JP2018505138A - がん患者を診断および処置するためのｅｒｂｂシグナル伝達経路活性の測定方法 - Google Patents

がん患者を診断および処置するためのｅｒｂｂシグナル伝達経路活性の測定方法 Download PDF

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Abstract

個々の対象から得られた罹患細胞試料における細胞経路の機能的ステータスを決定するための方法が本明細書で提供される。これらの方法は、対象から得られた罹患細胞試料を、経路が正常に機能しているときに特異的な細胞経路を撹乱することが公知の撹乱剤（例えば、活性化薬剤）と接触させることを含む。撹乱剤の存在下における１つまたは複数の生理応答パラメータにおける変化は、撹乱剤によって標的化された細胞経路が、個々の対象において機能的であることを示す。個々の対象ごとに標的化治療剤を選択する方法も提供される。

Description

関連出願
本願は、２０１４年１２月１２日に出願された、米国仮特許出願第６２／０９１，１８０号の優先権を主張し、その内容全体が、本明細書中に参照によって組み込まれる。
発明の背景
化学物質および外因性タンパク質が、特定の細胞標的に対する有効なヒト治療剤となり得ることを発見して以来、罹患した個体の処置は著しい進歩を為した。しかし、依然として、がん等、多くの一般的な疾患の処置は、相当な改善の余地がある。ヒトゲノムプロジェクトの主な推進力の１つは、治療介入の開発および処方を前進させるために、疾患の遺伝的原因を発見することであった。報告を信用すれば、ヒトゲノムプロジェクトによって全ヒト遺伝子が同定された。これらの遺伝子の多くは、ヒト集団において疾患と統計的に連鎖した。今のところ、疾患の遺伝連鎖の知識または遺伝的バイオマーカーの検出は、必ずしも疾患経過または治療転帰を有効に予測するとは限らない。同様に、遺伝連鎖、さらには係る遺伝子からのタンパク質発現レベルの定量化までもが、適切な治療経過の決定において非常に限定されていた。
ペタバイト量の遺伝情報が収集された。大量の統計的および分析的モデリング演算能力が、収集された遺伝的データに適用されて、多くの異なる種類の疾患を分析した。このプロセスから、少なくとも２つの重要な事実が分かった。第１に、一部には、ある個体における乳がんが、別の個体における同じがんと遺伝的構成、タンパク質発現レベルおよび治療介入に対する応答が完全に異なる場合があるため、乳がん等の「疾患」が不均一である。第２に、事例の大部分において、現在の遺伝的バイオマーカーの検出の適中率が低い。
現代の標的薬物は、特定の限られた数のヒト細胞モデルを念頭に置いたプロセスに沿って発見および開発されている。このような細胞株の多くは、特定の細胞標的に対し所望の活性を有する薬物を選択するための、潜在的な薬物の大規模ライブラリーの最適化されたスクリーニング環境を提供するよう操作されている。各患者の疾患が、同じ疾患の他の患者とは異なることを示す臨床情報を踏まえると、このプロセスを用いることにより、潜在的な薬物の有効性に関して誤解を招く可能性がある。今日まで、創薬および開発プロセスは、臨床治験に先立ち応答性のヒトを同定するのにそれほど有効ではなく、臨床開発プロセスを通して高い失敗率に悩み続けてきた。患者に対する害の低下に焦点を合わせる規制臨床開発プロセスにより承認される薬物の多くは、実際の疾患患者集団における有効率の低さに悩んでいる。
臨床医へのあらゆる病状提示が、同じ原因から生じるとは限らない。分かり易い例を挙げると、骨関節の炎症は、あるものは内部、あるものは外部、あるものは「遺伝的に連鎖した」、またあるものは未知の原因による、複数の起源から生じ得る。医科学は、外部病原体を適宜同定することができれば、感染性疾患に関する患者のトリアージにおいて相当に有効である。医師には、現在利用できる治療法のいずれが、内因による炎症の低下をもたらすか予測するための手持ちのツールがさらに少ない。医師は、特定の患者の細胞が、どのように機能するか、あるいはより適切には機能不全となるか、また、臨床的に「炎症」として現れる疾患の処置に利用できる多くの治療法の１種に対しどのように応答するかに関する知識を欠く。医師は、異常遺伝子が存在することは分かっていようが、これが、特定の患者における疾患経過にどのように影響を与えるかは分かっていない。医師は、特に、どのように薬物が作用する筈であるかは分かっていようが、特定の患者が、該薬物活性に対し無応答性または抵抗性となり得るかは分かっていない。
患者は、自身の特定の疾患原因のより優れた同定および有効な治療経過のためのより優れた情報に基づく意思決定を必要とする。ヒトゲノム配列決定および他の遺伝的定量化ツールは、各患者の疾患が、該患者に幾分特有であることを医者に告げた。この情報は、個別化医療周辺のビジネス全体を生み出し、これにより、各患者は、自身の疾患にカスタマイズされたカスタマイズ治療レジメンを受けることができる可能性がある。薬物は、特定の遺伝子関連の疾患兆候に対して開発されている。この理想的アプローチは、主として現在の予後ツールセットの著しい弱点のために、未だに検証を必要とする。遺伝子は存在し得るが、特定の個体の文脈におけるその機能は相関しない。
患者がそれぞれ異なること、および何回療法を行っても陽性応答をもたらすことができないことという理解に対する１つの回答が、コンパニオン診断の開発であった。このタイプの診断試験は、現代のバイオマーカー検出ツールを使用して、特定の薬物に応答する可能性がより高い患者を同定する試みのために設計される。試験は、増加した遺伝子数、遺伝子の突然変異、または特定の遺伝子の変更された発現レベルを探すことを含む。例えば、特定の遺伝子の突然変異または過剰発現された疾患に関連する受容体タンパク質の存在を決定するための試験の助けによって、現在多くのがんが診断されている。しかしながら、ほとんどのバイオマーカー試験は、疾患およびその根本的な原因に関して間接的で推論的な情報を提供するにすぎない。したがって、有意な治療応答の予測におけるこれらの試験のほとんどの成功率は、５０％よりかなり低いことが多い。
したがって、より優れた診断アッセイおよび個体ごとの治療剤の有効性に関するより優れた予後の指標を提供する必要が未だある。
疾患を診断するための、および治療の意思決定のための基礎としてのバイオマーカーの使用は、疾患に関与するシグナル伝達経路の活性は評価されないという事実により制限される。したがって、本発明は、患者の罹患細胞の生理学的活性の変化に基づいて疾患に関与するシグナル伝達経路が評価される診断方法を提供する。したがって、本発明は、患者の罹患細胞において特定のシグナル伝達経路が活性であるかどうかの決定を可能にし、それにより、実際にはシグナル伝達経路が疾患プロセスに関与するかどうかを示さない可能性があるバイオマーカー（例えば細胞表面の受容体）の発現ではなく、この生理学的活性に基づいて処置レジメンを選択できるようにするものである。特に、本発明は、「バイオマーカー陰性」であり、さらに疾患プロセスに関与する活性なシグナル伝達経路を有する患者を同定する方法を提供する。これは、これまでは患者のバイオマーカー陰性のステータスに基づいてこのような処置を回避していたと予想される患者を選択し、そのシグナル伝達経路に影響を与える標的化治療剤で処置することを可能にする。例えば、本発明は、本発明の前に、患者がＥｒｂＢ標的化治療薬での処置に関して見過ごされたであろうが、そのような患者が、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与える標的化治療剤での処置のために選択され得るように、ＥｒｂＢ２陰性がんを有し、活性なＥｒｂＢシグナル伝達経路をさらに有する患者を同定することを提供する。これは、ＥｒｂＢ２を標的化する薬物に関するＦＤＡラベルは、過剰発現または増幅したＥｒｂＢ２受容体を有する患者での使用にのみ承認されているという事実を反映する。同様に、本発明は、本発明の前に、患者がＥＲに関連する療法（例えば、ホルモン療法）に関して見過ごされたであろうが、そのような患者が、ＥＲシグナル伝達経路に影響を与える標的化治療剤での処置（例えば、ホルモン療法）のために選択され得るように、エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性がんを有し、活性なＥＲシグナル伝達経路をさらに有する患者を同定することを提供する。したがって、本発明は、標的化治療剤での処置を受けることによって利益を得る可能性がある患者集団を大きく拡張する。
本発明の一態様は、罹患細胞における異常なシグナル伝達経路に関連する疾患に関して対象を診断および処置する方法であって、対象は、疾患に関してバイオマーカー陰性であり、本方法は、
対象から得られた生存可能な初代罹患細胞の試料を調製して、ベース培地中で試料を培養するステップ；
試料を培養するのに使用されるベース培地を、それらを撹乱剤（ｐｅｒｔｕｒｂｉｎｇ ａｇｅｎｔ）と接触させる１２時間前以前７２時間前以降に、新鮮なベース培地で置き換えるステップ；
細胞接着または付着に対する作用などの生理応答パラメータにおける変化によって測定した場合、撹乱剤と接触させていない細胞と比べてシグナル伝達経路を上方調節または下方調節するように、疾患に関連するシグナル伝達経路に選択的に影響を与えることが公知の撹乱剤と、罹患細胞を接触させるステップ；
撹乱剤と接触させた生存可能な罹患細胞の細胞接着または付着などの生理応答パラメータを連続的に測定するステップ；および
生理応答パラメータの連続的な測定の数学的分析によって測定量を決定して、罹患細胞で生じた生理応答パラメータにおける変化の量を同定するステップ、
測定量を、シグナル伝達経路活性の正常な参照インターバルから導出されたカットオフ値と比較するステップ
を含み、
測定量がカットオフ値より大きい場合、対象は、異常なシグナル伝達経路に関連する疾患に関して診断され、シグナル伝達経路に影響を与える標的化療法での処置のために選択され得る、方法を提供する。
変化は、例えば、好適な対照と比較した細胞接着または付着における増加または減少であってもよい。
一実施形態では、疾患は、がんであり、例えば、乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、食道がん、頭頸部がん、または胃がんである。異常なシグナル伝達経路に関連する他のタイプの疾患、例えば自己免疫疾患および感染症も包含される。
一実施形態では、疾患は、がんであり、したがって罹患細胞は、腫瘍細胞の試料であり、健康な細胞は、腫瘍細胞と同じ細胞型の非腫瘍細胞の試料である。好ましい実施形態では、がんは、乳がんである。乳がんを診断することに関する一実施形態では、撹乱剤は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路、例えばＮＲＧ１に選択的に影響を与える。乳がんを診断することに関する一実施形態では、撹乱剤は、ＥＲαシグナル伝達経路、例えばエストラジオールに選択的に影響を与える。乳がんを診断することに関するさらに別の実施形態では、撹乱剤は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路、例えばＨＥＲ２シグナル伝達経路に選択的に影響を与える。ＥｒｂＢシグナル伝達経路に選択的に影響を与える薬剤は、当該分野において公知である。
様々な実施形態では、シグナル伝達経路は、ＭＡＰＫ−ＰＫ、ＲＡＳ／ＲＡＦ、ＲＨＯ、ＦＡＫ１、ＭＥＫ／ＭＡＰＫ、ＭＡＫ、ＭＫＫ、ＡＫＴ、ＥＧＦ受容体、Ｈｅｒ２受容体、Ｈｅｒ３受容体、Ｈｅｒ４受容体、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ＧＰＥＲ３０、ＰＩＫ３／ＰＴＥＮ、ＶＥＧＦ受容体経路阻害剤、細胞接着、ＴＧＦベータ／ＳＭＡＤ、ＷＮＴ、ヘッジホッグ／ＧＬＩ、ＨＩＦ１アルファ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｎｏｔｃｈ、Ｇ１／Ｓ遷移の制御、ＤＮＡ損傷の制御、およびアポトーシスからなる群より選択される。追加の好適なシグナル伝達経路としては、本明細書で開示された他のシグナル伝達経路が挙げられる。様々な実施形態では、撹乱剤は、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物、リガンド、試薬、有機分子、シグナル伝達因子、増殖因子、生化学的物質、またはそれらの組合せであってもよい。
測定量は、一般的に、試験で測定されることが意図された量と定義される。本明細書に記載される発明の場合、測定されることが意図された量は、撹乱に対する生存可能な細胞の生理学的な応答における変化である。本明細書にさらに記載されるように、細胞接着または付着は、インピーダンスバイオセンサーまたは光学的バイオセンサーで測定できる細胞における生理学的な変化の一例である。一実施形態では、測定量は、撹乱される細胞試料の細胞接着または付着における変化を表し、ユークリッド分析を使用して評価される。ユークリッド分析は、複数の時点における差分ベクトル（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｖｅｃｔｏｒ）の算術的な総和、時間的最大値（ｔｅｍｐｏｒａｌ ｍａｘｉｍａ）、時間的最小値（ｔｅｍｐｏｒａｌ ｍｉｎｉｍａ）、最大値または最小値に到達する時間、傾きの変化、バイオセンサーシグナルにおける絶対値の低下、全ての測定値の合計、およびそれらの組合せからなる群より選択することができる。別の実施形態では、細胞接着または付着における変化は、時間的最大値または最小値における変化によって測定される。好ましい実施形態では、測定量の計算は、後述するようなアルゴリズムを適用することによって実行される。
時点対インピーダンスの情報は、様々な細胞条件（細胞＋培地、細胞＋撹乱因子Ｆ、細胞＋確認用試薬＋撹乱因子Ｆ）ごとに少なくとも２４０分にわたり１分ごとに記録される。疾患のメカニズムに応じて、１つより多くの撹乱因子Ｆが使用される可能性があり、複数の関連経路に沿って疾患が伝播するケースでは、複数の経路のそれぞれを個々にまたは組み合わせて撹乱することが有用な場合がある。例えば、ＥｒｂＢ２がんは、受容体のＥｒｂＢファミリーならびに関連経路であるＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ経路を含む。複数の経路が撹乱されるケースにおける測定量は、各経路につき決定された別々の測定量の組合せと予想される。以下で詳細に示される方程式に従って、これらの条件における差に対応するベクトルを合計することにより、測定量（ＮＥＤ、非線形のユークリッド距離としても公知）が提供される。
時間対ＣＡＳ試験のデータから導出された非線形のユークリッドの時点ベクトルから測定量を計算するのに使用される方程式：
式中、変数は、以下のように定義される：
ｉ＝試験中にＣＡＳが記録される１分ごとのステップ
Ｆ１＝撹乱因子１
Ｆ２＝撹乱因子２（それが使用される場合）
Ｃｉ＝対照、試験細胞への撹乱因子の添加なし
ＣＦ１ｉ＝撹乱因子１（Ｆ１）を有する細胞
ＣＦ２＝撹乱因子２（Ｆ２）を有する細胞（それが使用される場合）
ＣＣＦ１ｉ＝ＨＥＲ２経路の確認用薬剤が添加された細胞
ＣＣＦ２＝ＨＥＲ２経路の確認用薬剤が添加された細胞（撹乱因子２が使用される場合）
これらのステップを実行するために、複数の確認用因子を選択してもよい。
本発明は、測定量アルゴリズムの簡易バージョンが、同様に有用な情報を提供することができる実施形態を包含する。例えば以下の通りである。
加えて、分析の価値を損なうことなく分析をさらに強化するために、上記のアルゴリズムのいずれかにおける総和の限界をｉ＞２４０またはｉ＜２４０に拡張してもよい。
別の実施形態では、罹患細胞を、疾患に関連するシグナル伝達経路を標的化する確認用薬剤とさらに接触させ、細胞接着または付着に対する確認用薬剤の作用を測定する。好適な確認用薬剤は、当業者に公知である。確認用薬剤は、目的の疾患のメカニズムに関連する経路におけるポイントで目的のシグナル伝達経路を阻害することが公知であることを理由として選択される。この実施形態は、罹患細胞と、目的のシグナル伝達経路と関連がある撹乱剤との接触に起因する生理学的な応答の量を定量することを可能にする。これは、測定された生理学的な応答が目的のシグナル伝達経路に特異的であるかどうかの確認を可能にする。
さらに別の実施形態では、罹患細胞を、疾患に関連するシグナル伝達経路を標的化する標的化治療剤とさらに接触させ、細胞接着または付着に対する標的化治療剤の作用を測定する。
標的化治療剤の非限定的な例としては、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ラパチニブ、ドセタキセル、タモキシフェン、シスプラチン、アブラキサン、パクリタキセル注射、ブレンツキシマブベドチン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｏｎ）、エベロリムス、ペメトレキセド、エキセメスタン、オファツムマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、イリノテカン、ビカルタミド、オキサリプラチン、セツキシマブ、ビスモデギブ（ｖｉｓｏｍｅｄｅｇｉｂ）、クエン酸トレミフェン、フルベストラント、ゲムシタビン、イマチニブ、イキサベピロン、トポテカン（ｔｏｐｅｏｔｅｃａｎ）、アキシチニブ、ロミデプシン、カバジタキセル（ｃａｂｒａｚｉｔａｘｅｌ）、ソラフェニブ、インフリキシマブ、レナリドマイド、リツキシマブ、ダサチニブ、スニチニブ、エルロチニブ、ニロチニブ、パクリタキセル、テモゾロミド、トリオキシド、パニツムマブ、ボルテゾミブ、アザシチジン、パゾパニブ、クリゾチニブ、カペシタビン、イピリムマブ、ベムラフェニブ、酢酸ゴセレリン、アビラテロン、ＢＨ３模倣物、ナビトクラックス（ｎａｖｉｔｏｃｌａｘ）、アナストロゾール、レトロゾール、アロマターゼ阻害剤、シクロホスファミド、ドキソルビシン、メトトレキセート、フルオロウラシル、イキサベピロン、カルボプラチン、アフリベルセプト、テムシロリムス、イブリツモマブ（ｉｒｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、アビラテロン、クスチルセン（ｃｕｓｔｉｒｓｅｎ）、ネラチニブ、エンザルタミド、ニボルマブ、パルボシクリブ、レゴラフェニブ、エンチノスタット、アファチニブ、ＡＲＮ−５０９、ＡＲＮ−８１０、ＢＩＮＤ−０１４、ダブラフェニブ、ダラツムマブ、ランブロリズマブ、ＬＤＫ３７８、ＭＭ−１２１、ｓｙｍ００４、トラスツズマブエムタンシン、チボザニブ、トラメチニブ、アキシチニブ、ＬＹ２８３５２１９、ＭＰＤＬ３２０Ａ、オビヌツズマブ、Ｓｙｍ００４、トシツモマブ、トラメチニブ、ネシツムマブ、ラムシルマブ、ＡＤＸＳ−ＨＥＲ２、ＴＡＫ−２８５、ＭＭ−３０２、ＭＭ−１２１、ＭＭ−１１１、ＲＥＧＮ１４００、セパチニブ（ｓａｐａｔｉｎｉｂ）、ダコミチニブ、ポジオチニブ（ｐｏｚｉｏｔｉｎｉｂ）、ＡＳＬＡＮ００１、ＬＩＭ７１６、ＡＶ−２０３、デュリゴツズマブ（ｄｕｌｉｇｏｔｕｚｕｍａｂ）、ルムレツズマブ（ｌｕｍｒｅｔｕｚｕｍａｂ）、パニツムマブ、ＲＥＧＮ９５５、ＭＭ−１５１、ゲフィチニブ、Ｕ３−１２８７（ＡＭＧ８８８）、ＴＫ−Ａ３／ＴＫ−Ａ４、ＡＺＤ９２９１、ロシレチニブ、およびそれらの組合せが挙げられる。他の好適な標的化治療薬が、本明細書で開示される。さらに別の実施形態では、本方法は、標的化治療薬を対象に投与するステップをさらに含む。
別の態様では、本発明は、エストロゲンに関連するシグナル伝達経路に影響を与える標的化療法（例えばホルモン療法）のために、エストロゲン受容体アルファ非過剰発現（ＥＲα陰性）乳がんを有する対象を選択する方法であって、
ＥＲα非過剰発現（ＥＲα陰性）乳がんを有する対象から得られた生存可能な初代乳がん細胞の試料を調製し、ベース培地中で試料を培養するステップ；
細胞接着または付着などの生理応答パラメータに対する作用によって測定した場合、シグナル伝達経路を上方調節または下方調節するように、ＥＲαシグナル伝達経路に選択的に影響を与えることが公知の撹乱剤と、生存可能な初代乳がん細胞を接触させ、（２）試料の第２の部分を、撹乱剤および同じエストロゲン関連のシグナル伝達経路活性を阻害することが公知の確認用薬剤と接触させるステップ；
試料の各部分において生存可能な初代乳がん細胞の細胞接着または付着などの生理応答パラメータを連続的に測定するステップ；および
生理応答パラメータの連続的な測定の数学的分析によって測定量を決定して、試料の第１の部分と試料の第２の部分との値における差を同定するステップ；および
測定量を、エストロゲン受容体経路活性に関する正常な参照インターバルから導出されたカットオフ値と比較するステップ
を含み、
測定量がカットオフ値より大きい場合、対象は、エストロゲンに関連するシグナル伝達経路に影響を与える標的化療法での処置のために選択される、方法を提供する。
一実施形態では、本方法は、試料を培養するのに使用されるベース培地を、試料を撹乱剤と接触させる１２時間前以前７２時間前以降に、新鮮なベース培地で置き換えるステップを含む。
測定量は、例えば、撹乱されていない生存可能ながん細胞試料と比較した、撹乱剤と接触させた生存可能ながん細胞試料の部分における細胞接着または付着の増加または減少であってもよいし、またはそれを撹乱剤および確認用薬剤と接触させた後の、生存可能な細胞試料の部分における細胞接着または付着の増加または減少であってもよい。ＥＲαシグナル伝達経路に影響を与える好適な撹乱剤は当該分野において公知であり、本明細書で開示され、例えばエストラジオールである。別の実施形態では、生存可能な腫瘍細胞を、ＥＲαシグナル伝達経路を阻害することが公知の確認用薬剤とさらに接触させ、細胞接着または付着に対する確認用薬剤の作用を測定する。好適な確認用薬剤、例えば選択的エストロゲン受容体ダウンレギュレーターは、当業者に公知である。別の実施形態では、生存可能な腫瘍細胞を、ＥＲαシグナル伝達経路を標的化する標的化治療薬とさらに接触させ、細胞接着または付着に対する標的化治療薬の作用を測定する。ＥＲαシグナル伝達経路を標的化する好適な標的化治療薬は当該分野において公知であり、本明細書で開示され、例えばフルベストラントおよびタモキシフェンである。本方法は、標的化治療薬を対象に投与するステップをさらに含んでいてもよい。
さらに別の態様では、本発明は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与える標的化治療剤での療法のために、ＥｒｂＢ２非過剰発現または増幅がん（例えば、乳がん）を有する対象を選択する方法であって、
対象から得られた生存可能な初代がん細胞の試料を調製して、ベース培地中で試料を培養するステップ；
（１）対象から得られた生存可能ながん細胞の試料の第１の部分をニューレグリンと接触させ、（２）試料の第２の部分をニューレグリンおよび確認用薬剤と接触させるステップであって、確認用薬剤は、ニューレグリンと同じＥｒｂＢシグナル伝達経路を選択的に阻害する、ステップ；および／または（３）試料の第３の部分を上皮増殖因子と接触させ、（４）試料の第４の部分を上皮増殖因子および確認用薬剤と接触させるステップであって、確認用薬剤は、上皮増殖因子と同じＥｒｂＢシグナル伝達経路を選択的に阻害する、ステップ；
試料の各部分において、生存可能な初代がん細胞の生理応答パラメータを連続的に測定するステップ；
生理応答パラメータの連続的な測定の数学的分析によって測定量を決定して、試料の第１の部分と試料の第２の部分との値における差および／または試料の第３の部分と試料の第４の部分との値における差を同定するステップ；および
測定量を、ＥｒｂＢシグナル伝達経路活性の正常な参照インターバルから導出されたカットオフ値と比較するステップ
を含み、
測定量がカットオフ値より大きい場合、対象は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与える標的化治療剤での処置のために選択される、方法を提供する。
一実施形態では、本方法は、試料を培養するのに使用されるベース培地を、それらを撹乱剤と接触させる１２時間前以前７２時間前以降に、新鮮なベース培地で置き換えるステップを含む。
測定量は、例えば、撹乱されていない生存可能ながん細胞試料と比較した、撹乱剤と接触させた生存可能ながん細胞試料の撹乱された部分における細胞接着または付着の増加または減少であってもよいし、またはそれを撹乱剤および確認用薬剤と接触させた後の、生存可能な細胞試料の部分における細胞接着または付着の増加または減少であってもよい。
他のＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与える好適な撹乱剤は当該分野において公知であり、本明細書で開示される。別の実施形態では、腫瘍細胞を、ＥｒｂＢシグナル伝達経路を標的化する標的化治療薬とさらに接触させ、細胞接着または付着に対する標的化治療薬の作用を測定する。ＥｒｂＢシグナル伝達経路を標的化する好適な標的化治療薬は当該分野において公知であり、本明細書で開示される。本方法は、標的化治療薬を対象に投与するステップをさらに含んでいてもよい。
別の態様では、本発明は、標的化治療剤を投与することによって対象を処置する方法であって、対象は、対象の細胞においてシグナル伝達経路が活性であるかどうかを決定するための本発明の方法を使用した処置のために選択された、方法を提供する。したがって、本発明は、バイオマーカー陰性のがんを有する対象を、特異的なシグナル伝達経路を標的化する標的化治療剤で処置する方法であって、対象は、バイオマーカー陰性のがんを有するにもかかわらず活性なシグナル伝達経路を有することが示されたため、その対象が処置のために選択された、方法を提供する。
したがって、一実施形態では、本発明は、がんを有する（例えば、がんと診断されている）ヒト対象を処置する方法であって、ヒト対象のがん細胞は、非過剰発現非増幅ＥｒｂＢ２受容体を有し、本方法は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与える標的化治療剤を対象に投与することを含み、対象は、
対象から得られた生存可能な初代がん細胞の試料を調製して、ベース培地中で試料を培養するステップ；
（１）対象から得られた生存可能な初代がん細胞の試料の第１の部分を撹乱剤と接触させ、（２）試料の第２の部分を撹乱剤および確認用薬剤と接触させるステップであって、撹乱剤は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に選択的に影響を与え、確認用薬剤は、同じＥｒｂＢシグナル伝達経路に対する撹乱剤の作用を選択的に阻害する、ステップ；
試料の各部分において、生存可能な初代がん細胞の生理応答パラメータを連続的に測定するステップ；
生理応答パラメータの連続的な測定の数学的分析によって測定量を決定して、試料の第１の部分と試料の第２の部分との値における差を同定するステップ；および
測定量を、ＥｒｂＢシグナル伝達経路活性の正常な参照インターバルから導出されたカットオフ値と比較するステップ
を含む方法を使用して、処置のために選択されたものであり、
測定量がカットオフ値より大きい場合、対象は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与える標的化治療剤での処置のために選択される、方法を提供する。
一実施形態では、本方法は、試料を培養するのに使用されるベース培地を、試料を撹乱剤と接触させる１２時間前以前７２時間前以降に、新鮮なベース培地で置き換えるステップを含む。
様々な実施形態では、撹乱剤は、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＨＢ−ＥＧＦ、アンフィレグリン、ベータセルリン、エピジェン、エピレグリン、ニューレグリン−１、ニューレグリン−２、ニューレグリン−３、ニューレグリン−４、およびそれらの組合せからなる群より選択される。一実施形態では、本方法は、
（１）対象から得られた生存可能ながん細胞の試料の第１の部分をニューレグリンと接触させ、（２）試料の第２の部分をニューレグリンおよび確認用薬剤と接触させるステップであって、確認用薬剤は、ニューレグリンと同じＥｒｂＢシグナル伝達経路を選択的に阻害する、ステップ；および／または（３）試料の第３の部分を上皮増殖因子と接触させ、（４）試料の第４の部分を上皮増殖因子および確認用薬剤と接触させるステップであって、確認用薬剤は、上皮増殖因子と同じＥｒｂＢシグナル伝達経路を選択的に阻害する、ステップ；ならびに
生理応答パラメータの連続的な測定の数学的分析によって測定量を決定して、試料の第１の部分と試料の第２の部分との値における差および／または試料の第３の部分と試料の第４の部分との値における差を同定するステップ
を含む。
本方法は、生存可能な初代がん細胞を、撹乱剤およびＥｒｂＢシグナル伝達経路を標的化する標的化治療剤の両方と接触させ、生理応答パラメータに対する標的化治療剤の作用を測定するステップをさらに含んでいてもよい。
一実施形態では、生理応答パラメータは、細胞接着または付着である。別の実施形態では、生理応答パラメータは、細胞代謝産物のレベルである。別の実施形態では、生理応答パラメータは、ミトコンドリアの機能に関する細胞の酵素のレベルである。
一実施形態では、対象は、ＨＥＲ２非過剰発現非増幅がんを有する。別の実施形態では、対象は、ＥＧＦＲ陰性およびＨＥＲ２陰性がんを有する。別の実施形態では、対象は、ＥｒｂＢ２非過剰発現非増幅（ｎｏｎ−ａｍｐｌｉｆｅｄ）乳がんを有する。他の実施形態では、対象は、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、膠芽腫、肝細胞癌、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、卵巣がん、子宮頸がん、膵臓がん、前立腺癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非ホジキンリンパ腫および甲状腺癌からなる群より選択される、ＥｒｂＢ非過剰発現非増幅がんを有する。
一実施形態では、確認用薬剤は、２Ｃ４マウスモノクローナル抗体である。別の実施形態では、確認用薬剤は、ＨＥＲ２の細胞外セグメントのドメインＩＩ；ＨＥＲ２の細胞外セグメントのドメインＩＶ；ＥＧＦＲもしくはＨＥＲ２またはＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４の細胞質アデノシン三リン酸結合部位；ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２のアデノシン三リン酸結合部位におけるシステイン残基；およびそれらの組合せからなる群より選択される部位に結合する。
一実施形態では、標的化治療剤は、ラパチニブである。別の実施形態では、標的化治療剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アファチニブ、ネラチニブ、ＡＤＸＳ−ＨＥＲ２、ＴＡＫ−２８５、ＭＭ−３０２、ＭＭ−１２１、ＭＭ−１１１、ＲＥＧＮ１４００、サピチニブ（ｓａｐｉｔｉｎｉｂ）、ダコミチニブ、ポジオチニブ（ｐｏｚｉｏｔｉｎｉｂ）、ＡＳＬＡＮ００１、ＬＩＭ７１６、ＡＶ−２０３、デュリゴツズマブ、ルムレツズマブ、パニツムマブ、ＲＥＧＮ９５５、ＭＭ−１５１、セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、トラスツズマブエムタンシン、およびそれらの組合せからなる群より選択される。他の実施形態では、標的化治療剤は、ＨＥＲ２の細胞外セグメントのドメインＩＩ；ＨＥＲ２の細胞外セグメントのドメインＩＶ；ＥＧＦＲもしくはＨＥＲ２またはＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４の細胞質アデノシン三リン酸結合部位；ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２のアデノシン三リン酸結合部位におけるシステイン残基；およびそれらの組合せからなる群より選択される部位に結合する。
別の実施形態では、対象は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与えない治療剤、例えば標準的な化学療法剤またはＥｒｂＢとは異なるシグナル伝達経路に影響を与える異なる標的化治療剤でも処置される。
別の実施形態では、本発明は、ＥｒｂＢ２非過剰発現非増幅乳がんを有する（例えば、そう診断されている）ヒト対象を処置する方法であって、本方法は、ラパチニブを対象に投与することを含み、対象は、
対象から得られた生存可能な初代乳がん細胞の試料を調製して、ベース培地中で試料を培養するステップ；
試料を培養するのに使用されるベース培地を、試料を撹乱剤と接触させる１２時間前以前７２時間前以降に、新鮮なベース培地で置き換えるステップ；
（１）対象から得られた生存可能ながん細胞の試料の第１の部分を、撹乱剤としてのニューレグリンと接触させ、（２）試料の第２の部分をニューレグリンおよび確認用薬剤と接触させるステップであって、確認用薬剤は、ニューレグリンと同じＥｒｂＢシグナル伝達経路を選択的に阻害する、ステップ；および／または（３）試料の第３の部分を、撹乱剤としての上皮増殖因子と接触させ、（４）試料の第４の部分を上皮増殖因子および確認用薬剤と接触させるステップであって、確認用薬剤は、上皮増殖因子と同じＥｒｂＢシグナル伝達経路を選択的に阻害する、ステップ；
撹乱剤と接触させた生存可能な初代乳がん細胞の細胞接着または付着を連続的に測定するステップ；
生理応答パラメータの連続的な測定の数学的分析によって測定量を決定して、試料の第１の部分と試料の第２の部分との値における差および／または試料の第３の部分と試料の第４の部分との値における差を同定するステップ；ならびに
測定量を、ＥｒｂＢ経路活性に関する正常な参照インターバルから導出されたカットオフ値と比較するステップ；
を含む方法を使用して、ラパチニブでの処置のために選択されたものであり、
測定量がカットオフ値より大きい場合、対象は、ラパチニブでの処置のために選択される、方法を提供する。
上記に記載された同じ方法を、ラパチニブ以外の標的化治療剤に適用してもよい。したがって、他の実施形態では、標的化治療剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アファチニブ、ネラチニブ、ＡＤＸＳ−ＨＥＲ２、ＴＡＫ−２８５、ＭＭ−３０２、ＭＭ−１２１、ＭＭ−１１１、ＲＥＧＮ１４００、サピチニブ、ダコミチニブ、ポジオチニブ、ＡＳＬＡＮ００１、ＬＩＭ７１６、ＡＶ−２０３、デュリゴツズマブ、ルムレツズマブ、パニツムマブ、ＲＥＧＮ９５５、ＭＭ−１５１、セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、トラスツズマブエムタンシン、およびそれらの組合せからなる群より選択される。他の実施形態では、標的化治療剤は、ＨＥＲ２の細胞外セグメントのドメインＩＩまたは別のＥｒｂＢファミリーメンバーの同族のドメイン；ＨＥＲ２の細胞外セグメントのドメインＩＶまたは別のＥｒｂＢファミリーメンバーの同族のドメイン；ＥＧＦＲもしくはＨＥＲ２またはＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４の細胞質アデノシン三リン酸結合部位；ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２のアデノシン三リン酸結合部位におけるシステイン残基；およびそれらの組合せからなる群より選択される部位に結合する。
一実施形態では、対象は、ＥＧＦＲ陰性およびＨＥＲ２陰性乳がんを有する。
一実施形態では、対象はまた、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与えない治療剤、例えば標準的な化学療法剤またはＥｒｂＢとは異なるシグナル伝達経路に影響を与える異なる標的化治療剤でも処置される。
別の実施形態では、本発明は、エストロゲン受容体（ＥＲ）非過剰発現乳がんを有する（例えば、そう診断されている）ヒト対象を処置する方法であって、本方法は、ＥＲシグナル伝達経路に影響を与える標的化治療剤を対象に投与することを含み、対象は、
対象から得られた生存可能な初代乳がん細胞の試料を調製して、ベース培地中で試料を培養するステップ；
（１）対象から得られた生存可能な初代乳がん細胞の試料の第１の部分を、エストロゲン関連のシグナル伝達経路を上方調節または下方調節することが公知の撹乱剤と接触させ、（２）生存可能な初代がん細胞の試料の第２の部分を、撹乱剤および同じエストロゲン関連のシグナル伝達経路活性を阻害することが公知の確認用薬剤と接触させるステップ；
試料の各部分において、生存可能な初代がん細胞の生理応答パラメータを連続的に測定するステップ；
生理応答パラメータの連続的な測定の数学的分析によって測定量を決定して、試料の第１の部分と試料の第２の部分との値における差を同定するステップ；
測定量を、エストロゲン受容体経路活性に関する正常な参照インターバルから導出されたカットオフ値と比較するステップ；
を含む方法を使用して、処置のために選択されたものであり、
測定量がカットオフ値より大きい場合、対象は、エストロゲンに関連するシグナル伝達経路に影響を与える標的化治療剤での処置のために選択される、方法を提供する。
一実施形態では、本方法は、試料を培養するのに使用されるベース培地を、それらを撹乱剤と接触させる１２時間前以前７２時間前以降に、新鮮なベース培地で置き換えるステップを含む。
本方法は、初代乳がん細胞を、ＥＲシグナル伝達経路を標的化する標的化治療剤と接触させ、生理応答パラメータに対する標的化治療剤の作用を測定するステップをさらに含んでいてもよい。
一実施形態では、生理応答パラメータは、細胞接着または付着である。別の実施形態では、生理応答パラメータは、細胞代謝産物のレベルである。別の実施形態では、生理応答パラメータは、ミトコンドリアの機能に関する細胞の酵素のレベルである。
一実施形態では、対象は、ＥＲα陰性乳がんを有する。
一実施形態では、撹乱剤は、エストラジオール、エストロン、ラロキシフェン、エストリオール、ゲニステイン、ＤＨＥＡ、アンドロステンジオン、アンドロステンジオール、プロゲステロン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、それらの硫酸化型、およびそれらの組合せからなる群より選択される。
一実施形態では、標的化治療剤は、フルベストラント、タモキシフェン、レトロゾール、パルボシクリブ、アベマシクリブ（ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂ）、およびそれらの組合せからなる群より選択される。他の実施形態では、標的化治療剤は、アロマターゼ酵素（ＣＹＰ１９Ａ）のシトクロムＰ４５０サブユニット、エストロゲン受容体の活性化機能１（ＡＦＰ−１）ドメイン、サイクリン依存性キナーゼ４（サイクリンＤ１）、サイクリン依存性キナーゼ６（サイクリンＤ３）、およびそれらの組合せからなる群より選択される部位に結合する。
一実施形態では、対象はまた、ＥＲシグナル伝達経路に影響を与えない治療剤、例えば標準的な化学療法剤またはＥＲとは異なるシグナル伝達経路に影響を与える異なる標的化治療剤でも処置される。一実施形態では、対象は、化学療法、ＣＤＫ４／ＣＤＫ６阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤、およびそれらの組合せからなる群より選択される療法でも処置される。一実施形態では、対象は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与える標的化治療剤で処置される。例えば、一実施形態では、対象は、以前にエストロゲンに関連する標的化療法を受け、それに応答しなかったことがあり、次いでＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与える標的化治療剤で処置され、ここでＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与える標的化治療剤での処置が、エストロゲンに関連する標的化療法の機能を強化する。
一部の薬物は、特定の遺伝子関連の疾患兆候に対し標的化されている。このアプローチは、主として現在の予後予測ツールセットにおける重大な欠点のために、まだ広く利用されていない。本明細書に記載されるキットおよび方法は、個体の疾患に対して有効性を示す治療剤を選択する方法をもたらす。ある特定の実施形態では、細胞応答測定系（ＣＲｅＭＳ）で、治療剤を、罹患した組織からの無標識の生きた細胞全体に接触させ、治療剤の存在下で、細胞の生理学的パラメータにおけるそれらの変化または欠如を検出する。ベースラインの測定値と比較して疾患細胞の生理学的パラメータにおける変化を引き起こす対象を処置するために、治療剤が選択される。
したがって、一態様では、本発明は、初期の診断に、または処置全体にわたりのいずれかで、１つまたは複数の治療剤を選択する方法を提供する。ある特定の実施形態では、治療剤は、個体における疾患または障害の処置に使用するために商業的に承認されている。本方法は、細胞応答測定系で、対象からの少なくとも１つの単離された疾患細胞試料に、１つまたは複数の治療剤を投与するステップ；治療剤（１つまたは複数）の投与の前の細胞の応答パラメータのベースラインの測定値と比較して、治療剤（１つまたは複数）に応答して、疾患細胞試料の細胞の応答パラメータにおいて変化が起こるかどうかを決定するステップを含み、細胞の応答パラメータにおける変化が、個々の対象においてその治療剤（１つまたは複数）が疾患に対する治療有効性を有することを示す。ある特定の実施形態では、単離された疾患細胞試料は、無標識細胞全体を含む。ある特定の実施形態では、単離された疾患細胞における細胞の応答パラメータの変化は、規定の期間にわたり連続的にモニターされる。他の実施形態では、本方法は、少なくとも１つの細胞の応答または生理学的パラメータの変化をもたらす治療剤または治療剤の組合せを選択するステップ、および選択された治療剤を医療提供者に伝達するステップをさらに含む。他の実施形態では、本方法は、少なくとも１つの細胞の応答または生理学的パラメータの変化をもたらす治療剤または治療剤の組合せを対象に投与するステップをさらに含む。
他の実施形態では、個々の対象ごとに処置を選択するための方法は、個々の対象における疾患に対する薬剤の治療有効性を決定することを含み、本方法は、細胞応答測定系（ＣＲｅＭＳ）で、個々の対象からの少なくとも１つの単離された無標識疾患細胞試料に、薬剤を投与するステップであって、疾患細胞試料は、がん細胞試料、自己免疫疾患を有する対象からの細胞試料、外来性病原因子（ｆｏｒｅｉｇｎ ａｇｅｎｔ）に感染した組織からの細胞試料およびそれらの組合せからなる群より選択される、ステップ；治療剤の存在下で、規定の期間にわたり細胞試料の少なくとも１つの生理応答パラメータにおける変化を連続的に測定するステップ；およびベースラインの測定値と比較して、薬剤に対する細胞試料の生理応答パラメータにおいて変化が起こるかどうかを決定するステップを含み、ここで生理学的な応答における変化が、個々の対象においてその薬剤が疾患に対する治療有効性を有することを示す。
他の実施形態において、個々の対象におけるがんのための薬剤の治療上の有効性を決定するステップを含む、がんを有する個々の対象に対する処置を選択するための方法は、バイオセンサーにおいて、薬剤を個々の対象由来の少なくとも１種の単離された無標識がん細胞試料に投与するステップと、治療剤の存在下で、規定の期間にわたって、細胞試料の少なくとも１種の生理応答パラメータの変化を連続的に測定するステップと、ベースライン測定値と比較して細胞試料の生理応答パラメータの変化を提示する、対象の処置のための治療剤を選択するステップとを含む。
