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記試験組成物が、抗生物質、抗体、アルキル化剤、代謝拮抗物質、細胞周期阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、siRNA、または細胞を含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記試験組成物が、HER2を結合する抗体を含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
第1の環境内の細胞の前記質量特性が、ある期間にわたって該細胞の質量特性がどのように変化するかを観察するように、複数回観察される、本発明1005の方法。
[本発明1009]
前記細胞の質量特性の変化が、時間的質量プロファイルを観察するように経時的に観察される、本発明1008の方法。
[本発明1010]
観察された時間的質量プロファイルを時間的質量プロファイルのデータベースと比較する段階をさらに含み、該時間的質量プロファイルのデータベースは、前記試験組成物に対する細胞感受性の特性を示す時間的質量プロファイル、および前記試験組成物に対する細胞抵抗性の特性を示す時間的質量プロファイルを含むように選択される、本発明1009の方法。
[本発明1011]
細胞の質量を観察するための方法であって、
(a)試験光線と参照光線との間の分数位相偏移を測定するように適合されている干渉顕微鏡の観察チャンバの中に細胞を配置する段階と、
(b)照明波長における試験光線に細胞を暴露させる段階と、
(c)細胞を通って伝搬する試験光線と参照光線との間の分数位相偏移を測定する段階と、
(d)細胞の質量を観察するために、(c)で得られた測定値を使用する段階と、
を含む、方法。
[本発明1012]
細胞の質量が、以下の方程式
[数1]
を使用して観察され、式中、mは、細胞の質量であり、αは、前記位相偏移と細胞質量との間の関係を表す定数であり、φは、前記測定された分数位相偏移であり、λは、照明波長であり、積分が全細胞面積Aにわたって行われる、本発明1011の方法。
[本発明1013]
α=1.8×10−3m3kg−1である、本発明1011の方法。
[本発明1014]
細胞の質量が、ある期間にわたって細胞の質量がどのように変化するかを観察するよう、複数回観察される、本発明1011の方法。
[本発明1015]
複数の細胞の質量を定量化するために使用される、本発明1011の方法。
[本発明1016]
(a)顕微鏡に動作可能に連結されている検出器と、
(b)細胞を含有するように適合されている観察チャンバを備える、サンプルアセンブリと、
(c)参照細胞を含有するように適合される参照チャンバを備える、参照アセンブリと、
(d)光源からの光線を試験ビームおよび参照ビームに分割するためのビームスプリッタと、
を備える、生細胞干渉法システムを使用して行われる、本発明1011の方法。
[本発明1017]
観察チャンバが、該チャンバ内で細胞培地を循環させるように適合されている少なくとも1本の灌流導管を備える、本発明1016の方法。
[本発明1018]
生細胞干渉法システムが、プロセッサ要素と、細胞の1つまたは複数の画像を処理して記憶するように適合されているメモリ記憶要素とを備える、本発明1016の方法。
[本発明1019]
細胞の質量特性が、治療組成物に対する細胞応答を定量化するように観察される、本発明1011の方法。
[本発明1020]
前記細胞が、癌に罹患している個人から得られ、前記治療組成物が、癌を治療するために使用される、本発明1019の方法。
干渉計
生細胞干渉計は、以前に詳細に説明されている(1)。簡潔には、本システムは、典型的な光学分解能(20x対物レンズについては1.16μm)で、横特徴だけでなく、1ナノメートルの尺度を下回る反射物体の高さ寸法の観察も可能にする、20X 0.28NAマイケルソン干渉対物レンズを伴う、改良型Veeco NT9300光学プロファイラに基づく光学顕微鏡である。マイケルソン干渉計は、標本を包囲する流体によって誘発される光路差に合わせて調整するように、ビームスプリッタ、参照鏡、および補償流体セルから成る。位相偏移干渉法(PSI)(14)方法が、原位置で細胞体の位相画像を捕捉するために使用された。