別の態様では、本発明は、対象から得られた罹患細胞試料を、経路が正常に機能しているときに細胞経路を刺激する（ａｇｏｎｉｚｅ）かまたはそれに拮抗することが公知の撹乱剤と接触させることによって、個々の対象から得られた罹患細胞における細胞経路の機能的ステータスを決定する方法を提供する。１つまたは複数の生理応答パラメータは、試料中の生存可能な細胞において連続的に測定されてもよい。連続的な測定の分析を使用して、罹患細胞試料において、撹乱剤の存在下で、好適な対照と比べて１つまたは複数の生理応答パラメータにおける変化が起こるかどうかを決定することができる。撹乱剤の存在下における、好適なベースラインまたは対照と比べた１つまたは複数の生理応答パラメータにおける変化は、撹乱剤によって標的化された細胞経路が、個々の対象において機能的であることを示す。
別の態様では、本発明は、シグナル伝達経路に影響を与えることが公知の薬剤、すなわち目的のシグナル伝達経路に特異的な薬剤によって引き起こされた経路撹乱の量を決定する方法を提供する。この実施形態では、罹患細胞試料を、両方ともシグナル伝達経路に影響を与えることが公知である撹乱剤および確認用薬剤と接触させる。生理応答パラメータを測定し、撹乱剤のみと接触させた細胞試料と比べた変化を決定する。確認用薬剤が阻害するシグナル伝達経路活性の量は、目的のシグナル伝達経路活性の量に相当する。撹乱剤が、シグナル伝達経路にとってそれほど特異的ではなく、目的のシグナル伝達経路に加えて他の細胞シグナル伝達活性を開始させる場合、確認用薬剤は、撹乱剤によって開始したその他の細胞活性を阻害することができないと予想される。したがって確認用薬剤は、細胞試料を目的のシグナル伝達経路に関する撹乱剤と接触させることに起因する生理応答パラメータにおける変化の量を決定する方法を提供する。これは、撹乱剤が目的のシグナル伝達経路に関係しない活性を開始させるケースにおいて偽陽性の結果を制限するという目的に役立つ。
別の態様では、本発明は、個々の対象ごとに標的化治療剤を選択する方法であって、本方法は、対象から得られた罹患細胞試料を、経路が正常に機能しているときに細胞経路を刺激するかまたはそれに拮抗することが公知の撹乱剤と接触させるステップ、試料中の生存可能な細胞において１つまたは複数の生理応答パラメータを連続的に測定するステップ、および連続的な測定の分析によって、罹患細胞試料において、撹乱剤の存在下で、好適なベースラインまたは対照と比べて、１つまたは複数の生理応答パラメータにおける変化が起こるかどうかを決定するステップによってなされ、撹乱剤の存在下における、好適なベースラインまたは対照と比べた１つまたは複数の生理応答パラメータにおける変化は、対象が、細胞経路を標的化する標的化治療剤に応答すると予想されることを示す、方法を提供する。
一実施形態では、前述の方法はまた、標的化治療剤を対象に投与するステップを含んでいてもよい。
ある特定の実施形態では、生理応答パラメータは、細胞接着、細胞付着、細胞形態、細胞増殖、細胞のシグナル伝達、細胞密度、細胞のサイズ、細胞の形状、細胞極性、ｐＨ、Ｏ２、ＣＯ２、グルコース、およびそれらの組合せであってもよい。例えば、生理応答パラメータは、細胞接着または付着であってもよい。
一実施形態では、撹乱剤は、ＭＡＰＫ−ＰＫ、ＲＡＳ／ＲＡＦ、ＲＨＯ、ＦＡＫ１、ＭＥＫ／ＭＡＰＫ、ＭＡＫ、ＭＫＫ、ＡＫＴ、ＥＧＦ受容体、Ｈｅｒ２受容体、Ｈｅｒ３受容体、Ｈｅｒ４受容体、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ＧＰＥＲ３０、ＰＩＫ３／ＰＴＥＮ、ＶＥＧＦ受容体経路阻害剤、細胞接着、ＴＧＦベータ／ＳＭＡＤ、ＷＮＴ、ヘッジホッグ／ＧＬＩ、ＨＩＦ１アルファ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｎｏｔｃｈ、Ｇ１／Ｓ遷移の制御、ＤＮＡ損傷の制御、およびアポトーシスを含む１つまたは複数の細胞経路を標的化する。撹乱剤は、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物、リガンド、有機分子、シグナル伝達因子、生化学的物質、またはそれらの組合せであってもよい。一実施形態では、撹乱剤は、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＰＤ−１、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＣ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、サイクリンＦ、およびＧ１／Ｓサイクリンからなる群より選択される、細胞周期の調節に関与する細胞経路の要素に標的化される。
標的化治療剤としては、ある特定の実施形態では、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ラパチニブ、ドセタキセル、タモキシフェン、シスプラチン、アブラキサン、パクリタキセル注射、ブレンツキシマブベドチン、エベロリムス、ペメトレキセド、エキセメスタン、オファツムマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、イリノテカン、ビカルタミド、オキサリプラチン、セツキシマブ、ビスモデギブ、クエン酸トレミフェン、フルベストラント、ゲムシタビン、イマチニブ、イキサベピロン、トポテカン、アキシチニブ、ロミデプシン、カバジタキセル、ソラフェニブ、インフリキシマブ、レナリドマイド、リツキシマブ、ダサチニブ、スニチニブ、エルロチニブ、ニロチニブ、パクリタキセル、テモゾロミド、トリオキシド、パニツムマブ、ボルテゾミブ、アザシチジン、パゾパニブ、クリゾチニブ、カペシタビン、イピリムマブ、ベムラフェニブ、酢酸ゴセレリン、アビラテロン、ＢＨ３模倣物、ナビトクラックス、アナストロゾール、レトロゾール、アロマターゼ阻害剤、シクロホスファミド、ドキソルビシン、メトトレキセート、フルオロウラシル、イキサベピロン、カルボプラチン、アフリベルセプト、テムシロリムス、イブリツモマブ、アビラテロン、クスチルセン、ネラチニブ、エンザルタミド、ニボルマブ、パルボシクリブ、レゴラフェニブ、エンチノスタット、アファチニブ、ＡＲＮ−５０９、ＡＲＮ−８１０、ＢＩＮＤ−０１４、ダブラフェニブ、ダラツムマブ、ランブロリズマブ、ＬＤＫ３７８、ＭＭ−１２１、ｓｙｍ００４、トラスツズマブエムタンシン、チボザニブ、トラメチニブ、アキシチニブ、ＬＹ２８３５２１９、ＭＰＤＬ３２０Ａ、オビヌツズマブ、Ｓｙｍ００４、トシツモマブ、トラメチニブ、ネシツムマブ、ラムシルマブ、およびそれらの組合せの１つまたは複数を挙げることができる。
一実施形態では、罹患細胞試料は、がん細胞試料、例えば、乳がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、膠芽腫、肝細胞癌、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、卵巣がん、子宮頸がん、膵臓がん、前立腺癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非ホジキンリンパ腫および甲状腺癌または頭頸部がんである。
一部の実施形態では、１つまたは複数の生理応答パラメータにおける変化は、非線形のユークリッド分析を使用して評価することができる。例えば、１つまたは複数の生理応答パラメータにおける変化は、複数の時点における差の算術的な総和、時間的最大値、時間的最小値、最大値または最小値に到達する時間、傾きの変化、バイオセンサーシグナルにおける絶対値の低下、全ての測定値の合計、またはそれらの組合せなどの分析方法を使用して評価することができる。一実施形態では、１つまたは複数の生理応答パラメータにおける変化は、時間的最大値または最小値における変化によって測定される。
別の態様では、本発明は、個々の対象において撹乱剤および／または治療剤の影響を受けた細胞経路の要素を同定する方法を提供する。これらの方法は、対象から得られた単離された無標識細胞試料を、撹乱剤および／または治療剤と接触させるステップ、試料中の生存可能な細胞において少なくとも１つの生理応答パラメータを連続的に測定することによってこれら薬剤の作用をモニターするステップ、連続的な測定の分析によって、生理応答パラメータにおける変化が起こるかどうかを決定することにより、これら薬剤への試料の感受性を特徴付けるステップ、およびプロテオミクス、ｑＰＣＲ、ゲノミクス、ＲＮＡ定量化、タンデム液体クロマトグラフィー−質量分析法、およびメタボロミクスから選択される方法を使用して、これら薬剤によって標的化された細胞経路の要素を分析することにより、細胞経路の要素が、細胞試料中の撹乱剤および／または治療剤の存在によって変更されるかどうかを決定するステップを含む。一実施形態では、試料への撹乱剤の活性は、細胞経路の要素の分析の前に停止される。
別の実施形態では、本発明は、標的化治療剤に応答する可能性が高いかまたは可能性が低い患者を同定する試験のためのカットオフ値を決定する方法を提供する。この方法は、それぞれが同じ疾患を有し、同じ治療薬を処方されている患者の群を選択するステップ；患者の群内の各対象で試験値を誘導するステップであって、試験値は、治療剤および／または撹乱剤での処置中の患者細胞試料における１つまたは複数の生理応答パラメータの連続的な測定の分析に由来する、ステップ；試験された全患者の相当なパーセンテージにとって予め規定した臨床エンドポイントに到達するのに十分な期間にわたり、試験された患者の群の各メンバーの健康ステータスを観察するステップ；患者が予め規定した臨床エンドポイントに到達した場合、患者のそれぞれにとってそれに到達するのに必要な時間の長さを記録するステップ；値が他方と等距離である２つまたはそれより多くの候補カットオフ値を同定するステップであって、各候補カットオフ値は、それ未満の値において患者は応答するまたは応答しないと予測され、それ超の値において患者は、そのスコアがカットオフ値未満になる方式と逆の方式で応答すると予測される値を表す、ステップ；統計的方法を使用して、試験値がカットオフであるかまたはそれ未満であった患者の臨床エンドポイント期間と、試験値がカットオフ超であった患者の臨床エンドポイント期間との差を分析するステップ；およびカットオフ値超の患者の群とカットオフ値未満の患者の群との間に統計学的に有意な差があることを示す候補カットオフ値の群のなかから、療法に応答しないと予測される患者の最大のパーセンテージをもたらすカットオフ値を選択するステップを含んでいてもよい。
別の態様では、本発明は、個々の対象への治療薬の有効性を予測する方法であって、本方法は、同じ疾患を有し、同じ治療薬で試験された個々の対象の群で試験結果の値を記録するステップ、および個々の対象の試験値のパーセンタイル順位を決定するステップであって、個々の対象の試験値のパーセンタイル順位は、個々の対象における疾患への治療剤の有効性を予測する、ステップによってなされる、方法を提供する。一実施形態では、本方法は、記録された試験結果の値をリストにコンパイルするステップ、およびそれぞれ個々の対象の絶対的な数値の試験値に基づき試験された個々の対象ごとの試験結果の値に基づき、リストを順番付けするステップを含む。
別の態様では、本発明は、輸送培地を含有する、個々の対象からの疾患細胞試料のための容器；輸送培地を含有する、個々の対象からの対照細胞試料のための容器；バイオセンサー；ならびにバイオセンサーからのデータを出力に変換すること、出力を、応答なし、弱い応答性、および応答性と分類すること、およびその分類を含む報告を作成することのためのコンピューター実行可能な命令を有する非一過性コンピューター可読媒体を含むキットを提供し、ここで出力は、規定の期間にわたる細胞の生理応答パラメータにおける変化を示し、細胞の生理応答パラメータは、ｐＨ、細胞接着、細胞付着のパターン、細胞増殖、細胞のシグナル伝達、細胞生存、細胞密度、細胞のサイズ、細胞の形状、細胞極性、Ｏ２、ＣＯ２、グルコース、細胞周期、同化、異化、小分子の合成および生成、転換、ならびに呼吸、ＡＴＰ、カルシウム、マグネシウム、および他の荷電イオン、タンパク質、特定の経路のメンバーの分子、様々な細胞区画におけるＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、ゲノミクス、およびプロテオミクス、翻訳後修飾およびメカニズム、２次メッセンジャーのレベル、ｃＡＭＰ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡおよび生理学的機能を有する他のＲＮＡ、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される。
さらに別の態様では、本発明は、個々の対象において撹乱剤および／または治療剤の影響を受けた細胞経路の要素を同定する方法であって、
対象から得られた単離された無標識細胞試料を、撹乱剤および／または治療剤と接触させるステップ；
試料中の生存可能な細胞において少なくとも１つの生理応答パラメータを連続的に測定することによってこれら薬剤の作用をモニターするステップ；
連続的な測定の分析によって、生理応答パラメータにおける変化が起こるかどうかを決定することにより、これら薬剤への試料の感受性を特徴付けるステップ；
試料への撹乱剤の活性を停止させるステップ；および
プロテオミクス、ｑＰＣＲ、ゲノミクス、ＲＮＡ定量化、タンデム液体クロマトグラフィー−質量分析法、およびメタボロミクスから選択される方法を使用して、これら薬剤によって標的化された細胞経路の要素を分析することにより、細胞経路の要素が、細胞試料中の撹乱剤および／または治療剤の存在によって変更されるかどうかを決定するステップ
を含む、方法を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、個々の対象の疾患を機能的なレベルで定義する目的で、個々の対象から得られた罹患細胞における細胞経路の機能的ステータスを決定する方法であって、
対象から得られた罹患細胞試料を、経路が正常に機能しているときに細胞経路を刺激するかまたはそれに拮抗することが公知の撹乱剤と接触させるステップ；
試料中の生存可能な細胞において１つまたは複数の生理応答パラメータを測定するステップ；および
測定の分析によって、罹患細胞試料において、撹乱剤の存在下で、好適なベースラインまたは対照と比べて、１つまたは複数の生理応答パラメータにおける変化が起こるかどうかを決定するステップ
を含み、
撹乱剤の存在下における、好適なベースラインまたは対照と比べた１つまたは複数の生理応答パラメータにおける変化は、撹乱剤によって標的化された細胞経路が、個々の対象において異常であるかまたは正常であることを示す、方法を提供する。
測定するステップは、例えば、試料中の生存可能な細胞において、１つまたは複数の生理応答パラメータを連続的に測定するステップまたは間欠的に測定するステップであってもよい。
さらに別の態様では、本発明は、標的化治療薬が対象のがん細胞において機能的であるかどうかを決定するために、対象から得られた生存可能ながん細胞の試料において、標的化治療薬である第１の薬剤が、それが対処することが意図されるシグナル伝達経路への作用を有するかどうかを評価する方法であって、
対象から得られた生存可能な初代がん細胞の試料を調製して、ベース培地中でそれらを培養するステップ；
試料を培養するのに使用されるベース培地を、それらを薬剤と接触させる１２時間前以前７２時間前以降に、新鮮なベース培地で置き換えるステップ；
細胞接着または付着に対する作用によって測定した場合、シグナル伝達経路を上方調節または下方調節するように、第１の薬剤が対処することが意図されるシグナル伝達経路に選択的に影響を与えることが公知の第１の薬剤および第２の薬剤と、試料を接触させるステップ；
単独の第１の薬剤または第２の薬剤と接触させた対象から得られた生存可能ながん細胞の試料と比べて、第１の薬剤と第２の薬剤の両方と接触させた試料における生存可能な細胞の細胞接着または付着を連続的に測定するステップ；および
単独の第１の薬剤または第２の薬剤と接触させた試料と比較して、第１の薬剤と第２の薬剤の両方と接触させた試料中で細胞接着または付着における変化が起こったかどうかを連続的な測定の数学的分析によって決定するステップ；および
対象における治療的使用のために、単独の第１または第２の薬剤と比較して、第２の薬剤と組み合わせた場合に細胞接着または付着における変化を引き起こすことから、細胞シグナル伝達経路における変化を示し、標的化治療薬が対象のがん細胞において機能的であると予測される第１の薬剤を選択するステップ
を含む、方法を提供する。
図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃは、２名のＨＥＲ２過剰発現乳がん患者（患者Ｂ１およびＢ４）由来の細胞、ＨＥＲ２過剰発現乳がんに適応される２種の標的化経路薬物（ラパチニブおよびトラスツズマブ）およびヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）を用いて行った、「ＣＥＬｘ」検査の結果を示す図である。検査におけるＢ１およびＢ４細胞の生理的変化を細胞応答測定系（ＣＲｅＭＳ）により測定し、ＣＲｅＭＳからの出力を図面に記録する。Ｂ１およびＢ４細胞それぞれの一方の試料をラパチニブで前処置し、Ｂ１およびＢ４細胞それぞれのもう一方の試料をトラスツズマブで前処置し、その後のＥＧＦ撹乱に対する細胞の各セットの生理応答を、検査を通じて連続的基準で記録する。図１Ａに示すＣＥＬｘ経路シャットダウン検査は、患者Ｂ１が、トラスツズマブに応答しないが、ラパチニブに応答すると予測する。図１Ｂに示す結果は、また、患者Ｂ４が、トラスツズマブおよびラパチニブの両方に応答すると予測する。ＣＥＬｘ検査予測および第三者臨床参照（ｔｈｉｒｄ ｐａｒｔｙ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）によって記録された結果の比較を図１Ｃに示す；この図は、ＣＥＬｘ検査が、臨床参照標準によって記録された結果を的確に予測したことを示し、この結果によると、患者Ｂ１は、トラスツズマブに無応答性であり、ラパチニブに応答性であることが判明し、患者Ｂ４は、両方に応答性であることが判明した。 図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃは、２名の乳がん患者（患者Ｂ１およびＢ２）由来の細胞、抗増殖薬パクリタキセルを用いて行ったＣＥＬｘ検査の結果を示す図である。検査におけるＢ１およびＢ２細胞の生理的変化をＣＲｅＭＳにより測定し、ＣＲｅＭＳからの出力を図面に記録する。Ｂ１およびＢ２細胞それぞれの一方のセットをパクリタキセルで処置し、Ｂ１およびＢ２細胞のもう一方の対照セットには薬物を与えなかった；細胞の各セットの生理応答を４８時間の経過にわたって連続的に記録した。Ｂ２被験細胞は、Ｂ２対照細胞と比較したＣＲｅＭ出力の有意な減少に反映される通り、パクリタキセルに対する初期応答性を示したが、概して２４時間後、ＣＲｅＭ出力が逆転し、被験細胞が増殖し始めており、もはやこの薬物に応答性でないことを示す。Ｂ１被験細胞は、検査期間を通じてＢ１対照細胞と比較したＣＲｅＭ出力の減少に反映される通り、パクリタキセルに対する速効性かつ連続的な応答性を示す。図２Ａおよび図２Ｂに提示されているＣＥＬｘ検査結果は、患者Ｂ１およびＢ２が両者共にパクリタキセルに応答すると予測する。ＣＥＬｘ検査予測および第三者臨床参照によって記録された結果の比較を図２Ｃに示す；この図は、ＣＥＬｘ検査が、臨床参照標準によって記録された結果を的確に予測したことを示し、この結果によると、患者Ｂ１およびＢ２は両者共に、パクリタキセルに応答性であることが判明した。 図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃは、２名の結腸がん患者（患者Ｃ１およびＣ２）由来の細胞、ＥＧＦならびに結腸がんに適応される２種の薬物、セツキシマブおよびイリノテカンの組み合わせを用いて行ったＣＥＬｘ検査の実験の全時間経過にわたる結果を示す図である。検査におけるＣ１およびＣ２細胞の生理的変化をＣＲｅＭＳにより測定し、ＣＲｅＭＳからの出力を図面に記録する。Ｃ１およびＣ２被験細胞それぞれの一方のセットをセツキシマブおよびイリノテカンで処置し、対照Ｃ１およびＣ２細胞のもう一方のセットには薬物を与えなかった；細胞の各セットの生理応答を連続的に記録した。Ｃ１およびＣ２被験細胞は両者共に、これらそれぞれの対照細胞と比較した被験細胞のＣＲｅＭＳ出力の低下に反映されている通り、薬物組み合わせに対する応答性を示した。これらの結果は、患者Ｃ１およびＣ２が両者共に、セツキシマブおよびイリノテカンの組み合わせに応答すると予測する。ＣＥＬｘ検査予測および第三者臨床参照によって記録された結果の比較を図３Ｃに示す；この図は、ＣＥＬｘ検査が、臨床参照標準によって記録された結果を的確に予測したことを示し、この結果によると、患者Ｃ１およびＣ２は両者共に、セツキシマブおよびイリノテカン組み合わせに対し応答性であることが判明した。 図４は、１１種の異なる患者細胞（患者Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７由来の乳がん細胞、患者Ｃ１およびＣ２由来の結腸がん細胞ならびに患者Ｌ１およびＬ２由来の肺がん細胞）および１５種の異なる薬物（カペシタビン、セツキシマブ、ドセタキセル、フルオロウラシル、ゲフィチニブ、ＧＳＫ１０５９６１５、ＧＳＫ１１２０２１２、ラパチニブ、パクリタキセル、パゾパニブ、トラスツズマブ、トポテカン、シスプラチン、エルロチニブおよびオキサリプラチン（ｏｘｉｌｉｐｌａｔｉｎ））の選択から可能な細胞および薬物組み合わせの一部を用いて行った、５７種のＣＥＬｘ検査の概要結果を示す図である。図４は、患者Ｌ１およびＬ２細胞におけるパクリタキセルおよびシスプラチンの薬物組み合わせを用いて行った２種のＣＥＬｘ組み合わせ検査ならびに患者Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４細胞におけるトラスツズマブおよびラパチニブの薬物組み合わせによる４種のＣＥＬｘ検査から得られた結果も示す。１１種の異なる細胞経路を標的化する総計１６種の異なる薬物を、この実験セットにおける細胞試料に導入した。実験毎に、その対照細胞と比較した被験細胞の生理応答の変化を計算した。図４における各ボックスは、５０％超（黒塗ボックス）、５％〜５０％の間（縦線ボックス）、５％未満（横線ボックス）または検査なし（白ボックス）のいずれかとして、各実験において測定された生理応答の変化を分類する。この図に表されている一連の実験は、広範な薬物に曝露された後に種々のがん細胞型において生じる生理的変化を測定するＣＥＬｘ検査の能力を例示する。 図５は、薬物セツキシマブおよびＥＧＦにより、４名の乳がん患者（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４）由来の細胞において別々に行った８種のＣＥＬｘ検査の概要結果を示す図である。細胞Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４における検査の一方のセットは、「光学的」バイオセンサーＣＲｅＭＳを用いて行い、同じ細胞における検査のもう一方のセットは、「インピーダンス」バイオセンサーＣＲｅＭＳを用いて行った。ＣＲｅＭＳによって記録された出力のパーセンテージ変化の範囲を示す概要様式で結果を提示する。検査した患者細胞毎に、各ＣＲｅＭＳによって記録された生理的変化の量は同一であった。これらの結果は、ＣＥＬｘ検査方法が、細胞における異なる生理的変化を測定する異なる種類のＣＲｅＭＳを利用できることを例示する。 図６は、実施例１〜４に記載されている６５種の検査の概要結果を提示する図である。１１種の異なる細胞経路を標的化する総計１６種の異なる薬物を、この実験セットにおいて、３種の異なる種類のがんを患う１１名の患者由来の細胞試料へと導入した。実験毎に、そのベースラインまたは対照細胞と比較した被験細胞の生理応答の変化を計算した。図６における各ボックスは、５０％超、５％〜５０％の間または５％未満のいずれかとして、各実験において測定された生理応答の変化を分類する。ＣＥＬｘ検査は、生理応答の変化が５％〜５０％の間または５０％超である場合、治療法に対する肯定的な患者応答を予測し、生理応答の変化が５％未満である場合、治療法に対する患者応答なしを予測する。応答は次の通りに示されている：５０％超（黒塗ボックス）、５％〜５０％の間（縦線ボックス）、５％未満（横線ボックス）または検査なし（白ボックス）。この図に表されている一連の実験は、広範な細胞経路に影響を与える広範な薬物に曝露された後に種々のがん細胞型において生じる生理的変化を測定するＣＥＬｘ検査の能力を例示する。 図７は、図６に記載されているＣＥＬｘ検査予測（個々の薬物に対する被験細胞応答）と、薬物に対する患者の応答性を記録した第三者から得られた結果との間の相関（０％または１００％のいずれか）を記録する図である。黒塗ボックスは、治療剤に対する応答または無応答に関する細胞試料における検査結果と細胞試料の公知のステータスとの間の１００％一致を表し、空白ボックスは検査されておらず、灰色の影付きボックスは、治療剤に対する応答または無応答に関する公知の細胞試料ステータスとの一致なしを表す。検査された事例において、ＣＥＬｘ検査および第三者は、１事例を除いて同じ結果を生じ、ＣＥＬｘ検査の持つ、広範な細胞経路を標的化する１６種の異なる薬物に対する乳房、肺および結腸患者応答を予測する力を例示する。 図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃおよび図８Ｄは、異なる患者がん細胞および薬物のＣＥＬｘ検査結果、対、薬物に対する患者の応答性を記録した第三者から得られた結果を記録する図である。図８Ａは、検査した全１２種のがん患者細胞および１６種の異なる薬物の結果の比較を記録する。図８Ｂは、単独および１３種の異なる薬物と組み合わせて検査した８種の乳がん患者細胞の結果の比較を記録する。図８Ｃは、単独および３種の異なる薬物と組み合わせて検査した２種の異なる結腸がん患者細胞の結果の比較を記録する。図８Ｄは、単独および３種の異なる薬物と組み合わせて検査した２種の異なる肺がん患者細胞の結果の比較を記録する。各図において、ＣＥＬｘ検査は、１事例を除いて、患者が特定の薬物または薬物の組み合わせに応答するかしないか的確に予測することが示されている。 図９は、検査した全患者細胞および薬物ならびに検査した患者、薬物、経路およびＣＲｅＭＳの種類のサブグループに関するＣＥＬｘ検査の感度および特異性を記録する図である。全体および試験したサブグループそれぞれの内において、ＣＥＬｘ検査は、高い感度（９８％＋）および特異性（９９．９％＋）を生じた。これらの結果は、異なるがん細胞型、薬物の種類、ＣＲｅＭＳの種類および標的化する経路にわたる検査の予測力を例示する。 図１０Ａ〜Ｃは、単独の、またはＰＩ３Ｋ経路阻害剤（ラパチニブ）と併用したＰＩ３Ｋ経路因子（ＮＲＧ１）の存在下での乳がん細胞株および初代腫瘍細胞における細胞付着シグナル伝達（ＣＡＳ）によって測定した場合の、特異的なＰＩ３Ｋ経路活性の測定を記録する図である。図１０Ａおよび１０Ｂは、ＮＲＧ１は、ＢＴ４７４細胞（図１０Ａ）および患者５４の腫瘍細胞（図１０Ｂ）においてＣＡＳを増加させること、およびラパチニブは、ＣＡＳを低下させることを示し、ＮＲＧ１だけを用いて測定されたＣＡＳは、ＰＩ３Ｋ経路に沿った活性に特異的であったことが確認される。図１０Ｃは、初代乳がん細胞（患者５４の細胞）と健康な乳がん細胞（Ｈ６２細胞）との間のＮＲＧ１への差次的な応答を示し、疾患活性の表現型バイオマーカーとしてシグナル伝達経路活性を使用することの有効性が実証される。 図１１Ａ〜Ｃは、単独の、またはＥＲα経路阻害剤（フルベストラント）と併用したＥＲα経路因子（エストラジオール）の存在下での乳がん細胞株および初代腫瘍細胞における細胞付着シグナル伝達（ＣＡＳ）によって測定した場合の、特異的なＥＲα経路活性の測定を記録する図である。図１１Ａおよび１１Ｂは、エストラジオールが、ＢＴ４７４細胞（図１１Ａ）および患者５４の腫瘍細胞（図１１Ｂ）においてＣＡＳを増加させること、およびフルベストラントがＣＡＳを低下させたことを示し、エストラジオールだけを用いて測定されたＣＡＳは、ＥＲα経路に沿った活性に特異的であったことが確認される。図１１Ｃは、初代乳がん細胞（患者５４の細胞）と健康な乳がん細胞（Ｈ６２細胞）との間のエストラジオールへの差次的な応答を示し、疾患活性の表現型バイオマーカーとしてシグナル伝達経路活性を使用することの有効性が実証される。 図１２は、実施例７で試験された異なる患者材料におけるＨＥＲ２の発現に関するＦＡＣＳデータを示す棒グラフである。 図１３は、異なる生存率の細胞に関する細胞付着（インピーダンス）ＣＡＳ結果を示すグラフである。 図１４は、ＨＥＲ２により誘発される疾患を有するＨＥＲ２が低い患者のＥＧＦおよびＮＲＧ１撹乱に関する、確認用薬剤を用いたＣＡＳの結果を示すグラフである。 図１５Ａ〜Ｄは、異なる細胞株および患者試料での、確認用薬剤を用いたおよび用いないＮＲＧ１撹乱に関するＣＡＳの結果の比較を示す棒グラフである。図１５Ａは、ＨＥＲ２過剰発現細胞株（ＳＫＢＲ３）に関する結果を示し、図１５Ｂは、ＨＥＲ２により誘発される疾患を有するＨＥＲ２非過剰発現患者（Ｒ３９）に関する結果を示し、図１５Ｃは、ＨＥＲ２により誘発される疾患を有さないＨＥＲ２非過剰発現患者（Ｒ４９）に関する結果を示し、図１５Ｄは、健康な患者（Ｒ６２）に関する結果を示す。 図１６は、ＨＥＲ２経路のコンパイルされた試料データのＮＲＧ１撹乱に関するＣＡＳの結果を示すグラフである。 図１７は、ＨＥＲ２経路のコンパイルされた試料データのＥＧＦ撹乱に関するＣＡＳの結果を示すグラフである。 図１８は、シグナル伝達経路活性測定におけるベース培地のエージングの作用を示すグラフである。
本発明をより容易に理解することができるように、まず特定の用語を定義する。追加の定義は、詳細な説明中で明示される。
Ａ．定義
別段の規定がなければ、本明細書に用いられているあらゆる技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書において言及されているあらゆる特許、出願、公開出願および他の刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。本セクションに表記されている定義が、参照により本明細書に組み込まれている特許、出願、公開出願および他の刊行物に表記されている定義に反し、またはその他これと不一致である場合、本セクションに表記されている定義は、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容が援用されている定義に勝る。次の用語は、本明細書において、次の定義を有することが意図されている。
用語「約」は、本明細書において、およそ、その近辺、概してまたはその前後を意味する。用語「約」は、数的範囲と併せて用いられる場合、表記されている数値の上下に境界を延長することにより該範囲を修正する。一般に、用語「約」は、本明細書において、記述されている値の上下に数値を１０％の変動で修正するよう用いられている。一態様において、用語「約」は、それが用いられている数の数値のプラスマイナス２０％を意味する。したがって、約５０％は、４５％〜５５％の範囲内を意味する。端点によって本明細書に列挙されている数的範囲は、該範囲内に含まれるあらゆる数および分率を包含する（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４および５を包含する）。
用語「アクチベーター」、「活性化する」、「撹乱因子（ｐｅｒｔｕｒｂａｎｔ）」、「撹乱する」、および「撹乱」は、細胞への言及と共に使用される場合、試薬、承認された薬物、開発中の実験化合物および薬物様の分子および実験薬物、有機分子、増殖因子、シグナル伝達因子、生化学的物質、核酸、サイトカイン、ケモカイン、または当業者に周知の細胞に対する作用を有するタンパク質を使用した、細胞の生理学的な操作の特異的な対象または活性を指す。操作は、細胞の生理学的活性のあらゆるモジュレーションを指し、これらに限定されないが、上方または下方調節を挙げることができる。アクチベーター剤または撹乱因子としては、加えて、これらに限定されないが、以下の単一の薬剤またはそれらの組合せのいずれか：これらのメンバーまたはメンバーの組合せに限定されないが、以下のリスト：血管内皮増殖因子、ホスファチジルイノシトール、上皮増殖因子およびＥＧＦペプチド配列を有する因子、肝細胞増殖因子、ｍ−ＣＳＦ、ＲＡＮＫリガンド、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、インスリン増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、肝細胞増殖因子、ニューレグリンまたは神経性のレグリン（ｒｅｇｕｌｉｎ）、ヘレグリンおよび受容体のＥｒｂＢファミリーに関連する因子、エストロゲンならびにそのホルモン前駆体および分解産物（例えばＤＨＥＡ、エストロン、アンドロステンジオン）、プロゲステロン、テストステロン、フォレート、アデノシン三リン酸、ＡＭＰ、サイクリックＡＭＰ、ならびにＦＡＳリガンド、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、または細胞経路もしくはシグナル伝達の撹乱の他の薬剤、例えば対象の血漿もしくは血清もしくは患者細胞（特に線維芽細胞および上皮）に由来する上清分画、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ＋、Ｃｌ−、Ｃａ＋２、グルコース、グルタミン、ヒスチジン、マンニトール、およびトリプトファン、抗生物質（ラパマイシン）、必須および非必須アミノ酸、ビタミン、他の有機化合物、微量ミネラルおよび無機塩、亜セレン酸ナトリウム、血清、細胞抽出物、分画化された細胞抽出物または分画化された血清、細胞外シグナル伝達因子、細胞内シグナル伝達因子、インスリン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、ホスホリルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈｏｐｈｏｒｙｌｅｔｈａｎｏｌｏａｍｉｎｅ）、トリヨードチロニン（ｔｒｉｉｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）、ピルビン酸ナトリウム、マイトジェン、オキシトシン、イソプロテレノール、Ｌ−グルタミンからのメンバーおよびメンバーの組合せを含む特異的な増殖因子を挙げることができる。
用語「接着」は、直接的に、間接的に、および／または経路の伝達によって間接的に細胞をＥＣＭまたは他の細胞に接続させることに関与する様々な分子を含むプロセスを包含し得る。例えば、インテグリンは、細胞骨格組織化、細胞運動性、細胞周期の調節、細胞のインテグリン親和性の調節、ウイルスへの細胞の付着、他の細胞またはＥＣＭへの細胞の付着に関与する。インテグリンはまた、シグナル伝達、すなわち細胞が１種のシグナルまたは刺激を、別の細胞で、細胞内で、および細胞間で変換するプロセスにも関与する。インテグリンは、ＥＣＭからの情報を細胞に導入し、細胞からの情報を他の細胞（例えば、他の細胞上のインテグリンを介して）またはＥＣＭに導入することができる。α−およびβ−サブユニットの組合せが、インテグリンのリガンド特異性を決定する。多くのインテグリンは、同じリガンドに結合特異性を有し、これは、インテグリンの発現／活性化パターンおよびｉｎ ｖｉｖｏでの相互作用を指定するリガンドの利用可能性の組合せである。接着は、細胞領域または細胞集団の領域中で密度が変化する可能性がある。細胞または細胞集団中で、接着の量が変化する可能性がある。接着プロセスに関与する特異性またはタンパク質タイプによって、接着の品質が変化する可能性がある。接着の極性が変化する可能性がある。
用語「アッセイ」または「アッセイする」は、例えば、外因性刺激（例えば、治療剤またはリガンド）による撹乱による細胞の光学的または生体インピーダンス応答等、標的の存在、非存在、含量、程度、動態、動力学または種類を決定するための分析を指す。
用語「付着する」または「付着」は、例えば、物理的吸収、化学結合、化学誘引および類似のプロセスまたはそれらの組み合わせ等により表面に接続された、本開示の表面修飾因子物質、細胞、リガンド候補化合物および類似の実体を指す。特に、「細胞付着」、「細胞接着」または「細胞試料付着」は、培養または細胞繋留材料との相互作用その他等による、細胞の一体的な結合または表面への相互作用を指す。
用語「付着パターン」は、表面への細胞または細胞試料の接続の観察可能な形質または特徴を指す。付着パターンは、定量的とすることができる（例えば、付着部位の数）。付着パターンは、定性的とすることもできる（例えば、細胞外マトリックスへの付着の好ましい分子部位）。
用語「細胞付着シグナル（ＣＡＳ）」は、マイクロプレートのウェルに置かれたときに細胞により生成された細胞付着の定量的な測定値を指し、インピーダンスバイオセンサーで分析される。典型的には、いかなる薬剤の非存在下における細胞のＣＡＳは、特定のシグナル伝達経路に影響を与える撹乱剤単独の存在下における細胞のＣＡＳと、および／または特定のシグナル伝達経路に影響を与える撹乱剤と、その特定のシグナル伝達経路の特異的な阻害剤との組合せの存在下における細胞のＣＡＳと比較することができる。典型的には、細胞のＣＡＳは、オームで測定される。
用語「抗体」は、広義で用いられており、所望の生物学的活性または機能を提示する、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を包含）、ヒト化抗体、キメラ抗体、多特異的抗体（例えば、二特異的抗体）および抗体断片を特に包含する。
抗体は、例えば、キメラ、ヒト化またはヒト抗体とすることができ、これらの抗原結合性断片とすることができる。「抗体断片」は、全長抗体の一部、一般に、その抗原結合性または可変領域を含む。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；ならびに例えば、抗体断片から形成された二特異的抗体等の多特異的抗体が挙げられる。「機能的断片」は、全長抗体の抗原への結合を実質的に保持し、生物学的活性を保持する。抗体は、共有結合または他の付着により１種または複数の他の薬物と組み合わせることにより、「装備」または「コンジュゲート」して、個々の薬物分子が別々に達成することのできるものよりも優れた効力、特異性および有効性を達成することができる。
用語「確認用薬剤」は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載される試験で採用される目的の経路活性を崩壊させるかまたはそれに影響を与えることが公知の、小分子、公知の機能を有する特異的なリガンド、または抗体もしくは親和性／特異性試薬を指す。これは、撹乱剤が細胞試料に導入されたときに生成した、目的の経路活性に直接関連する活性を特異的に開始させる特異的な作用機序に関連する経路活性の量を確認および定量するための試験で使用される。例えば、撹乱因子が、細胞表面の受容体にとって公知のリガンドである場合、確認用薬剤導入後に変化する本明細書に記載される方法で測定された活性は、その方法が分析することを意図した経路に関連する活性の量を表すと予想される。さらなる例において、例えばリガンド結合領域、受容体二量体化領域、および受容体チロシンキナーゼ領域で構成される受容体を用いたケースであり得るが、撹乱剤は、受容体のリガンド結合部位に結合するリガンドであってもよい。そのため確認用試薬は、リガンド結合の前またはリガンド結合の後の事象、すなわち受容体二量体化または受容体二量体化後の受容体チロシンキナーゼ活性を妨げた薬剤であってもよい。さらに、確認用試薬は、目的の患者にとって活性化されたまたは機能不全性の下流のシグナル伝達経路の特定部分を精緻化する（ｒｅｆｉｎｅ）薬剤であってもよい。
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、この集団の個々の抗体は、少量存在する場合がある生じ得る天然起源の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対し指向されている。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に包含する従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原における単一の決定基に対し指向されている。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示すものであり、いずれか特定の方法による抗体の産生を要求するものとして解釈するべきではない。
用語「免疫捕獲試薬」は、あらゆるタイプの抗体を指し、加えて、ＲＮＡ、ＤＮＡ、および塩基の合成バリアントを含有するポリマーで構成されるアプタマー、またはアプタマーまたは試薬が、別の分子を特異的に認識し結合し、そしてその存在、量、および／または品質をシグナル伝達するように構築され選択されているあらゆる合成分子も含む。
用語「培養」は、本発明を実行するための細胞の調製を指す。調製は、本発明の実施中の様々な時間における、様々な培地、培地の補充物、温度、湿度、ＣＯ２％の様々な条件、播種密度、細胞型の純度または混合物、および細胞培養の当業者に公知の他の条件を含み得る。調製は、細胞を増殖させる、休止状態にする、老化させる、および細胞周期の様々な段階に入らせる、それを経過させる、またはそれをチェックする条件を含み得る。培養は、当業者に公知の様々な培地または補充物、例えば、これらに限定されないが、本発明の理想的な実施を可能にするおよび／または最適化する、ビタミン、サイトカイン、増殖因子、血清（例えば供給源の動物は、ウシ、ウシ胎仔、ヒト、ウマまたは他の哺乳動物である）、代謝産物、アミノ酸、微量ミネラル、イオン、ｐＨ緩衝液、および／またはグルコースを含んでいてもよい。細胞の培養は、本発明による撹乱の前または後に、無血清および／または撹乱因子非含有の培地を用いて実施されてもよい。理想的には、培養は、患者の腫瘍の微小環境を模倣するように設計された条件を含んでいてもよい。調製物の培養は、理想的には、経路活性に対する刺激作用（ａｇｏｎｉｓｍ）または拮抗作用の測定が許容されるように、特定の経路を基底のまたは高めたレベルにするために設計される条件を含んでいてもよい。
用語「ベース培地」は、明確に規定された量で、無機塩、必須アミノ酸、グルコース、ビタミン、およびｐＨ緩衝液を含有するタイプの培養培地を指し、このような培地は、本方法が分析することを意図したシグナル伝達経路を刺激する薬剤を含有しない。多くのベース培地が当業者に公知であり、例えば、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＭＥＭ、ＭＥＧＭ、ＲＰＭＩ−１６４０およびそれらの組合せを挙げることができる。例えば、ＥｒｂＢシグナル伝達経路を分析しようとする場合、ベース培地は、ＥｒｂＢ経路を撹乱することが公知の試薬を含有しない。ベース培地は、細胞集団が生存可能なままであり、その個々の細胞型の不均質性および細胞周期の様々な相を代表する正常な細胞分布を保持するように、細胞培養物を維持するのに使用される。これは、本方法における疾患細胞の試料を撹乱剤と接触させるステップの直前に、本明細書に記載される方法において対象から得られた罹患細胞の試料を培養するのに使用される。
用語「新鮮な」は、材料に適用される場合、まだ使用されていない材料を指す。したがって新鮮なベース培地は、まだ使用されていないベース培地である。新鮮なベース培地は、細胞培養物を含有する容器中のベース培地の体積を増加させるために、ベース培地中ですでに培養された疾患細胞の試料を含有する容器に添加することができる。代替として、容器中の罹患細胞の試料を培養するのに使用されたベース培地の一部を、細胞培養容器から除去して、新鮮なベース培地で置き換えてもよい。いずれのケースにおいても、細胞培養容器中のベース培地の総体積の５０％より多くが新鮮なベース培地である場合、細胞培養容器は、新鮮なベース培地を含有するとみなされる。長期間にわたり（例えば７２時間より長く）同じベース培地中で培養された細胞は、個々の細胞型の不均質性を失うと予想され、細胞の大部分が、シグナル伝達経路活性の測定に干渉する可能性があるＧ０／Ｇ１細胞周期相に入る可能性がある。細胞試料が元の細胞試料に見出される個々の細胞型の不均質性および細胞周期の様々な相を代表する正常な細胞分布を反映するように、新鮮な培地中に置かれた細胞試料は、新しい培地に慣らす期間（例えば少なくとも１２時間）を必要とする。
用語「緩衝培地」は、ｐＨ緩衝液および等張溶液を含有する溶液を指す。緩衝培地は、典型的には、細胞の試料を枯渇させるか、または細胞周期Ｇ０／Ｇ１で細胞が休止状態のときに見出されるような静止または老化状態に細胞を駆動するために使用される。
「キメラ」抗体（免疫グロブリン）は、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における相当する配列と同一または相同の重鎖および／または軽鎖の一部を含有するが、一方、鎖（複数可）の残り部分は、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における相当する配列と同一または相同であり、また、所望の生物学的活性を提示する限りにおいて、係る抗体の断片も含有する（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１巻：６８５１〜６８５５頁）。
用語「ヒト化抗体」は、本明細書において、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する抗体である。ヒト化抗体は、その大部分において、ヒト免疫グロブリン（レシピエントまたはアクセプター抗体）であり、レシピエント抗体の可変ドメイン高頻度可変領域残基は、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）由来の高頻度可変領域残基によって置き換えられている。高頻度可変領域は、配列によって定義される相補性決定領域（ＣＤＲ）であっても（例えば、Ｋａｂａｔ １９９１年、１９８７年、１９８３年を参照）、構造によって定義される高頻度可変ループ（ＨＶＬ）であっても（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ １９８７年を参照）、あるいはその両方であってもよい。
「生体分子コーティング」は、天然起源の生体分子もしくは生化学物質または１種もしくは複数の天然起源の生体分子もしくは生化学物質に由来するもしくはこれに基づく生化学物質である分子を含む、表面におけるコーティングである。例えば、生体分子コーティングは、細胞外マトリックス構成成分（例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、他の糖タンパク質、ペプチド、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、ビトロネクチン、細胞間ＣＡＭ、血管性ＣＡＭ、ＭＡｄＣＡＭ）またはこれらの誘導体を含むことができる、あるいは天然起源の生化学物質、リジンおよびオルニチンに基づくポリマー型分子であるポリリジンまたはポリオルニチン等、生化学物質を含むことができる。アミノ酸等、天然起源の生化学物質に基づくポリマー型分子は、天然起源の生化学物質のアイソマーまたはエナンチオマーを用いることができる。コーティングは、細胞表面受容体もしくは細胞表面同族結合タンパク質または前記細胞表面タンパク質に対し親和性を有するタンパク質を包含することもできる。
用語「ベースライン測定値」は、検査しようとする細胞のセットの生理的開始点を指し、薬物が添加される前の期間にわたる測定値の評価に基づく。この用語は、外因性撹乱に先立つ基礎細胞代謝測定値またはＣＲｅＭＳ読み取り値を包含することができる。あるいは、この用語は、外因性撹乱ありまたはなしにおける正常な健常細胞代謝機能のＣＲｅＭＳ測定値を包含するがこれに限定されない。
用語「測定量」は、臨床試験において測定されることが意図される量と定義される。本明細書に記載される発明に関して、測定されることが意図される量は、撹乱に対する細胞の生理学的な応答における変化である。撹乱に対する細胞の生理学的な応答の測定値における変化は、様々なユークリッドの数学的分析を使用して数学的に決定してもよいし、定量試験のケースでは数値で報告してもよいし、または定性試験のケースでは陽性または陰性結果として報告してもよい。定量および定性試験の両方において、測定量（例えば試験結果）は、それ超かそれ未満で異なる臨床的な決定または解釈がなされるカットオフ値と比較される。
用語「基底の形態学」は、薬剤、撹乱因子、または刺激の導入前における細胞または細胞試料の形態および構造を指す。
用語「細胞接着」は、別の細胞への、細胞外マトリックスの要素への、または表面（例えば、マイクロタイタープレート）への細胞の結合を指す。
用語「細胞応答測定系」または「ＣＲｅＭＳ」は、細胞内、細胞内および細胞間、ならびに細胞および計装機器間の生理的または細胞の応答パラメータの変化を定量的に決定することができる機器を指す。実施形態において、細胞は、無標識細胞全体である。生理的または細胞の応答パラメータの変化は、グルコース、酸素、二酸化炭素、タンパク質やアミノ酸等のアミン含有材料等、分析物、または細胞外マトリックス、または細胞シグナル伝達分子、または細胞増殖、細胞形態もしくは細胞骨格再編成の変化を決定することにより測定される。ＣＲｅＭＳの一例は、バイオセンサーである。
用語「ＣＲｅＭＳシグナル」は、本明細書において、化学電気的ＣＲｅＭＳによって細胞が分析される際の細胞の細胞生理的変化の尺度として定義されている。ＣＲｅＭＳシグナルおよびＣＲｅＭＳシグナルの変化は、生理的変化を測定する特定の化学電気的トランスデューサーに関係する様々な単位を有し得る。例えば、ＣＲｅＭＳシグナルは、細胞指数、インピーダンス、波長単位、ｐＨ単位、電圧、電流の単位を有し得るが、これらに限定されない、あるいは単位の比率を用いることによって無次元となり得る。これらの単位のいずれも、時間成分を有し得る。ＣＲｅＭＳシグナルは、例えば、正規化、ベースライン決定、曲線減算またはこれらのいずれかの組み合わせ等、生物学、生化学および生物物理学の技術分野の当業者によって頻繁に為される通り、解釈を明確にするため数学的に改変することができる。ＣＲｅＭＳシグナルは、単一の時点で、あるいはより好ましくは、細胞生理応答の完全パターンを表す連続的な一連の時点にわたって測定することができる。
用語ＣＲｅＭ「光学的シグナル」は、細胞が置かれているフォトニック結晶バイオセンシングＣＲｅＭＳから反射される光として測定される波長値または波長値の変化として定義される。単位は、典型的には、ピコメートルまたはナノメートル表記であるが、変化の比率が報告されるのであれば、無次元にしてもよい。「光学的シグナル」は、時間と組み合わせた前記単位で表現することができる。反射された光の波長のシフトは、フォトニック結晶表面における質量に比例する。よって、「光学的シグナル」は、ＣＲｅＭＳにおける細胞数の定量的尺度である。さらに、例えば、細胞形態、細胞接着、細胞生存率、細胞の構造的再編成の変化は、波長シフトとして検出されるセンサーにおける質量の量に差をもたらすため、「光学的シグナル」は、細胞生理的ステータスの尺度である。
用語「細胞指数」は、本明細書において、インピーダンスの測定値として定義されており、本発明の一事例において、例えば、１０ｋＨｚの固定された電気的周波数および固定された電圧で測定することにより適用することができる。
さらに、方程式：細胞指数ｉ＝（Ｒｔｎ−Ｒｔ０）／Ｆによって計算され、
式中：
ｉは、１、２、または３つの時点であり、
Ｆは、機器を１０ｋＨｚの周波数で操作する場合の例では、１５オームであり、
Ｒｔ０は、時点Ｔ０で測定されたバックグラウンドの抵抗であり、
Ｒｔｎは、細胞の添加、細胞の生理学的変化、または細胞の撹乱後の時点Ｔｎで測定された抵抗である。
細胞指数は、細胞ステータスを表すための、測定された電気インピーダンスの相対変化として導かれる無次元パラメータである。細胞が、電極に存在しないまたは十分に接着されていない場合、ＣＩはゼロである。同じ生理条件下において、より多くの細胞が電極に付着されている場合、ＣＩ値はより大きくなる。したがって、ＣＩは、ウェルに存在する細胞数の定量的尺度である。その上、細胞生理的ステータス、例えば、細胞形態、細胞接着または細胞生存率の変化は、ＣＩの変化をもたらす。
用語「バイオマーカー」は、最も一般的な意味で、細胞または患者の健康または疾患ステータスの状態の生物学的な測定基準を指す。一般的なバイオマーカーの非限定的なリストは、哺乳動物に見出される生物学的に誘導された分子、哺乳動物の細胞または組織の生物活性、遺伝子のコピー数、遺伝子の突然変異、単一ヌクレオチド多型、遺伝子発現レベル、ｍＲＮＡレベル、スプライスバリアント、転写修飾、転写後修飾、後成的修飾、細胞表面マーカー、タンパク質または核酸（機能的なＲＮＡの全ての形態を含む）の差次的な発現、核酸の増幅、細胞形態、翻訳後修飾、タンパク質のトランケーション、リン酸化、脱リン酸化、ユビキチン化、脱ユビキチン化、代謝産物、生合成のあらゆる段階におけるホルモン、サイトカイン、ケモカイン、およびそれらの組合せを含む。バイオマーカーのサブセットは、病理学者が疾患を診断するのを助け、医者が療法を処方するのを助けるための診断的および治療的な選択目的に使用される。バイオマーカーは、典型的には、固定されたマウントされた組織で、遺伝子のコピー数、遺伝子の突然変異、またはタンパク質の状況または活性の詳細が不明なタンパク質のレベルを測定する。本発明は、新しいタイプのバイオマーカー、すなわち生きた患者細胞試料からの活性または動的な結果である生理応答パラメータを含む。
用語「バイオマーカーのステータス」は、患者または患者の細胞におけるバイオマーカーの評価を指し、典型的には、バイオマーカーが存在する場合は「バイオマーカー陽性」と報告され、またはバイオマーカーが存在しない場合は「バイオマーカー陰性」と報告される。タンパク質受容体がバイオマーカーとして使用される場合（例えばＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２またはＥＲ）、バイオマーカー陽性結果は、受容体が過剰発現または増幅しているとも称され、バイオマーカー陰性結果は、受容体が正常に発現しているかまたは増幅していないと称される。バイオマーカーまたはバイオマーカーシグネチャが疾患進行の予後の指標であるかまたは治療有効性を予測する疾患の場合、現行の臨床上の実施は、患者をバイオマーカー陰性または陽性のいずれかに分類することによって患者の診断を洗練させるために、バイオマーカーの量またはそれに関連する突然変異の測定に頼っている。バイオマーカーのステータスの決定は、患者を処置するのに治療的効果のある薬物の選択をガイドするのにしばしば使用される。バイオマーカー陽性およびバイオマーカー陰性患者を区別するのに使用されるバイオマーカー測定のカットオフ値は、バイオマーカーごとに異なる。バイオマーカーが薬物標的である場合、カットオフ値は、それ超だと患者がバイオマーカーを標的化する治療薬を受け、それ未満だと患者がバイオマーカーを標的化する治療薬を受けない条件である。臨床試験は、典型的には、バイオマーカーの臨床的な関連性を同定するのに必要である。
用語「ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２のステータス」は、バイオマーカーとして患者または患者の細胞（例えば、がん細胞）におけるＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２の発現の評価を指し、ステータスは、典型的には、固定された組織試料のＩＨＣ染色試験によって決定した場合、バイオマーカーが正常な健康な非がん乳房組織試料と比較して過剰な存在量で存在する場合、「ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２陽性」と報告され、またはバイオマーカーが正常な健康な非がん乳房組織試料以下のレベルで存在する場合、「ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２陰性」と報告される。典型的には患者の細胞によって発現される受容体（ＩＨＣ）の量、またはｍＲＮＡレベル（ｑＰＣＲ）、または遺伝子のコピー数（ＦＩＳＨ）に焦点を当てた、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２のステータスを評価するための、様々な方法が当該分野において公知であり、それによって、患者を、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ陽性（この受容体が患者の細胞で過剰発現または増幅されている場合）またはＨＥＲ２／ＥｒｂＢ陰性（この受容体が患者の細胞で過剰発現も増幅もされていない場合）と診断することができる。過剰発現および増幅は、疾患を有さない正常な個体からの類似の組織で見出されるレベルより上昇したレベルを説明する技術分野の用語である。ＤＡＫＯ ＩＨＣ試験の場合、ＨＥＲ２陰性結果は、典型的には、報告されたスコアが２＋未満である患者に対して報告される。以下の表１に、ＤＡＫＯ ＨＥＲ２ ＩＨＣ試験の染色の解釈のガイドラインを示す。
ＨＥＲ２のＦＩＳＨ試験は、正常細胞はそれぞれ第１７番染色体にＨＥＲ２遺伝子の２つのコピーを有しており、そのうち１つは母親から受け継いだものであり、もう１つは父親から受け継いだものであることを考慮に入れる。ＨＥＲ２陽性がん細胞において、遺伝子は増幅することができ、すなわち各細胞が２つより多くのコピーを有する。またがん細胞は、異数性の染色体を有する可能性もあり、これは、それらのＨＥＲ２遺伝子を含むそれらの全てのＤＮＡが増幅することを意味する。ＨＥＲ２のＦＩＳＨ試験は、第１７番染色体上の動原体（ＣＥＰ１７）と呼ばれる異なる領域に結合する緑色の蛍光タグを用いて、この交絡変数に合わせて制御される。ＨＥＲ２陽性細胞は、それらが有する動原体シグナルより多くのＨＥＲ２シグナルを常に有すると予想される。ＡＳＣＯ−ＣＡＰ ＨＥＲ２試験の２０１３年のガイドライン推奨によれば、ＨＥＲ２陽性患者は、ＦＩＳＨ増幅を示し（ＣＥＰ１７に対するＨＥＲ２の比率が＞２．２であるか、または内部対照プローブなしの試験システムの場合、平均のＨＥＲ２遺伝子のコピー数＞６のシグナル／細胞核）、ＨＥＲ２陰性患者は、ＦＩＳＨのＨＥＲ２／ＣＥＰ１７の比率が＜１．８であるか、または内部対照プローブなしの試験システムの場合、平均のＨＥＲ２遺伝子のコピー数＜４のシグナル／細胞核を示す。試験は、資格のある技術者および病理学者によって実行され、格付けされることとなる。
ＨＥＲ２によって誘発されるがんの決定に関して、ＨＥＲ２のｍＲＮＡの存在の量を解釈するための基準は設定されていない。
用語「ＨＥＲ２陰性がん」、「ＥｒｂＢ２陰性がん」、「ＨＥＲ２非過剰発現非増幅がん」および「ＥｒｂＢ２非過剰発現非増幅がん」は、本明細書で使用される場合、対象のがん細胞（例えば、乳がん細胞）のＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２のステータスに関して同義的に使用される。
用語「エストロゲン受容体のステータス」または「ＥＲのステータス」は、バイオマーカーとして患者または患者の細胞（例えば、がん細胞）におけるＥＲの発現の評価を指し、ステータスは、典型的には、染色された固定された検体の核においてバイオマーカーが過剰発現される場合、「ＥＲ陽性」と報告され、または染色された固定された検体の核においてバイオマーカーが正常に発現されるかまたは存在しない場合、「ＥＲ陰性」と報告される。典型的には患者の細胞によって発現される受容体（ＩＨＣ）の量、またはｍＲＮＡレベル（ｑＰＣＲ）に焦点を当てた、ＥＲのステータスを評価するための様々な方法が当該分野において公知であり、それによって、患者をＥＲ陽性（この受容体が患者の細胞で発現される場合）またはＥＲ陰性（この受容体が患者の細胞で発現されない場合）と診断することができる。
ＥＲステータスにおけるＡＳＣＯ ＣＡＰの２０１０年の承認されたガイドラインは、内部（正常な上皮要素）および外部対照の期待される反応性の存在下での試験において試料中に少なくとも１％の陽性腫瘍核がある場合、ＥＲアッセイは陽性とみなされることである。試料がＥＲまたはＰｇＲを発現することができる（陽性の固有の対照が観察される）という証拠が存在するなかで、腫瘍細胞核の＜１％の結果が免疫反応性である場合、ＥＲ染色試験結果は、ＥＲに関して陰性である。免疫反応性の腫瘍核がないという結果、および試料中に存在する、または同じ試料から別々に提供された内部上皮要素がまったく核染色されないという結果の場合、ＥＲ染色試験結果は、ＥＲに関して解釈不可能である。試験は、資格のある技術者および病理学者によって実行され、格付けされることとなる。
用語「ＥＲ陰性がん」および「ＥＲ非過剰発現がん」は、本明細書で使用される場合、対象のがん細胞（例えば、乳がん細胞）のＥＲのステータスに関して同義的に使用される。
用語「バイオセンサー」は、分析物または分析物の変化または細胞の生理状態を測定する機器を指す。実施形態において、バイオセンサーは、典型的に、３部分を含有する：分析物に結合するまたはこれを認識する生物学的構成成分または要素（細胞外マトリックス、細胞シグナル伝達分子または細胞増殖、組織、細胞、代謝物、異化産物、生体分子、イオン、酸素、二酸化炭素、炭水化物、タンパク質等の非限定例を挙げられる）、検出器要素（光学的、圧電気的、電気化学的、温度測定的または磁気的等、物理化学的様式で動作する）および両方の構成成分と関連するトランスデューサー。
用語「光学的バイオセンサー」は、蛍光、吸収、透過率、密度、屈折率および光の反射を測定する機器を指す。実施形態において、光学的バイオセンサーは、生細胞、病原体またはそれらの組み合わせにおける分子認識または分子撹乱事象を定量化可能なシグナルに変換するための光学的トランスデューサーを含むことができる。その上、実施形態は、フォトニック結晶機器、光導波路機器および表面プラズモン共鳴機器を包含することができる。
用語「インピーダンスバイオセンサー」は、生きた患者細胞の複素インピーダンス変化（デルタＺまたはｄＺ）を測定する機器を指し、インピーダンス（Ｚ）は、オームの法則（Ｚ＝Ｖ／Ｉ）に説明されている通り、電圧の電流に対する比に関連付けられる。これは、細胞との電極界面における局所イオン環境に対し高感度であり、このような変化を、電圧および電流変動の関数として検出する。正常機能またはその撹乱の結果としての細胞の生理的変化は、電極周囲の電流の流れに定量化可能な変化をもたらし、測定されるシグナルの大きさおよび特徴に影響する。実施形態において、インピーダンスバイオセンサーは、生細胞、病原体またはそれらの組み合わせにおける分子認識または分子撹乱事象を定量化可能なシグナルに変換するための電極または電気回路を含むことができる。実施形態において、ＩＳＦＥＴバイオセンサーは、生細胞、病原体またはそれらの組み合わせにおける分析物認識または細胞撹乱事象を定量化可能なシグナルに変換するためのイオン選択性電界効果電気トランスデューサーを含むことができる。ＩＳＦＥＴバイオセンサーにおける分析物濃度が変化すると、トランジスタにおける電流が変化し、これにより定量化シグナルが生じる。
用語「細胞シグナル伝達」は、情報の細胞内または細胞間移行を指す。細胞シグナル伝達は、細胞の間の直接的な接触により、またはある細胞からの、別の細胞によって取り込まれる物質の放出により達成することができる。細胞間シグナル伝達は、２分子（例えば、リガンドおよび受容体）間の相互作用を介して起こり得る。受容体結合は、細胞内シグナル伝達のカスケードを誘発し得る（例えば、細胞内における生化学的変化の惹起または膜電位の修飾）。
用語「ＨＥＲファミリー関連のシグナル伝達経路」は、ＨＥＲファミリーの受容体（ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ３およびＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４）を介したシグナル伝達に関連する細胞内シグナル伝達経路を指す。以下の表２に、ＨＥＲファミリーの受容体および各受容体に結合することが公知の対応するリガンドを要約する。
用語「ＥＲ関連のシグナル伝達経路」は、ＥＲαおよびＥＲβを含むエストロゲン受容体（ＥＲ）を介したシグナル伝達に関連する細胞内シグナル伝達経路を指す。ＥＲに関する公知のリガンド（これらは、ＥＲのアルファまたはベータアイソフォームへのそれらの親和性の点で異なる場合がある）としては、エストラジオール、エストロン、ラロキシフェン、エストリオールおよびゲニステインが挙げられる。
用語「細胞骨格組織化」は、細胞の内部足場の配置を指す。細胞の細胞骨格は、細胞質または膜要素および／または細胞内小器官の支持に役立つフィラメントを含む。細胞骨格は、細胞の形状の維持も助ける。
用語「細胞増殖」は、細胞成長および細胞分裂の結果としての細胞数の増加を指す。
用語「細胞生存」は、代謝、成長、運動、生殖、ある種の応答性および適応性等、ある特定の機能を行う能力によって特徴付けられる細胞の生存率を指す。
用語「有効性」は、特定の介入が有益な結果を生じる程度を指す。実施形態において、介入は、小分子または抗体等、治療剤となり得る。有益な結果は、症状の阻害、細胞成長の減少、細胞死滅の増加、炎症の減少および免疫応答性の増加を限定することなく包含する。
「細胞外マトリックス構成成分」は、動物の細胞外マトリックスにおいて生じる分子である。これは、いずれかの種由来およびいずれかの組織型由来の細胞外マトリックスの構成成分となり得る。細胞外マトリックス構成成分の非限定例として、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、他の糖タンパク質、ペプチド、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン等が挙げられる。細胞外マトリックス構成成分は、成長因子（増殖因子）を包含することもできる。
用語「グローバルな表現型」は、全体としての細胞または細胞試料の複数の観察可能な特性またはその複合体を指し、発生、生化学的または生理学的な特性、生物季節学、行動、および行動の所産を反映する。グローバルな表現型としては、これらに限定されないが、細胞のサイズ、細胞の形状、特徴的な突起物、成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）、拡散、付着点（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｆｏｃｉ）の密度、細胞骨格の配置、細胞増殖パターン、受容体のファゴサイトーシス、または付着点の数、ｐＨの変化、代謝産物の取り込みまたは流出、シグナル伝達タンパク質および増殖因子、酸素、ＣＯ２、グルコース、ＡＴＰ、およびマグネシウム、カルシウム、カリウムなどのイオンを挙げることができる。
用語「事象特異性」は、細胞の特異的な特性の物理的観察を指す。係る特異的な特性は、特定のアクチベーターまたは治療剤に対する細胞の意図および／または予想される生理応答の一部としての特異的な細胞機能、外因性撹乱または経路アゴニズム／アンタゴニズムに関する。アクチベーターおよび治療剤は、細胞骨格構造または細胞経路等、細胞機能のある特定の側面に影響を与えるよう標的化されることが公知となり得る。アクチベーターまたは治療剤の存在下の細胞における物理的に観察可能な事象は、細胞におけるアクチベーターまたは治療剤の意図および／または予想される効果の反映であるため、物理的に観察可能な事象は、事象特異性と呼ばれる。例えば、ＣＲｅＭＳの付着バイオセンサー型における大部分の細胞試料へのビンブラスチンの添加は、シグナルの深刻な低下を生じる。ビンブラスチンは、細胞の細胞骨格足場破壊因子である。シグナルの低下は、微小管分子における薬物の作用に起因する細胞形状および付着の損失に特異的に連鎖した細胞の物理的に観察可能な事象である。
用語「インピーダンス」は、本明細書において、方程式：インピーダンス（オーム）＝電圧（ボルト）／電流（アンペア）またはＺ＝Ｖ／Ｉによる、電圧および電流に関する物理法則によって定義される。
処置または治療法の目的のための「哺乳動物」は、ヒトや、イヌ、ウマ、ネコ、ウシその他等の飼育動物および家畜および動物園、競技用またはペット動物を包含する、哺乳動物として分類されるいずれかの動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
用語「マイクロカンチレバー機器」、「マイクロカンチレバーアレイ」、またはマイクロカンチレバー装置」は、少なくとも１つのカンチレバー、その用途に応じてバー型、Ｖ型であってもよいし、または他の形状を有していてもよいフレキシブルビームを含むＣＲＥＭＳ機器のタイプを指す。マイクロカンチレバーの１つの端部は、支持ベース上に固定され、別の端部は自由な状態である。マイクロカンチレバーは、電気的な方法を使用して、天然の共振周波数と一致し得る位相差シグナルを検出し（参照により本明細書に組み入れられる２０００年３月２８日に発行された米国特許第６，０４１，６４２号に記載の実施例）、公知の分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質などの高分子の生体分子が配置されているマイクロカンチレバーの共振特性における変化を使用して標的の種の濃度を決定することにより濃度を測定することができる。たわみは、光学的および圧電方法を使用して測定される。
用語「正常な機能」は、不自然なレベルのシグナル伝達、複製、接触阻止の喪失、ならびに異常な遺伝子のコピーおよび増幅のために細胞が機能不全性にならないようにする、明確な抑制と均衡のシステムを有する細胞における経路を指す。多くのケースにおいて、一部の休止または定常の基底状況で始まる経路の場合、経路のメンバーのＥＣ５０濃度での少量の撹乱因子の添加は、細胞のシステムが撹乱因子を認識して、経路活性を開始させ、次いで撹乱因子の作用を下方調節して他の細胞機能とのバランスを維持するため、ほんのわずかな一過性の作用しか有さないと予想される。罹患した機能は、撹乱因子に対する過剰反応、経路に沿った活性過多／過小、撹乱因子作用に順応させる不適切な経路間の活性、および最小の撹乱因子作用を下方調節できないこととして認識可能なことが多い。加えて、一部の罹患した状況の場合、一部の経路メンバーに関する基底状況は、経路に対して到達され得ない。これらのシステムは、構成的に活性化されたと説明される。
用語「正常な参照インターバル」は、本明細書において、２つの数値、すなわち健康な対象（例えば目的の疾患がない対象）の集団から得られた値の特定のパーセンテージを含むと推測される上および下の参照限界値の間とその値を含むインターバルと定義される。ほとんどの分析物にとって、下および上の参照限界値は、それぞれ参照集団に関する試験結果分布の２．５および９７．５パーセンタイルと推測される。いくつかのケースにおいて、１つのみの参照限界値は医学的に重要であり、通常は上の限界値であり、例えば９７．５パーセンタイルである。参照インターバルの限界値の推測に関する信頼区間は、参照集団、一般的には約１２０人の参照対象の無作為抽出と仮定して構築することができる。各信頼区間の幅は、参照対象の数、加えて観察された参照値の分布に依存する。
正常な参照範囲のカットオフは、参照個体の選択プロセス、その参照個体に適用された分析方法により決定され設定され、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる出版物Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｐｐｒｏｖｅｄ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ＥＰ２８−Ａ３Ｃ「Ｄｅｆｉｎｉｎｇ， Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ， ａｎｄ Ｖｅｒｉｆｙｉｎｇ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｒｖａｌｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ」で定義されるようにデータの収集および分析をもって結論付けられる。
一実施形態では、参照個体は、疾患を有さない、特にいかなる形態のがんも有さない個体と予想される。正常な参照インターバルは、本明細書に記載される方法を使用して正常な参照個体を試験することによって決定されると予想される。正常な参照インターバルの上の限界値は、正常な経路活性の上の限界値を表すと予想される。一実施形態では、陽性の試験結果と陰性の試験結果とを区別するカットオフ値は、正常な参照インターバルの上の限界値に等しいと予想される。他の実施形態では、カットオフ値は、正常な参照インターバルの上の限界値に、以下の値：検出限界、ブランクの限界値、定量限界、測定量の標準偏差の１つ、組合せ、または全ての、いずれか、組合せ、全て、または複数を加えたものに等しいと予想される。
疾患を有さない参照個体の群は、目的の疾患の範囲外の様々な特徴によってさらに定義することができる。例えば、本発明の乳がんへの適用において、疾患を有さない参照女性の群は、以下の特徴：閉経前または閉経後であること、授乳中または授乳中ではないこと、経産婦であること、ＢＲＣＡ遺伝子の突然変異を有すること、糖尿病の存在、ＢＭＩ（ボディマス指数）によって決定される肥満症、ホルモンなどの薬理学的作用物質または他の薬物嗜癖からの離脱、アルコールなどの食材からの離脱および／またはがんの家族歴のいずれか、組合せ、または全てを含むようにさらに定義することができる。
用語「異常なシグナル伝達経路」または「機能不全性のシグナル伝達経路」は、同義的に使用され、その正常な機能を実行する細胞の能力を損なうような方式で崩壊した細胞シグナル伝達経路を指す。細胞のシグナル伝達崩壊とその結果生じた機能不全の供給源は、典型的には、シグナル伝達経路の正常な機能に干渉するゲノムへの損傷の結果である。この損傷は、ＤＮＡ複製のエラーなどの内因性プロセス、特定のＤＮＡ塩基の固有の化学的不安定の結果である可能性もあるし、または代謝中に生成したフリーラジカルの攻撃による可能性もある。いくつかの不活性化する突然変異は、ゲノムの完全性の維持に関与する遺伝子で起こることから、追加の突然変異の獲得が容易になる。ゲノムレベルの細胞制御に影響を与える追加のメカニズムは、後成的なメカニズムを含み、それによってヒストンタンパク質の機能への変化によって特異的な遺伝子の発現が変更された。エピゲノムの機能は、疾患の病因および伝播に関与する条件など多くの様々な環境条件に高度な適応性を有するか、またはそれに応答性であることが実証されている。様々な経路機能不全のＲＮＡベースのメカニズムが、転写、転写後、翻訳、および翻訳後レベルで説明されている。
加えて、タンパク質レベルにおける経路機能不全の多くの作用が細胞分子生物学の当業者に公知である。経路機能不全は、経路のメンバー（１つまたは複数）または補因子の過剰または過小発現、不自然な細胞型または細胞配置に存在するタンパク質活性、経路の交差反応性としても公知の不自然な経路のメンバーとのタンパク質相互作用、機能不全性のフィードバックループの結果であり得る。経路機能不全は、加えて、プロテオーム、プロテアソーム、カイノーム、メタボローム、核のタンパク質および因子、細胞質のタンパク質および因子、ならびに／またはミトコンドリアのタンパク質および因子の活性の結果でもあり得る。
機能不全性の経路を有する細胞が複製される場合、それらは、それらの後代に異常を伝達する可能性があり、そのため細胞が罹患した状態になる可能性を増加させる。生細胞における細胞シグナル伝達経路の活性を分析することによって、細胞のシグナル伝達経路が正常にまたは異常に機能するかどうかを決定することが可能である。
本明細書において互換的に使用されている「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、いずれかの長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはこれらのアナログ、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによってまたは合成反応によってポリマーに取り込むことのできるいずれかの基質となり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそのアナログ等、修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在するのであれば、ポリマーの組み立ての前または後に、ヌクレオチド構造に対する修飾を付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分によって中断することができる。ポリヌクレオチドは、標識とのコンジュゲーション等により、合成後にさらに修飾することができる。他の種類の修飾として、例えば、「キャップ」、天然起源のヌクレオチドのうち１個または複数とアナログとの置換、例えば、無電荷結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）および荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）による修飾、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ（ｐｌｙ）−Ｌ−リジン等）等のペンダント部分を含有する修飾、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン等）による修飾、キレート化剤を含有する修飾（例えば、金属、放射性金属、ボロン、酸化金属等）、アルキル化剤を含有する修飾、修飾結合（例えば、アルファアノマー核酸等）による修飾等のヌクレオチド間修飾と共に、非修飾型のポリヌクレオチド（複数可）が挙げられる。さらに、糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれかを、例えば、ホスホネート基、リン酸基によって置き換えることができる、標準保護基によって保護することができる、あるいは追加的ヌクレオチドに追加的な結合を調製するために活性化することができる、あるいは固体または半固体支持体へとコンジュゲートすることができる。５’および３’末端ＯＨは、リン酸化することができる、あるいは１〜２０個の炭素原子のアミンまたは有機キャッピング基部分と置換することができる。他のヒドロキシルは、標準保護基へと誘導体化することもできる。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖アナログ、アルファ−アノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソース等のエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログおよびメチルリボシド等の塩基性ヌクレオシドアナログを包含する、本技術分野において一般に公知のリボースまたはデオキシリボース糖の類似型を含有することもできる。１種または複数のホスホジエステル結合は、代替的結合基によって置き換えることができる。このような代替的結合基として、ホスフェートが、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、’’（Ｏ）ＮＲ．ｓｕｂ．２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ’、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ．ｓｕｂ．２（「ホルムアセタール」）によって置き換えられた実施形態（式中、各ＲまたはＲ’は独立的に、Ｈ、またはエーテル（−−Ｏ−−）結合を必要に応じて含有する置換もしくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）である）が挙げられるがこれらに限定されない。ポリヌクレオチドにおけるあらゆる結合が同一である必要はない。先行する記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡを包含する、本明細書に言及されているあらゆるポリヌクレオチドに適用される。
「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結された２個以上のアミノ酸を含有するペプチドまたはタンパク質を指し、ペプチド、オリゴマー（ｏｌｉｇｉｍｅｒ）、タンパク質その他を包含する。ポリペプチドは、天然、修飾または合成アミノ酸を含有することができる。ポリペプチドは、翻訳後プロセシング等により天然に、あるいはアミド化、アシル化、架橋その他等、化学的に修飾されていてもよい。
用語「水晶共振器／マイクロバランス」は、測定が意図されるウイルスまたは任意の他の小さい物体等、僅かな質量の添加によって妨害された際の圧電気的水晶結晶板の周波数の変化を測定することにより質量を測定する、ＣＲＥＭＳ機器の種類を指す。周波数測定は、高精度で容易に行うことができ、したがって、僅かな質量の測定が容易である。
本明細書において、「試料」は、本開示において、器具、マイクロプレートまたは方法を用いて単離、操作、測定、定量化、検出または分析すべき部分を含有し得る任意のものを指す。試料は、生体液または生体組織等、生体試料となり得る。生体液の例として、細胞培養培地等の培地における細胞の懸濁液、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、羊水その他が挙げられる。生体組織は、通常、特定の種類の細胞とその細胞間物質との凝集塊であり、ヒト、動物、植物、細菌、真菌またはウイルス構造の構造材料の１種を形成し、結合、上皮、筋肉および神経組織を包含する。生体組織の例として、器官、腫瘍、リンパ節、動脈および個々の細胞（複数可）も挙げられる。生体試料は、細胞懸濁液、生物学的分子（例えば、タンパク質、酵素、核酸、炭水化物、生物学的分子に結合している化学分子）を含有する溶液をさらに包含することができる。
用語「細胞試料」は、特定の対象から単離された細胞を指し、細胞は、対象の生体液、排泄物または組織から単離される。組織から単離される細胞は、腫瘍細胞を包含することができる。組織から単離される細胞は、ホモジナイズされた組織および細胞抽出物ならびにそれらの組み合わせを包含する。細胞試料は、血液、血清、血漿、尿、精液、精子液（ｓｅｍｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）、精漿、前立腺液、前射精液（ｐｒｅ−ｅｊａｃｕｌａｔｏｒｙ ｆｌｕｉｄ）（カウパー腺液）、排泄物、涙、唾液、汗、生検材料、腹水、脳脊髄液、リンパ液、髄または毛髪からの単離を包含するが、これらに限定されない。
用語「ＣＥＬｘ」検査は、本明細書に記載されている方法の様々な実施形態を全般的に指す。
用語「疾患細胞試料」は、疾患の部位由来の複数の細胞または疾患の特徴を有する細胞を指す。
用語「健康な細胞試料」は、細胞が、試験されている疾患を有さないかまたは試験されている疾患を有さない組織から抽出される細胞試料を指す。例えば、特定の対象が、対象の乳がんに対する治療剤の作用に関して試験されている場合、非がん細胞または乳房組織以外からの細胞が、「健康」とみなされる。用語「健康な細胞試料」は、対象の健康ステータス全体を決定したりまたは反映したりするものではない。正常な参照インターバルを誘導する目的の場合、使用される健康な細胞試料は、試験されている疾患を有さない対象から得られることが多い。
用語、分析的「感度」は、検査または検出限界を指し、ゼロから区別される最少の含量として定義される（例えば、ゼロ対照の平均を上回る９５％信頼区間または２標準偏差（ＳＤ）が一般に用いられる）。
用語、臨床「感度」は、検査が陽性であり標的状態を有する対象の割合を指す、あるいは対象とする状態が存在する場合に検査が陽性である頻度を指す。検査の臨床「感度」は、計算：１００％×ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）（式中、ＴＰは、検査されている転帰の真陽性事象の数であり、ＦＮは、陰性として不正確に決定された事象である偽陰性事象の数である）によって得られる正確性の推定として定義される。
臨床「特異性」は、検査が陰性であり標的状態を持たない対象の割合を指す、あるいは対象とする状態が存在しない場合に検査が陰性である頻度を指す。臨床特異性は、計算：１００％×ＴＮ／（ＦＰ＋ＴＮ）（式中、ＴＮは、検査されている転帰の真陰性事象の数であり、ＦＰは、陽性として不正確に決定された事象である偽陽性の数である）によって推定される。
用語「表面プラズモン共鳴機器」は、局所的屈折率の変化を検出することによる、金属表面における生体分子の結合事象を測定する光学的バイオセンサー型のＣＲｅＭＳを指す。
用語「治療剤」は、いずれかの合成または天然起源の生物学的に活性なものの化合物または組成物を指し、生物（ヒトまたは非ヒト動物）に投与されると、局所および／または全身作用により所望の薬理学的、免疫原性および／または生理的効果を誘導する。この用語は、タンパク質、ペプチド、ホルモン、核酸、遺伝子コンストラクトその他等の分子を包含する薬物、ワクチンおよび生物製剤として伝統的に考慮される化合物または化学物質を網羅する。薬剤は、獣医学を包含する医学、応用および植物等による農業ならびに他の分野において用いられる生物学的に活性な薬剤となり得る。用語、治療剤は、医薬；ビタミン；ミネラルサプリメント；疾患もしくは疾病の処置、予防、診断、治癒もしくは緩和に用いられる物質；または身体の構造もしくは機能に影響を与える物質；または所定の生理的環境に置かれた後に生物学的に活性となるもしくはより活性となるプロドラッグも限定することなく包含する。治療剤として、抗がん療法薬、抗精神病薬、抗炎症剤および抗生物質が挙げられるがこれらに限定されない。
用語「細胞傷害性療法」および「化学療法」は、罹患細胞（加えて、場合により非罹患細胞）に対して非特異的なまたは標的化されていない細胞傷害性を示す１つまたは複数の治療剤での処置を指す。
用語「標的化経路薬物」、「経路薬物」または「標的化薬物」は、疾患プロセスに関与する特定の生体分子（例えば、タンパク質）に結合し、これによりその活性を調節するよう設計された、治療能を有するいずれかの分子または抗体を指す。
用語「ＨＥＲ２療法」または「ＨＥＲ２標的化療法」は、ＨＥＲ２分子および／またはシグナル伝達経路を特異的に標的化するように設計されている１つまたは複数の治療剤、これらに限定されないが、例えばＨＥＲ２分子および／またはシグナル伝達経路を標的化する抗体および小分子などを使用する処置を指す。またこのようなＨＥＲ２療法は、ＨＥＲファミリーの他のメンバーを標的化していてもよく、例えば、ＨＥＲ１およびＨＥＲ２の両方、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ４、またはＨＥＲ３単独を標的化する療法である。
用語「ＥＲ療法」、「ＥＲ標的化療法」または「ホルモン療法」は、ＥＲ分子および／またはシグナル伝達経路を特異的に標的化するように設計される１つまたは複数の治療剤、これらに限定されないが、アロマターゼ阻害剤、選択的エストロゲン受容体モジュレーターおよび選択的エストロゲン受容体ダウンレギュレーター、加えてこのような療法とサイクリン依存性キナーゼＣＤＫ４およびＣＤＫ６を阻害する療法との組合せなどを使用する処置を指す。