測定中に、圧電変換装置が、光路を少量減少させ、試験および参照ビームの間の位相偏移を引き起こす。本システムは、多くの異なる位相偏移において結果として生じる干渉パターンの放射照度を記録し、次いで、PSIアルゴリズムを使用して放射照度データを統合することによって、放射照度を位相波面データに変換する。現在実装されているように、自動焦点およびPSI測定周期は、12秒かかる。PSI測定自体は、1〜2秒かかり、カメラフレームレート(60fps)によって制限される。この実験では、400〜1,000個の細胞を含有する、一式の25の画像が、7分ごとに捕捉された。各一式の25の画像は、何百もの細胞を含有し、ここでは最初の5つの画像からのデータが提示され、したがって、各実行は、約80個の細胞を含む。選択された画像のそれぞれの中の全ての細胞が測定された。
Veeco NT9300に固有のソフトウェアは、位相画像から手動で選択される細胞の光学的厚さの自動測定を可能にする。光学的厚さは、Rossと一致する、変換定数α=1.8×10−3m3kg−1を使用して、本文で説明されるように質量に変換される(9)。各細胞の境界が、ピクセル高のヒストグラムから判定される閾値を使用して、背景から物体を区切るアルゴリズムによって自動的に選択された(15)。光学的厚さへの未加工位相画像の変換は、一連の十分に確立された「位相アンラッピング」ルーチンを使用する(16)。時として、この位相から光学的厚さへの変換は、1つの波長(530nm)分小さく不正確であり、細胞を伴う連続領域に、真の値よりも1波長小さい、見掛けの光学的厚さを持たせる。この誤差は、光学的厚さの非物理的不連続性として容易に検出され、影響を受けたピクセルに光学的厚さの1つの波長を再び追加することによって補正される。このプロセスは、現在、完全には自動化されていない。
細胞質量測定のための干渉顕微鏡法の精度は、電磁気理論で(17、18)、ならびに超遠心分離(3、4、10〜12、19〜21)、タンパク質溶液、ヒドロゲル、および透明膜の屈折率測定(22〜24)、x線密度測定(25)、および電子顕微鏡法(26〜30)を含む、種々の参照技法によって確固たるものとして確証される。LCIシステムの精度および安定性を特徴付けるために、いくつかのベンチマーク実験を行い、その詳細が図8〜11で挙げられる。干渉光路の時間的安全性(1.2オングストローム、図8a)の関数である、LCI質量測定の変動係数(CV)の下限は、約0.35%であると判定された。類似CVが、細胞を刺激した、部分的に溶解したポリスチレンビーズの連続測定について(CV<0.4%、図8b)、および実際の生細胞の短期反復測定について(CV<1%、図9)判定された。集団平均体積および標準偏差が製造業者によって提供され、通常はフローサイトメトリ(Flow Check, Polysciences Inc)で較正標準として使用される、6μm直径ポリスチレン球の集団(図10a)を測定した。LCIによって判定された集団質量CV(6.8%)は、製造業者によって判定される(15%)よりもかなり小さかった。また、15週齢の雌C57BL/6マウスから新たに得られた赤血球(RBC)の集団も測定した(図10b〜c)。(光化学および他の方法によって判定される)平均細胞質量の値の確立された範囲が存在するため、マウスRBCは、情報を与える独立標準としての機能を果たす。平均RBC細胞質量の我々のLCI判定値である、19.4pgは、15〜21pgにおける公表値の範囲と優れた一致にある(9〜12、31)。最終的に、比較のために、種々の哺乳類細胞型の集団の質量を測定した(図10b、11)。これらは、図9bのマウスRBCおよびポリスチレン球データとともに描画される。多時間生細胞実験における測定変動の尺度を推定するために、全ての単細胞質量対時間のデータ(約480個の細胞を表す)を、単純指数成長モデルに適合させ(mass(t)=m0 *Ct、式中、定数Cは単位元に近い)、残余誤差を、傾向と各時点における実際のデータとの間のパーセント差として計算した(図12a)。残余は、ゼロの周囲で対称に分布し(図12b)、25%から75%の四分位の範囲(IQR)は、0.0126(c2)から0.027(c3)まで変化する。平均IQRは、0.02であった。総合すると、これらの結果は、約0.5〜1.0%の測定再現性の下界、および2.0〜3.0%の外界を示す。生細胞の短期および長期測定の主な違いは、数時間の尺度にわたって生じる形状変化である。