用語「抗増殖薬」、「抗増殖剤」または「アポトーシス誘導薬」は、細胞分裂を低下、細胞成長を低下または細胞を死滅させるよう機能する治療能を有するいずれかの分子または抗体を指す。多くの場合、このような薬物の活性は、正常な細胞プロセスに関与する広範なクラスの生体分子に方向づけられており（例えば、ＤＮＡインターカレーション）、よって、薬物は、細胞疾患ステータスに対する判別性が低い。
ポリペプチドの「バリアント」は、参照配列とは異なるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを指す。参照配列は、全長ネイティブポリペプチド配列または全長ポリペプチド配列の他のいずれかの断片となり得る。一部の実施形態において、参照配列は、可変ドメイン重鎖または可変ドメイン軽鎖コンセンサス配列である。ポリペプチドバリアントは、一般に、参照配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する。
Ｂ．シグナル伝達経路活性を測定する診断アッセイおよび方法
今日の多くのがんは、疾患に関連する特定の遺伝子の突然変異または過剰発現された受容体タンパク質の存在を決定するための試験の助けによって診断される。例えば、乳がんの場合、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）が、がん細胞中で過剰発現または増幅されているかどうかを決定するために試験が実行される。これらの試験の結果は、疾患を処置するのに最も適している療法を決定するのに使用される。
ほとんどの標的化療法の実際の標的はシグナル伝達経路の要素である一方で、ほとんどのバイオマーカー試験は、シグナル伝達経路活性そのものに関する間接的で推論的な情報を提供するにすぎない。これらの試験は、典型的には、活性化されたシグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子中の突然変異に関するＤＮＡ分析、または固定された組織における過剰発現された受容体タンパク質の免疫組織化学からなる。実際には、疾患は、個々のタンパク質ではなく、腫瘍細胞の生存および増殖を引き起こすシグナル伝達経路ネットワークの動的で複雑な回路機構によって駆動される。このようなネットワークは、単純な直線的な経路ではなく、遺伝学的分析を使用して評価することができない複雑なバイパスメカニズムおよびフィードバックループを含む。
現行のバイオマーカー試験の限界に起因する誤診の可能性の一例は、現行の乳がんバイオマーカー試験で見出すことができる。毎年およそ３００，０００人の女性が、浸潤性または非浸潤性乳がんの診断を受けている。エストロゲン受容体アルファ（ＥＲα）陽性乳がんと診断された女性の７０％において、臨床転帰が劇的に改善されている。これらの改善された転帰は、主として、ＥＲαへの結合に関連するエストラジオールの産生またはその活性を崩壊させる標的化療法の利用可能性の結果である。女性の残りの３０％、およそ９０，０００人は、がんがＥＲα陰性であり、かなり悪化した予後に直面している。
乳がんにおいて機能不全性のエストロゲンシグナル伝達ネットワーク（ＥＳＮ）が広く認識された役割を果たすが、診療施設では単一の反応物であるＥＲαを測定する試験だけが実行されており、現在、患者の腫瘍上皮細胞中のＥＳＮ活性を測定する診断試験は利用できない。しかしながら、ＥＲα発現のみが測定される場合、ＥＲα陰性と分類されているが腫瘍細胞において異常なＥＳＮ活性を有する患者は、エストロゲンによって誘発される乳がんを実際には有するが、それを有さないと診断される。この誤診によって、ＥＲα陰性乳がんが、ＥＲα陽性乳がんに処方されるものよりはるかに有効性が低い薬物で処置されることから、このような患者にとって重大なマイナスの結果をもたらす。ＥＲα陽性患者とＥＲα陰性患者との転帰の差は、明確である。
臨床試験からの発見は、一部のＥＲα陰性患者は、内分泌療法によって利益を得ることを解明する。これは、患者を同定することができれば、患者の生存転帰を改善できるであろうということを示唆する。これは、ＥＲα陰性患者に内分泌療法の試みを推奨するためのＮＣＣＮ乳がんパネルをもたらした。
診療施設で使用される現行の方法が、疾患活性を促進することが公知の特異的な機能的活性を測定しない別の例は、ＨＥＲ２過剰発現乳がん（ＨＥＲ２陽性）の場合である。ＨＥＲ２タンパク質を標的化する薬物は、ＨＥＲ２の過剰発現したレベルの存在は必ずしもがん細胞増殖を促進するＨＥＲ２関連の経路の活性と相関しないため、効果がないことが多い。このケースでは、ＨＥＲ２関連の経路が活性かどうかを決定することが好ましいと予想される。
したがって、初代罹患細胞においてシグナル伝達経路活性を測定するための方法は、まず疾患が特徴付けられた患者を、静的な遺伝学的またはタンパク質分析の助けによってより正確に診断するための試験として重要な商業的な用途を有する。このアプローチは、長年にわたる科学的なコンセンサスの領域を覆し、生存可能な初代罹患細胞においてシグナル伝達経路活性を測定することは、遺伝子またはタンパク質のステータスだけではなく、患者の疾患の正しい診断にとっても必須であることを示す。
遺伝子またはタンパク質分析に焦点を当てるということは、患者のバイオマーカーのステータスが、それらのがんを診断するのに十分であるという広く支持された見解を反映している。ただし遺伝子またはプロテオーム発現のレベルを測定することは、罹患したシグナル伝達経路活性そのものに関して間接的で推論的な情報を提供するにすぎない。現行の調査により、疾患は、典型的には、シグナル伝達経路ネットワークの動的で複雑な回路機構によって促進されることが確立されている。このようなネットワークは、単純な直線的な経路ではなく、むしろ固定された細胞の静的な遺伝学的および免疫組織化学的分析を使用して評価することができない複雑なバイパスメカニズムおよびフィードバックループを含む。シグナル伝達経路活性の分析は、生きた固定されていない細胞の使用と、これらの生細胞における動的な細胞変化を時間をわたり測定できる方法の開発とを必要とする。この静的な遺伝子またはタンパク質分析への依拠は、一般的に使用される試験方法によって部分的に促進される。これらは、まず多くの細胞固定技術の１つを使用して腫瘍組織を調製すること、次いで免疫組織化学または蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などの様々な技術を使用して固定された細胞を分析することを含む。これらの方法は、腫瘍検体の遺伝子またはプロテオーム組成を検出することが可能であるが、これらは、動的な細胞経路活性を測定することはできない。
シグナル伝達経路活性の測定は、疾患と一致する異常の存在を検出することができる。これを達成するために、細胞シグナル伝達経路の操作と細胞接着プロセスとの間の密接な関係を高めるプラットフォームが開発されている。インテグリン、カドヘリン、Ｉｇ ＣＡＭ、およびセレクチンなどの膜貫通型細胞接着受容体と、細胞外マトリックス中または他の細胞上のそれらの同族の結合部位との相互作用は、複数の細胞シグナル伝達プロセスとの関係を実証した。接着の連絡は、細胞内シグナル伝達カスケードに直接連結される組織化された膜近位の細胞骨格構造を介して伝達する。これは、経路の撹乱因子を適用したときに特異的な細胞経路を介した特異的な接着分子に影響を与えることを可能にする。
細胞経路の撹乱がどの程度の細胞接着をもたらすかを測定するために、微小電極をコーティングした特異的な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料に付着させた生存可能な患者細胞の複雑なインピーダンス変化を測定する機器が使用される。これらの機器は、細胞インピーダンスバイオセンサーとして公知であり、各ウェルの底部を覆う薄い金電極を有する標準的なマイクロプレートで構成される。選択的な細胞外マトリックスと共に採用されたウェルは、マイクロプレートウェルの電極に特異的な方式で生存可能な細胞を付着させる。ウェルの電極上部における生存可能な細胞の存在は、電極／細胞境界面における局所的なイオン環境に影響を与えて、電極インピーダンスの増加を引き起こす。細胞が撹乱されるかまたは刺激されて、それらの機能を変化させる場合、それに伴い細胞接着における付随する変化は、インピーダンスを変更する。接着応答の特異性は、特異的なＥＣＭもしくはツール化合物または経路中の様々なポイントで作用することが公知の薬物の適用によって決定することができる。インピーダンスの結果は、インピーダンスの時間的パターンによって示された時点における特異的なプロテオーム変化の免疫検出によってさらに裏付けられる。システムは、ナノメートル未満からマイクロメートルの範囲における接着の変化を検出することが可能であり、生細胞における様々な経路の薬理学を類別するためのデータを生成する。測定されたインピーダンスの量は、細胞付着シグナル（ＣＡＳ）と称され、オームで表され、細胞の生存率、接着、およびシグナル伝達経路撹乱をモニターするのに使用することができる。生成したデータは、インピーダンス対時間である。
それゆえに、本発明の診断試験において、分析物は、マイクロプレートのウェル中に置かれたときに、単独で、または細胞撹乱因子の存在下で生存可能な患者細胞が生成する細胞付着シグナル（ＣＡＳ）であり、インピーダンスバイオセンサーなどのバイオセンサーで分析される。試験毎に、患者細胞試料の２つの群につきＣＡＳを測定して分析する。
１）患者細胞のみ（Ｃ）
２）患者細胞＋撹乱する経路因子（ＣＦ）
３）患者細胞＋撹乱する経路因子＋確認用薬剤（ＣＣＦ）。
シグナル伝達経路が正常または異常に機能しているかどうかを検出するために、患者の罹患細胞中のシグナル伝達経路を、１つまたは複数の経路因子および確認用薬剤で撹乱し、結果得られた活性を、撹乱因子および／または確認用薬剤がカットオフ値で有する作用と比較する。カットオフ値は、がんを有さない対象から得られた健康な細胞の試料セットのシグナル伝達経路活性の分析を含む研究から導出することができる。アッセイの測定量は、患者の罹患細胞におけるＣＦおよびＣ細胞間のＣＡＳにおける変化、ならびにＣＦおよびＣＣＦ罹患細胞間のＣＡＳにおける変化を反映する。シグナル伝達経路が異常である場合、ＣＦおよびＣ罹患細胞間のＣＡＳの変化、ならびに／またはＣＦおよびＣＣＦ罹患細胞間のＣＡＳの変化は、カットオフ値を超えると予想される。カットオフ値は、典型的には、目的の経路活性に関する正常な参照インターバルの上の限界値を超える。簡易化した実施形態では、また、経路因子または確認用薬剤で撹乱する直前の時間のポイントにおけるＣＡＳと比較した、撹乱のポイント後におけるＣＦおよびＣＤＦ試料のＣＡＳの測定も、有用な測定量であり得る。このような分析の例は、図１０Ｃおよび１１Ｃに示され、実施例６でさらに説明される。これらの実験において、健康な乳がん細胞（Ｈ６２細胞）および乳がん患者細胞（患者５４の初代腫瘍細胞）を、ＰＩ３Ｋ経路（ＮＲＧ１、図１０Ｃ）またはエストロゲン受容体アルファ（ＥＲα）経路（エストラジオール、図１１Ｃ）を特異的に活性化する撹乱剤で処置し、細胞におけるＣＡＳを測定した。結果から、ＰＩ３Ｋ経路のシグナル伝達活性は、健康な細胞と比べて罹患細胞で上昇することが実証される（図１０Ｃ）。同様に、ＥＲα経路におけるシグナル伝達活性は、健康な細胞と比べて罹患細胞において上昇する（図１１Ｃ）。
シグナル伝達経路に対する特異的な標的化治療用阻害剤の作用も、ＣＡＳを使用して評価することができる。図１０Ａ〜Ｂおよび１１Ａ〜Ｂで示されるように、ＰＩ３Ｋ経路またはＥＲα経路の特異的な阻害剤は、乳がん細胞株（図１０Ａ、１１Ａ）および初代乳がん細胞（図１０Ｂ、１１Ｂ）においてシグナル伝達経路活性を低下させることが示された。
本発明の診断アッセイは、本質的にあらゆる臨床状況で、特に現在のところ遺伝学的またはタンパク質バイオマーカーが疾患の指標として、したがって治療の意思決定のための指標として使用されている臨床状況で使用することができる。以下の表３は、ＦＤＡによって承認された治療剤のリストを、様々な病状の処置におけるそれらの使用に関連するバイオマーカーと共に示す。本発明の方法によれば、本明細書に記載されるアプローチは、治療剤によって影響を受ける関与するシグナル伝達経路の活性を検査することによって、患者が標準的なバイオマーカーアッセイを使用して陽性結果を呈するかどうかに関係なく、その治療剤での処置を患者に処方すべきかどうかを決定するのに使用することができる。
したがって、本発明は、罹患細胞における異常なシグナル伝達経路に関連する疾患に関して対象を診断する方法であって、対象は、バイオマーカー陰性であり、本方法は、
対象から得られた生存可能な初代罹患細胞の試料を調製して、ベース培地中で試料を培養するステップ；
（１）対象から得られた生存可能な初代罹患細胞の試料の第１の部分を撹乱剤と接触させ、（２）試料の第２の部分を撹乱剤および確認用薬剤と接触させるステップであって、撹乱剤は、疾患に関連するシグナル伝達経路に選択的に影響を与え、確認用薬剤は、同じ疾患に関連するシグナル伝達経路に対する撹乱剤の作用を選択的に阻害する、ステップ；
試料の各部分中の生存可能な初代罹患細胞の細胞接着または付着を連続的に測定するステップ；および
生理応答パラメータの連続的な測定の数学的分析によって測定量を決定して、試料の第１の部分と試料の第２の部分との値における差を同定するステップ；
測定量を、ＥｒｂＢシグナル伝達経路活性の正常な参照インターバルから導出されたカットオフ値と比較するステップ
を含み、
測定量がカットオフ値より大きい場合、対象は、罹患細胞における異常なシグナル伝達経路に関連する疾患に関して診断される、方法を提供する。
さらなる実施形態では、試料を培養するのに使用されるベース培地は、それらを撹乱剤と接触させる１２時間前以前７２時間前以降に、新鮮なベース培地で置き換えられる。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して異常なシグナル伝達経路活性を有すると診断された対象は、対象がそれを有すると診断される異常なシグナル伝達経路活性を阻害することが公知の療法のために選択される。さらなる実施形態では、対象に、本明細書に記載される方法を使用して選択された療法が投与される。
一実施形態では、疾患は、がんであり、例えば乳がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、膠芽腫、肝細胞癌、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、卵巣がん、子宮頸がん、膵臓がん、前立腺癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非ホジキンリンパ腫および甲状腺癌または頭頸部がんである。異常なシグナル伝達経路に関連する他のタイプの疾患、例えば自己免疫疾患および感染症も包含される。
一実施形態では、疾患は、がんであり、したがって罹患細胞は、腫瘍細胞の試料である。別の実施形態では、疾患に関与する組織タイプから得られた罹患した患者の健康な細胞は、対照として使用される。好ましい実施形態では、がんは、乳がんである。乳がんを診断することに関する一実施形態では、撹乱剤は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路、例えばＮＲＧ１に選択的に影響を与える。別の実施形態では、撹乱剤は、ＭＡＰＫシグナル伝達経路、例えば上皮増殖因子に選択的に影響を与える。乳がんを診断することに関する一実施形態では、撹乱剤は、ＥＲαシグナル伝達経路、例えばエストラジオールに選択的に影響を与える。乳がんを診断することに関するさらに別の実施形態では、撹乱剤は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路、例えばＨＥＲ２シグナル伝達経路に選択的に影響を与える。ＥｒｂＢシグナル伝達経路に選択的に影響を与える薬剤は、当該分野において公知である。
様々な実施形態では、シグナル伝達経路は、ＭＡＰＫ、ＲＨＯ、ＡＫＴ、ＦＡＫ１、ＲＡＳ／ＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ、ＭＡＫ、ＭＫＫ、およびＭＥＫからなる群より選択される。追加の好適なシグナル伝達経路としては、本明細書で開示された他のシグナル伝達経路が挙げられる。様々な実施形態では、撹乱剤は、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物、リガンド、試薬、有機分子、シグナル伝達因子、増殖因子、生化学的物質、またはそれらの組合せであってもよい。
本明細書にさらに記載されるように、細胞接着または付着は、インピーダンスバイオセンサーまたは光学的バイオセンサーを使用して測定することができる。一実施形態では、細胞接着または付着における変化は、ユークリッド分析を使用して評価される。例えば、ユークリッド分析は、複数の時点における差の算術的な総和、時間的最大値、時間的最小値、最大値または最小値に到達する時間、傾きの変化、バイオセンサーシグナルにおける絶対値の低下、全ての測定値の合計、およびそれらの組合せからなる群より選択することができる。別の実施形態では、細胞接着または付着における変化は、時間的最大値または最小値における変化によって測定される。
様々な実施形態では、生存可能な初代罹患細胞を、疾患に関連するシグナル伝達経路を標的化する確認用薬剤とさらに接触させ、細胞接着または付着に対する確認用薬剤の作用を測定する。別の実施形態では、確認用薬剤は、エストロゲンに関連するシグナル伝達経路活性を阻害することが公知の、選択的エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＳＥＲＤ）、または選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）である。
さらに別の実施形態では、罹患細胞を、疾患に関連するシグナル伝達経路を標的化する標的化治療薬とさらに接触させ、細胞接着または付着に対する標的化治療薬の作用を測定する。標的化治療薬の非限定的な例としては、セツキシマブ、ドセタキセル、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イリノテカン、ラパチニブ、パクリタキセル、パゾパニブ、トポテカン、トラスツズマブ、フルベストラント、タモキシフェン、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、エベロリムス、アビラテロン、ビカルタミド、ボルテゾミブ、ベムラフェニブ、イピリムマブおよびそれらの組合せが挙げられる。他の好適な標的化治療薬が、本明細書で開示される。さらに別の実施形態では、本方法は、標的化治療薬を対象に投与するステップをさらに含む。
別の実施形態では、本発明は、ホルモン療法のために、エストロゲン受容体アルファ（ＥＲα）陰性乳がんを有する対象を選択する方法であって、
対象から得られた生存可能な初代乳がん細胞の試料を調製して、ベース培地中で試料を培養するステップ；
（１）対象から得られた生存可能な初代乳がん細胞の試料の第１の部分を、エストロゲン関連のシグナル伝達経路を上方調節または下方調節することが公知の撹乱剤と接触させ、（２）試料の第２の部分を、撹乱剤および同じエストロゲン関連のシグナル伝達経路活性を阻害することが公知の確認用薬剤と接触させるステップ；
試料の各部分において、生存可能な初代乳がん細胞の生理応答パラメータを連続的に測定するステップ；
生理応答パラメータの連続的な測定の数学的分析によって測定量を決定して、試料の第１の部分と試料の第２の部分との値における差を同定するステップ；および
測定量を、エストロゲン受容体経路活性に関する正常な参照インターバルから導出されたカットオフ値と比較するステップ
を含み、
測定量がカットオフ値より大きい場合、対象は、ホルモン療法のために選択される、方法を提供する。
さらなる実施形態では、試料を培養するのに使用されるベース培地は、それらを撹乱剤と接触させる１２時間前以前７２時間前以降に、新鮮なベース培地で置き換えられる。
ＥＲαシグナル伝達経路に影響を与える好適な撹乱剤は当該分野において公知であり、本明細書で開示され、例えばエストラジオールである。別の実施形態では、生存可能な初代がん細胞を、エストロゲンに関連するシグナル伝達経路活性を阻害する確認用薬剤、例えば選択的エストロゲン受容体ダウンレギュレーターとさらに接触させる。別の実施形態では、腫瘍細胞を、ＥＲαシグナル伝達経路を標的化する標的化治療薬とさらに接触させ、細胞接着または付着に対する標的化治療薬の作用を測定する。ＥＲαシグナル伝達経路を標的化する好適な標的化治療薬は当該分野において公知であり、本明細書で開示され、例えばフルベストラントおよびタモキシフェンである。本方法は、標的化治療薬を対象に投与するステップをさらに含んでいてもよい。
さらに別の実施形態では、本発明は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与える標的化治療薬での療法のために、ＥｒｂＢ２非過剰発現（ｎｏｎ−ｏｖｅｒｐｒｅｓｓｉｎｇ）非増幅がんを有する対象を選択する方法であって、
対象から得られた生存可能な初代がん細胞の試料を調製して、ベース培地中で試料を培養するステップ；
（１）対象から得られた生存可能な初代がん細胞の試料の第１の部分を撹乱剤と接触させ、（２）試料の第２の部分を撹乱剤および確認用薬剤と接触させるステップであって、撹乱剤は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に選択的に影響を与え、確認用薬剤は、同じＥｒｂＢシグナル伝達経路に対する撹乱剤の作用を選択的に阻害する、ステップ；
試料の各部分において、生存可能な初代がん細胞の生理応答パラメータを連続的に測定するステップ；
生理応答パラメータの連続的な測定の数学的分析によって測定量を決定して、試料の第１の部分と試料の第２の部分との値における差を同定するステップ；
測定量を、ＥｒｂＢシグナル伝達経路活性の正常な参照インターバルから導出されたカットオフ値と比較するステップ
を含み、
測定量がカットオフ値より大きい場合、対象は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与える標的化治療剤での処置のために選択される、方法を提供する。
さらなる実施形態では、試料を培養するのに使用されるベース培地は、それらを撹乱剤と接触させる１２時間前以前７２時間前以降に、新鮮なベース培地で置き換えられる。
ＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与える好適な撹乱剤は当該分野において公知であり、本明細書で開示される。一実施形態では、生存可能な初代がん細胞を、ＥｒｂＢ関連のシグナル伝達経路のシグナル伝達を阻害することが公知の確認用薬剤、例えば２Ｃ４マウスモノクローナル抗体またはチロシンキナーゼ阻害剤と接触させる。別の実施形態では、生存可能な初代腫瘍細胞を、ＥｒｂＢシグナル伝達経路を標的化する標的化治療薬とさらに接触させ、細胞接着または付着に対する標的化治療薬の作用を測定する。ＥｒｂＢシグナル伝達経路を標的化する好適な標的化治療薬は当該分野において公知であり、本明細書で開示される。本方法は、標的化治療薬を対象に投与するステップをさらに含んでいてもよい。
別の実施形態では、本発明は、ラパチニブでの療法のために、ＥｒｂＢ２非過剰発現非増幅乳がんを有する対象を選択する方法であって、
対象から得られた生存可能な初代乳がん細胞の試料を調製して、ベース培地中で試料を培養するステップ；
試料を培養するのに使用されるベース培地を、試料を撹乱剤と接触させる１２時間前以前７２時間前以降に、新鮮なベース培地で置き換えるステップ；
（１）対象から得られた生存可能な初代乳がん細胞の試料の第１の部分を、撹乱剤としてのニューレグリンと接触させ、（２）試料の第２の部分をニューレグリンおよび確認用薬剤と接触させるステップであって、確認用薬剤は、ニューレグリンと同じＥｒｂＢシグナル伝達経路を選択的に阻害する、ステップ；および／または（３）試料の第３の部分を、撹乱剤としての上皮増殖因子と接触させ、（４）試料の第４の部分を上皮増殖因子および確認用薬剤と接触させるステップであって、確認用薬剤は、上皮増殖因子と同じＥｒｂＢシグナル伝達経路を選択的に阻害する、ステップ；
撹乱剤と接触させた生存可能な初代乳がん細胞の細胞接着または付着を連続的に測定するステップ；
生理応答パラメータの連続的な測定の数学的分析によって測定量を決定して、試料の第１の部分と試料の第２の部分との値における差および／または試料の第３の部分と試料の第４の部分との値における差を同定するステップ；ならびに
測定量を、ＥｒｂＢ経路活性に関する正常な参照インターバルから導出されたカットオフ値と比較するステップ；
を含み、
測定量がカットオフ値より大きい場合、対象は、ラパチニブでの処置のために選択される、方法を提供する。
代替として、上記に記載された同じ方法が、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与えるラパチニブ以外の他の標的化治療剤（ｔｈｅｒｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）を用いて適用される可能性がある。以下の表（表４）は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路がんを処置することが意図される経路、薬物標的、および標的化療法を要約する。
標的化治療剤での処置のために対象を選択するための上に記載した方法に加えて、本発明はまた、標的化治療剤を対象に投与するステップを含む、標的化治療剤で対象を処置する方法であって、対象は、対象からの生存可能な初代細胞の試料を使用した処置のために対象を選択するための上に記載した方法の１つを適用することによって、標的化治療剤を用いた処置のために選択された、方法も包含する。
Ｃ．治療剤の有効性を選択またはモニターする方法
１つの個体における部位からのがんは、別の個体における同じ部位におけるがんと、遺伝学的構成、タンパク質の発現レベル、および治療的介入への応答において完全に異なっている可能性があるため、がんのような疾患は、部分的に不均一である。罹患した組織は、遺伝子発現または遺伝子変更において互いに顕著に異なっている可能性がある。例えば、転移性腫瘍は、原発性腫瘍と異なっている可能性がある。医者は、ヒトゲノムの配列決定および他の遺伝学的定量化ツールによって、各患者の疾患がその患者にいくらか固有であるという情報を得てきた。この情報は、各患者が患者の疾患に応じてカスタマイズされた治療レジメンを受けることができるであろう個別化医療周辺のビジネス全体を生み出してきた。
一部の薬物は、特定の遺伝子関連の疾患兆候に対し標的化されている。このアプローチは、主として現在の予後ツールセットの著しい弱点のために、未だに広く利用されていない。本明細書に記載されている方法は、個体の疾患に対し有効性を示す治療剤を選択する方法を提供する。実施形態において、ＣＲｅＭＳにおいて、治療剤が、罹患組織から単離された無標識生細胞全体に接触し、細胞の生理的パラメータの変化またはその欠如が、治療剤の存在下で検出される。ベースライン測定値と比較して疾患細胞の生理的パラメータの変化をもたらす、対象を処置するための治療剤が選択される。
本開示の一態様は、対象の初期の診断に、または処置全体にわたりのいずれかにおいて、疾患または障害の処置に使用するために商業的に承認されている薬物を含む１つまたは複数の治療剤を選択する方法を含む。実施形態では、本方法は、細胞応答測定系で、対象からの少なくとも１つの単離された疾患細胞試料に、１つまたは複数の治療剤を投与するステップ；治療剤（１つまたは複数）の投与前の細胞の応答パラメータのベースラインの測定値と比較して、治療剤（１つまたは複数）に応答して、疾患細胞試料の細胞の応答パラメータにおいて変化が起こるかどうかを決定するステップを含み、細胞の応答パラメータにおける変化が、個々の対象においてその治療剤（１つまたは複数）が疾患に対する治療有効性を有することを示す。ある特定の実施形態では、単離された疾患細胞試料は、無標識細胞全体を含む。他の実施形態では、単離された疾患細胞における細胞の応答パラメータの変化は、規定の期間にわたり連続的にモニターされる。他の実施形態では、本方法は、少なくとも１つの細胞の応答または生理学的パラメータの変化をもたらす治療剤または治療剤の組合せを選択するステップ、および選択された治療剤を医療提供者に伝達するステップをさらに含む。他の実施形態では、本方法は、少なくとも１つの細胞の応答または生理学的パラメータの変化をもたらす治療剤または治療剤の組合せを投与するステップをさらに含む。
別の実施形態において、本発明は、個々の対象における疾患のための薬剤の治療上の有効性を決定することによって、個々の対象に対する処置を選択する方法であって、細胞応答測定系（ＣＲｅＭＳ）において、薬剤を上記個々の対象由来の少なくとも１種の単離された無標識疾患細胞試料に投与するステップであって、疾患細胞試料が、がん細胞試料、自己免疫性疾患の対象由来の細胞試料、外来性病原因子に感染した組織由来の細胞試料およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるステップと、治療剤の存在および／または非存在下で、規定の期間にわたって、細胞試料の少なくとも１種の生理応答パラメータの変化を連続的に測定するステップと、ベースライン測定値と比較して、薬剤に対する細胞試料の生理応答パラメータの変化が生じるか決定するステップであって、生理応答の変化が、薬剤が、前記個々の対象における疾患に対し治療上の有効性を有することを示すステップとを含む方法を提供する。実施形態において、疾患細胞は、がん細胞である。
他の実施形態において、本発明は、特定の対象に対する治療剤の有効性を比較するための方法であって、細胞の少なくとも１種の生理的パラメータを測定する機器において、少なくとも２種の異なる治療剤を、同じ対象由来の別々の疾患細胞試料に投与するステップと、ベースライン測定値と比較して、治療剤それぞれに対する各細胞試料の生理応答を決定するステップであって、生理応答が、各治療剤の有効性を示すステップとを含む方法を提供する。ある特定の実施形態において、単離された疾患細胞試料は、無標識細胞全体を含む。他の実施形態において、単離された疾患細胞における細胞の応答パラメータの変化は、規定の期間にわたって連続的にモニターされる。実施形態において、方法は、より優れた有効性をもたらす治療剤または治療剤の組み合わせを選択するステップと、医療提供者に選択を伝達するステップとをさらに含む。他の実施形態において、方法は、より優れた有効性をもたらす治療剤または治療剤の組み合わせを対象に投与するステップをさらに含む。
本開示の別の態様は、腫瘍細胞の成長速度を決定するための方法を提供する。腫瘍の成長速度を測定することにより、腫瘍細胞が成長することができる速さに応じて処置を選択することができる。腫瘍細胞が、速く成長する腫瘍である場合、医療従事者は、より遅く成長する腫瘍の処置と比較して、より積極的な処置を選択するであろう。ある特定の実施形態において、この方法は、細胞応答測定系において単離された腫瘍細胞試料を提供するステップと、腫瘍細胞試料の成長速度を規定の期間にわたって連続的にモニターするステップと、速い成長速度を提示する腫瘍細胞に対しより積極的な処置を選択するステップ、および／または選択された処置を医療提供者に伝達するステップとを含む。他の実施形態において、単離された疾患細胞試料は、無標識細胞全体を含む。他の実施形態において、方法は、選択された処置を対象に投与するステップをさらに含む。実施形態において、速く成長する腫瘍は、約１００時間未満、好ましくは、２０時間未満の細胞倍加速度を有し、一方、より遅く成長する腫瘍は、１００時間以上の細胞倍加速度を有し、細胞倍加速度とは、１個の細胞が２個の細胞に分裂する時間である。
別の態様では、本発明は、疾患細胞試料中の経路の機能不全を確認するために、個々の対象からの生存可能な初代疾患細胞試料において特定の経路が異常であるかどうか、および／または特定の経路が確認用薬剤に感受性であるかどうかを決定するための方法を提供する。このような方法において、処置が続く期間にわたり、個体の疾患細胞試料において機能している細胞経路のプロファイルを得て、モニターすることができる。ある特定の実施形態では、本方法は、細胞応答測定系で、対象からの少なくとも１つの単離された生存可能な初代疾患細胞試料に、１つまたは複数の撹乱剤および／または確認用薬剤を投与するステップ；撹乱剤および／または確認用薬剤の投与前の細胞の応答パラメータのベースラインの測定値と比較して、撹乱剤および／または確認用薬剤に応答して、生存可能な初代疾患細胞試料の細胞の応答パラメータにおいて変化が起こるかどうかを決定するステップによって異常な経路機能の存在に関して疾患細胞試料を特徴付けることを含み、細胞の応答パラメータにおける変化が、個々の対象からの単離された生存可能な初代疾患細胞試料において、撹乱剤によって活性化された、または確認用薬剤によって阻害された細胞経路が異常であることを示し得る。ある特定の実施形態では、撹乱剤としては、増殖因子、ヘレグリンなどの受容体および細胞表面タンパク質に結合し、次いで細胞経路を活性化するタンパク質もしくは他のリガンド、疾患細胞試料中の経路を活性化する細胞表面の受容体を有する形質転換細胞を含む細胞、または細胞内で細胞の生理学的機能を所望の方式で撹乱する有機小分子（１０，０００ダルトンまたはそれ未満）、ペプチド、核酸（例えば干渉性ＲＮＡ）が挙げられる。他の実施形態では、確認用薬剤としては、非限定的なリストから、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＰＤＧＦＲ、ＴＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＴＮＦＲ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、またはＶＥＧＦ受容体などの増殖因子受容体、トポイソメラーゼ活性、キナーゼ、Ｇタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、微小管重合、細胞骨格組織化、細胞の機能および細胞接着を阻害するものが挙げられる。
例えば、一実施形態では、個々の対象から得られた罹患細胞における細胞経路の機能的ステータスを決定するための方法であって、本方法は、対象から得られた罹患細胞試料を、細胞経路を刺激するかまたはそれに拮抗することが公知の撹乱剤（例えば、アクチベーター剤）と接触させるステップ、試料中の生存可能な初代細胞において１つまたは複数の生理応答パラメータを連続的に測定するステップ、および撹乱剤の存在下で、好適な対照と比べて、連続的な測定の数学的分析によって、生存可能な初代罹患細胞試料における１つまたは複数の生理応答パラメータにおける変化の量を決定するステップによってなされ、撹乱剤の存在下における、好適な対照と比べた１つまたは複数の生理応答パラメータにおける変化の量は、撹乱剤によって標的化された細胞経路が、個々の対象において異常であることを示す、方法が提供される。
一実施形態では、個々の対象における細胞経路のステータスの知見は、シグナル伝達経路により誘発される疾患の存在を診断するのに使用することができる。さらなる実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて診断された対象は、シグナル伝達経路疾患を標的化する治療剤に応答することが予測される。例えば、撹乱剤の存在下における１つまたは複数の生理応答パラメータの連続的な測定の分析によって決定した場合に、対象からの罹患細胞が、撹乱剤（例えば、アクチベーター剤）に異常に応答するとすれば、その対象は、撹乱剤と同じ細胞経路に標的化された治療剤に応答する可能性があると予想される。撹乱剤の存在下で、好適な対照と比べて、１つまたは複数の生理応答パラメータにおける変化が罹患細胞試料の生存可能な細胞で起こるとすれば、対象からの罹患細胞は、撹乱剤に異常に応答する。
別の例において、撹乱剤の存在下における１つまたは複数の生理応答パラメータの連続的な測定の分析によって決定した場合に、対象からの罹患細胞が、撹乱剤（例えば、アクチベーター剤）に異常に応答しないとすれば、その対象は、撹乱剤と同じ細胞経路に標的化された治療剤の投与によって利益を得られない可能性があると予想される。撹乱剤の存在下での罹患細胞試料の生存可能な細胞における１つまたは複数の生理応答パラメータにおける変化が、好適な対照より小さい場合、対象からの罹患細胞は、撹乱剤に正常に応答する。
したがって、別の態様では、個々の対象ごとに標的化治療剤を選択するための方法であって、本方法は、対象から得られた罹患細胞試料を、細胞経路を刺激するかまたはそれに拮抗することが公知の撹乱剤と接触させるステップ、試料中の生存可能な細胞において１つまたは複数の生理応答パラメータを連続的に測定するステップ、および連続的な測定の数学的分析によって、好適な対照と比べて、罹患細胞試料において、撹乱剤の存在下で起こる１つまたは複数の生理応答パラメータにおける変化の量を決定するステップによってなされ、撹乱剤の存在下における、好適な対照と比べた１つまたは複数の生理応答パラメータにおける変化の量は、対象が、細胞経路を標的化する標的化治療剤に応答すると予想されることを示す、方法が提供される。
ある特定の実施形態では、対象から得られた細胞試料の第１の部分を、撹乱剤と接触させ、細胞試料の第２の部分を、撹乱剤および確認用薬剤と接触させる。次いで本方法は、試料の部分のそれぞれにおいて生理応答パラメータ（例えば、細胞接着または付着）を連続的に測定するステップ、それに続いて生理応答パラメータの連続的な測定の数学的分析によって測定量を決定して、試料の第１の部分と試料の第２の部分との値における差を同定するステップ；それに続いて測定量を、正常な参照インターバルから導出されたカットオフ値と比較するステップをさらに含む。測定量がカットオフ値より大きい場合、標的化治療薬が選択される。
ある特定の実施形態では、本方法は、対象への標的化治療剤の投与（すなわち、対象が薬剤に応答すると決定される場合）をさらに含む。
他の実施形態では、本方法は、細胞応答測定系で、対象からの単離された疾患細胞試料に、１つまたは複数のアクチベーター剤を投与するステップ；撹乱剤の投与前の細胞の応答パラメータのベースラインの測定値と比較して、規定の期間にわたり撹乱剤に応答して、疾患細胞試料の細胞の応答パラメータにおいて変化が起こるかどうかを決定するステップ、単離された疾患細胞試料に、１つまたは複数の確認用薬剤を投与するステップ、および撹乱剤の投与の前または後の細胞の応答パラメータと比較して、規定の期間にわたり確認用薬剤に応答して疾患細胞試料の細胞の応答パラメータにおいて変化が起こるかどうかを決定するステップを含み、好適な対照と比べた細胞の応答パラメータにおける変化の量は、個々の対象からの単離された疾患細胞試料において、撹乱剤によって活性化された、および確認用薬剤によって阻害された細胞経路が異常に機能していることを示す。
追加の実施形態は、処置、臨床試験のために対象を選択するための方法、および／または候補治療剤への患者の応答性を評価するための方法を含む。実施形態では、候補治療薬に応答する可能性が最も高い患者のみを選択するために、その候補治療薬の臨床試験の前に対象が選択される。このアプローチは、候補治療薬が、特にその疾患を有すると診断される全集団の部分にのみ有効な結果を提供することができる治療剤を用いて、規制当局の承認を保証するのに十分な選択された患者集団内での有効性を実証することができる可能性を高めると予想される。このアプローチのもとで承認されていない治療薬の臨床試験が考慮される患者において、承認されていない薬物への患者の応答性を予測するために、患者の罹患細胞が、異常なシグナル伝達経路活性の存在を決定するために評価されることが予想される。異常なシグナル伝達経路活性の存在を実証する患者のみが、試験のために選択されると予想される。他の実施形態では、細胞応答測定系で、対象からの少なくとも１つの単離された疾患細胞試料に、１つまたは複数の治療剤を投与するステップ；治療剤（１つまたは複数）の投与前の細胞の応答パラメータのベースラインの測定値と比較して、治療剤（１つまたは複数）に応答して、疾患細胞試料の細胞の応答パラメータにおいて変化が起こるかどうかを決定するステップを含む方法であって、細胞の応答パラメータにおける変化が、個々の対象においてその治療剤（１つまたは複数）が疾患に対する治療有効性を有することを示す、方法によって、対象の細胞の試料がレスポンダー（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）として同定される場合、対象は、処置のために選択される。ある特定の実施形態では、本方法は、細胞が治療剤（１つまたは複数）に応答して細胞の応答パラメータにおける変化を呈する対象を、処置または臨床試験のために選択するステップをさらに含む。
さらなる態様では、本発明は、治療剤への応答性または非応答性を実証する対象からの疾患試料のバイオマーカーを同定する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、細胞応答測定系で、対象からの単離された疾患細胞試料を治療剤と接触させるステップ；治療剤（１つまたは複数）の投与前の細胞の応答パラメータのベースラインの測定値と比較して、治療剤（１つまたは複数）に応答して、疾患細胞試料の細胞の応答パラメータにおいて変化が起こるかどうかを決定するステップを含み、細胞の応答パラメータにおける変化が、個々の対象においてその治療剤（１つまたは複数）が疾患に対する治療有効性を有することを示し（レスポンダー）、変化の欠如は、治療剤がその対象の疾患に対する有効性を有さないことを示す（ノンレスポンダー（ｎｏｎｒｅｓｐｏｎｄｅｒ））。実施形態では、本方法は、治療剤に応答する対象からの細胞を、他のバイオマーカーに関してさらに特徴付けるステップ、および／または治療剤に応答しない対象からの細胞を、他のバイオマーカーに関してさらに特徴付けるステップをさらに含む。バイオマーカーは、遺伝子の突然変異、単一ヌクレオチド多型、遺伝子発現レベル、タンパク質、タンパク質の突然変異、翻訳後タンパク質修飾、スプライスバリアント、細胞表面マーカー、タンパク質または核酸の過剰発現、核酸（非限定的な例としては、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡなど）の増幅、細胞形態、およびそれらの組合せを含む。
標的化治療薬の有効性は、患者が、標的化療法が影響を与えることを意図した疾患（例えば異常なシグナル伝達経路活性）を有するかどうか、それがその標的に結合するかどうか、およびそれが異常なシグナル伝達活性において同時に起こる変化を引き起こすかどうかに依存する。本明細書に記載される方法は、撹乱剤および／または確認用薬剤および／または治療剤が、これら薬剤が作用することを意図される経路に対して有する作用を、細胞試料中のこれら薬剤への生理学的な応答を測定することによって測定する。ゲノムおよびプロテオームツールは、治療剤および／または撹乱剤（例えば、活性化薬剤）による影響を受けた細胞経路の要素における変更を同定するのに使用することができる。したがって、一実施形態では、個々の対象において撹乱剤および／または確認用薬剤および／または治療剤の影響を受けた細胞経路の要素を同定する方法であって、本方法は、対象から得られた単離された無標識細胞試料を、撹乱剤および／または確認用薬剤および／または治療剤と接触させるステップ、試料中の生存可能な細胞において少なくとも１つの生理応答パラメータを連続的に測定することによってこれら薬剤の作用をモニターするステップ、連続的な測定の数学的分析によって、生理応答パラメータにおける変化が起こるかどうかを決定することにより、これら薬剤への試料の感受性を特徴付けるステップ、試料への撹乱剤の活性を停止させるステップ、および細胞経路の要素が、細胞試料中のこれら薬剤によって変更されたかどうかを決定するために、プロテオミクス、ｑＰＣＲ、ゲノミクス、ＲＮＡ定量化、タンデム液体クロマトグラフィー−質量分析法、およびメタボロミクスから選択される方法を使用して、これら薬剤によって標的化された細胞経路の要素またはバイオマーカーを分析するステップによってなされる、方法が提供される。この方法は、例えば、患者細胞において経路が撹乱されたときに、どの細胞経路の要素が発現または活性化（例えば、リン酸化）の変化を受けるのかを決定するのに使用することができる。
これらの方法はまた、同じ個々の対象からの異なる組織からの２つの細胞試料の経路活性を比較するためにも使用することができる。
ある特定の実施形態では、撹乱剤は、薬物、撹乱剤の組合せ、経路のアクチベーターおよび阻害剤を含む撹乱剤の組合せ、経路の異なるメンバーのアゴニストおよびアンタゴニストを含む撹乱剤の組合せ、または治療薬を含む撹乱剤の組合せであってもよい。
これらの方法はまた、薬物候補である小分子または抗体が、それらが標的化している経路に対する作用を有するかどうかを評価することによって創薬プロセスを強化するためにも使用することができる。
さらに他の実施形態において、本発明は、細胞の少なくとも１種の生理的パラメータを測定する機器において、複数の治療剤組み合わせを同じ対象由来の別々の疾患細胞試料に投与することによって、特定の対象に最適な治療レジメまたは薬物の組み合わせを決定するための方法であって、各治療法組み合わせが、同じ対象由来の別々の疾患細胞試料に投与されるステップと、ベースライン測定値と比較して、各治療法組み合わせに対する各細胞試料の生理応答を決定するステップであって、生理応答が、可能な治療法組み合わせの最も効果的な治療法組み合わせを示すステップとを含む方法を提供する。ある特定の実施形態において、方法は、少なくとも１種の細胞応答または生理的パラメータの変化をもたらす治療剤または治療剤の組み合わせを選択するステップをさらに含む。他の実施形態において、方法は、少なくとも１種の細胞応答または生理的パラメータの変化をもたらす治療剤または治療剤の組み合わせを対象に投与するステップをさらに含む。
別の態様では、本発明は、疾患を処置するための治療剤を選択することによって、患者を疾患に関して処置することを含む方法であって、細胞応答測定系で、対象からの少なくとも１つの単離された疾患細胞試料に、１つまたは複数の治療剤を投与するステップ；治療剤（１つまたは複数）の投与前の細胞の応答パラメータのベースラインの測定値と比較して、治療剤（１つまたは複数）に応答して、疾患細胞試料の細胞の応答パラメータにおいて変化が起こるかどうかを決定するステップ、細胞の応答パラメータにおける変化を引き起こす治療剤を選択するステップ；少なくとも１つの細胞の応答または生理学的パラメータの変化をもたらす治療剤を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。治療剤としては、特異的な生物学的経路に標的化されるもの、細胞増殖を阻害するもの、細胞の殺滅を強化するもの、炎症を阻害するもの、微生物を殺滅するもの、および／または免疫応答を強化するものが挙げられる。ある特定の実施形態では、治療剤が特異的な生物学的経路に標的化される場合、治療剤は、細胞表面の受容体と相互作用して、受容体に関するリガンドの作用を阻害することができる。本発明の別の実施形態では、生理応答パラメータまたはバイオマーカーは、患者の生細胞または組織試料からの上清画分を試験することによって測定される。例えば、一部の乳がん細胞は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に関して陽性であり、上皮増殖因子（ＥＧＦ）に応答する。個々の対象の細胞につきＥＧＦの相互作用を阻害する治療剤の有効性は、リガンドの存在および非存在下で決定することができる。
他の実施形態において、治療剤は、細胞増殖および／または細胞死滅を阻害する。このような場合、細胞応答または生理的パラメータの変化の速度は、試料において測定することができ、細胞死を引き起こすまたは細胞増殖を阻害する治療剤の有効性を示す。実施形態において、細胞応答の変化の速度は、治療剤ならびに増殖を増強させかつ／または細胞死滅を阻害する公知の薬剤の存在および／または非存在下で決定される。
本発明の他の態様において、キットが提供される。一実施形態において、キットは、輸送培地を含有する、個々の対象由来の疾患細胞試料のための容器と、輸送培地を含有する、対照細胞試料のための容器と、バイオセンサーと、バイオセンサーからのデータを、規定の期間にわたる、ｐＨ、細胞接着、細胞付着パターン、細胞増殖、細胞シグナル伝達、細胞生存、細胞密度、細胞サイズ、細胞形状、細胞極性、Ｏ２、ＣＯ２、グルコースおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される細胞生理応答パラメータの変化を示す出力へと変換し、出力を、応答なし、弱い応答性および応答性として分類し、分類による報告を作成するためのコンピュータ実行可能命令を有する非一過性コンピュータ可読媒体とを含む。
Ｄ．細胞試料
本発明の実施形態は、対象の罹患細胞に投与された際の治療法の有効性を決定するため、有効性をモニターするため、あるいは治療法の用量を同定するためのシステム、キットおよび方法を包含する。
伝統的に、疾患は、疾患に冒されている組織または器官によって分類されてきた。根底にある機序（例えば、遺伝的、自己免疫性応答等）に関するより良い知識により、現在、同じ組織／器官を冒す、または同じ症状を生じる疾患が、異なる病因を有し得ること、また、不均一な遺伝子発現プロファイルを有し得ることが理解されている。加えて、多くの疾患において、治療剤に対しレスポンダーおよびノンレスポンダーが存在することが示された。実施形態において、特定の治療薬の薬物組み合わせが、特定の個体に有効となるか予測または予後判定するため、例えば、個体がレスポンダーであるかノンレスポンダーであるか決定するために、本明細書の方法において、レスポンダーおよびノンレスポンダーが同定されるいかなる病型を用いてもよい。
本来不均一であり、レスポンダーおよび多くのノンレスポンダーを有することが公知の病型の一例は、がんである。がんは、典型的に、組織型にしたがって分類される。しかし、がんの不均一性のより的確な説明は、異なるがんの異なる突然変異において反映される。がんの不均一性のさらにより的確な説明は、特定の患者の細胞における突然変異の実際の機能的、生理的結果である。例えば、乳がんは、この器官のがんを引き起こす異なる種類および異なる突然変異を有する。転帰および処置は、がんを引き起こす突然変異が、機能獲得型（例えば、タンパク質産生の増加を引き起こす癌原遺伝子）であるか、機能欠損型突然変異（例えば、腫瘍抑制因子）であるか、また、いずれの遺伝子において生じるかに基づき異なる可能性がある。特定のがんの不均一性によって、特定の治療剤に対する不均一な応答が存在し得ることが予想されよう。本発明の実施形態は、治療剤または治療剤のパネルに対する特定の対象のがん細胞を検査して、特定の対象のがんに特異的な治療剤または最も有効な治療剤の有効性を決定して、対象のための処置を選択することを可能にする。
本発明の実施形態は、個々の対象由来のがん細胞の疾患細胞試料を包含する。係るがん細胞は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、基底細胞癌、肝外胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣芽細胞腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮腫、乳がん、中等度分化の松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、松果体芽腫、気管支腫瘍、カルチノイド腫瘍、子宮頚がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性障害、結腸がん、結腸直腸がん、皮膚性Ｔ細胞リンパ腫、腺管上皮内癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜がん、食道がん、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、性腺外胚細胞腫瘍、眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫、線維性組織球腫（ｆｉｂｒｏｕｓ ｈｉｓｔｏｃｙｔｏｍａ）、胆嚢がん、胃がん、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛性腫瘍、グリオーマ、ヘアリー細胞白血病、心臓がん、肝細胞がん、ランゲルハンス細胞組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎細胞がん、喉頭がん、口唇がん、肝臓がん、非浸潤性小葉癌（ＬＣＩＳ）、肺がん、メルケル細胞癌、メラノーマ、中皮腫、口内（ｍｏｕｔｈ）がん、多発性骨髄腫、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、中咽頭がん、卵巣がん、膵臓がん、乳頭腫症、パラガングリオーマ、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体実質、下垂体腫瘍、胸膜肺芽細胞腫、前立腺がん、直腸がん、横紋筋肉腫、唾液腺がん、扁平上皮癌、小腸がん、精巣がん、咽喉がん、甲状腺がん、尿管がん、尿道がん、子宮がん、腟がん、外陰部がんおよびウィルムス腫瘍に由来し得るが、これらに限定されない。
自己免疫性疾患は、自己抗原に対する免疫系活性化による炎症の増加によって特徴付けられる。現在の治療法は、Ｂ細胞等の免疫系細胞および抗ＴＮＦα等の炎症性分子を標的化する。治療法は、免疫モジュレートまたは免疫抑制剤として広く特徴付けることができる。薬物は、ＴＮＦアルファ、インテグリン、スフィンゴシン受容体およびインターロイキン等、特定の分子に標的化することができる。他の薬物は、副腎皮質ステロイド等、抗炎症剤として作用する。さらに他の事例において、薬物は、メルカプトプリンおよびシクロホスファミド等、免疫抑制剤である。自己免疫性状態に関して、ある特定の治療法に対する応答に関して末梢血細胞を試験することができる。他の実施形態において、炎症部位の組織試料、例えば、関節リウマチにおける滑膜組織または潰瘍性大腸炎の結腸組織。
例えば、一部の関節リウマチ患者は、抗ＴＮＦα抗体に対しノンレスポンダーであることが公知である。実施形態において、ＲＡを有すると疑われる患者から末梢血細胞を得て、患者のＴＮＦ受容体の細胞シグナル伝達能力および関連するＭＡＰＫ経路の減少を用いて、患者が、免疫調節性または免疫抑制剤化合物に対しレスポンダーまたはノンレスポンダーである可能性が高いか決定することができる。同様に、ＩＬ−６、インターフェロンアルファ、インターフェロンガンマその他を標的化する治療法等、他の治療法を同じ仕方で検査することができる。他の実施形態において、多発性硬化症の患者は、インターフェロンベータに対しノンレスポンダーであることが公知である。対象由来の細胞試料を薬物のパネルに対し検査して、細胞生理的パラメータの変化を誘導することにより、あるとすれば、いずれの薬物が特定の対象に有効であるか理解することができる。有利な転帰の例は、米国リウマチ学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）（ＡＣＲ）判断基準によって決定される細胞炎症パラメータの低下、あるいは血液脳関門機能を強化するための細胞接着の増加となる。
他の実施形態において、患者は、微生物、異物または外来性病原因子による細胞の感染に起因する疾患を有し得る。微生物に感染した血液細胞または組織試料は、様々な抗生物質、抗ウイルス薬または他の治療候補に対する応答性に関して評価することができる。例えば、Ｃ型肝炎感染症には、ウイルス機能を低下させる多数の異なる治療剤が存在し、感染した組織試料を１種または複数の治療剤と接触させ、細胞生理的パラメータの変化を検出することができる。感染した組織の細胞生理的パラメータに変化を生じる治療剤、および／または最少用量で細胞生理的パラメータに変化を生じる治療剤が選択される。細胞生存の増加または細胞成長の増加等の転帰が、有利と考慮される。特定の受容体型または細胞経路の撹乱を介したウイルス侵入の遮断等により、直接的にヒト細胞をもたらすよう治療法が設計された他の実施形態において、本明細書の他の実施形態に記載されている前記治療法により、受容体結合または経路撹乱に関して患者細胞を検査することができる。
実施形態において、治療法を開始する前、治療法の間、治療法の後、緩解の間、再燃した際に細胞試料を得ることができる。本明細書に記載されている方法は、処置前、処置の間、患者が抵抗性を生じる場合、再燃した際の治療上の有効性の予測に有用である。本開示の方法は、治療剤または薬剤の組み合わせに対するレスポンダーまたはノンレスポンダーの予測としても有用である。
ある特定の実施形態では、細胞は、いかなる種類の固定剤と接触させないかもしくはそれで処理されず、またはパラフィンもしくは他の材料中に包埋されず、またはいかなる検出可能な標識でも処理されない。他の実施形態では、細胞が完全体（ｗｈｏｌｅ）のままであること、生存可能のままであること、および／または無標識のままであることが好ましい。したがって、生存可能な初代細胞は、細胞試料として使用することができる。一部の他の実施形態では、細胞試料は、罹患した組織および健康な組織の両方につき提供される。一部の実施形態では、細胞試料は、生存可能な形態と固定された形態の両方で提供される。固定された形態で提供される細胞試料は、特に追加のバイオマーカーの改善された同定および相関のために、本明細書に記載される方法に従って分析される生存可能な細胞との比較のための対照として役立つ可能性がある。
本発明の他の実施形態では、治療有効性を決定するために、個々の対象からの細胞が使用される。細胞は、周知の方法（すなわち、スワブ、生検など）によって収集および単離することができる。罹患および非罹患細胞の両方を使用することができる。非罹患細胞は、陰性対照、ベースラインの測定、経時的な測定のための比較などとして使用することができる。実施形態では、同じ対象からの組織細胞の対照試料も得ることができる。対照試料は、対象における別の健康な組織から、もしくは罹患した組織試料と同じ臓器からの健康な組織から採取してもよいし、またはより好ましくは、健康な組織は、疾患を有さない個体から採取される。罹患細胞は、活性な疾患を有する組織から抽出される細胞である。実施形態では、罹患細胞は、腫瘍細胞であってもよく、例えば乳がん細胞である。がん細胞は必ずしも腫瘍から抽出しなくてもよい。例えば、白血病細胞は、白血病を有する患者の血液から収集することができる。細胞は、異なる組織部位、例えば転移の部位、循環腫瘍細胞、原発性腫瘍の部位、および再発性腫瘍の部位、および互いに比較された細胞応答性の部位から収集できる。別の実施形態では、罹患細胞は、自己免疫疾患、例えば関節リウマチの部位から抽出することができる。ある特定の実施形態では、各組織試料中の細胞の数は、好ましくは少なくとも約５０００個の細胞である。他の実施形態では、組織試料中の細胞数は、約５０００から１００万個の細胞の範囲またはそれより多くであり得る。細胞試料は、これらに限定されないが、血液、血清、血漿、尿、精液、精子液、精漿、前立腺液、前射精液（カウパー腺液）、排泄物、涙、唾液、汗、生検材料、腹水、脳脊髄液、リンパ液、髄、または毛髪からの単離物を含む。一部の他の実施形態では、細胞試料は、患者の血清、それらの画分、類器官、線維芽細胞、間質細胞、間葉細胞、上皮細胞、白血球、赤血球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、免疫細胞、幹細胞、またはそれらの組合せを含んでいてもよいし、またはそれらに由来するものでもよい。
一実施形態において、対象由来の細胞の抽出は、ＣＲｅＭＳと同じ場所で行われる（例えば、研究室、病院）。したがって、細胞は、対象からバイオセンサーへの時間を埋めるための周知の移行培地において懸濁または保存することができる。別の実施形態において、対象由来の細胞の抽出は、ＣＲｅＭＳとは異なる場所で行われる。細胞試料を得たら、細胞生存率を保持する培地において細胞試料を維持する。分析地への輸送時間の長さに応じて、異なる培地を用いることができる。実施形態において、組織試料の輸送に最大１０時間を要し得る場合、培地は、４００ｍｏｓｍ／Ｌ未満の質量オスモル濃度を有し、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ＋、Ｃｌ−、Ｃａ＋２、グルコース、グルタミン、ヒスチジン、マンニトールおよびトリプトファン、ペニシリン、ストレプトマイシンを含み、必須アミノ酸を含有し、その上、非必須アミノ酸、ビタミン、他の有機化合物、微量ミネラルおよび無機塩、血清、細胞抽出物または成長因子（増殖因子）、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、ホスホリルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈｏｐｈｏｒｙｌｅｔｈａｎｏｌｏａｍｉｎｅ）、トリヨードチロニン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミンをさらに含有して、ヒト初代細胞の増殖およびプレーティング効率を支持することができる。係る培地の例として、初代細胞管理の実施のための、セルシオ（Ｃｅｌｓｉｏｒ）培地、ロズウェルパーク記念研究所（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地（ＲＰＭＩ）、ハンクス緩衝食塩水およびマッコイの５Ａ、イーグル基本最小培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、リーボビッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）Ｌ−１５またはそれらの修正物が挙げられる。実施形態において、培地および容器は、エンドトキシンフリー、非発熱性ならびにＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅフリーである。
他の実施形態では、個々の対象の組織検体から得られた罹患細胞は、組織試料を細かく切り刻むこと、酵素消化すること、抽出された細胞を細胞型により分離すること、および／または抽出された細胞を培養することを含むステップを使用して抽出される。培養試薬としては、様々な補充物、例えば、患者の血清または患者に由来する因子を挙げることができる。
さらなる態様は、後で個々の対象において治療剤の有効性を決定するのに使用することができる類器官を組織検体から抽出する方法を含む。このような方法は、細かく切り刻むステップおよび酵素消化するステップを含む。さらなる態様は、後で個々の対象において治療剤の有効性を決定するのに使用することができる類器官を組織検体から培養する方法を含む。このような方法は、細かく切り刻むステップ、酵素消化するステップ、細胞型により分離するステップ、および培養するステップを含む。さらなる態様は、本明細書に記載される方法を実行するための、このようにして分離された細胞の特異的な組換えを含んでいてもよい。
ある特定の実施形態では、対象からの生存可能な細胞の試料中におけるシグナル伝達経路活性を評価する前に、生理学的な状態および経路撹乱に関して細胞が同期されるように、細胞はまず、評価しようとするシグナル伝達経路（すなわち、対象の細胞における有効性に関して評価される標的化治療薬によって対処されるシグナル伝達経路）を撹乱することができる血清およびいかなる薬剤も含まない培地中で培養される。ある特定の実施形態では、細胞試料は、血清および増殖因子非含有の培地中で培養される。他の実施形態では、細胞は、ヒト初代細胞の増殖および平板培養効率を支持するために、機能的な細胞性環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、機能的な甲状腺受容体および／または機能的なＧタンパク質結合受容体（または上述の特性の２または３つのあらゆる組合せ）を維持する培地中で培養される。
Ｅ．細胞応答測定系（「ＣＲｅＭＳ」）
本発明のシステムおよび方法は、細胞応答測定系（ＣＲｅＭＳ）を利用する。ＣＲｅＭＳは、細胞内、細胞内および細胞間、ならびに細胞および計装機器の間の生理的パラメータの変化を定量的に決定することができる機器を指す。生理的パラメータの変化は、分析物（細胞外マトリックス、細胞シグナル伝達分子または細胞増殖、組織、細胞、代謝物、異化産物、生体分子、イオン、酸素、二酸化炭素、炭水化物、タンパク質等の非限定例を包含）の変化を決定することにより測定される。実施形態において、バイオセンサーは、単離された無標識生存細胞全体における生理的パラメータの変化を測定している。実施形態において、治療および／またはアクチベーター剤の種類により予想される変化を測定することができるバイオセンサーが選択される。
ＣＲｅＭＳの一例は、バイオセンサーである。バイオセンサーの例は、電気化学的バイオセンサー、電気的バイオセンサー、光学的バイオセンサー、質量感知バイオセンサー、サーマルバイオセンサーおよびＩＳＦＥＴバイオセンサーである。電気化学的バイオセンサーは、電位差測定的、電流測定的および／またはボルタメトリ特性を測定する。電気的バイオセンサーは、表面伝導率、インピーダンス、抵抗または電解質伝導率を測定する。光学的バイオセンサーは、蛍光、吸収、透過率、密度、屈折率および反射を測定する。質量感知バイオセンサーは、圧電性結晶の共鳴周波数を測定する。サーマルバイオセンサーは、反応および吸着の熱を測定する。ＩＳＦＥＴバイオセンサーは、イオン、元素および酸素や二酸化炭素等の単純分子、グルコースおよび生命科学における他の対象とする代謝物を測定する。実施形態において、バイオセンサーは、インピーダンス機器、フォトニック結晶機器、光導波路機器、表面プラズモン共鳴機器、水晶共振器／マイクロバランスおよびマイクロカンチレバー機器からなる群より選択される。実施形態において、光学的バイオセンサーは、生細胞、病原体またはそれらの組み合わせにおける分子認識または分子撹乱事象を変換するための光学的トランスデューサーを含むことができる。特定の実施形態において、機器は、インピーダンス機器である。
タンパク質または他のｉｎ ｖｉｔｒｏ生体分子相互作用の測定に用いられるバイオセンサーの例において、特定のタンパク質の質量の捕捉は、有意義な生化学的および生物物理学的な値に翻訳される。捕捉された特定のタンパク質の分子量に関与する捕捉された質量による単純計算を適用して、モル数を評価し、平衡結合定数および当業者に公知の他の相互作用に関する記述的な値を導く。細胞アッセイに用いられるバイオセンサーの例において、細胞表面における特定の接着分子は、外部化学物質または他の刺激の適用により、特定の細胞経路を経て、センサーの表面および他の近隣細胞の近くにおけるその付着および形態をモジュレートする。
バイオセンサーは、このようなモジュレーションを検出することができ、これは、刺激および刺激に対する応答に用いられる細胞内の経路に特有なものとなるような仕方で選択することができる。適宜設計されると、前記細胞アッセイに関するバイオセンサー結果は、分子および機能の見地から精巧に定量的となり得る。前記バイオセンサー結果は、さらなる特有性のために応答の時間的パターンとなり得る。細胞内の特定の経路をオンオフにすることが公知の生体分子アクチベーターまたは撹乱因子は、ＣＲｅＭＳバイオセンサーシグナルの特異性を決定するための対照として用いることができる。バイオセンサー結果の時間的応答のカーブデコンボリューションのための方法（例えば、対照応答との非線形ユークリッド比較）は、さらにより非常に精密な特定の細胞応答に適用することができる。細胞バイオセンサーアッセイにおける力価決定外部刺激の使用は、さらなる生化学的および生物物理学的パラメータの説明をもたらすこともできる。
無標識センサーの一例は、高周波水晶共振器または水晶結晶板マイクロバランス（ＱＣＭ）または共鳴カンチレバーである。共鳴器は、その表面にパターン化金属電極を備える水晶結晶板を包含する。水晶材料は、電圧が印加される際に十分に特徴付けられた共鳴特性を有する。電極に特定の周波数の交流電圧を印加することにより、結晶は、特徴的な周波数で振動する。振動数は、センサー表面に質量が捕捉されると、定量的な仕方でモジュレートされる。追加的な質量は、より低い共鳴器周波数を生じる。したがって、水晶発振器の共鳴周波数の僅かな変化を測定することにより、研究している生体分子または細胞に標識を付着させなくても、配置された質量のごく僅かな変化を測定することができる。
イオン選択性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）機器は、選択されたイオン、元素および酸素や二酸化炭素等の単純分子、グルコース、ならびに生命科学における他の対象とする代謝物を測定することができる小型化されたナノスケールの機器である。それらは、電気機械的動作レベルおよび生物学的応用レベルで広範囲に説明されてきた。今日まで、それらは、疾患プロセスにおける提案される治療介入に対する応答もしくは抵抗性またはそれらの時間的パターンを識別するための、特定の患者の細胞による使用に関しては説明されていなかった。
光学的バイオセンサーは、センサー表面にカップリングされる光のいくつかの特徴に測定可能な変化を生じるよう設計される。このアプローチの利点は、励起源（センサーの照明源）、検出トランスデューサー（反射または透過光を集める機器）およびトランスデューサー表面それ自体の間の直接的な物理的接続が必要とされないことである。言い換えると、光学的バイオセンサーへの電気的接続の必要がなく、センサーと大部分の生物システムの安定化および試験に必要とされる流体とのつなぎ合わせに関して方法を単純化する。質量を直接的に検出するのではなく、あらゆる光学的バイオセンサーは、検出された物質の誘電体誘電率に頼って、測定可能なシグナルを生じる。誘電体誘電率の変化は、自由空間における光の速さの培地における光の速さに対する比の差に関係する。この変化は、培地の屈折率を本質的に表す。屈折率は、培地の比誘電率の平方根として公式に定義される（この関係性のより明確な処理に関しては、マクスウェルの方程式を参照）。光学的バイオセンサーは、タンパク質、細胞およびＤＮＡ等、あらゆる生物学的材料が、自由空間よりも高い比誘電率を有するという事実に頼る。したがって、これらの材料は全て、通過する光の速さを遅らせる固有の能力を保有する。光学的バイオセンサーは、生物学的材料を含有する培地を通る光の伝播速度の変化を、センサー表面に捕捉された生物学的材料の量に比例する定量化可能なシグナルに翻訳するよう設計される。
異なる種類の光学的バイオセンサーとして、エリプソメーター、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）機器、イメージングＳＰＲ機器、格子結合イメージングＳＰＲ機器、ホログラフィックバイオセンサー、干渉バイオセンサー、反射干渉分光法（ＲＩＦＳ）、比色分析干渉バイオセンサー、差干渉計、ハートマン（Ｈａｒｔｍａｎ）干渉計、二重偏波干渉計（ＤＰＩ）、導波管センサーチップ、統合入力格子結合機器、チャープ導波管格子機器、フォトニック結晶機器、ウッドの回折異常（Ｗｏｏｄ’ｓ Ａｎｏｍａｌｉｅｓ）に基づく導波モード共鳴フィルター機器、三角銀粒子アレイ（Ｔｒｉａｎｇｌｕｌａｒ Ｓｉｌｖｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｒｒａｙ）が挙げられるがこれらに限定されない。また、可視、紫外、近赤外および赤外等が挙げられるがこれらに限定されない、電磁スペクトルの種々の波長を測定する機器をさらに包含する。動作のモードとして、散乱、非弾性散乱、反射、吸光度、ラマン、透過率、ＴＥ波およびＴＭ波が挙げられるがこれらに限定されない。
表面プラズモン共鳴機器は、局所的屈折率の変化を検出することにより、金属表面における生体分子の結合事象を測定する光学的バイオセンサーである。一般に、ハイスループットＳＰＲ装置は、自動サンプリングロボット、高分解能ＣＣＤ（電荷結合素子）カメラ、およびプラスチック支持プラットフォームに包埋された４つより多いアレイセルをそれぞれ備える金または銀コーティングされたガラススライドチップからなる。ＳＰＲ技術は、特定の金属界面、とりわけ銀および金において励起することのできる表面プラズモン（特殊電磁波）を活用する。入射光が、臨界角を超える角度で金属界面とカップリングされると、入射光から表面プラズモンへのエネルギーの共鳴伝達のために、反射光は、反射性において急激な減衰（ＳＰＲ最小）を提示する。表面における生体分子の結合は、局所的屈折率を変化させ、ＳＰＲ最小のシフトをもたらす。ＳＰＲシグナルの変化をモニターすることにより、表面における結合活性をリアルタイムで測定することが可能になる。
ＳＰＲ測定は、屈折率変化に基づくため、分析物の検出は、無標識かつ直接的である。分析物は、いかなる特殊な特徴または標識（放射性または蛍光性）も要求せず、多段階検出プロトコールの必要がなく直接的に検出することができる。測定は、リアルタイムで行うことができ、動態データおよび熱力学的データの収集を可能にする。最後に、ＳＰＲは、広範な分子量および結合親和性にわたる多数の分析物を検出することができる。よって、ＳＰＲ技術は、細胞応答測定系として非常に有用である。
生きた患者細胞の複素インピーダンス変化（デルタＺまたはｄＺ）の測定のためのＣＲｅＭＳは、本実施形態に記載されており、インピーダンス（Ｚ）は、オームの法則（Ｚ＝Ｖ／Ｉ）によって説明される電圧の電流に対する比に関連付けられる。例えば、患者細胞が付着された電極に定電圧が印加され、差次的周波数において、その周囲を、細胞間をおよび細胞を通って流れる電流を生じる。このＣＲｅＭＳは、細胞との電極界面における局所イオン環境に対し高感度であり、電圧および電流変動の関数としてこれらの変化を検出する。正常機能またはその撹乱の結果としての細胞の生理的変化は、電極周囲の電流の流れに定量化可能な変化を生じ、係るＣＲｅＭＳにおいて測定されるシグナルの大きさおよび特徴に影響を与える。
ある特定の実施形態では、バイオセンサーは、事象特異性を有するグローバルな表現型における変化を検出する。グローバルな表現型は、ｐＨ、細胞接着、細胞付着のパターン、細胞増殖、細胞のシグナル伝達、細胞生存、細胞密度、細胞のサイズ、細胞の形状、細胞極性、Ｏ２、ＣＯ２、グルコース、細胞周期、同化、異化、小分子の合成および生成、転換、ならびに呼吸、ＡＴＰ、カルシウム、マグネシウム、および他の荷電イオン、タンパク質、特定の経路メンバーの分子、様々な細胞区画におけるＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、ゲノミクス、およびプロテオミクス、翻訳後修飾およびメカニズム、２次メッセンジャーのレベル、ｃＡＭＰ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡおよび生理学的機能を有する他のＲＮＡ、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される１つまたは複数の細胞の応答パラメータを含む。事象特異性に関して、そのタイプの治療剤および／またはアクチベーター剤にとって期待される変化である細胞試料中の変化を反映する細胞パラメータが選択される。例えば、治療剤が、細胞骨格の要素を標的化することが公知である場合、このような治療剤と接触させた細胞は、その治療剤の存在下で細胞接着における変化を示すことが期待されると予想される。
他の実施形態では、付着パターンにおける変化は、細胞接着における変化である。いくつかのケースにおいて、細胞接着における変化は、屈折率における変化またはインピーダンスにおける変化によって示される。さらに他の実施形態では、付着パターンにおける変化は、基底の形態学における変化、細胞密度における変化、または細胞のサイズもしくは細胞の形状における変化である。具体的な実施形態では、基底の形態学における変化は、細胞極性における変化である。実施形態では、細胞のシグナル伝達の減少は、細胞骨格組織化における変化を示す。
他の実施形態において、本開示の方法は、無標識であり、リアルタイムで測定することのできる細胞試料の分析を提供する。一実施形態において、分析される細胞試料は、無標識であり、生存しており、細胞を固定するためのいかなる処置にも付されない。別の実施形態において、本開示の方法およびキットにおいて用いられる治療および／またはアクチベーター剤も無標識である。今日まで、無標識方法は、治療上の有効性の決定に有効な仕方で適用されたことがない。
無標識アッセイは、標識アッセイの時間および紛らわしい複雑化要因を低下させることにより、スクリーニングキャンペーンの時間および費用を低下させることができる。遺伝子発現、遺伝子突然変異およびタンパク質機能を同定および定量化することができるアッセイは、ラージスケール並列処理を可能にするフォーマットで行われる。無標識アッセイを用いて、数万から数百万種のタンパク質−タンパク質またはＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用を同時に、より経済的に行うことができる。
多種多様な標識による方法とは対照的に、分子相互作用の検出を可能にする方法は相対的に少数しか存在せず、標識なしでの細胞機能の検出は、さらにより少数である。無標識検出は、治療およびアクチベーター剤の分子フォールディングによって、細胞上の活性部位の遮断における標識の効果によって、あるいは細胞内に有効に置くことのできる実験においてあらゆる分子に均等に機能する適切な標識を見出せないことによって生じる実験的不確実性を除去する。無標識検出方法は、クエンチング、保存可能期間およびバックグラウンド干渉による実験的アーチファクトを除去しつつ、アッセイ開発に要求される時間および労力を大幅に単純化する。
標識は、生化学的および細胞ベースのアッセイの頼みの綱である。標識は、全てのアッセイ方法の大部分を構成するが、特に生きたヒト細胞における複雑な動的活性の研究という状況で数々の問題を克服しなければならない。放射性標識の使用は、大量の汚染材料を生み出すことから、それらを使用する者への（細胞レベルでの）危害を防ぐための制御方法を有する特殊化した施設で使用しなければならない。フルオロフォアの励起／放出効率は、時間および光への曝露によって減弱することから、的確および正確であるべき標識の能力を低下させ、アッセイが、時間的情報が得ることができないようにエンドポイント様式で１回のみ読み取られることを要求する。あらゆる標識に基づくアッセイは、同種および均一な様式での標識の付着のためのプロセス、標識が直線的に定量的となることや相互作用または測定されているプロセスに干渉または影響しないことの決定のためのプロセスの開発に相当な量の時間を要求する。複合的な混合物における標識の均質な適用は、プロセスを天然に進行させるのに必要な全ての分子の存在によって複雑化する。標識の付加はその分子の機能の可視化を間接的に可能にするだけであり、系全体の機能を直接的に可視化するものではない（すなわち多少拡大された仮定が必要な場合がある）。細胞活性は、標識を用いて正確に測定することがより一層難しい。有用な試験は、標識をどのように、正しい方法で、細胞に対して正しい配置で正しい分子上に載せるのか解明して、標識が正常な細胞プロセスを乱さないことを確実にしなければならない。
無標識検出は、一般に、ＤＮＡ分子、ペプチド、タンパク質または細胞等、生物学的化合物または生物学的実体のいくつかの物理特性を直接的に測定することができるトランスデューサーの使用に関与する。あらゆる生化学的分子および細胞は、センサーの１種を用いて存在または非存在、増加または減少および修飾を示すために用いることができる、容積、質量、粘弾性、誘電体誘電率、熱容量および伝導率に関して有限の物理値を有する。その上、生物系は、分子を利用して、エネルギーを得て、Ｏ２／ＣＯ２消費／生成、グルコース産生／消費、ＡＴＰ産生／消費等、その生命過程を行い、これにより、有限の期間にわたってその周囲（ｅｎｖｉｒｏｎ）におけるｐＨ等、測定可能な変化を引き起こす。センサーは、これら物理特性の１種を、測定可能な電流または電圧等の定量化可能なシグナルに変換することができるトランスデューサーとして機能する。
場合によっては、バイオセンサーとしてトランスデューサーを用いるために、トランスデューサーの表面は、望まれない材料が付着できないようにしつつ、タンパク質等の特定の材料または特定の細胞型を選択的に捕捉する能力を持たなければならない。選択的検出能は、トランスデューサーの表面上に化学分子の特定のコーティング層を構築することによりもたらされる。センサー表面に付着される材料は、センサーコーティングと称され、一方、検出される材料は、分析物と呼ばれる。よって、場合によっては、バイオセンサーは、トランスデューサーに付着する材料から測定可能なシグナルを生じることができるトランスデューサーと、被験試料由来の標的化される分析物に結合することができる受容体リガンドを含有する特定の認識表面コーティングとの組み合わせである。
ある特定の実施形態において、特定の細胞構成成分または経路に関連するコーティングが、バイオセンサーのために選択される。例えば、係る事例において、細胞生理的パラメータが、細胞接着の変化である場合、バイオセンサー表面への細胞試料における細胞の接着をもたらすコーティングが選択される。実施形態において、バイオセンサーへの細胞の接着を増強するコーティングは、細胞外マトリックス、フィブロネクチン、インテグリンその他を包含する。他の実施形態において、細胞表面マーカーに基づき特定の細胞型に結合するコーティングが選択される。実施形態において、係る細胞表面マーカーとして、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ−ＴＫ、ＰＩ３Ｋ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＨＥＲ２受容体、Ｈｅｒ３受容体、Ｈｅｒ４受容体、ＶＥＧＦＲおよび他の細胞表面がんバイオマーカーが挙げられる。
他の実施形態において、バイオセンサーは、生体分子コーティングでコーティングされている。細胞に接触するＣＲｅＭＳ表面は、細胞の添加に先立ち、細胞の添加の間に、あるいは細胞の添加の後に、生体分子コーティングを含有し得る。コーティング材料は、合成、天然、動物由来、哺乳動物性となり得る、あるいはセンサーに置かれた細胞によって作製される。例えば、生体分子コーティングは、インテグリン、アドへリン、カドヘリンならびに他の細胞接着分子および細胞表面タンパク質に会合することが公知の細胞外マトリックス構成成分（例えば、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン、細胞間ＣＡＭ、血管性ＣＡＭ、ＭＡｄＣＡＭ）、またはその誘導体を含むことができる、あるいは天然起源の生化学物質、リジンおよびオルニチンに基づくポリマー型分子であるポリリジンまたはポリオルニチン等、生化学物質を含むことができる。アミノ酸等、天然起源の生化学物質に基づくポリマー型分子は、バイオセンサーに特定の細胞表面タンパク質を付着させるよう設計された、天然起源の生化学物質のアイソマーまたはエナンチオマー、抗体、断片または抗体のペプチド誘導体、相補性決定領域（ＣＤＲ）を用いることができる。
マイクロプレートに生存可能な細胞を付着させるための方法としては、例えば、バイオセンサーの表面と相互作用するように設計された１つの端部、およびペプチド上の官能基と反応するように設計された別の端部を有する反応性分子でセンサーマイクロプレート表面をコーティングすることが挙げられる。例えば、金でコーティングしたバイオセンサーを使用する場合、反応性分子としては、硫黄原子、またはバイオセンサー表面と化学的に相互作用するように設計された他の化学部分を挙げることができる。分子の他方の端部は、例えばペプチド上のアミドまたはカルボキシ基と特異的に反応することができる。
別の例において、バイオセンサー表面は、ファンデルワールス力、水素結合、静電引力、疎水性相互作用、またはこれらのあらゆる組合せを介して接着する分子でコーティングされていてもよく、例えば当該分野で実施されている分子が、タンパク質を適用するのに使用される可能性がある。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子が、第１の表面の分子コーティングに付加されてもよい。本発明において有用な接着分子は、Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ ２００６ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｌｉｇａｎｄｓ ａｔ ａ Ｇｌａｎｃｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１９巻（１９号）３９０１〜０３頁に記載されている。特異的な細胞接着分子と接触させるのに使用できる追加のＥＣＭ分子としては、Ｔａｋａｄａら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８巻：２１５（２００７年）の表１に記載のものが挙げられる。この例は、細胞とＥＣＭとの接着および細胞と細胞との接着に関与するインテグリンに関する。他の多くの接着分子が、生理学的な制御および応答に関する特性と共に記載されている。（以下の表５を参照）。
追加のコーティングとしては、本明細書に記載される方法を実行する目的のために、患者細胞をバイオセンサーの近くに移動させるように、患者細胞表面タンパク質に親和性を有することが公知の抗体または他のタンパク質を挙げることができる。また、患者細胞が所望の方式でマイクロプレートに付着しているのを確認することも有益であり得る。特異的なバイオセンサーコーティングは、センサーコーティングを特異的な細胞経路に関連付けることによって、特異的な患者細胞型からの特異的な細胞シグナルならびに撹乱および治療薬に対する細胞のシグナル伝達応答を、強化する、改善する、明確にする、隔離する、または検出するために追加的に使用することができる（例えば、Ｈｙｎｅｓ、Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ， Ｃｅｌｌ、１１０巻：６７３〜６８７頁（２００２年）を参照）。バイオセンサーは、細胞を播種する領域を含む。例えば、バイオセンサーは、細胞を播種するためのウェルを含有するマイクロタイタープレートを含んでいてもよい。バイオセンサー上に、１つまたは複数の細胞試料を、表面への物理的な吸着によって別個の位置に播種することができる。バイオセンサーは、１、１０、２４、４８、９６、３８４個、またはそれより多くの別個の位置を含んでいてもよい。細胞試料は、約１００から約１００，０００個の個々の細胞、またはその間のあらゆる細胞数を含んでいてもよい。最適な細胞試料は、バイオセンサー上の別個の位置のサイズおよび性質に依存する。細胞試料は、約５０００個またはそれ未満の細胞；約１０，０００個またはそれ未満の細胞；約１５，０００個またはそれ未満の細胞；約２０，０００個またはそれ未満の細胞；約２５，０００個またはそれ未満の細胞；または約５０，０００個またはそれ未満の細胞を含んでいてもよい。細胞試料は、約１０００から約２５００個の細胞；約１０００から約５０００個の細胞；５０００から約１０，０００個の細胞；約５０００から約１５，０００個の細胞；約５０００から約２５，０００個の細胞；約１０００から約１０，０００個の細胞；約１０００から約５０，０００個の細胞；および約５０００から約５０，０００個の細胞を含んでいてもよい。