これは、(1)細胞境界の区切りにおける小さな誤差、(2)「丸みを帯びた」細胞の縁に存在する密集縞の光学的「平均化」、および(3)質量対光学的厚さの定数である、αの値の潜在的変化から、統合光学的厚さの追加変動を引き起こし得るが、以前の研究は、この誤差が比較的小さくなるであろうと示唆する(3)。(1)αは、結晶化タンパク質溶液の限界までさえも、濃度の変化による影響を受けない(9)、(2)αは、特定の場所で光と相互作用する質量を反映し(9〜12、31)、したがって、細胞が成長するにつれて、細胞が視野内でどれだけ多くの面積を占有するかによって影響されない、(3)αの値は、細胞で見出される広範囲の物質にわたって0.0018に近いままである(32)ことが確立される。
H929ヒト多発性骨髄腫細胞を、10%の既定ウシ胎仔血清(HyClone)および抗生物質を補充したRPMI 1640成長培地の中で、5%CO2中で37℃にて維持した。観察チャンバは、シリコンが流体表面の最上部の付近にあるように、プラスチック棚の上に配置された2x2cmシリコン基材を伴って、直径4.5cmおよび深さ1.5cmであった。均一な厚さのサンプルチャンバを作成するように、3つの600μmステンレス鋼ビーズ(Salem Specialty Ball Company,Canton,CT)の上に静置することによってシリコン表面から分離された、一片の光学ガラス(BK7ガラス、Quartz Plus,Inc.,Brookline,NH)によって、撮像セルが完成された。0.5mL/分の速度で蠕動灌流ポンプを使用して、5%CO2空気で発泡させられた培地を、インキュベーションチャンバを通して連続的に流した。サンプルチャンバ上に入射する530nm波長のLED照明(Luxeon Star LED,Brantford,Ontario)は、1.2mm直径の照明スポットにわたって拡散した15μWの出力を有した。外部刺激に対する細胞応答が、この構成では7時間もの長さにわたって測定され、非摂動培養が最大12時間にわたって観察されたが、実験の持続時間の上限は判定されていない。
H929細胞を、1×106細胞/ウェルの密度で6ウェル培養皿の中に播種した。LCIの観察チャンバの中で細胞を平板培養する前に、DMSO中の1μLのツニカマイシン(T7765、Sigma−Aldrich)、またはDMSOのみのいずれかを、10mg/mlの濃度、DMSO/培地(1:1000希釈)で培地に添加した。実験システムが安定すること、すなわち、培養順化、温度安定化等を可能にするために、細胞が観察チャンバの中で平板培養された1時間後に、質量測定が始まった。細胞周期分析については、各時点からの細胞を収集し、ヨウ化プロピジウムを含有する低張性DNA染色緩衝液でインキュベートし、後に、フローサイトメトリによって分析した。Trizol試薬(Invitrogen)を使用して、各時点のRNAを抽出した。
Superscript III第1鎖cDNA合成キット(Invitrogen)を使用して、オリゴ(dT)プライマーを伴う3μgの全RNAからCDNAを合成した。25周期にわたって58℃の焼鈍温度でPlatinum Taq(Invitrogen)を使用して、XBP1スプライスおよび非スプライスアイソフォームのRT−PCRを行った。説明されるように、SYBRグリーンリアルタイムPCRキット(Diagenode)およびApplied Biosystems(Foster City,CA,USA)7700シーケンス検出器を使用して、CHOP(DDIT3)mRNAの定量的RT−PCRを行った(33)。正規化対照として、サンプルを36b4発現について分析した。プライマー配列が要求に応じて利用可能である。
質量蓄積動力学は、同時に測定された約100個の細胞の集団全体について、長期的尺度(数時間)にわたって細胞ごとの基準で以前に報告されていない。LCI質量プロファイリングが、薬物反応等の外部細胞刺激に対する応答を急速に判定できるという仮説を試験するために、H929多発性骨髄腫細胞を、タンパク質糖化阻害剤である薬剤ツニカマイシン(TM)に暴露させ(34)、5時間にわたって質量を連続的に測定することによって、TM処置細胞の成長プロファイルを未処置対照細胞と比較した。