ある特定の実施形態において、細胞応答または生理的パラメータの変化は、規定の期間にわたり測定される。他の実施形態において、規定の期間とは、対照細胞が、生理的パラメータの出力の変化が２０％以下で変動する定常状態に達するのに要する時間の量である。他の実施形態において、変化は、細胞において１時間以下で観察される。他の実施形態において、変化は、細胞において、少なくとも１分間〜約６０分間およびその間の全期間で観察される。他の実施形態において、細胞応答の変化は、約１０分〜約１週間または２００時間測定される。他の実施形態において、治療剤が、細胞経路を標的化する場合、細胞応答は、約１０分〜約５時間、約１０分〜約４時間、約１０分〜約３時間、約１０分〜約２時間、約１０分〜約１時間または約１０分〜約３０分またはその間のいずれかの時点で測定される。他の実施形態において、治療剤が、細胞増殖または細胞死滅または細胞抵抗性に影響を与える場合、細胞応答は、約１時間〜約２００時間測定される。さらに他の実施形態において、１分〜２００時間の間の応答の組み合わせ（あるいは完全時間的パターンとして記載）が、細胞および抵抗性を生じる細胞能力における化合物の治療効果の決定に用いられる。この時間枠は、患者における可能性の高い応答およびその維持の評価において重要な、短期経路シグナル伝達、動的再プログラム化およびより長期の細胞応答の重要なプロセスを網羅する。
特定の対象の細胞がバイオセンサー上に播種されたら、ベースラインの測定値を決定することができる。ベースラインの測定値は、同じ細胞試料でとってもよいし、または対照細胞試料でとってもよい。対照試料は、健康な細胞、または同じ患者および／もしくは同じ組織からの罹患細胞を含んでいてもよい。対照試料は、撹乱因子または薬剤を受けない罹患細胞を含んでいてもよい。対照試料は、その薬剤に応答することが公知の疾患細胞を含んでいてもよい。他の実施形態では、対照試料は、その薬剤に応答しないことが公知の疾患細胞を含む。対照試料は、細胞の健康、細胞代謝、または細胞経路活性に関する標準化した応答を惹起するように設計された特定の患者の健康なまたは罹患細胞に、アクチベーター剤を適用することを含んでいてもよい。
対照は、各疾患および／または薬物タイプにつき決定されると予想される。一実施形態では、これは、同じ患者からの健康な細胞対照に対する比較、または罹患していない患者のプールに関する結果（例えば正常な参照範囲）に対する比較を含む。例えば、細胞を殺滅する薬物を用いる場合、本方法は、健康な細胞より多く疾患細胞を殺滅して、有意な治療指数を達成する利益を示すと予想される。他の実施形態は、薬物によって経路の機能および対照を決定するための経路ツールの使用を含む。標的化治療薬の場合、ツールは、撹乱剤（例えば、アクチベーター剤）、経路を撹乱して、標的化された薬物の撹乱を崩壊させる能力を決定するための対照として使用される生物試薬（ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔ）または小分子であり得る。さらに他の実施形態では、細胞への薬物の生理学的な作用は、例えば、酸素消費の時間的パターンもしくは速度、酸性化、イオン流動、または代謝産物の転換の速度もしくは時間的パターンを指摘するアクチベーター剤によって、外因性の撹乱なしで測定される。
特定の実施形態では、バイオセンサーシグナルは、連続的な時間経過にわたり測定される。薬物処置への患者細胞応答を示す時間対バイオセンサーシグナルのプロットには、特徴的なパターンがある。これらのパターンの評価は、有効な事象の存在を同定するのに有用である。生きた完全に機能的な細胞の時間経過または一貫して変化する測定値は、単にポイントを時間で表す典型的な全細胞アッセイで使用される現行の実施より有益である。本明細書に記載される方法は、動的システムが患者において起こると予想されるときにそれを測定するものであり、患者の応答を決定するための最も正確な手段の代表である。経路応答のケースにおいて、完全な時間経過または時間的パターンの記録は、より複雑な分析を支持する能力において優れており、単回の測定の場合に最適な時点を選択することを不要にする。
対照との比較は、時間的最大値、最小値で、または最大のシグナルと最小のシグナルとの差として、または時間経過プロットの積分された曲線下面積（ＡＵＣ）の比較、または試験ウェルの陽性もしくは陰性対照ウェルに対する他の非線形比較（例えば差分ベクトルの総和）、または同じ患者の生存可能な罹患細胞の撹乱されたウェルと撹乱されていないウェルとの比較によって行うことができる。バイオセンサーでの測定のみによって裏付けられた追加の分析は、最大値／最小値に到達する時間、および時間経過（ｔｅｍｐｏｒａｌ ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ）の他の導関数である。より長期の応答のケースにおいて、比較の時間は、数日または１週間の処置または複数回の薬物適用の後の具体的な時点の比較であり得る。それより長い時間経過では、傾きの変化を比較してもよいし、または１週間の薬物処置の開始時、中間または終了時における時間対バイオセンサーシグナルのプロットの第２の導関数を比較してもよい。対照と比較して有意な変化は、細胞代謝の低減に関するバイオセンサーシグナルにおける絶対値の低下を含む場合がある。代替として、低下に続いて、アッセイ中の薬物に対する耐性の出現を示す可能性がある増加が起こる可能性がある。加えて、非線形のユークリッド分析は、全時間経過にわたる対照試料と患者試料との全体の差の尺度をもたらすのに使用することができる。このこともまた、患者の転帰を予測することに関して重要であると予想される。
ある特定の実施形態では、規定の期間にわたるバイオセンサーの出力は、細胞指数として表される。細胞指数は、試験開始点からのインピーダンスにおける変化である。細胞指数は、インピーダンスの測定値と定義され、本発明の一例において、例えば１０ｋＨｚの一定の電気的な周波数および一定の電圧で測定することによって適用される可能性がある。
さらに、方程式：細胞指数ｉ＝（Ｒｔｎ−Ｒｔ０）／Ｆによって計算され、
式中：
ｉは、１、２、または３つの時点であり、
Ｆは、機器を１０ｋＨｚの周波数で操作する場合の例では、１５オームであり、
Ｒｔ０は、時点Ｔ０で測定されたバックグラウンドの抵抗であり、
Ｒｔｎは、細胞の添加、細胞の生理学的変化、または細胞の撹乱後の時点Ｔｎで測定された抵抗である。
細胞指数は、細胞のステータスを表すための、測定された電気インピーダンスにおける相対的変化として誘導された無次元パラメータである。細胞が存在しないかまたは電極に十分接着していない場合、ＣＩは、ゼロである。同じ生理学的条件下で、より多くの細胞が電極に付着している場合、ＣＩ値はより大きい。したがってＣＩは、ウェル中に存在する細胞数の定量的な尺度である。加えて、細胞形態、基底、安定もしくは休止状態の変化、細胞接着、または細胞生存率などの細胞の生理学的なステータスにおける変化は、ＣＩの変化を引き起こすと予想される。
細胞指数は、存在、密度、付着または出発点もしくはベースラインインピーダンス測定値に基づくそれらの変化の定量的尺度である。ベースライン出発点インピーダンスは、薬物または他の撹乱因子によるいかなる処置にも先立つ細胞の健康、生存率および生理的ステータスの物理的観察可能な特徴および兆候である。ベースライン出発点は、ＣＥＬｘ検査の定性的対照として用いることができる。薬物または撹乱因子の添加は、細胞によって経験される細胞生理的変化の特異性を反映するインピーダンスの時間的パターンを変化させる。細胞生理的ステータス、例えば、細胞形態、細胞数、細胞密度、細胞接着または細胞生存率の変化は、細胞指数の変化をもたらす。
生理応答パラメータは、加えて細胞周期分析を含んでいてもよく、様々な化学的バイオセンサー、例えばコンジュゲートしたもしくはコンジュゲートしていない蛍光色素、または機能的な経路および機能不全性の経路に関連する患者細胞の他の比色変化を使用して測定することができる。例えばコンジュゲートしていない色素を使用する細胞集団の細胞周期における変化は、ヨウ化プロピジウム、またはＤＮＡに挿入されて増殖および複製のＧ０、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、Ｇｍ期にわたる細胞周期と相関することが公知の類似の色素を用いて、ＤＮＡ量における変化を評価することにより定量化することができる。１つの色素のタイプであるヨウ化プロピジウムを用いる場合、Ｇ２／Ｍ期における細胞の蛍光は、Ｇ０／Ｇ１期における細胞の蛍光より２倍高いと予想される。ヨウ化プロピジウムは、ＲＮＡに挿入することもでき、しばしばＲＮＡと比較してＤＮＡからの蛍光シグナルを識別するのにリボヌクレアーゼが使用される。例としては、細胞周期チェックポイントに関連する特定のタンパク質に特異的な色素が挙げられ、これは、追加の細胞周期ステータスの測定値を提供する。これらの測定を実行するのに有用な一般的な機器としては、本明細書で列挙したものに限定されないが、蛍光顕微鏡検査法、共焦点レーザー走査顕微鏡検査法、フローサイトメトリー、蛍光比色法、蛍光偏光法、ホモジニアスな時間分解蛍光、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
コンジュゲートしていない色素は、同化、異化、小分子の合成および生成、転換、ならびに呼吸などの代謝パラメータを測定しながら、細胞または経路の生理学的なステータスの化学的バイオセンサーとして本発明と共に利用することができる。ワールブルク効果と名付けられた周知の細胞の生理学的な応答は、腫瘍および他の罹患細胞におけるエネルギー生成のための酸化的リン酸化から乳酸産生へのシフトを説明しており、主要なシグナル伝達経路、癌遺伝子および腫瘍サプレッサー（例えば、これらに限定されないが、Ａｋｔ、ｍＴｏｒ、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３）は、本明細書に記載される化学的バイオセンサー方法のいずれかによって、または光電子工学的なバイオセンサーによって測定することができる。細胞応答における細胞の酸素消費または呼吸および解糖は、プロトンを産生することから、溶存酸素および遊離のプロトンの濃度または酸性度の急速で容易に測定可能な変化を引き起こす。
化学的バイオセンサーを利用する生理応答パラメータの、追加の、ただし非制限的な例は、代謝的に活性なおよび不活性な細胞機能の指標であるＡＴＰの存在の定量化（例えばＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏおよび類似のルシフェラーゼによって促進されるアッセイ）に基づく、培養物中の細胞によって利用されているＡＴＰの量である。
生体分子のフォールディングおよび機能に重要なカルシウム、マグネシウム、および他の荷電イオンは、生理学的な応答のために流動的である。これらもまた、Ｃａｌ−５２０、オレゴングリーンＢＡＰＴＡ−１、ｆｕｒａ−２、ｉｎｄｏ−１、ｆｌｕｏ−３、ｆｌｕｏ−４、カルシウムグリーン−１、および特異的なイオン錯化および測定のための他のＥＧＴＡまたはＥＤＴＡ様の化学物質などの化学的バイオセンサーによって測定することができる。これらの生理応答パラメータは、多くのタイプのコンジュゲートしていない反応性または結合色素または他の電子的または分光的手段を使用して測定することができる。これらの方法の多くは、細胞にとって非破壊的であり、同じ細胞集団の生理学的機能を長期にわたり繰り返し連続的に測定できるように調整することができる。
コンジュゲートした色素、例えば天然の細胞タンパク質結合リガンドに付着したもの、または免疫粒子（抗体もしくは抗体の断片または高い特異性の高親和性合成分子、例えばアプタマー）、または核酸ポリマーのハイブリダイゼーションプローブに付着したものは、タンパク質、特定の経路メンバーの分子、様々な細胞区画におけるＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、ゲノミクス、およびプロテオミクスに関する生理応答パラメータを測定するために使用することができ、特異的な翻訳後修飾およびメカニズムを測定することもできる。細胞制御の翻訳後修飾および後成的な手段は、これらに限定されないが、リボザイム、キナーゼ、ホスファターゼ、ユビキチナーゼ、デユビキチナーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、およびプロテアーゼなどの経路の機能を実行する多数の酵素による調節を含み得る。死細胞のホルマリン固定されたパラフィンにマウントした試料を染色するのに使用されるこれらの分子の例は、ＤＡＫＯ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ、第６版に、またはＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｕｔｏｒｉａｌｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｇｕｉｄｅｓ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ．ｃｏｍ／ｃｏｍｍｏｎ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｃｏｎｔｅｎｔ．ｊｓｐ？ｉｄ＝ｔｕｔｏｒｉａｌｓ−ａｎｄ−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｇｕｉｄｅｓに見出すことができる。これらの２つの例は、生細胞応答を測定するための本発明でより一層有用であり得る。これらの方法に限定されないが、この測定を実行するのに有用な一般的な機器は、蛍光顕微鏡検査法、共焦点レーザー走査顕微鏡検査法、フローサイトメトリー、蛍光比色法、ホモジニアスな時間分解蛍光、蛍光偏光法、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）である。
コンジュゲートした色素とコンジュゲートしていない色素との組合せも、細胞の生理学的な応答を測定するために本発明によって採用することができる。活性化後、生理学的な応答の制御に関与する１つのタイプの受容体は、ＧＰＣＲである。これらは、２つのシグナル伝達経路、すなわち２次メッセンジャーであるｃＡＭＰのレベルにおける変化、または２次メッセンジャーであるイノシトール（１，４，５）三リン酸（ＩＰ３）によって遊離した細胞内Ｃａ２＋のレベルにおける変化を介して情報を伝達し、細胞を制御する。例えばｃＡＭＰの検出は、クリプテートで標識された抗ｃＡＭＰ抗体（または他の免疫捕獲分子）およびＧＰＣＲ反応とそれに続く抗体結合について細胞性ｃＡＭＰと競合するｄ２で標識されたｃＡＭＰを使用する競合的イムノアッセイに基づいていてもよい。特異的なシグナル（すなわちエネルギー移動）は、標準または試料中のｃＡＭＰの濃度に反比例する。
ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡおよび生理学的機能を有する他のＲＮＡを定量化することによる生理学的な応答の測定は、転写レベルにおける細胞性の変化の撹乱を決定するための本発明の実施と共に採用される非常に高感度な方法であってもよい。ＲＮＡは、例えば、本明細書に列挙されるこれらのものに限定されないが、全て化学的センサーを採用するｒｔＰＣＲ、ｑＰＣＲ、選択的な配列プロービング、選択的な配列捕獲、および配列ハイブリダイゼーション方法を使用することによって定量化することができる。
免疫捕獲およびハイブリダイゼーション方法としては、Ｌｕｍｉｎｅｘなどのビーズベースの方法、またはＩｌｌｕｍｉｎａなどの光ファイバーのチップ技術、または細胞から生理学的な応答分子を釣り上げ、単離し、正確に測定するために使用される特異的な捕獲試薬が固体表面上に固定されている、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくは他のハイブリダイゼーションマイクロアレイ技術を使用するものが挙げられる。これらの方法は、単一の実験で多数の応答パラメータを測定するという利益をもたらす。
細胞応答または生理的パラメータの変化は、ベースライン測定値との比較により決定される。細胞パラメータまたは生理応答の変化は、ＣＲｅＭＳの種類に依存する。例えば、細胞応答の変化が、光学的に決定される場合、物理的に観察可能な変化は、例えば、化学吸光度または透過率のスペクトル波長における光学的密度、表面プラズモン測定機器の変化、またはフォトニック結晶機器により検出される変化の関数として測定することができる。細胞パラメータまたは生理応答の変化が、電気的に決定される場合、物理的に観察可能な変化は、例えば、電極に接着された細胞のミリまたはマイクロインピーダンス変化を用いて測定することができる。ｐＨ、グルコース、二酸化炭素またはイオンの変化は、イオン選択性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）を用いて電子工学的に測定することができる。
他の実施形態において、変化の速度は、治療法に対する細胞生理応答の差の決定に要求される期間のＣＲｅＭＳ応答を測定する方法により決定される。変化の速度は、時間経過データの様々な解釈により説明され、速度、または速度の加速を包含する速度のさらなる導関数として表現することができる。
患者の生理学的状態を測定する試験は、それ超およびそれ未満で患者は異なる臨床転帰を経ると予測される１つまたは複数のカットオフ値を誘導することができる。実施形態では、細胞の応答における変化を決定するための１つまたは複数のカットオフ値は、公知の応答細胞試料からの試料のセットの、および公知の不応答患者からの試料のセットからの統計的有意性の適切な信頼区間を決定するための、当業者に公知の標準偏差、シグナル対ノイズ比、標準誤差、分散分析、または他の統計的検定値を決定するステップ；および２つのものの間の差を決定し、両方の群の信頼区間の間のカットオフ値を設定するステップを含む方法によって決定される。追加の実施形態は、罹患していないことが公知の患者からのＣＲｅＭＳ応答によって定義された正常な参照範囲から決定されたカットオフを利用する。この実施形態では、単一の患者の疾患材料の試験結果は、本発明において他所でさらに記載される撹乱されたおよび撹乱されていない生存可能ながん細胞の結果を、正常な（健康な）参照範囲インターバルと比較することによって報告される。
正常な（健康な）参照範囲の試験結果は、健康な対象からの正常な組織を使用した研究を遂行することによって、どのようなものが「正常な」経路活性であるかを確立する。次いで試験結果は、正常な参照インターバル研究から導出された値と比較して、罹患した経路を有することが期待されないあらゆる患者（例えばバイオマーカー陰性患者）が実際には異常な経路活性を有するかどうかを評価する。また本発明の結果は、バイオマーカー陰性患者から観察された異常な測定値についても、現在疾患を有すると診断された対象（バイオマーカー陽性患者）から得られた測定値と比較され、バイオマーカー陰性である患者が、異常な経路活性とバイオマーカー陽性患者の経路活性に匹敵する経路活性の両方を有するかどうかを判断することができる。したがって、現在のところ経路活性を崩壊させることを意図した療法を受けており、それから利益を得ている患者の経路活性に匹敵する異常な経路活性を有する患者は、経路疾患を有すると診断されると予想され、したがって経路活性を崩壊させるためにバイオマーカーを標的化する薬物で処置されるべきである。
したがって本発明は、医師が、罹患した経路の機能的な活性に基づいて疾患を診断するより正確な手段をもたらすことを可能にする。これは、相関的な原因とならないモデルに頼る単一のバイオマーカーが測定される場合に採用されるアプローチとは対照的である。現行のバイオマーカーアプローチは、高いパーセンテージの偽陰性および偽陽性結果を生じる可能性がある。本発明は、誤った結果のパーセンテージを低下させると予想される。
好ましい実施形態は、８０〜９０％信頼区間を包含し、より好ましい実施形態は、＞９０％信頼区間を包含し、最も好ましい実施形態は、＞９５％または＞９９％信頼区間を包含する。
実施形態において、カットオフ値は、カットオフ値を用いて盲検の公知試料のステータスをレスポンダーまたはノンレスポンダーとして決定し、試料を非盲検化し、試料のステータス予測の正確性を決定することにより検証される。単一のカットオフ値の場合、カットオフ値を下回る値または公知のレスポンダーの値により近い値は、患者試料が、治療剤に対する応答性を提示していることを示す。値が、カットオフ値であるもしくはそれを上回る、または公知のノンレスポンダー値の値により近い場合、細胞試料は、治療剤に対するノンレスポンダーとして同定される。一部の実施形態では、規定の期間におけるバイオセンサーの出力は、応答なし、弱い応答性、または応答性と分類される。
好ましい実施形態では、カットオフ値を使用して、盲検の公知の試料のステータスを、疾患経路応答を有する（例えばがん患者）または疾患経路応答を有さない（例えば健康な疾患がない患者）と決定し、試料を非盲検化して、試料のステータスの予測の精度を決定することによって、カットオフ値が検証される。単一のカットオフ値のケースにおいて、カットオフ値未満に入るかまたは疾患経路応答を有さない試料の値に近い値は、患者試料が、経路疾患を呈さないことを示す。値が、カットオフ値もしくはそれ超であるか、または公知の罹患した経路試料の値に関する値に近い場合、細胞試料は、罹患した経路が存在すると同定される。一部の実施形態では、規定の期間におけるバイオセンサーの出力は、経路疾患が存在しない、経路疾患が決定的ではない、または経路疾患が存在すると分類される。
規定の期間における出力は、出力をカテゴリーに分類するために選択される。他の実施形態では、規定の期間は、細胞がバイオセンサーで連続的にモニターされている期間のエンドポイントである。他の実施形態では、期間は、少なくとも６０分、２４０分、３００分、１０時間、２４時間、６０時間、または１２０時間である。好ましい実施形態では、規定の期間における出力は、３０分から１０時間の間である。より好ましい実施形態では、規定の期間における出力は、１８０分から６００分の間であるか、または２４０分である。
実施形態において、応答なしとして分類される出力は、治療剤の投与に先立つベースラインまたは治療剤で処置されない対照細胞の出力値と、僅か少なくとも２０％以下、１５％以下、１０％以下または５％以下の異なる出力値により示される。
他の実施形態において、弱い応答性として分類される出力は、治療剤の投与に先立つベースラインまたは治療剤で処置されない対照細胞の出力値と、少なくとも５０％以下かつ５％超の異なる出力値により示される。他の実施形態において、応答性として分類される出力は、治療剤の投与に先立つベースラインまたは治療剤で処置されない対照細胞と、少なくとも５０％超の異なる出力値により示される。実施形態において、対照試料は、同じ対象由来の、治療剤で処置されていない疾患細胞の試料である。
本明細書に記載される方法のさらなる態様は、個々の対象において治療剤の有効性を予測するのに使用することができるアルゴリズムを開発することを含む。アルゴリズムは、本明細書に記載される方法を使用して誘導された値を、個々の対象の健康の態様を定義する１つまたは複数の患者の特徴に割り振られた値と組み合わせて取り入れる。患者の特徴としては、これらに限定されないが、転移の存在、転移の位置、結節のステータス、がんの初期診断から転移診断までの無疾患インターバル、アジュバント化学療法を受けること、他の薬物療法を受けること、放射線療法を受けること、疾患の優勢な部位、腫瘤サイズ、ボディマス指数、圧痛関節の数、腫脹関節の数、痛み、能力障害指標（ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）、医師の包括的な評価、患者の包括的な評価、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎機能指標（Ｂａｔｈ Ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ Ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｉｎｄｅｘ）、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎疾患活動性指標（Ｂａｔｈ Ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ Ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）、Ｂａｔｈ強直性脊椎炎測定指標（Ｂａｔｈ Ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ Ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ Ｍｅｔｒｏｌｏｇｙ Ｉｎｄｅｘ）、Ｃ反応性タンパク質、全背痛（ｔｏｔａｌ ｂａｃｋ ｐａｉｎ）、炎症、遺伝学的ステータス、他の病気の病歴、他の生体の健康の統計的ステータス、およびあらゆるそれらの組合せを挙げることができる。これらの値を取り入れるアルゴリズムは、これらの値と治療剤が処置することを意図されている疾患を有する患者集団における疾患進行との相関に従って、これらの値を重み付けすると予想される。差次的な応答をもっていかなる相関も実証しなかった疾患の特徴は、アルゴリズムに取り込まれないと予想される。
一実施形態では、患者の特徴に記載された値は、試験結果（すなわち、本明細書に記載されるような治療剤、撹乱剤、アクチベーター剤などへの応答性を決定する方法から導出された値）、患者の特徴、および研究された患者の群の臨床転帰の回帰分析から導出することができる。この分析から、アルゴリズムの値を誘導することができる。一例において、患者の特徴データに基づく変数と組み合わせた試験を使用するアルゴリズムの最適化は、９つの等しく間隔をあけた０．１０から始まる幅０．１０のカットポイントに基づいて試験値を１０のインターバルに分割することによって実行することができる。各カットポイントにつき、対象がカットポイント未満またはそれに等しいアルゴリズム値を有する場合では値「１」を示し、それ以外では「ゼロ」を示す指標変数を使用してコックス回帰を行うことができる。ハザード比は、カットオフまたはそれ未満の値と、カットオフを超える値との比較であり、これは、各カットポイントにつき決定されると予想される。次いで推測されるハザード比を最小化するカットポイントの値が選択される。
例えば、患者の総腫瘍質量が特定の値を超える場合、患者の薬物への応答性は、本明細書に記載される方法によって決定した場合、薬物に応答しない患者で見出された中央値の結果を超えて患者の可能な無増悪期間を延長させるのに十分ではないと予想されることが認識される可能性がある。試験結果が、患者において薬物が機能的であることを示し、患者は、他の点でそれにより利益を得ることが期待されるケースにおいて、患者の特徴の変数を含むアルゴリズムは、腫瘍質量の変数が試験結果の値を相殺するため、結果は未確定であることを報告すると予想される。
本明細書に記載される本方法の別の態様は、標的化治療剤に応答する可能性が高いかまたは可能性が低い患者を同定する試験のためのカットオフ値を決定するための方法を提供する。この方法は、ａ）それぞれが同じ疾患を有し、同じ治療薬を処方されている患者の群を選択するステップ、ｂ）本明細書に記載される方法を使用して、患者の群内の各対象で試験値を誘導するステップ、ｃ）試験された全患者の相当なパーセンテージにとって予め規定した臨床エンドポイントに到達するのに十分な期間にわたり、試験された患者の群の各メンバーの健康ステータスを観察し、患者が予め規定した臨床エンドポイントに到達した場合、患者のそれぞれにとってそれに到達するのに必要な時間の長さを記録するステップ、ｄ）値が他方と等距離である２つまたはそれより多くの候補カットオフ値を同定するステップであって、各候補カットオフ値は、それ未満の値において患者は応答するまたは応答しないと予測され、それ超の値において患者は、そのスコアがカットオフ値未満になる方式と逆の方式で応答すると予測される値を表す、ステップ、ｅ）統計的方法を使用して、試験値がカットオフであるかまたはそれ未満であった患者の臨床エンドポイント期間と、試験値がカットオフ超であった患者の臨床エンドポイント期間との差を分析するステップ、およびｆ）カットオフ値超の患者の群とカットオフ値未満の患者の群との間に統計学的に有意な差があることを示す候補カットオフ値の群のなかから、療法に応答しないと予測される患者の最大のパーセンテージをもたらすカットオフ値を選択するステップを含む。
本明細書に記載される方法を使用して、細胞が同じ治療薬で試験された同じ疾患を有する他の個体から導出された試験値と比較可能な、個々の対象ごとの数値による試験結果の値を誘導することが可能である。これは、ａ）同じ疾患を有し、同じ治療薬で試験された個々の対象の群で試験結果の値を記録するステップ、ｂ）これらの値をリストにコンパイルするステップ、ｃ）それぞれ個々の対象の絶対的な数値の試験値に基づき試験された個々の対象ごとの試験結果の値に基づき、リストを順番付けするステップ、およびｄ）個々の対象の試験値のパーセンタイル順位を決定するステップであって、個々の対象の試験値のパーセンタイル順位は、個々の対象における疾患への治療剤の有効性を予測する、ステップによって、個々の対象への治療薬の有効性を予測することを可能にする。
別の実施形態は、同じ療法の有効性を試験する臨床試験から得られた結果を分析して、特定の結果のパーセンタイル順位を推測すること、次いで個々の対象の試験値ごとにパーセンタイル順位を同定すること、および同じパーセンタイル順位に相当する臨床試験のエンドポイントの結果を同定することを含み、ここで個々の対象の試験値と同じパーセンタイル順位における臨床試験のエンドポイントの結果は、個々の対象が疾患に関して治療剤から得る可能性が高い臨床結果を予測する。臨床試験のエンドポイントとしては、例えば、進行までの期間、無増悪生存期間、全生存期間、客観的な応答期間、ＡＣＲ応答、総シャープスコア（Ｔｏｔａｌ Ｓｈａｒｐ Ｓｃｏｒｅ）、びらんスコア、および関節裂隙狭小化（Ｊｏｉｎｔ Ｓｐａｃｅ Ｎａｒｒｏｗｉｎｇ）における変化、臨床応答、痛み、能力障害指標、臨床的寛解、体表面積の関与、医師の包括的な評価、ならびに乾癬の面積および重症度の指標を挙げることができる。
別の実施形態は、本明細書に記載される方法から導出された試験結果の値と、試験された治療薬を受けた個体ごとの臨床転帰との統計的相関を決定する方法を含む。この方法は、ａ）それぞれが同じ疾患を有し、同じ治療薬を処方されている患者の群を選択するステップ、ｂ）本明細書に記載される方法を使用して、個体ごとに試験結果の値を誘導するステップ、ｃ）同じ疾患を有し、同じ治療薬で試験された患者の群内の各対象で、試験結果の値のリストをコンパイルするステップ、ｄ）試験された全患者の相当なパーセンテージにとって予め規定した臨床エンドポイントに到達するのに十分な期間にわたり、試験された患者の群の各メンバーの健康ステータスを観察するステップ、ｅ）患者が予め規定した臨床エンドポイントに到達した場合、患者のそれぞれにとってそれに到達するのに必要な時間の長さを記録するステップ、ｆ）エンドポイントの結果と試験値との間の統計的関係が決定されるような方式で、エンドポイントのデータ（例えば進行までの期間、無増悪生存、ＡＣＲ応答）を分析するステップを含む。
一例として、臨床試験からの結果が利用できるようになったら、カットオフ値の推測値、すなわち「Ｃ＊」の決定を以下のように進める。試験値が進行までの時間（ＴＴＰ）などの患者の転帰を予測することをコックス回帰試験が示すと仮定して、試験値は、９つの等しく間隔をあけた０．１０から始まる幅０．１０のカットポイントに基づいて１０のインターバルに分割されると予想される。各カットポイントにつき、対象がカットポイント未満かまたはそれに等しいアッセイ値を有する場合では値「１」を示し、それ以外では「ゼロ」を示す指標変数を使用してコックス回帰が行われると予想される。ハザード比は、カットオフまたはそれ未満の値と、カットオフを超える値との比較であり、これは、各カットポイントにつき決定されると予想される。推測されたハザード比を最大化するカットポイントの値は、その後の重要な研究期間での使用のために選択されると予想される。最終的な分析のために、指標変数（カットポイント未満対カットポイント超）を用いてコックスの比例ハザード回帰を行うことができる。最終的な分析はまた、ＴＴＰの他の推定される予測の患者特徴変数を含んでいてもよい。
Ｆ．治療およびアクチベーター剤
患者が特定の疾患または状態と診断されると、多くの場合、広範囲の処置オプションが存在する。場合によっては、処置が非常に高価となったり、あるいは処置に伴う副作用が重篤であることもあるため、患者が処置に対しレスポンダーまたはノンレスポンダーとなる可能性があるか知ることは有用となる。加えて、患者が抵抗性となる場合、患者の罹患細胞が抵抗性となった後に、他のいずれの処置が効果的となり得るか知ることは有用となる。
ある特定の実施形態において、一部の患者が応答し、その他の患者が応答しない、状態の処置において用いられるいずれかの治療剤（単数または複数）は、本明細書に記載されている方法において分析することができる。例えば、がんに関して、多数の異なるキメラおよびヒト化抗体を包含する、多数の標的化免疫療法が利用できる。自己免疫性状態に関して、炎症性サイトカインまたはその受容体に標的化されている分子等の分子を分析することができる。炎症性サイトカインに標的化されている薬剤の例は、抗ＴＮＦα剤、インターフェロンアルファ、インターロイキンを標的化する薬剤その他である。副腎皮質ステロイド、タクロリムス（ＦＫ−５０６またはＴＡＣＲ）（Ｔ細胞代謝および増殖を阻害）、シロリムス（ＳＩＲＯ／８１７６８）、ミコフェノール酸（ｍｙｏｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、カルシニューリン阻害剤（ＣＩ）、シクロスポリン（ＣｓＡ）およびラパマイシン（ｍＴＯＲ阻害剤）等の免疫抑制剤が挙げられる。
他の実施形態では、本方法は、１つまたは複数の治療剤、撹乱剤（例えば、アクチベーター剤）、確認用薬剤、またはそれらの組合せを、個々の対象からの罹患細胞の生理学的パラメータにおける変化を引き起こす能力に関して試験することを含む。実施形態では、治療剤はまた、無標識でもある。一部の実施形態では、２またはそれより多くの治療剤は、別々に試験してもよいし、または同じ患者からの罹患細胞の別々の試料と組み合わせて試験してもよい。他の治療剤より少ない用量で細胞の応答または生理学的な特徴における最大の変化を引き起こす治療剤が選択される。最大の治療作用を提供する化合物の組合せが決定され得る。実施形態では、決定は、患者の健康な細胞、または罹患していない患者の健康な細胞、または罹患していない患者の結果のプールと比較してなされ、治療指数ならびに他の個体の安全性および耐性の作用を決定することができる。
一部の実施形態では、治療剤が細胞経路に影響を与える標的化治療剤である場合、細胞の応答性における変化は、経路のアクチベーター剤または撹乱因子（すなわち、撹乱剤）の非存在または存在下で測定される。ベースラインの測定値またはカットオフ値と比較して、任意選択で他の治療剤と比較して、経路の撹乱因子に対する細胞の応答性を阻害する治療剤が選択される。
他の実施形態において、治療剤が、細胞表面受容体に結合する標的化治療剤である場合、細胞応答性の変化は、受容体に結合するアクチベーター剤または撹乱因子の非存在または存在下で測定される。実施形態において、治療剤は、アクチベーターまたは撹乱因子の前または後に細胞試料に投与される。実施形態において、アクチベーター剤または撹乱因子は、無標識である。細胞表面受容体の密度に関係なく、ベースライン測定値と比較して、必要に応じて、他の治療剤と比較して、アクチベーター剤または撹乱因子に対する細胞応答性を阻害する治療剤が選択される。一部の実施形態において、細胞受容体の密度とは無関係のアクチベーター剤または撹乱因子の作用を阻害する治療剤が選択される。
生理的パラメータの変化は、ベースラインまたは健常または撹乱されていない細胞対照と比較した、パラメータの増加または減少となり得る。変化は、完全アゴニズム、スーパーアゴニズム、不可逆的アゴニズム、選択的アゴニズム、共アゴニズム、インバースアゴニズムまたは部分限定アゴニズム、可逆的および不可逆的アンタゴニズム、競合的アンタゴニズム、非競合的アンタゴニズム、不競合的アンタゴニズムを表すことができる。変化は、適切な対照と比較して、より早く、より遅く生じる、または全く生じない可能性がある。より長いまたはより短い期間生じるよう、変化を選択することができる。可逆的または不可逆的な変化を選択することができる。
例えば、細胞シグナル伝達の減少をもたらす治療剤が、自己免疫性状態の処置に選択される。サイトカインの作用を阻害する薬剤に応答する末梢血細胞は、細胞シグナル伝達の減少を示す。別の例において、Ｈｅｒ２等の受容体に標的化されているヒト化抗体等、抗がん剤に応答性の疾患細胞に関して、疾患細胞は、ＥＧＦファミリー経路シグナル伝達の有意な低下を示す。他の事例において、抗血管新生剤に応答性の疾患細胞に関して、疾患細胞は、ＶＥＧＦ経路シグナル伝達の低下または増殖能力の低下を示す。薬剤の種類毎に測定されるＣＲｅＭＳ応答または物理的に観察可能な特徴は、不正に設計された薬物の意図される生理応答に依存性であり、必要に応じて特異的または一般的となり得る。重要なことは、薬物が変化することが意図される応答を検査するための、ある期間にわたる生細胞の生理的測定のためのＣＲｅＭＳの使用である。
特定の治療剤を、罹患細胞と、必要に応じて、健常細胞に投与して、特定の治療法の有効性を決定することができる。処置および無処置の罹患および／または健常細胞における治療法の効果を比較するために、罹患細胞および／または健常細胞は、無処置とすることもできる。単一の治療法を投与して、対象が治療的処置にどのように応答するか決定することができる。別の実施形態において、異なる治療法のパネルを特定の対象の細胞に投与することができる。
ある特定の実施形態において、細胞経路の活性化を阻害する治療剤の有効性のためのカットオフ値は、薬物を添加し、生理応答を測定することにより、一実施形態において決定される。別の実施形態において、経路は、薬物前処置ありおよびなしで撹乱される。８５％信頼区間、あるいは理想的には、９０％を超える信頼区間、あるいはより理想的には９５％または９９％を超える信頼区間における、薬物による生理的ベースラインシグナルに対する変化または撹乱シグナルの低下が、効果的と考慮される。実施形態において、細胞増殖を阻害または細胞死滅を増強する治療剤の有効性のためのカットオフ値は、生理応答を経時的に記録することにより決定される。８５％信頼区間、あるいは理想的には、９０％を超える信頼区間、あるいはより理想的には、９５％または９９％を超える信頼区間における、非処置もしくは健常細胞またはそれらの組み合わせと比較した、薬物による生理的ベースラインシグナルに対する低下または時間的パターンからの逸脱が、効果的と考慮される。
個々の対象の疾患を処置するための治療剤の感受性および特異性は、ＣＲｅＭＳによって測定された細胞生理的経路応答を比較して、薬物が、特定の標的において設計された通りに働くことを決定し、有効性のためのカットオフ値が達成されたことを決定することにより決定される。
一部の実施形態では、各々の薬剤に関してヒルスロープ、ＥＣ５０またはＩＣ５０値を得るために、アクチベーター剤および／または治療剤の用量を決める（ｔｉｔｒａｔｅ）。アクチベーター剤の用量決定および／または治療剤の用量決定から得られたデータは、各々の薬剤の効力（どれくらいの濃度が最大作用の半分を達成するか）および／または有効性（最大の達成可能な作用）を評価するのに使用することができる。さらなる態様は、活性化薬剤が細胞経路活性を低下させ、治療剤が細胞経路活性を刺激するＩＣ５０値を明らかにするために、アクチベーター剤または治療剤の用量を決定することによって、対象から得られた罹患細胞を使用して個々の対象において治療剤の有効性を予測する方法を含む。
治療剤としては、これらに限定されないが、細胞増殖を阻害するかまたは細胞殺滅を引き起こす特定の細胞経路および／または作用物質に標的化される薬剤を挙げることができる。治療剤が標的化する経路の例としては、ＭＡＰＫ−ＰＫ、ＲＡＳ／ＲＡＦ、ＲＨＯ、ＦＡＫ１、ＭＥＫ／ＭＡＰＫ、ＭＡＫ、ＭＫＫ、ＡＫＴ、ＥＧＦ受容体、Ｈｅｒ２受容体、Ｈｅｒ３受容体、Ｈｅｒ４受容体、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ＧＰＥＲ３０、ＰＩＫ３／ＰＴＥＮ、ＶＥＧＦ受容体経路阻害剤、細胞接着、ＴＧＦベータ／ＳＭＡＤ、ＷＮＴ、ヘッジホッグ／ＧＬＩ、ＨＩＦ１アルファ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｎｏｔｃｈ、Ｇ１／Ｓ遷移の制御、ＤＮＡ損傷の制御、およびアポトーシスが挙げられる。一部の実施形態では、治療剤は、細胞周期の調節に関与する細胞経路を標的化する。細胞周期の調節に影響を与える例示的な標的化治療剤としては、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＰＤ−１、およびサイクリン（例えば、サイクリンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＦ、およびＧ１／Ｓサイクリン）に標的化されたものが挙げられる。一部の実施形態では、標的化治療剤は、アロマターゼ酵素を標的化する。
他の実施形態では、治療剤は、いくつかの小分子および抗体薬物、例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ラパチニブ、ドセタキセル、タモキシフェン、シスプラチン、アブラキサン、パクリタキセル注射、ブレンツキシマブベドチン、エベロリムス、ペメトレキセド、エキセメスタン、オファツムマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、イリノテカン、ビカルタミド、オキサリプラチン、セツキシマブ、ビスモデギブ、クエン酸トレミフェン、フルベストラント、ゲムシタビン、イマチニブ、イキサベピロン、トポテカン、アキシチニブ、ロミデプシン、カバジタキセル、ソラフェニブ、インフリキシマブ、レナリドマイド、リツキシマブ、ダサチニブ、スニチニブ、エルロチニブ、ニロチニブ、パクリタキセル、テモゾロミド、トリオキシド、パニツムマブ、ボルテゾミブ、アザシチジン、パゾパニブ、クリゾチニブ、カペシタビン、イピリムマブ、ベムラフェニブ、酢酸ゴセレリン、アビラテロン、ＢＨ３模倣物、ナビトクラックス、アナストロゾール、レトロゾール、アロマターゼ阻害剤、シクロホスファミド、ドキソルビシン、メトトレキセート、フルオロウラシル、イキサベピロン、カルボプラチン、アフリベルセプト、テムシロリムス、イブリツモマブ、アビラテロン、クスチルセン、ネラチニブ、エンザルタミド、ニボルマブ、パルボシクリブ、レゴラフェニブ、エンチノスタット、アファチニブ、ＡＲＮ−５０９、ＡＲＮ−８１０、ＢＩＮＤ−０１４、ダブラフェニブ、ダラツムマブ、ランブロリズマブ、ＬＤＫ３７８、ＭＭ−１２１、ｓｙｍ００４、トラスツズマブエムタンシン、チボザニブ、トラメチニブ、アキシチニブ、ＬＹ２８３５２１９、ＭＰＤＬ３２０Ａ、オビヌツズマブ、Ｓｙｍ００４、トシツモマブ、トラメチニブ、ネシツムマブ、ラムシルマブ、およびそれらの組合せから選択される。これらの治療剤の標的は公知である。ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの方法（Ｃｈｏｕ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、７０巻（２号）：４４０〜４４６頁（２０１０年））を使用して、追加の治療剤の組合せを選択することができる。