上記で論議されるように、生細胞質量プロファイリングは、経時的な細胞質量のピコグラム規模の変化を通して、治療薬に対する応答を急速に定量化するための有望な新しいアプローチである。質量プロファイリングにおける有意な障壁は、単離された単細胞よりも患者由来のサンプルまたは組織培養中でより一般的に存在する、多形細胞集合および集塊を、既存の方法が扱えないことである。ここで、HER2指向モノクローナル抗体である、トラスツズマブ(Herceptin)に対する単細胞およびコロニー形成ヒト乳癌細胞株の感受性の急速かつ正確な数量詞として、自動生細胞干渉法(aLCI)の証拠が提供される。相対感受性が、従来の増殖アッセイで可能であるよりも数十倍から数百倍速く判定された。クラスタサンプル評価および速度における、これらのaLCIの前進は、患者由来の固形腫瘍サンプルの治療反応試験に使用されてもよく、これらのサンプルは、生体外で短期間のみ生存可能であり、細胞凝集体および集合の形態である可能性が高い。
細胞株および培養
BT−474、SK−BR−3、MDA−MB−231、およびMCF−7乳癌細胞株を、American Type Culture Collection(Rockville,MD)から入手した。全ての株を、10%ウシ胎仔血清(Omega;Tarzana,CA)、ならびに1%ペニシリン、ストレプトマイシン、およびL−グルタミンを補充したRPMI 1640(Cellgro;Manassas,VA)成長培地の中で維持した。
臨床グレードトラスツズマブ(Herceptin)(Genentech;South San Francisco,CA)を20ug/mlで使用した。
5×104個の細胞を、12ウェルプレートの中へ播種し、治療を開始する前に2日間にわたって付着および成長させた。20ug/mlのHerceptinを用いた治療の第0、3、5、および7日に、細胞をトリプシン処理し、数を数えた。倍率変化を計算するために、倍増時間を対照および薬剤処置サンプルについて判定し(DT=t*(log(2)/log(Nt/N0)))、倍率変化をDTdrug/DTctrlと見なした。DT=倍増時間、t=時間、Nt=時間tでの細胞の数または質量、N0=時間t=0での細胞の数または質量。
細胞を、チャンバ状カバーガラス上へ播種し、一晩付着させた。細胞を、pH7.4の1xPBS中の3.7%ホルムアルデヒドで固定し、0.1%Triton−X中で透過処理した。次いで、サンプルをAlexa 568−Phalloidinアクチン染料(Invitrogen; Grand Island, NY)およびDAPIとともにインキュベートした。Zen 2010ソフトウェアを使用したZeiss LSM 780 CCDカメラを用いて、共焦点画像を撮影した。
生細胞干渉計が以前に説明されている(例えば、J.Reed,et al.Biophys J.2011,101,1025−31、J.Reed,et al.ACS Nano.2008,2,841−6、J.Reed,et al.Nanotechnology.2008,19を参照)。本システムは、20X 0.28NAマイケルソン干渉対物レンズを伴う、改良型Bruker NT9300光学プロファイラ(Bruker;Tucson,AZ)から成る。マイケルソン干渉計は、サンプルを包囲する流体によって誘発される光路差に対処するように、ビームスプリッタ、参照鏡、および補償流体セルから成る。位相偏移干渉法(PSI)方法が、細胞サンプルの位相画像を捕捉するために使用された。多重サンプル撮像を可能にするために、aLCIは、各サンプルウェルにおけるカバーガラス光路長のわずかな差に合わせて干渉計参照鏡を調整するために、小型モータを採用する。
Matlab(Mathworks Inc.,Natick,MA)で書かれた、カスタム多重ステッププログラムを使用して、画像分析を行った。第1のステップは、Bruker Visionソフトウェア(Bruker Nano Inc.,Tuscon,AZ)によって採用されたGoldstein位相アンラッピングアルゴリズムによる処理後に残留した、位相誤差(定量的位相撮像に固有の曖昧性による整数波長誤差)を除去する、位相アンラッピングステップであった。このアルゴリズムは、整数波長ジャンプ、および背景レベルを下回る非物理的偏位を除去するために、各ピクセルから離れた複数のランダムウォークを使用する。第2のステップは、局所適応メジアンフィルタおよび流域変換の組み合わせを使用して、各画像を細胞またはコロニー物体に区分することである。最終的に、IDL粒子追跡コードに基づく、Daniel BlairおよびEric DufresneによるMatlabのために適合された粒子追跡コードを使用して、画像分割によって識別された物体を追跡した(例えば、JC.Crocker,et al.Journal of Colloid and Interface Science.1996,179,298−310を参照)。