一実施形態において、個々の対象における疾患のための薬剤の治療上の有効性を決定するための方法は、細胞応答測定系（ＣＲｅＭＳ）において、薬剤を個々の対象由来の少なくとも１種の単離された疾患細胞試料に投与するステップと、ベースライン測定値と比較して、薬剤に対する細胞試料の細胞の応答パラメータの変化が生じたか決定するステップであって、細胞応答の変化が、薬剤が、個々の対象における疾患に対し治療上の有効性を有することを示すステップとを含む。実施形態において、方法は、治療剤を投与する前または後に、細胞応答測定系において、個々の対象由来の少なくとも１種の単離された疾患細胞試料に、細胞応答経路を撹乱するアクチベーター剤または撹乱因子を投与するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、治療剤は、細胞経路のメンバーである細胞表面の受容体に標的化される。これらの試料は、試料を経路のアクチベーター剤または撹乱因子で活性化する前に、治療剤と接触させることができる。他の実施形態では、アクチベーター剤または撹乱因子は、特異的な増殖因子、血管内皮増殖因子、ホスファチジルイノシトール、上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、ｍ−ＣＳＦ、ＲＡＮＫリガンド、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、ニューレグリン、エストロゲン、プロゲステロン、フォレート、アデノシン三リン酸、およびＦＡＳリガンド、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、または細胞経路もしくはシグナル伝達の撹乱の他の薬剤、例えば対象の血漿もしくは血清、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ＋、Ｃｌ−、Ｃａ＋２、グルコース、グルタミン、ヒスチジン、マンニトール、およびトリプトファン、抗生物質（ラパマイシン）、必須および非必須アミノ酸、ビタミン、他の有機化合物、微量ミネラルおよび無機塩、血清、細胞抽出物、分画化された細胞抽出物または分画化された血清、細胞外シグナル伝達因子、細胞内シグナル伝達因子、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、ホスホリルエタノールアミン、トリヨードチロニン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミンを含む。他の実施形態では、治療剤は、細胞増殖を阻害すること、細胞殺滅を強化すること、および細胞を、罹患した状況を引き起こすシグナルに応答しないかまたは低い応答しか示さないようにすることによって罹患細胞に影響を与えるものである。このような治療剤の例としては、シクロホスファミド、５−ＦＵ、カペシタビン、および他のピリミジン薬物、他のＳＮ−３８代謝産物アナログ（例えばイリノテカン）、タキソール、および白金を含有する薬物（例えばシスプラチン）が挙げられる。
一部の実施形態において、このような薬剤のうち１種または複数に対する試料の応答は、細胞増殖を撹乱する成長因子（増殖因子）または抗アポトーシス薬の存在または非存在下で測定することもできる。細胞増殖を撹乱する成長因子（増殖因子）として、成長ホルモン、上皮成長因子、血管内皮増殖因子、血小板由来増殖因子、肝細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子および当業者に公知の他の因子が挙げられる。抗アポトーシス剤として、抗アポトーシスタンパク質または経路を調節する化合物（例えば、Ｂｃｌ−２タンパク質活性におけるタキソールおよび抗アポトーシスＲａｓシグナル伝達カスケードの制御のためのゲフィチニブ）が挙げられる。
例えば、乳がんと診断され、過剰発現または増幅したＨＥＲ２受容体を有すると決定された特定の対象の場合、その対象から単離された細胞を、特定の抗がん治療薬、特に抗ＨＥＲ２治療薬への応答性に関して試験することができる。例えば、ＨＥＲ２過剰発現対象からの細胞を、上皮増殖因子（ＥＧＦ）および／もしくは相同な構造を有するペプチド、ニューレグリン、またはヘレグリンの存在または非存在下におけるトラスツズマブまたはラパチニブへの応答性に関して試験することができる。一実施形態では、対象からの細胞を、バイオセンサー上に播種することができる。実施形態では、細胞は、無標識細胞全体である。このような細胞は、乳がんの腫瘍および健康な乳房組織からの細胞の両方であり得る。トラスツズマブまたはラパチニブは、罹患細胞の試料、任意選択で健康な細胞の試料に投与することができる。一部の実施形態では、トラスツズマブで処置された細胞試料を、次いでニューレグリンなどのＨｅｒ受容体アクチベーターと接触させる。罹患細胞および健康な細胞の両方の試料は、未処置のままであってもよい。細胞の応答は、細胞応答測定系（ＣＲｅＭＳ）を使用して決定される。実施形態では、細胞の応答は、１時間またはそれ未満の後に決定される。次いで特定の対象の細胞を処置するトラスツズマブの有効性は、経路撹乱の存在または非存在下において決定することができる。
ある特定の実施形態において、細胞経路のアクチベーター、細胞増殖のアクチベーターまたはアポトーシスの阻害剤に対する個々の対象の細胞試料の細胞応答を阻害する薬剤が選択される。同じまたは異なる経路を活性化する多数の異なる治療剤が、本開示の方法において評価される場合、他の薬剤よりも低濃度でアクチベーターまたは阻害剤応答を阻害することができる薬剤が、好ましくは選択される。
同様の実施形態において、活性の低下が罹患状態をもたらした場合、治療剤は、細胞活性に作用（ａｇｏｎｉｚｅ）または部分的に作用することにより、罹患細胞に影響を与える治療剤である。
検査は、一般に、２０％未満の標準偏差、最適には、５％未満の標準偏差で、１ｎＭ未満〜１００ｕＭ超の濃度範囲内で薬物の有効性を測定することができる。化合物検査範囲は、最大耐用量として公知の薬物包装ラベルに定義されている投薬レベルに相当する。検査における細胞の実際のセットにおける生細胞の数を確かめることができない大部分の検査とは異なり、この検査は、検査の初めにおける品質管理およびベースライン生理決定ステップにおいて決定される生細胞によってのみ働く。この特色の結果は、検査結果の分散を低下させる。検査は、当業者にとって一般に公知の、細胞生存率に一般に許容される温度、酸素、湿度および二酸化炭素範囲を用いて行うことができる。場合によっては、好ましい温度範囲は、２５℃〜４０℃の間である。他の事例において、温度は、特異的な撹乱のためにこの範囲内の＋０．５℃へとさらに最適化し、標準温度制御インキュベーターキャビネットを用いて維持することができる。
別の実施形態において、個体由来の罹患細胞の試料は、抗がん療法薬のパネルに対する応答性に関して検査することができる。がんのために、多数の小分子および抗体薬物が利用できる。係る治療剤の例として、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ラパチニブ、ドセタキセル、タモキシフェン、シスプラチン、アブラキサン、パクリタキセル注射、ブレンツキシマブベドチン、エベロリムス、ペメトレキセド、エキセメスタン、オファツムマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、イリノテカン、ビカルタミド、オキサリプラチン、セツキシマブ、ビスモデギブ、トレミフェンクエン酸塩、フルベストラント、ゲムシタビン、イマチニブ、トポテカン、アキシチニブ、ロミデプシン、カバジタキセル、ソラフェニブ、インフリキシマブ、レナリドミド、リツキシマブ、ダサチニブ、スニチニブ、エルロチニブ、ニロチニブ、パクリタキセル、テモゾロミド、トリオキサイド、パニツムマブ、ボルテゾミブ、アザシチジン、パゾパニブ、クリゾチニブ、カペシタビン、イピリムマブ、ベムラフェニブ、ゴセレリン酢酸塩、アビラテロン、ＢＨ３模倣物、ナビトクラックス、アナストロゾール、レトロゾール、アロマターゼ阻害剤、シクロホスファミド、ドキソルビシン、メトトレキサート、フルオロウラシルおよびそれらの組み合わせが挙げられる。
例えば、ＨＥＲ２過剰発現対象から収集された細胞の試料は、抗ＨＥＲ２治療薬などの抗乳がん治療薬のパネルに対して試験することができる。一実施形態では、対象からの細胞の各試料に、抗乳がん治療薬のうち１つを投与することができる。抗乳がん治療薬のパネルとしては、これらに限定されないが、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ラパチニブ、ドセタキセル、タモキシフェン、シスプラチン、ＢＨ３模倣物、アロマターゼ阻害剤、シクロホスファミド、ドキソルビシン、メトトレキセート、フルオロウラシル、ＮｅｕＶａｘ（商標）（アジュバントのサルグラモスチム（ｒＧＭ−ＣＳＦ）と共に投与されるＥ７５ペプチド）、およびそれらの組合せを挙げることができる。アロマターゼ阻害剤は、アロマターゼ阻害剤のうち少なくとも１つであってもよく、アナストロゾール、レトロゾール、またはエキセメスタンである。ＢＨ３模倣物は、ナビトクラックスであってもよい。
一実施形態において、抗乳がん療法薬は、Ｈｅｒ／Ｎｅｕ受容体ファミリー活性モジュレーター（例えば、ペルツズマブ）、細胞成長因子（細胞増殖因子）受容体モジュレーター（例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体のモジュレーター）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路モジュレーター、（ＰＩ３Ｋ）経路モジュレーター、ＢＨ３模倣物、アロマターゼ阻害剤またはそれらの組み合わせとなり得る。
本発明の方法は、候補治療法を対象の細胞に投与して、安全性を決定し、治療上の有効性を決定するステップを包含する。その上、対象の罹患細胞への候補治療法の投与は、第ＩＩまたはＩＩＩ相臨床治験に適した患者集団を選択する方法として用いることができる。本発明の方法は、公知の治療法組み合わせに対し罹患細胞を検査するステップを包含する。その上、本発明の方法は、公知および候補治療法を検査するステップを包含する。
本発明の方法は、また、治療剤の組み合わせを投与して、薬剤の特定の組み合わせが、より有効な結果（すなわち、疾患症状の寛解または治癒）を生じるか決定するステップを包含する。治療剤の組み合わせは、同じ細胞試料に投与される２種以上の治療剤である。本発明の実施形態において、治療剤の組み合わせは、細胞試料に同時発生的に投与される。実施形態において、少なくとも１種の治療剤は、組み合わせの他の少なくとも１種の治療剤の投与とは異なる時点で細胞試料に投与される。
細胞試料への治療剤の投与後に、細胞試料の複数の側面に関するリアルタイムデータを収集することができる。例えば、ｐＨおよび温度を測定することができる。その上、「細胞死因子」等、他の因子を決定することができる。ＣＲｅＭＳにより決定される細胞死因子は、ＣＲｅＭＳにより測定される物理化学的特性の変化となり得る。例えば、がん細胞は、表面に付着し、屈折率のベースライン読み取り値をもたらす。がん細胞死を促進する治療剤の投与は、試料におけるがん細胞が集まって表面から離れるため、屈折率に変化を引き起こす。これは、連続的リアルタイム様式で表面プラズモン共鳴を利用する光学的バイオセンサーにより測定することができる。
一実施形態において、本発明は、ＣＲｅＭＳにおいて、薬剤を対象由来の疾患細胞試料に投与することによって、特定の対象のための薬剤の治療上の有効性を決定するため、およびベースライン測定値と比較して、薬剤に対する細胞試料の生理応答を決定するための方法であって、生理応答が、薬剤の治療上の有効性を示す、方法を提供する。疾患細胞試料に投与される薬剤は、単一の薬剤または２種以上の薬剤となり得る。薬剤が、２種以上の薬剤である場合、２種以上の薬剤は、同時発生的に、あるいは異なる時点で投与することができる。例えば、細胞試料に１種の薬剤を投与して、後に第２の薬剤を投与することができる（例えば、１０分後に）。方法は、プラセボを罹患細胞試料に投与するステップを包含することもできる。方法は、健常細胞試料において検査される薬剤（複数可）を投与するステップを包含することもできる。
ある特定の実施形態では、本方法は、特定の治療薬ごとに最適な用量範囲を決定することを含む。用量範囲の決定は、臨床試験の適正な設計を可能にし、および／または医師が有効性と有害な副作用との釣り合いをとることを可能にする。実施形態では、方法は、ある範囲の用量の治療剤を投与して、同じ患者からの罹患細胞の試料を分離すること、およびベースラインおよび／または健康な対照細胞と比較して、本明細書に記載される細胞の生理学的パラメータにおける変化が生じる用量範囲を決定することを含む。
本明細書に記載されている方法のいずれかが用いられて、個々の対象の疾患細胞が、１種または複数の治療剤に応答するか決定されると、結果は、医療従事者に伝達されて、対象の処置のための治療剤の選択を可能にする。実施形態において、方法は、選択された治療剤を対象に投与するステップをさらに含む。
Ｇ．個々の対象における細胞経路のステータスの決定
多くの疾患は、上述したような機能不全性の細胞経路によって引き起こされる。多くのケースにおいて、特定の遺伝子突然変異は、しばしばこれらの機能不全性の経路に関連し、タンパク質受容体の過剰または過小発現を引き起こす。様々な治療薬は、所与の障害に特徴的であると考えられるバイオマーカーを特異的に標的化するように設計されている。残念なことに、標的化治療剤は、それらを受ける患者の半分未満にしか有効ではないことが多く、これは少なくとも部分的に、患者の疾患の性質は単に特異的な遺伝学的バイオマーカーの存在の関数ではないためである。したがって、疾患のバイオマーカーまたは遺伝子シグネチャの同定は、薬物有効性を正確に予測するには不十分である。疾患プロセスに関与する細胞経路の活性は、遺伝学的状態の静的な定量化を用いて捕らえるには複雑すぎる。上述したように、個々の対象における治療剤の有効性は、対象からの罹患細胞試料を、治療剤に、単独で、または撹乱剤と組み合わせて曝露し、処置した細胞における治療剤の生理学的な作用を測定することによって決定することができる。
別の実施形態では、対象から得られた細胞試料中の薬剤によって標的化された細胞経路のステータスを決定することによって、標的化治療剤への個々の対象の応答性を決定することも可能である。疾患を引き起こす経路の活性は、細胞経路が正常に機能しているときに特異的な細胞経路を撹乱することが公知の薬剤を使用して測定することができる。この実施形態は、生存可能な罹患細胞の状況における細胞経路の機能が、疾患活性の根源であり、疾患活性は、単にその経路内に存在するタンパク質の過剰発現の程度が原因ではないという観察を反映する。
したがって、一態様では、本発明は、対象から得られた罹患した細胞試料を、経路が正常に機能しているときに特異的な細胞経路を撹乱することが公知の撹乱剤（例えば、活性化薬剤）と接触させることによって、個々の対象から得られた罹患細胞における細胞経路の機能的ステータスを決定する方法を提供する。１つまたは複数の生理応答パラメータは、試料中の生存可能な細胞において（例えば、細胞応答測定系（ＣＲｅＭＳ）で）測定することができ、連続的な測定の数学的分析は、生理応答パラメータにおける変化の量が、撹乱剤および／または確認用薬剤の存在下で起こるかどうか、好適な対照（例えば正常な参照インターバル）より大きいかどうかを決定するのに使用することができる。撹乱剤の存在下における、好適な対照と比べた１つまたは複数の生理応答パラメータにおける変化の量は、撹乱剤によって標的化された細胞経路が、個々の対象において異常であるかまたは正常であるかを示す。
別の態様では、本発明は、対象から得られた罹患した細胞試料を、経路が異常に機能しているときに特異的な細胞経路を撹乱することが公知の撹乱剤と接触させることによって、個々の対象ごとに標的化治療剤を選択する方法を提供する。１つまたは複数の生理応答パラメータは、試料中の生存可能な細胞において（例えば、細胞応答測定系（ＣＲｅＭＳ）で）測定することができ、連続的な測定の数学的分析は、撹乱剤の存在下で生理応答パラメータにおける変化が起こるかどうかを決定するのに使用することができる。好適な対照と比べた、撹乱剤の存在下における１つまたは複数の生理応答パラメータにおける変化は、撹乱剤によって標的化された細胞経路が、個々の対象において機能不全であること（例えば異常であること）、したがって対象が、同じ細胞経路を標的化する標的化治療剤に応答すると予想されることを示す可能性がある。一部の実施形態では、本方法は、標的化治療剤を対象に投与することをさらに含む。この実施形態は、治療剤が影響を与える細胞経路が正常または異常に機能しているかどうかを決定することによって、標的化治療剤への個々の対象の応答性を決定することを可能にする。
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法の適用の前では、個々の対象における細胞経路の機能的ステータスは不明である。他の特定の実施形態では、対象から得られた細胞試料は、罹患細胞を含有するか、および／または無標識であってもよい。
撹乱剤の作用は、細胞試料の少なくとも１つの生理応答パラメータを、撹乱剤および／または確認用薬剤の存在下で試料中の生存可能な細胞中のこのパラメータにおける変化を検出するのに十分な規定された期間にわたりモニターすることによって測定することができる。一部の実施形態では、試料は、生存可能な細胞から本質的になる。
撹乱剤としては、本明細書に記載される撹乱剤（例えば、活性化薬剤）を挙げることができる。例えば、撹乱剤は、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物、リガンド、有機分子、シグナル伝達因子、生化学的物質、またはそれらの組合せであり得る。特定の撹乱剤としては、これらに限定されないが、アゴニストまたはアンタゴニスト、増殖因子、サイトカイン、ホルモン、特異的な細胞活性を刺激するかまたはそれに拮抗するように設計された小分子、酵素、ペプチドおよび上記のもののいずれかのペプチド画分、抗体または抗体の断片が挙げられる。
確認用薬剤としては、本明細書に記載されるように撹乱剤が開始させることができるシグナル伝達経路活性を阻害することが公知の薬剤を挙げることができる。撹乱剤および確認用薬剤によって標的化される経路の例としては、ＭＡＰＫ−ＰＫ、ＲＡＳ／ＲＡＦ、ＲＨＯ、ＦＡＫ１、ＭＥＫ／ＭＡＰＫ、ＭＡＫ、ＭＫＫ、ＡＫＴ、ＥＧＦ受容体、Ｈｅｒ２受容体、Ｈｅｒ３受容体、Ｈｅｒ４受容体、ＰＩＫ３／ＰＴＥＮ、ＶＥＧＦ受容体経路阻害剤、細胞接着、ＴＧＦベータ／ＳＭＡＤ、ＷＮＴ、ヘッジホッグ／ＧＬＩ、ＨＩＦ１アルファ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｎｏｔｃｈ、Ｇ１／Ｓ遷移の制御、ＤＮＡ損傷の制御、およびアポトーシスが挙げられる。一部の実施形態では、薬剤は、細胞周期の調節に関与する細胞経路を標的化する。細胞周期の調節に影響を与える例示的な薬剤としては、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＰＤ−１、およびサイクリン（例えば、サイクリンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＦ、およびＧ１／Ｓサイクリン）に標的化されたものが挙げられる。一部の実施形態では、薬剤は、アロマターゼ酵素を標的化する。
例示的な実施形態では、撹乱剤および確認用治療剤は、以下の細胞プロセス：ＭＡＰキナーゼシグナル伝達、アポトーシス、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達、クロマチン／後成的な調節、細胞代謝、細胞周期の制御、免疫学および炎症、発生および分化、ならびに／または細胞骨格の調節および接着の少なくとも１つに関与する細胞経路に作用する。以下の表６〜１４に、例示的な撹乱剤、およびそれらが標的化する経路を示す。
生理応答パラメータとしては、本明細書に記載されるもの、例えば、細胞接着、細胞付着、細胞形態、細胞増殖、細胞のシグナル伝達、細胞密度、細胞のサイズ、細胞の形状、細胞極性、ｐＨ、Ｏ２、ＣＯ２、グルコース、およびそれらの組合せが挙げられる。例示的な実施形態では、生理応答パラメータは、細胞接着または付着における変化である。
生理応答パラメータにおける変化が細胞試料中で起こるかどうかを決定するために連続的な測定を分析する方法が本明細書に記載される（例えば、応答の大きさ（陽性または陰性）、最大または最小までの時間、応答のタイムラインの任意のポイントにおける時間対大きさの傾きなど）。これらのおよび他の非線形分析方法は、撹乱剤の存在下で生理応答パラメータにおける変化が起こるかどうかを決定するために使用することができる。
ベースラインおよび対照は、細胞経路のステータスを判断するのに使用することができる。好適なベースラインとしては、これらに限定されないが、撹乱剤を含まない試料、撹乱剤の無限希釈の試料、撹乱剤添加後の十分に長い時間の前または後の同じ試料、および細胞ベースのアッセイ分野の当業者に公知の他のこのようなベースライン活性を挙げることができる。
好適な対照としては、これらに限定されないが、同じ患者からの健康な材料の試料、正常な参照インターバルを誘導するための十分な数の目的の疾患がない患者からの健康な材料の試料のセット、類似しているが異なる活性化薬剤を含む試料、公知の陽性または陰性応答を示す細胞株、活性化薬剤の逆の活性で処置された試料、１人または複数の患者からの罹患した材料の試料、ならびに細胞ベースのアッセイ分野の当業者に公知の他のこのような陽性および陰性対照を挙げることができる。
一部の実施形態では、撹乱剤の用量決定から得られたデータは、個々の対象において標的化治療剤の有効性を決定するのに使用することができる。例えば、罹患細胞試料が、増加する濃度の撹乱剤に曝露されると、細胞試料中の生存可能な細胞に対する撹乱剤のＥＣ５０値を生成することができ、その細胞試料に関するＥＣ５０値は、細胞経路が正常に機能しているときに撹乱剤によって実行される細胞経路を崩壊させることが公知の標的化治療剤の有効性を予測する。ＥＣ５０値を決定することによって、撹乱剤への患者細胞試料の感受性が獲得され、そのため、その患者において関連する細胞経路が機能的であるかまたは機能不全性である程度を評価するのに使用することができる。
一例において、ＥＣ５０が非常に小さい数値であれば、患者が、最小量の撹乱剤に対しても非常に感受性であることを示す。撹乱剤が正常なヒト流体中に見出される天然の薬剤である場合、この薬剤を低減するように設計された処置は、この薬剤レベルを低いＥＣ５０未満に低減させても効果がない場合がある。別の例において、経路のメンバーが構成的であり、経路を撹乱剤に不応答にするかまたは非常に弱くしか応答しないようにする可能性があれば、細胞経路が機能不全であることを示す。この例において、ＥＣ５０は、非常に大きい数値である。別の例において、経路のメンバーが過剰発現されている可能性があり、その結果として撹乱剤の添加時に経路の乱れた生理学的な応答が生じるのであれば、それが機能不全性の経路ステータスに寄与する。さらなる別の例において、経路のメンバーが、発現中に例えば突然変異により活性過小であり、不活性状態または隔離された状態のままになる可能性があれば、それが機能不全性のステータスに寄与する。別の実施形態では、経路のメンバーが、他の細胞機能と不適切に関連して、正常な経路応答に特徴的ではない生理学的な応答を生成する可能性があれば、それが機能不全性のステータスに寄与する。
撹乱剤の用量決定から得られたデータも、撹乱剤の効力（すなわち、どれくらいの濃度が最大作用の半分を達成するか）および／または有効性（すなわち、最大の達成可能な作用）を評価するのに使用することができる。
ある個々の対象からの単離された無標識疾患細胞試料に関するＥＣ５０の結果は、本質的に同じ細胞型を含有し、同じ撹乱剤で試験された他の個々の対象からの単離された無標識細胞試料に関するＥＣ５０の結果と比較することができる。統計的分析を実行してもよく、その場合、統計的分析によって細胞経路の機能的ステータスが予測される。個々の対象における細胞経路の機能的ステータスは、その経路に標的化された治療剤への対象の応答性を示す。
Ｈ．薬物有効性を測定するための細胞周期ステータスを分析する方法
サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、細胞周期の主要なレギュレーターとして作用する。様々な種類のがんを処置するために開発されたいくつかの標的化治療剤は、ＣＤＫを標的化する。本明細書に記載される方法の一実施形態では、ＣＤＫ経路の活性は、細胞周期のステータスを測定するために区別され、この測定は、薬物有効性との相関を示す可能性がある。
したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、細胞を特定の細胞周期ステータスに移行させることに関与する細胞経路を撹乱する、撹乱剤、および／または確認用薬剤、および／または標的化治療剤を利用することができる。例えば、薬物のトラスツズマブが目的通りに機能する場合、トラスツズマブは明らかに細胞周期をＧ１／Ｓ期で静止した状態にし、細胞をそれ以上増殖できないようにして、がん性の状況を崩壊させる。本明細書に記載される方法は、Ｇ１／Ｓ期における細胞の機能的ステータスを測定することによって、例えば、Ｇ１／Ｓステータスに関連する経路のステータスを試験することによって、患者試料におけるトラスツズマブの有効性を確認すると予想される。このような経路は当該分野において周知である。他の例において、Ｇ０期における細胞を停止させる撹乱剤を選択することができ、本明細書に記載される方法は、この停止または休止状態の細胞期に関連する経路の機能を試験するのに使用することができる。さらなる他の例において、細胞がアポトーシスに入るかまたはアポトーシスに入るのを開始させる薬剤を選択することができ、本明細書に記載される方法は、細胞死サイクルに入ることに関連する経路の機能を試験することができる。
Ｉ．試験結果の分析および解釈
本明細書に記載される方法を使用して得られた試験結果は、臨床医および／または患者に情報を提供するために、様々な方法で分析および解釈することができる。ある特定の実施形態は、以下に記載される通りである。
（ｉ）罹患した経路の分析。この分析は、ｅｘ ｖｉｖｏで罹患した経路活性が患者に見出されるかどうかを同定する。この分析は、疾患プロセスが患者の罹患細胞に存在するかどうかの動的な評価を医師に初めて提供すると予想される。この実施形態では、試験された経路は、４つの群のカテゴリー：構成的に活性であること、活性過剰であること、まったく活性ではないこと（活性過小）、または正常に活性であることの１つに分類することができる。経路が罹患しているかどうか、したがって目的の経路活性を阻害することが公知の標的化療法での処置に好適であるかどうかを決定するために、本明細書に記載される方法によって決定された、疾患を有する疑いのある患者に関する経路活性は、その経路活性に関して正常な参照インターバルから導出されたカットオフ値と比較される。異常である（例えば異常経路活性と正常な経路活性とを線引きするカットオフを超える）経路活性を有することが見出された経路を標的化する薬物は、その活性を崩壊させることが期待され、それによって患者において意図した作用がもたらされると予想される。
（ｉｉ）薬物機能性分析。この分析は、ｅｘ ｖｉｖｏにおける薬物の機能性の２つの尺度を提供する。
１）応答スコア（ＲＳ）：応答スコアは、試験された薬物が標的化された経路に対して有していた機能的な作用を特徴付ける。これは、０〜１のスケールで報告することができ、より高いスコアがより大きい薬物機能性を示す。
２）応答スコアのパーセンタイル順位（ＲＳＰＲ）：ＲＳＰＲは、患者の応答スコアが、同じ薬剤で試験された他の患者で得られたスコアと比べてどれくらいの順位なのかを特徴付ける。各患者につき、全群中のそれらの応答スコアのパーセンタイルを決定する。パーセンタイル順位が割り振られたら、次いで患者を、３つの群：ａ）中央値未満の群、ｂ）中央値付近の群、またはｃ）中央値を超える群の１つに分類することができる。特定の薬物に関して、進行までの時間（ＴＴＰ）などの臨床エンドポイントによって測定した場合の患者の薬物応答における多様なバリエーションは、応答スコアにおけるバリエーションに反映されると予想される。臨床試験において７５番目のパーセンタイルの患者のＴＴＰ期間が、２５番目のパーセンタイルの患者のＴＴＰ期間より５〜１０倍大きいことがよくあるため、医師にそれらの患者の応答スコアの相対的な順位を提供することは、医師に重要な解釈的な関係を与える。例えば、医師は、個々の患者の応答スコアのパーセンタイルに相当するパーセンタイル範囲での臨床試験における患者のＴＴＰ期間に基づいて、個々の患者につきＴＴＰ期間を推測することができる。
（ｉｉｉ）可能性がある臨床転帰の予測。この分析は、問題の薬剤を受けた後に試験および観察された患者に関する応答スコアと臨床エンドポイントとの間の臨床試験に見出される相関を反映する。この相関を用いれば、臨床試験において特定の応答スコアが付与された患者と一致する臨床転帰を同定することが可能である。例えば、測定された臨床転帰がＴＴＰであれば、患者の結果を３つのカテゴリーの１つに分類することができる。
１）可能性があるＴＴＰ期間−最も低い：この部分集団に入る患者は、患者の集団全体が経ると予想される中央値のＴＴＰ期間より十分に低いＴＴＰ期間を経る可能性が高い。
２）可能性があるＴＴＰ期間−未確定：このカテゴリーに入る応答スコアを受ける患者に関する評価は提供されない。
３）可能性があるＴＴＰ期間−最も高い：この部分集団に入る患者は、患者の群全体が経ると予想される中央値のＴＴＰ期間を十分に超えるＴＴＰ期間を経る可能性が高い。
臨床医は、臨床医がどの薬物療法を選択するかを決定する際の指針としてＣＥＬｘプロファイル試験の結果を使用すると予想される。患者の細胞が複数の薬物で試験される場合、医師が最も可能性がある臨床転帰に相関する試験結果を用いて薬物を選択できるように、各薬物の可能性がある臨床転帰を比較することができる。
Ｊ．キット
本発明の別の態様では、キットが提供される。ある特定の実施形態では、キットは、輸送培地を含有する、個々の対象からの疾患細胞試料のための容器；輸送培地を含有する、個々の対象からの対照細胞試料のための容器；バイオセンサー；バイオセンサーからのデータを出力に変換すること、出力を、レスポンダーまたはノンレスポンダーとしてステータスを示すカットオフ値を超えるかまたはそれ未満であると分類するか、および／または試料を、応答なし、弱い応答性、および応答性と分類すること、およびその分類を含む報告を作成することのためのコンピューター実行可能な命令を有する非一過性コンピューター可読媒体を含み、ここで出力は、規定の期間にわたる細胞の生理応答パラメータにおける変化を示し、細胞の生理応答パラメータは、ｐＨ、細胞接着、細胞付着のパターン、細胞増殖、細胞のシグナル伝達、細胞生存、細胞密度、細胞のサイズ、細胞の形状、細胞極性、Ｏ２、ＣＯ２、グルコース、細胞周期、同化、異化、小分子の合成および生成、転換、ならびに呼吸、ＡＴＰ、カルシウム、マグネシウム、および他の荷電イオン、タンパク質、特定の経路メンバーの分子、様々な細胞区画におけるＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、ゲノミクス、およびプロテオミクス、翻訳後修飾およびメカニズム、２次メッセンジャーのレベル、ｃＡＭＰ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡおよび生理学的機能を有する他のＲＮＡ、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される。
疾患細胞試料のタイプおよび量が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、疾患細胞試料は、少なくとも５，０００個の細胞を有する細胞全体の無標識の生存可能な細胞試料である。実施形態では、対照細胞試料は、同じ対象からの疾患細胞試料、同じ対象からの健康な細胞試料、疾患がないことが公知の対象からの健康な細胞試料、正常な参照インターバルを誘導するための目的の疾患がない十分な数の患者からの健康な材料の試料のセット、治療剤に応答することが公知の細胞試料、治療剤に応答しないことが公知の細胞試料、およびそれらの組合せからなる群より選択される。
容器および輸送培地は、細胞生存率を維持し、細胞活性化を最小化するよう設計される。実施形態において、培地および容器は、エンドトキシンフリー、非発熱性ならびにＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅフリーである。細胞試料を得たら、細胞生存率を保持する輸送培地において細胞試料を維持する。分析地への輸送時間の長さに応じて、異なる培地を用いることができる。実施形態において、組織試料の輸送が、最大１０時間を要する場合、培地は、４００ｍｏｓｍ／Ｌ未満の質量オスモル濃度を有し、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ＋、Ｃｌ−、Ｃａ＋２、グルコース、グルタミン、ヒスチジン、マンニトールおよびトリプトファン、ペニシリン、ストレプトマイシンを含み、必須アミノ酸を含有し、その上、非必須アミノ酸、ビタミン、他の有機化合物、微量ミネラルおよび無機塩、血清、細胞抽出物または成長因子（増殖因子）、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、ホスホリルエタノールアミン、トリヨードチロニン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミンを含有して、ヒト初代細胞の増殖およびプレーティング効率を支持することができる。係る培地の例として、初代細胞管理の実施のための、セルシオ培地、ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）、ハンクス緩衝食塩水およびマッコイの５Ａ、イーグル基本最小培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、リーボビッツＬ−１５またはそれらの修正物が挙げられる。
バイオセンサーは、本明細書に記載されている。ある特定の実施形態において、バイオセンサーは、細胞接着、細胞付着、細胞形態、細胞表現型、細胞増殖、細胞シグナル伝達、細胞密度、細胞極性、ｐＨ、Ｏ２、ＣＯ２、グルコースおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される細胞パラメータを検出するバイオセンサーからなる群より選択される。実施形態において、機器は、インピーダンスまたは光学的機器である。バイオセンサーは、必要に応じて、本明細書に記載されている通りにコーティングされていてよい。実施形態において、本明細書に記載されている治療および／またはアクチベーター剤の種類に関連する生理的パラメータの変化を測定するバイオセンサーが選択される。
他の実施形態において、キットは、バイオセンサーから得られたデータを、規定の期間にわたる、ｐＨ、細胞接着、細胞付着パターン、細胞増殖、細胞シグナル伝達、細胞生存、細胞密度、細胞サイズ、細胞形状、細胞極性、Ｏ２、ＣＯ２、グルコースおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される細胞生理応答パラメータの変化を示す出力へと変換し、レスポンダーもしくはノンレスポンダー、および／または応答なし、弱い応答性および応答性として出力を分類し、分類による報告を作成するためのコンピュータ実行可能命令を有する非一過性コンピュータ可読媒体を含む。
他の実施形態において、本発明は、本開示の方法を実行するための命令を有する演算機器またはコンピュータ可読媒体を提供する。コンピュータ可読媒体は、非一過性ＣＤ、ＤＶＤ、フラッシュドライブ、外部ハードドライブおよびモバイル機器を包含する。
本明細書に記載されているキットおよび方法は、プロセッサ／コンピュータシステムの使用を用いることができる。例えば、方法を実行するためのプログラムメモリ保存コンピュータプログラムコードに、ワーキングメモリに、また、従来のコンピュータスクリーン、キーボード、マウスおよびプリンタ等のインターフェースならびに本明細書に記載されている一実施形態の使用を見出すデータベースインターフェースを包含するネットワークインターフェースおよびソフトウェアインターフェース等の他のインターフェースに連結されたプロセッサを含む汎用コンピュータシステム。
コンピュータシステムは、キーボード、入力データファイルまたはネットワークインターフェース、または例えば、規定の期間にわたりバイオセンサーによって作成されたデータを解釈するシステム等の別のシステム等、データ入力機器からのユーザー入力を受け入れ、プリンタ、ディスプレイ、ネットワークインターフェースまたはデータ記憶機器等、出力機器に出力を提供する。入力機器、例えば、ネットワークインターフェースは、本明細書に記載されている細胞生理的パラメータの変化および／またはこれら変化の定量化を含む入力を受け取る。出力機器は、細胞パラメータの変化の検出および／または定量化を描写する１個または複数の数および／またはグラフを包含するディスプレイ等、出力を提供する。
コンピュータシステムは、本明細書に記載されている方法によって作成されたデータを記憶するデータ記憶装置に連結され得る。このデータは、測定値毎および／または対象毎に記憶される。必要に応じて、これらデータ種のそれぞれの複数のセットは、各対象に対応して記憶される。１個または複数のコンピュータ／プロセッサは、例えば、ネットワークを通じてコンピュータシステムに連結された、例えば、別々の機械として用いることができる、あるいはコンピュータシステムにおいて起動する別々のまたは統合されたプログラムを含むことができる。いずれの方法が用いられるとしても、これらのシステムは、データを受け取り、引き換えに検出／診断に関するデータを提供する。
一部の実施形態において、演算機器は、サーバーコンピュータ等、単一の演算機器を包含することができる。他の実施形態において、演算機器は、ネットワーク（図示せず）を通じて互いに通信するよう構成された複数の演算機器を包含することができる。演算機器は、メモリ内に複数のデータベースを記憶することができる。演算機器に記憶されたデータベースは、診療所、開業臨床医、プログラマ識別コードまたは他のいずれかの所望のカテゴリーにより組織化することができる。
バイオセンサーからのデータは、遠隔の演算システムまたは別のデータ記憶機器に送ることができる。通信プロセスは、初期化し、開始モジュールにおいて始め、接続操作へと進む。接続操作は、例えば、ケーブル接続、無線ローカルエリアネットワーク（ＷＬＡＮまたはＷｉ−Ｆｉ）接続、セルラーネットワーク、無線パーソナルエリアネットワーク（ＷＰＡＮ）接続、例えば、ＢＬＵＥＴＯＯＴＨ（登録商標）またはいずれかの所望の通信リンクを介して、医療提供者の記憶された情報を遠隔の演算システムへと通信により連結する。
転送操作は、バイオセンサーからのデータを演算機器へと送信する。実施形態において、転送操作は、機器間でデータを送信する前にデータを暗号化する。通信プロセスは、停止モジュールにおいて完了および終了することができる。バイオセンサーデータが、遠隔の演算機器へと転送されると、データは、経時的な細胞指数測定値等、出力に変換される。ある特定の実施形態において、定義されるエンドポイントが選択され、本明細書に記載されている通り、応答なし、弱い応答性または応答性としての細胞試料の分類に用いられる。実施形態において、レスポンダーまたはノンレスポンダーとしての試料の分析のステータスは、ケーブル接続、無線ローカルエリアネットワーク（ＷＬＡＮまたはＷｉ−Ｆｉ）接続、セルラーネットワーク、無線パーソナルエリアネットワーク（ＷＰＡＮ）接続、例えば、ＢＬＵＥＴＯＯＴＨ（登録商標）またはいずれかの所望の通信リンクを通して、同様のプロセスを用いて医療提供者に返信される。
ある特定の実施形態において、コンピュータ可読記憶媒体は、演算機器により実行されると、バイオセンサーからのデータを出力へと変換するステップであって、出力が、規定の期間にわたる細胞生理応答パラメータの変化を示し、細胞生理応答パラメータが、治療剤の存在および／または非存在下における、ｐＨ、細胞接着、細胞付着パターン、細胞増殖、細胞シグナル伝達、細胞生存、細胞密度、細胞サイズ、細胞形状、細胞極性、Ｏ２、ＣＯ２、グルコースおよびそれらの組み合わせからなる群より選択されるステップと、治療剤の存在下における細胞試料由来のバイオセンサーからの出力を、治療剤の非存在下における細胞試料由来のバイオセンサーからの出力と比較することにより、定義されたエンドポイントにおける応答なしおよび応答性として出力を分類するステップと、分類による報告を作成するステップとを含むステップを演算機器に実行させるコンピュータ実行可能命令を有する。実施形態において、コンピュータ実行可能命令は、医療提供者に分類を伝達するための命令を含む。
他の実施形態において、コンピュータ可読記憶媒体は、いずれの経路が、対象の疾患細胞試料において効き目があるか同定するための命令を包含することができる。命令は、演算機器により実行されると、第１の活性化または撹乱薬剤で処置した対象由来の疾患細胞試料からのバイオセンサーデータの出力と、第１の活性化または撹乱薬剤で処置していない同じ対象由来の第２の疾患細胞試料からのバイオセンサーデータの出力との間に互いに差が存在するか決定して、第１のアクチベーターまたは撹乱因子薬剤に対し応答性である経路が、疾患細胞試料において活性であるか決定するステップと、出力の差の存在を、経路の活性の兆候として同定するステップと、経路の活性を医療提供者に伝達するステップとを含む。アクチベーターまたは撹乱因子薬剤およびこれらの経路は、本明細書に記載されている。
本明細書に記載される方法を使用する少なくとも５つのタイプのＣＥＬｘ試験が想定される。
１）標的化された経路薬物の有効性を決定する経路シャットダウン試験。この試験において、標的化された経路薬物のその細胞標的への結合によって引き起こされた試験細胞の生理学的な変化が測定され、ベースラインの測定値と比較される。
２）抗増殖薬物の有効性を決定する抗増殖試験。この試験において、試験細胞の増殖能の阻害によって引き起こされた試験細胞の生理学的な変化が測定され、ベースラインの測定値と比較される。
３）組み合わせて利用される２つまたはそれより多くの薬物の有効性を決定する組合せ試験。この試験において、薬物によって引き起こされた試験細胞の生理学的な変化が測定され、ベースラインの測定値と比較される。組合せ試験は、２つもしくはそれより多くの標的化された経路薬物、２もしくはそれより多くの抗増殖薬物、または各タイプの薬物の１つもしくは複数を含み得る。
４）具体的な患者における経路の機能を実証する機能的な経路の試験。この試験において、撹乱因子および／または確認用薬剤の添加によって引き起こされた試験細胞の生理学的な変化は、患者におけるシグナル伝達経路の機能的ステータスを示す。この結果は、経路の機能が異常である（例えば疾患に関連する）かまたは正常であるかを決定するために、別々に決定されたカットオフ値と比較される。
５）組み合わされたリガンドおよび／または標的の存在を測定することによってリガンドおよび／または標的が存在するかどうかを決定するための、リガンド／標的試験。
実施例１〜５についての実験設計の考察
本方法は、細胞または細胞経路内でタンパク質結合が起こった後の、細胞または細胞経路の生理的変化を測定するためにＣＲｅＭＳを利用する。薬物は、結合していないと作動できず、殆どあらゆる疾患遺伝子は、コアなシグナル伝達経路に分類されることが一般に理解されている。この事実と、タンパク質結合の生化学的原理が細胞型にわたり普遍的であるという事実を踏まえると、これにより、本明細書に記載されている方法は、タンパク質および他の生体分子結合が起こり得るあらゆる細胞および細胞経路に広く適用できる。