Claims (20)
- 環境に対する細胞応答を観察するための方法であって、第1の環境に対する細胞応答が観察されるように、
(a)第1の環境内に少なくとも1つの細胞を配置する段階と、
(b)生細胞干渉法を含むプロセスを使用して、第1の環境内の細胞の質量特性を観察する段階と、
(c)(b)で観察される質量特性を、生細胞干渉法を含むプロセスを使用して第2の環境で観察される細胞の質量特性と比較する段階と、
を含む、方法。 - 質量特性が観察される前記少なくとも1つの細胞が、単離された単細胞として第1の環境内に存在する、請求項1記載の方法。
- 質量特性が観察される前記少なくとも1つの細胞が、細胞集合または集塊の中で第1の環境内に存在する、請求項1記載の方法。
- 第1の環境内に存在する複数の細胞の質量特性が観察される、請求項1記載の方法。
- 第1の環境が試験組成物を含み、第2の環境は該試験組成物を含まない、請求項1記載の方法。
- 前記試験組成物が、抗生物質、抗体、アルキル化剤、代謝拮抗物質、細胞周期阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、siRNA、または細胞を含む、請求項5記載の方法。
- 前記試験組成物が、HER2を結合する抗体を含む、請求項6記載の方法。
- 第1の環境内の細胞の前記質量特性が、ある期間にわたって該細胞の質量特性がどのように変化するかを観察するように、複数回観察される、請求項5記載の方法。
- 前記細胞の質量特性の変化が、時間的質量プロファイルを観察するように経時的に観察される、請求項8記載の方法。
- 観察された時間的質量プロファイルを時間的質量プロファイルのデータベースと比較する段階をさらに含み、該時間的質量プロファイルのデータベースは、前記試験組成物に対する細胞感受性の特性を示す時間的質量プロファイル、および前記試験組成物に対する細胞抵抗性の特性を示す時間的質量プロファイルを含むように選択される、請求項9記載の方法。
- 細胞の質量を観察するための方法であって、
(a)試験光線と参照光線との間の分数位相偏移を測定するように適合されている干渉顕微鏡の観察チャンバの中に細胞を配置する段階と、
(b)照明波長における試験光線に細胞を暴露させる段階と、
(c)細胞を通って伝搬する試験光線と参照光線との間の分数位相偏移を測定する段階と、
(d)細胞の質量を観察するために、(c)で得られた測定値を使用する段階と、
を含む、方法。 - α=1.8×10−3m3kg−1である、請求項11記載の方法。
- 細胞の質量が、ある期間にわたって細胞の質量がどのように変化するかを観察するよう、複数回観察される、請求項11記載の方法。
- 複数の細胞の質量を定量化するために使用される、請求項11記載の方法。
- (a)顕微鏡に動作可能に連結されている検出器と、
(b)細胞を含有するように適合されている観察チャンバを備える、サンプルアセンブリと、
(c)参照細胞を含有するように適合される参照チャンバを備える、参照アセンブリと、
(d)光源からの光線を試験ビームおよび参照ビームに分割するためのビームスプリッタと、
を備える、生細胞干渉法システムを使用して行われる、請求項11記載の方法。 - 観察チャンバが、該チャンバ内で細胞培地を循環させるように適合されている少なくとも1本の灌流導管を備える、請求項16記載の方法。
- 生細胞干渉法システムが、プロセッサ要素と、細胞の1つまたは複数の画像を処理して記憶するように適合されているメモリ記憶要素とを備える、請求項16記載の方法。
- 細胞の質量特性が、治療組成物に対する細胞応答を定量化するように観察される、請求項11記載の方法。
- 前記細胞が、癌に罹患している個人から得られ、前記治療組成物が、癌を治療するために使用される、請求項19記載の方法。
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