現在最先端の遺伝子検査は、薬物または経路が結合しているか直接的に示すことができず、したがって、薬物応答を確実に予測することができない。薬物が導入された後に細胞内で生じる生理的変化を同定することにより、ＣＥＬｘ検査は、薬物に対する対象の細胞の応答を確実に予測することができる。
本方法が可能にする試験タイプの実施形態の一部を実証するために、３つの異なるタイプのがんを有する１１人の異なる患者からの細胞に６５回の実験を実行した。１１種の異なる細胞経路に影響を及ぼす１６種の異なる薬物を試験して、２種の異なるＣＲｅＭＳタイプを利用した。以下の表１５に、本出願の実施例において結果が報告される試験のリストを示す。
実験設計の理論的根拠
組織：
最も高い発生率のがんのうち３種由来の組織を選んだ。
乳がん。乳がんモデルは、進行、細胞形態の多様性、可変的な代謝率および生存の観点から多くの他のがんの代表であり、多くの他の組織に存在するがんに共通な異常分子および経路を有するため、検査の６４％に乳がん細胞を利用した。
結腸および肺がん。結腸および肺がん細胞を利用して、他の顕著ながん型における本開示のシステムおよび方法の適用性を実証した。
細胞：
乳がんの上皮細胞型の共通臨床症状を有する８名の患者由来の細胞を検査のために選択した。組織収集分野の当業者によって通例用いられる細胞試料収集技法を用いて、患者由来の細胞を得た。
患者Ｂ１：細胞は、６１歳の女性における乳房のＴＮＭステージＩＩＡ、グレード３原発性浸潤性腺管癌に由来する。細胞は、およそ３１時間の倍加時間を有し、偶発的無定形の上皮細胞形態を有する肥大型として現れ、非常に高い発現レベルのＥＲＢ Ｂ１およびＥＲＢ Ｂ２受容体を有する。エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）および癌遺伝子ＴＰ５３ステータスは、全３種陰性である。
患者Ｂ２：細胞は、５１歳のコーカサス人種の女性の乳房の腺癌の胸水に由来する。細胞は、およそ２８時間の倍加時間を有し、浸潤性、ウナギ状の（ｅｅｌ−ｌｉｋｅ）形態で現れ、高い発現レベルのＥＲＢ Ｂ１を有し、正常ＥＲＢ Ｂ２受容体レベルを上回って僅かに上昇し、エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性、プロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性であり、高い癌遺伝子ＴＰ５３ステータスを有する。
患者Ｂ３：細胞は、４３歳の白人女性における乳房の腺癌の胸水に由来する；およそ２０時間の倍加時間、敷石状（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ）上皮形態、非常に高い発現レベルのＥＲＢ Ｂ１およびＥＲＢ Ｂ２受容体、エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性、プロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性、癌遺伝子ＴＰ５３陽性ステータス。
患者Ｂ４：細胞は、４７歳の黒人女性における乳房の浸潤性腺管癌の腹水に由来する；１１０時間の倍加時間、円形、葡萄状（ｇｒａｐｅ−ｌｉｋｅ）クラスター形態を有し、非常に高い発現レベルのＥＲＢ Ｂ１およびＥＲＢ Ｂ２受容体を有し、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性、プロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性および癌遺伝子ＴＰ５３野生型−低ステータスである。
患者Ｂ５：細胞は、６０歳の白人女性における原発性乳房浸潤性腺管癌に由来する；２８時間の倍加時間、無定形拡散および浸潤性形態の混合物、非常に高い発現レベルのＥＲＢ Ｂ１およびＥＲＢ Ｂ２受容体、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性、プロゲステロン受容体（ＰＲ）陽性、癌遺伝子ＴＰ５３陽性ステータス。
患者Ｂ６：細胞は、７０歳の黒人女性における原発性乳房化生性癌ＴＮＭステージＩＶグレード３に由来する；およそ３０時間の倍加時間、粗い拡散形態、非常に高い発現レベルのＥＲＢ Ｂ１およびＥＲＢ Ｂ２受容体、エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性、プロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性、癌遺伝子ＴＰ５３突然変異、低ステータス。
患者Ｂ７：細胞は、６９歳の白人女性における乳房の浸潤性腺管癌の胸水に由来する；３０時間の倍加時間、小さいモザイク上皮形態、低発現レベルのＥＲＢ Ｂ１およびＥＲＢ Ｂ２受容体、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性、プロゲステロン受容体（ＰＲ）陽性、癌遺伝子ＴＰ５３野生型ステータス。
患者Ｂ８：細胞は、４８歳の白人女性における乳房の腺癌の胸水に由来する；２４時間の倍加時間、非常に小さい葡萄状クラスター形態、低発現レベルのＥＲＢ Ｂ１受容体、高い発現レベルのＥＲＢ Ｂ２受容体、エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性、プロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性、癌遺伝子ＴＰ５３野生型、低ステータス。
結腸がんの上皮細胞型の共通臨床症状を有する２名の患者由来の細胞を、検査のために選択した：
患者Ｃ１：細胞は、男性の結腸直腸癌に由来する。細胞は、１４時間の球状体積倍加時間を有し、高レベルのＥＲＢ Ｂ１、変異体Ｋ−Ｒａｓ、変異体ＰＩＫ３ＣＡおよび癌遺伝子ＴＰ５３陽性ステータスである。
患者Ｃ２：細胞は、４４歳のコーカサス人種の女性における原発性結腸腺癌、グレード２に由来する。細胞は、４６時間の球状体積倍加時間を有し、高レベルのＥＲＢ Ｂ１、変異体ＢＲＡＦおよび癌遺伝子ＴＰ５３陰性ステータスである。
非小細胞肺がんの上皮細胞型の共通臨床症状を有する２名の患者由来の細胞を、検査のために選択した：
患者Ｌ１：細胞は、２５歳の男性の非小細胞肺癌の胸水に由来する；４８時間の倍加時間、上皮形態、上昇した発現レベルのＥＲＢ Ｂ１およびＥＲＢ Ｂ２受容体、ＰＩＫ３ＣＡ陽性であり、ＫＲＡＳとＢＲＡＦ両者共に陰性ステータス。
患者Ｌ２：細胞は、５２歳の白人男性の細気管支肺胞性腺癌に由来する；およそ３０時間の倍加時間、上皮形態、正常発現レベルのＥＲＢ Ｂ１およびＥＲＢ Ｂ２受容体であり、ＢＲＡＦ、ＨＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡおよびＫＲＡＳは全て陰性ステータス。
細胞経路標的：
これらの実験のために選んだ薬物は、広範囲に相互接続され、結合により調節され、リン酸化および脱リン酸化等の酵素活性に関与し、決定的な細胞機能を制御する仕方において、大部分の細胞調節経路の代表的な１１種の細胞経路に影響を与える。
ＭＡＰＫ（ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ−ＴＫ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２）。マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼは、あらゆる細胞型に見出され、細胞外刺激（マイトジェン、浸透圧ストレス、熱ショックおよび炎症誘発性サイトカイン）に応答し、遺伝子発現、有糸分裂、分化、増殖および細胞生存／アポトーシス等、様々な細胞活性を調節する必要不可欠なセリン／スレオニン特異的プロテインキナーゼである。その緊密な調節は、細胞生存率の維持に重要である。上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；ＥｒｂＢ−１；ヒトにおけるＨＥＲ１）は、細胞外タンパク質リガンドの上皮成長因子ファミリー（ＥＧＦ−ファミリー）のメンバーの細胞表面受容体である。ＥＧＦＲ過剰発現（上方調節として公知）または過剰活性をもたらす突然変異は、肺がん、肛門がんおよび多形神経膠芽腫を包含する多数のがんに関連している。ＥＧＦＲまたはファミリーメンバーの突然変異、増幅または誤調節は、全上皮がんの約３０％に関与し、拡大しているクラスの抗がん療法の標的である。
ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ（Ｈｅｒ２、３、４、ＶＥＧＦ）。殆どあらゆる細胞型に見出されるホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路は、細胞生存および細胞成長に決定的であり、細胞表面受容体に結合する成長因子（増殖因子）により活性化され得る。これは、がんにおいて最も高頻度で活性化される経路の中の、入り組んだシグナル伝達カスケードである。これは、ヒトのがんにおける他のいかなる経路よりも頻繁に、突然変異、増幅および再編成を包含するゲノム異常により標的化される。ＶＥＧＦ受容体は、広範なヒト腫瘍および細胞株にわたり発現される。ＶＥＧＦの発現は、腫瘍成長および転移を促進する血管網の発達および維持をもたらすことが示されてきた。ＶＥＧＦは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸および他の腫瘍の大部分において発現される。ＶＥＧＦは、肺がんが進行するにつれてより高レベルで発現される。さらに、大量の相次ぐ証拠は、ＶＥＧＦ遺伝子発現が、予後不良と密接に関連することを示す。
細胞接着。細胞接着経路は、殆どあらゆる主要な生理機能と交わる。経路は、セレクチン、インテグリンおよびカドヘリン等、細胞接着分子を用いることによる、表面、細胞外マトリックスまたは別の細胞への細胞の結合に関与する。正確な細胞接着は、多細胞構造の維持に必要不可欠である。細胞接着は、細胞の細胞質をリンクさせることができ、シグナル伝達に関与させることができる。あらゆる接着は、原形質膜の内在性構成成分と関与して直接的に、あるいは細胞外部に排出され堆積された材料により間接的に、細胞表面によって媒介される。
ＭＥＫ。ＭＥＫは、がん細胞増殖および生存についてシグナル伝達する、ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路における重要なプロテインキナーゼである。ＭＥＫは、がんにおいて、特に、ＲＡＳおよびＲＡＦ癌遺伝子に突然変異を有する腫瘍において高頻度で活性化される。ＭＥＫは、また、がんにおいて成長および生存因子として作用し得る、炎症性サイトカインＴＮＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−１の生合成を調節する。ＭＥＫ経路は、メラノーマ、非小細胞肺、頭部／頚部および膵臓がんを包含する異なる腫瘍の増殖における中心軸として作用する。また、単独の、あるいは他の薬剤と組み合わせたＭＥＫ阻害は、がんの処置における重要な治療戦略である。
ＲＨＯ。Ｒｈｏタンパク質は、細胞極性、小胞輸送、細胞周期およびトランスクリプトーム動力学等、広範な細胞機能に関与する。Ｒｈｏ活性化は、がん性細胞において多数の異なる効果を有し得る。腫瘍の惹起において、Ｒｈｏ活性の修飾は、アポトーシスを抑制し、したがって、人為的な細胞寿命延長に寄与することができる。天然アポトーシスが抑制された後に、Ｒｈｏタンパク質が不可欠な役割を果たす極性の損失により、異常腫瘍成長を観察することができる。次に、成長する腫瘤は、潜在的にＲｈｏタンパク質に起因する接着タンパク質の変化により、その正常境界を通って浸潤することができる。
ＡＫＴ。ＡＫＴは、セリン／スレオニンキナーゼであり、ＩＧＦ−１Ｒ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＶＥＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ等、受容体チロシンキナーゼの刺激、ならびに第２のメッセンジャーＰＩＰによる受容体ＰＩ−３Ｋの膜局在化複合体の集合およびＡｋｔの活性化に関与する、収束する上流シグナル伝達経路の一群の枢要な節点として細胞内で機能する。ＡＫＴおよびその上流レギュレーターは、広範な固形腫瘍および血液悪性疾患において調節解除されるため、また、この経路の上述の生物学的続発症を考慮すると、ＡＫＴ経路は、これらの腫瘍の生物学的侵襲性の重要な決定要因および新規抗がん療法の主要な潜在的標的と考慮される。
ＦＡＫ１。接着斑キナーゼ１（ＦＡＫ１）媒介性シグナル伝達の生物学的重要性は、このチロシンキナーゼが、胚発生、細胞遊走や細胞周期進行の制御およびアポトーシスにおいて基本的な役割を果たすという事実により強調される。これは、足場依存性細胞の生存において中心的な役割を果たし、インテグリン関連細胞遊走（悪性疾患の発達において重要な役割を果たすプロセス）に必要不可欠である。ＦＡＫは、広範なヒト上皮がんにおいて上方調節され、発現は、浸潤能に密接に相関される。近年、ＦＡＫ発現は、悪性疾患への腫瘍細胞の進行、あるいはがんの病原に結びつけられた。ＦＡＫ１は、乳がん抗エストロゲン抵抗性の調節において主要な役割を果たす。
ＲＡＳ／ＲＡＦ。ＲＡＳ経路は、がんにおける最も高頻度で調節解除される経路の１種である。ＲＡＳは、ＲＡＦ／マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）キナーゼ（ＭＥＫ）／ＥＲＫ ＭＡＰＫおよびホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）−ＡＫＴシグナル伝達カスケードを包含する複数のエフェクター経路を通してシグナル伝達する。これらのエフェクター経路の発癌能は、ＢＲＡＦおよびＰＩＫ３ＣＡにおける活性化突然変異ならびに腫瘍抑制因子ＰＴＥＮ、ＰＩ３Ｋの負のレギュレーターにおける機能欠損型突然変異の高頻度の発生により例示される。腫瘍発生におけるＲａｓのこのような重要な役割により、Ｒａｓシグナル伝達経路は、抗がん療法の標的として相当な注目を集めた。
ＭＡＫ経路。転移関連キナーゼ（ＭＡＫ）は、細胞成長に必要とされる転写因子の新規のレギュレーターである。この経路の阻害は、細胞周期停止活性をもたらす。
ＭＫＫ。マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＫＫ）シグナル伝達経路は、細胞分化、増殖、運動性および生存を包含する、生命に関わる細胞プロセスの転写および翻訳後調節の両方に関連している。ＭＫＫシグナル伝達経路は、ＶＥＧＦの放出およびＶＥＧＦに対する応答のモジュレートにおいて必要不可欠な役割を果たすため、ＭＫＫは、腫瘍血管新生の促進において重要な役割を果たすと考えられる。
アポトーシス経路。アポトーシス経路の活性化は、細胞傷害性薬物が腫瘍細胞を死滅させるための重要な機序である。アポトーシスは、２種の主要経路を通して起こる。外的または細胞質経路と称される第１の経路は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバーである、Ｆａｓデスレセプターにより誘発される。第２の経路は、撹乱されると、ミトコンドリアからのチトクロム−ｃの放出およびデスシグナルの活性化をもたらす、内的またはミトコンドリア経路である。両方の経路は、調節および構造分子を切断するカスパーゼと呼ばれるプロテアーゼのカスケードの活性化に関与する最終共通経路へと収束し、結果的に、細胞の死を引き起こす。アポトーシスシグナル伝達の欠損は、腫瘍の抵抗性に寄与する。
治療剤：
選ばれた治療剤は、小分子薬の代表的な治療剤および抗体に由来する治療剤を包含する。検査された治療剤は、細胞内で機能的な特異的な経路をシャットダウンするよう設計された作用機序による一部の治療剤と、細胞アポトーシスを引き起こすよう設計された他の治療剤とを包含する。
セツキシマブ。セツキシマブ（アービタックス）は、転移性結腸直腸がんおよび頭頚部がんの処置のために静脈内注入により与えられる、キメラ（マウス／ヒト）モノクローナル抗体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤である。成長因子（増殖因子）が、細胞表面におけるその受容体に結合すると、受容体は、細胞を分裂させるシグナルを生じる。一部のがんは、成長因子（増殖因子）なしであっても分裂のためのシグナルを生じる突然変異した受容体によって引き起こされる。これにより、細胞は、制御不能に分裂するようになる。セツキシマブは、このような受容体に結合し、該シグナルをオフにする。
エルロチニブ。エルロチニブ塩酸塩（タルセバ）は、非小細胞肺がん、膵臓がんおよび他の数種類のがんの処置に用いられる薬物である。これは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に作用する可逆的チロシンキナーゼ阻害剤である。エルロチニブは、様々な形態のがんにおいて高度に発現され、偶発的に突然変異される、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼを特異的に標的化する。これは、受容体のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）結合部位に可逆的様式で結合する。
ラパチニブ。ラパチニブ（タイケルブ／タイバーブ）は、乳がんおよび他の固形腫瘍のための経口による活性薬物である。これは、ＨＥＲ２成長受容体経路を中断する、二重チロシンキナーゼ阻害剤である。これは、ＨＥＲ２−陽性乳がんの併用療法において用いられる。ラパチニブは、２種の癌遺伝子、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）およびＨＥＲ２／ｎｅｕ（ヒトＥＧＦＲ２型）に関連するチロシンキナーゼ活性を阻害する。ＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現は、女性におけるある種の高リスク乳がんの原因となり得る。
トラスツズマブ。トラスツズマブ（ハーセプチン）は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体に干渉するモノクローナル抗体である。その主な用途は、ある特定の乳がんを処置することである。これが、欠損ＨＥＲ２タンパク質に結合すると、ＨＥＲ２タンパク質はもはや、乳房における細胞を制御不能に繁殖させることはない。
ドセタキセル。ドセタキセル（タキソテール）は、臨床的に十分に確立された抗有糸分裂化学療法医薬である（すなわち、これは細胞分裂に干渉する）。これは、乳房、卵巣、前立腺および非小細胞肺がんの処置に主に用いられる。ドセタキセルは、化学療法薬物クラス；タキサンのものであり、パクリタキセル（タキソール）の半合成アナログである。
ＧＳＫ１０５９６１５。ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤（ＰＩ３Ｋ阻害剤）は、がんにおいて重要な役割を果たすＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の一部である、ホスホイノシチド３−キナーゼ酵素を阻害することにより機能する潜在的な医薬物である。この経路の阻害は、多くの場合、腫瘍成長を抑制する。
ＧＳＫ１１２０２１２。ＧＳＫ１１２０２１２は、有望な抗腫瘍活性を有する、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２（ＭＥＫ１／２）酵素の強力かつ選択的なアロステリック阻害剤である。
パゾパニブ。パゾパニブ（ヴォトリエント）は、腫瘍成長を遮断し、血管新生を阻害する、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＰＤＧＦＲ−ａ／βおよびｃ−ｋｉｔの強力かつ選択的な複数標的化受容体チロシンキナーゼ阻害剤である。
パクリタキセル。パクリタキセルは、肺、卵巣、乳房、頭頚部がんおよび進行型のカポジ肉腫の患者の処置に用いられる有糸分裂阻害剤である。パクリタキセルは、微小管を安定化し、その結果、細胞分裂における微小管の正常崩壊に干渉する。ドセタキセルと共に、これは、タキサンの薬物カテゴリーを形成する。
フルオロウラシル。フルオロウラシル（５−ＦＵまたはｆ５Ｕ）（Ａｄｒｕｃｉｌ、Ｃａｒａｃ、Ｅｆｕｄｉｘ、ＥｆｕｄｅｘおよびＦｌｕｏｒｏｐｌｅｘ）は、がんの処置において用いられるピリミジンアナログである薬物である。これは、自殺（ｓｕｉｃｉｄｅ）阻害剤であり、チミジル酸シンターゼの不可逆的阻害により働く。これは、代謝拮抗物質と呼ばれる薬物のファミリーに属する。
カペシタビン。カペシタビン（ゼローダ）は、転移性乳房および結腸直腸がんの処置において用いられる経口投与される化学療法剤である。カペシタビンは、腫瘍において５−フルオロウラシルへと酵素により変換され、そこでＤＮＡ合成を阻害し、腫瘍組織の成長を遅らせるプロドラッグである。
トポテカン。トポテカン（ハイカムチン）は、トポイソメラーゼ阻害剤である化学療法剤である。これは、卵巣がんおよび肺がんならびに他のがん型の処置に用いられる。トポイソメラーゼ−Ｉは核酵素であり、ＤＮＡ複製を防止し、最終的に細胞死をもたらす。このプロセスは、ＤＮＡ鎖に切断を生じ、アポトーシスを起こす。
イリノテカン。イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）は、結腸がんの処置に用いられる薬物である。イリノテカンは、加水分解により活性化されて、トポイソメラーゼＩの阻害剤であるＳＮ−３８となる。活性代謝物ＳＮ−３８によるトポイソメラーゼＩの阻害は、最終的に、ＤＮＡ複製および転写の両方の阻害をもたらす。
オキサリプラチン。オキサリプラチンは、がん化学療法において用いられる配位錯体である。このような白金に基づく薬物は、通常、アルキル化剤として分類される。オキサリプラチンは、ＤＮＡにストランド間およびストランド内架橋の両方を形成することにより機能するアルキル化剤である。ＤＮＡにおける架橋は、ＤＮＡ複製および転写を防止し、細胞死をもたらす。
シスプラチン。シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎ）は、肉腫、一部の癌（例えば、小細胞肺がんおよび卵巣がん）、リンパ腫および胚細胞腫瘍を包含する様々な種類のがんの処置に用いられる。これは、白金含有抗がん薬のクラスの第１のメンバーであったが、これは現在、カルボプラチンおよびオキサリプラチンも包含している。このような白金錯体は、ｉｎ ｖｉｖｏで反応し、ＤＮＡと結合し、ＤＮＡの架橋を引き起こし、最終的にアポトーシスを誘発する。
ＣＲｅＭＳの種類
２種類のＣＲｅＭＳ、光学的バイオセンサーおよびインピーダンスバイオセンサーを利用して、検査における細胞の生理応答を測定して、生じた生理的変化の量を、異なる種類のＣＲｅＭＳにおいてどのように測定することができるか実証した。
予測の基準
疾患の診断：
本明細書に記載される方法から導出された試験結果は、カットオフ値と比較され、その場合、カットオフを超える試験結果は、試験陽性と記録され、カットオフ値未満は、試験陰性と記録される。患者のシグナル伝達経路活性の測定量が、その特定のシグナル伝達経路に関して誘導されたカットオフ値より大きいことが見出されている場合、患者は、異常なシグナル伝達経路活性を有するとみなされ、したがってその異常なシグナル伝達経路活性に関連する疾患を有すると診断される。逆に言えば、患者のシグナル伝達経路活性が、その特定のシグナル伝達経路に関して誘導されたカットオフ値未満であることが見出されている場合、患者は、正常なシグナル伝達経路活性を有するとみなされ、したがって異常なシグナル伝達経路活性に関連する疾患を有さないと診断される。
患者が、初めにシグナル伝達経路に関連するバイオマーカーを用いて診断されるケースにおいて、本明細書に記載される方法は、バイオマーカーベースの診断を修正することができる。
薬物の有効性：
標的化された経路の阻害またはアポトーシス経路により、ＣＥＬｘ検査において引き起こされる生理的変化の量を、３種のカテゴリーのうち１種へと記録した：
１）ノンレスポンダー：無処置対照細胞と比較した、２種の薬物のうち最も高い生理的に関連する濃度による、細胞指数の＜２５％低下。この結果は、患者が、被験薬物組み合わせに応答しないことを示す。
２）レスポンダー（弱い）：いずれかのレベルの濃度の薬物による、細胞指数の２５〜５０％の間の低下。これは、患者が、検査薬物の組み合わせにある程度まで応答することを示す。
３）レスポンダー（強い）：いずれかのレベルの濃度の薬物による、細胞指数の＞５０％低下。これは、患者が、検査薬物に応答することを示す。
インピーダンスまたは光学的バイオセンサーを用いる細胞指数は、インピーダンス測定または屈折率測定のベースライン出発点を用いて計算される。ベースライン出発点インピーダンスまたは屈折率は、物理的に観察可能であり、薬物または他の撹乱因子によるいかなる処置よりも前の細胞の健康、生存率および生理的ステータスの指標である。薬物または撹乱因子の添加は、インピーダンスまたは屈折率のベースライン読み取り値を、細胞によって経験される細胞生理的変化の特異性を反映する時間的パターンにおいて変化させる。
（実施例１）
２種の薬物に対する２名の患者の区別された応答を示す経路シャットダウン検査
２名のＨＥＲ２過剰発現乳がん患者（患者Ｂ１およびＢ４）由来の細胞、ＨＥＲ２陽性乳がんに適応される２種の薬物（ラパチニブおよびトラスツズマブ）およびヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）を用いて、ＣＥＬｘ経路シャットダウン検査を行った。検査におけるＢ１およびＢ４細胞の生理的変化を、インピーダンスバイオセンサーＣＲｅＭＳを用いて測定し、ＣＲｅＭＳからの出力を、図１Ａおよび図１Ｂに記録する。ＣＥＬｘ検査結果および第三者臨床参照の比較を、図１Ｃに記録する。本実施例は、患者の細胞における生理的変化を数時間の期間にわたり連続的に測定するためのＣＲｅＭＳを用いることにより、どのようにしてＣＥＬｘ検査が、患者が異なる標的化経路薬物に対し有する応答性を予測することができるかを例示する。本実施例は、また、遺伝的バイオマーカー、この場合は、過剰発現するＨＥＲ２受容体の存在が、薬物の有効性の予測に十分な条件ではない理由を例示する。
材料と方法
ＣＲｅＭおよびマイクロプレート：４”×６”、９６ウェルインピーダンスマイクロプレートを、全ウェルのインピーダンスを同時に測定しつつ定電圧を維持するよう設計されたＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（インディアナ州インディアナポリス）ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＳＰインピーダンスバイオセンサー内に置いた。特定のウェルのインピーダンスの変化は、細胞の数および細胞とインピーダンスマイクロプレートとの付着の種類に比例する。インピーダンスの変化は、これらの小細胞集団の撹乱に対する応答を示す。
細胞：患者Ｂ１およびＢ４由来の細胞を利用した。細胞を−８０℃で受け取り、解凍し、標準ヒト上皮細胞取り扱い手順に従って、典型的には、血清含有緩衝培地を含有するＴ７５培養フラスコにおいて、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。インピーダンスマイクロプレートに加える前に、成長容器からヴェルセンを用いて細胞を取り出し、計数し、血清または他の成長因子（増殖因子）なしの培地に再懸濁した。
バッファーおよび試薬：ＡＴＣＣ（米国バージニア州マナサス）またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ニューヨーク州グランドアイランド）から送達された通りに、標準培地、血清、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン）および他のバッファーを購入し、用いた。追加的な成長因子（成熟ヒトＥＧＦ ｃａ６ＫＤａ）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）から購入し、成長因子（増殖因子）または血清なしの緩衝細胞培地において調製した。小分子薬物である治療剤ラパチニブは、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（米国テキサス州）から購入し、抗体薬物であるトラスツズマブは、臨床調剤薬局から得た。
手順：各ウェルにおける６，０００〜１２，０００個の間の細胞を、１２０ｕＬの血清含有標準培地を含有するインピーダンスマイクロプレートに播種した。溶液を、血清を含有しない培地に置き換えて、生理的状態および経路撹乱に関して細胞を同期化した。２０マイクロリットルの薬物を、経路撹乱の２時間前に無血清培地に加えた。ＥＣ８０用量の受容体リガンド（典型的には、２０ｕＬにおける６ｎＭ）を用いて、経路撹乱を惹起した。生理的変化のＣＲｅＭＳ記録を、バッファー交換から完全な細胞応答を通して経路撹乱まで数時間連続的に維持した。経路検査は、３７℃、５％ＣＯ２、相対湿度７５％で行った。
ＣＲｅＭＳは、検査を通じて連続的基準でデータを記録し、データは、Ｂ１およびＢ４細胞における２種の治療剤の効果を表した。
結果：図１Ａおよび図１Ｂは、それぞれ抗体薬物トラスツズマブおよび小分子薬物ラパチニブによる、Ｂ１およびＢ４細胞に関するＣＥＬｘ検査において収集されたデータを提示する。インピーダンスＣＲｅＭＳにより収集されたデータは、Ｘ軸に分で表す期間、Ｙ軸に細胞指数を示す各図において表されている。細胞指数は、検査におけるＢ１およびＢ４細胞の生理的変化を表す。
結果は、薬物添加なしのリガンド受容体による完全経路の撹乱が、最も高い細胞指数を生じたことを示す。撹乱されたＢ１細胞に薬物トラスツズマブを加えた後、被験細胞の細胞指数は５％未満変化し、Ｂ１被験細胞が、トラスツズマブの添加により影響されていないことを示す。逆に、Ｂ１細胞に薬物ラパチニブを加えた後、被験細胞の細胞指数は５０％を超えて減少し、標的化された経路内の活性が有意に減弱したことを示す。薬物、ラパチニブおよびトラスツズマブそれぞれをＢ４細胞の別々の試料に加えた後、各被験細胞試料の細胞指数は５０％を超えて減少した。この結果は、各被験細胞試料の標的化された経路内の活性が有意に減弱したことを示した。
これらの結果に基づき、図１Ａに示すＣＥＬｘ経路シャットダウン検査は、患者Ｂ１が、トラスツズマブに応答しないが、ラパチニブに応答することを予測する。図１Ｂに示す結果は、患者Ｂ４が、トラスツズマブおよびラパチニブの両方に応答することも予測する。ＣＥＬｘ検査予測および第三者臨床参照によって記録された結果の比較を図１Ｃに示す。この図は、ＣＥＬｘ検査が、臨床参照標準によって記録された結果を的確に予測したことを示し、この結果によると、患者Ｂ１は、トラスツズマブに対し無応答性であり、ラパチニブに対し応答性であることが判明し、患者Ｂ４は、両方に対し応答性であることが判明した。
考察：本発明の本実施例において、ＣＥＬｘ検査は、患者Ｂ１およびＢ４の細胞を用いて、２種の薬物、トラスツズマブおよびラパチニブの有効性を的確に予測した。Ｂ１およびＢ４細胞は、受容体リガンドによるＨＥＲ２経路の撹乱に応答し、患者が、該経路内の活性をシャットダウンすることができる薬物に応答し得ることを示す。本実施例において、薬物が同様の作用機序を有するにもかかわらず、Ｂ１細胞は、２種の薬物に対する区別された応答を実証する。患者Ｂ１は、ラパチニブに応答性であり、トラスツズマブに無応答性であることが判明した。
本実施例は、どのようにしてＣＥＬｘ検査が、抗体薬物であるトラスツズマブの場合のように細胞表面に働く治療剤、またはキナーゼ阻害剤薬物ラパチニブの場合のように細胞質において働く治療剤を包含する異なる種類の治療剤に適用できるかを例示する。これは、本開示のシステムおよび方法が、ＭＡＰＫ、ＲＨＯ、ＡＫＴ、ＦＡＫ１、ＲＡＳ／ＲＡＦ、ＰＩＫ３および細胞接着経路を標的化する薬物に応答した変化の検出に有効となる仕方も例示する。本実施例は、関連する遺伝的バイオマーカー、この場合は、過剰発現するＨＥＲ２遺伝子の存在に関する知識が、薬物が、その意図される作用機序に従って機能するか予測するのに十分な条件ではないことの原理も例示する。本実施例において、薬物トラスツズマブは、これに意図されている通りに、全てのＨｅｒ２陽性がん細胞型におけるＨＥＲ２成長因子シグナル伝達経路を必ずしもシャットダウンするとは限らない。同様の遺伝的プロファイルにもかかわらず、患者Ｂ１およびＢ４は、ＣＥＬｘ検査によって確認される通り、トラスツズマブに対し異なって応答する。逆に、本発明の方法の実施形態は、ＨＥＲ２部位に働く別の薬物、ラパチニブが、両方の患者に設計された通りに、経路をシャットダウンすることができることを的確に予測する。本実施例の結果は、第三者によって報告された応答と相関し、患者の罹患細胞における生理的変化の測定値を用いて、治療法が意図された有効性をもたらすか予測する能力を確認する。本発明により、医師は、薬物に対する腫瘍細胞の実際の応答性に基づき、乳がん患者のための処置を選択する。
（実施例２）
１種の薬物に対する２名の患者の区別された応答を示す抗増殖性検査
２名の乳がん患者（患者Ｂ１およびＢ２）由来の細胞および薬物パクリタキセルを用いて、ＣＥＬｘ抗増殖性検査を行った。インピーダンスバイオセンサーＣＲｅＭＳにより検査におけるＢ１およびＢ２細胞の生理的変化を測定し、ＣＲｅＭＳからの出力を図２Ａおよび図２Ｂに記録する。ＣＥＬｘ検査結果および第三者臨床参照の比較を図２Ｃに記録する。本実施例は、抗増殖薬が導入された後の患者のがん細胞における数日間の経過にわたり生理的変化を測定することにより、治療剤の有効性を予測するためのＣＥＬｘ検査の能力を実証する。本実施例は、結果の測定におけるベースライン、この場合は、無処置患者細胞の役割も実証する。加えて、患者Ｂ２に関して記録された結果は、薬物に対する細胞の応答性において経時的に生じ得る変化のために、連続的基準で数日間にわたり細胞の生理応答をモニターすることの重要性を実証する。
材料と方法
ＣＲｅＭＳ、マイクロプレート、試薬およびバッファー：実施例１において使用したＣＲｅＭＳ、マイクロプレート、試薬およびバッファーは、検査した治療剤を除いて、実施例２において用いたものと同じである。実施例２において、治療剤、パクリタキセルを検査した。パクリタキセルは、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（米国テキサス州）から購入した。
細胞：実施例１に記載されている様式と同じ様式で、患者Ｂ１およびＢ２由来の乳がん細胞を利用し、取り扱った。
手順：各ウェルにおいて６，０００〜１２，０００個の間の細胞を、１２０ｕＬの血清含有定着（ｓｅｔｔｌｉｎｇ）培地を含有するインピーダンスマイクロプレートに播種した。４０マイクロリットルの薬物パクリタキセルを、Ｂ１およびＢ２細胞それぞれの１セットに加えた；Ｂ１およびＢ２細胞の別の対照セットには、薬物を与えなかった。生理的変化のＣＲｅＭＳ記録を、細胞がマイクロプレートに最初に播種されてから完全な細胞応答まで、４８〜７２時間の間、連続的に維持した。３７℃、５％ＣＯ２、７５％相対湿度で検査を行った。
結果：図２Ａおよび図２Ｂは、薬物パクリタキセルによるＢ１およびＢ２細胞に関するＣＥＬｘ検査において収集されたデータを提示する。インピーダンスＣＲｅＭＳによって収集されたデータは、Ｘ軸に時間で表す期間、Ｙ軸に細胞指数を示す図において表されている。細胞指数は、検査におけるＢ１およびＢ２細胞の生理的変化を表す。細胞指数の増加は、一般に、細胞増殖の増加の指標である。長期細胞指数の減少は、一般に、細胞生存率の損失または生細胞数減少を示す。Ｂ２被験細胞は、Ｂ２対照細胞と比較したＣＲｅＭ出力の有意な減少において反映される通り、パクリタキセルに対し初期応答性を示したが、概して２４時間後、ＣＲｅＭ出力は逆転し、被験細胞が増殖し始め、もはや薬物に対し応答性ではないことを示す。Ｂ１被験細胞は、検査期間を通して、Ｂ１対照細胞と比較したＣＲｅＭ出力の減少において反映される通り、パクリタキセルに対し速効性および連続的な応答性を示す。図２Ａおよび図２Ｂに提示されているＣＥＬｘ検査結果は、患者Ｂ１およびＢ２が両者共に、パクリタキセルに応答することを予測する。ＣＥＬｘ検査予測および第三者臨床参照によって記録された結果の比較を図２Ｃに示す。この図は、ＣＥＬｘ検査が、臨床参照標準によって記録された結果を的確に予測したことを示し、この結果において、患者Ｂ１およびＢ２は両者共に、パクリタキセルに対し応答性であることが判明した。
考察：本実施例において、ＣＥＬｘ検査は、２名の乳がん患者、Ｂ１およびＢ２による抗増殖薬、パクリタキセルの有効性を的確に予測した。その上、患者Ｂ２のＣＥＬｘ検査結果は、パクリタキセルに対する抵抗性が、短期に発達することを示し、連続的基準で延長された期間にわたって細胞の生理応答をモニターすることの重要性を例示する。薬物療法による主要問題の１つは、薬物に対する抵抗性の急速な発達であるため、この結果は重要である。患者に無効な治療法が処方されれば、時間が失われる。化学毒性のリスクを増加させ、化学療法の共通の副作用に陥ることに加えて、多くの場合、ある薬物による処置は、より有効であったかもしれない別の薬物による処置の可能性を除外する。
（実施例３）
統合された２種の薬物に対する２名の患者の応答を示す組み合わせ検査
２名の結腸がん患者（患者Ｃ１およびＣ２）由来の細胞、ＥＧＦおよび結腸がんに適応される２種の薬物、セツキシマブおよびイリノテカンの組み合わせを用いて、ＣＥＬｘ組み合わせ検査を行った。インピーダンスバイオセンサーＣＲｅＭＳにより検査におけるＣ１およびＣ２細胞の生理的変化を測定し、ＣＲｅＭＳから得られた出力を図３Ａおよび図３Ｂに記録する。ＣＥＬｘ検査結果および第三者臨床参照の比較を図３Ｃに記録する。本実施例は、どのようにしてＣＥＬｘ検査が、遺伝子検査または発現プロファイリングを用いては行うことができないやり方で、２種以上の薬物の組み合わせに対し個々の患者が有する応答性を予測することができるかを実証する。検査は、ＣＥＬｘ検査が、乳がん細胞に加えて結腸がん細胞を用いて動作する仕方も例示する。
材料と方法
ＣＲｅＭＳ、マイクロプレート、試薬およびバッファー：実施例１および２において使用されたＣＲｅＭＳ、マイクロプレート、試薬およびバッファーは、使用した治療剤を除いて、実施例３において用いられたものと同じである。実施例３において、２種の治療剤、セツキシマブおよびイリノテカンを検査した。イリノテカンは、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（米国テキサス州）から購入し、セツキシマブは、臨床調剤薬局から得た。
細胞：実施例１に記載されている様式と同じ様式で、患者Ｃ１およびＣ２由来の結腸がん細胞を利用し、取り扱った。
手順：各ウェルにおいて６，０００〜１２，０００個の間の細胞を、１２０ｕＬの血清含有定着培地を含有するインピーダンスマイクロプレートに播種した。溶液を、血清を含有しない培地に置き換えて、生理的状態に関して細胞を同期化した。それぞれ２０マイクロリットルのイリノテカンおよびセツキシマブを、Ｃ１およびＣ２細胞のそれぞれ１セットに加えた；Ｃ１およびＣ２細胞の別の対照セットには、薬物を与えなかった。生理的変化のＣＲｅＭＳ記録を、細胞がマイクロプレートに最初に播種されてから完全な細胞応答まで、４８〜７２時間の間、連続的に維持した。３７℃、５％ＣＯ２、７５％相対湿度で検査を行った。
結果：図３Ａおよび図３Ｂは、Ｃ１およびＣ２細胞ならびに抗体薬物セツキシマブおよび小分子薬物イリノテカンの組み合わせに関するＣＥＬｘ検査において収集されたデータを提示する。インピーダンスＣＲｅＭＳによって収集されたデータは、Ｘ軸に時間で表す期間、Ｙ軸に細胞指数を示す図において表されている。細胞指数は、検査におけるＣ１およびＣ２細胞の生理的変化を表す。結果は、無処置対照Ｃ１およびＣ２細胞が、最も高い細胞指数を生じたことを示す。２種の薬物がＣ１およびＣ２被験細胞に添加された後の結果は、細胞試料毎の細胞指数の５０％超の低下を示す。これらの結果は、患者Ｃ１およびＣ２が両者共に、セツキシマブおよびイリノテカンの組み合わせに応答することを予測する。ＣＥＬｘ検査予測および第三者臨床参照によって記録された結果の比較を図３Ｃに示す。この図は、ＣＥＬｘ検査が、臨床参照標準によって記録された結果を的確に予測したことを示し、この結果において、患者Ｃ１およびＣ２は両者共に、セツキシマブおよびイリノテカン組み合わせに対し応答性であることが見出された。
考察：本実施例において、ＣＥＬｘ検査は、２名の結腸がん患者、Ｃ１およびＣ２による、２種の薬物、セツキシマブおよびイリノテカンの有効性を的確に予測した。しかし、２種の薬物による患者Ｃ１の全体的な結果が、細胞指数の５０％超の低下を示したとしても、ＣＥＬｘ検査結果は、薬物の一方、セツキシマブが、患者Ｃ１の細胞において生理的変化を引き起こさなかったことを示した。これは、患者Ｃ１における薬物組み合わせの全体的な治療上の利益が、イリノテカンによるものである可能性が高いことを示唆する。医師が、併用療法内の１種の薬物、この場合はイリノテカンのみが有効であることを知れば、効果的な薬物のみを処方するであろう。ＣＥＬｘ検査結果は、患者２が、個々の薬物それぞれに対し応答性であることを示し、薬物の組み合わせが、単一の薬物のみの使用よりも効果的となると示唆した。
結果は、ＣＥＬｘ検査が、２種以上の治療剤の組み合わせに対する個々の患者の応答性を予測することができる仕方を例示する。検査は、ＣＥＬｘ検査が、結腸がん細胞を用いて動作する仕方を例示する。これは、異なる種類の薬物、この場合は、細胞表面に結合することにより働く抗体薬物セツキシマブ、およびアポトーシス経路阻害剤、この場合は、細胞核に結合することにより働くイリノテカンに対するがん細胞の生理応答性をさらに例示する。また、これは、ＭＡＰＫ、ＲＨＯ、ＡＫＴ、ＦＡＫ１、ＲＡＳ／ＲＡＦ、ＰＩＫ３および細胞接着経路ならびにアポトーシス経路を標的化する薬物に対するがん細胞の生理応答性も例示する。結果は、医師に、結腸がん患者に対しより効果的な処置を選択させるであろう。
（実施例４）
異なる薬物を用いた追加的なＣＥＬｘ検査
１１種の異なる患者細胞（患者Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７由来の乳がん細胞、患者Ｃ１およびＣ２由来の結腸がん細胞ならびに患者Ｌ１およびＬ２由来の肺がん細胞）および１５種の異なる薬物（カペシタビン、セツキシマブ、ドセタキセル、フルオロウラシル、ゲフィチニブ、ＧＳＫ１０５９６１５、ＧＳＫ１１２０２１２、ラパチニブ、パクリタキセル、パゾパニブ、トラスツズマブ、トポテカン、シスプラチン、エルロチニブおよびオキサリプラチン）の選択から可能な細胞および薬物組み合わせの一部を用いて、５１種のＣＥＬｘ経路シャットダウンおよび抗増殖性単一薬物検査を行った。６種のＣＥＬｘ組み合わせ検査を行い、２種は、パクリタキセルおよびシスプラチンの薬物組み合わせならびに患者Ｌ１およびＬ２細胞を用いて、４種は、トラスツズマブおよびラパチニブの薬物組み合わせならびに患者Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４細胞を用いて行った。インピーダンスバイオセンサーＣＲｅＭＳにより、細胞の生理的変化および検査した薬物を測定し、ＣＲｅＭＳからの概要出力を図４に記録する。これらのＣＥＬｘ検査結果および第三者臨床参照の間の相関を図７に記録する。
材料と方法
ＣＲｅＭＳ、マイクロプレート、試薬およびバッファー：図４に収載されている５７種の検査のそれぞれは、実施例１〜３に記載されているものと同じＣＲｅＭＳ、マイクロプレート、試薬およびバッファーによる。
細胞：実施例１に記載されている様式と同じ様式で、患者Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｃ１、Ｃ２、Ｌ１およびＬ２由来の細胞を利用し、取り扱った。
手順：標的化経路薬物（セツキシマブ、ゲフィチニブ、ＧＳＫ１０５９６１５、ＧＳＫ１１２０２１２、ラパチニブ、パゾパニブ、トラスツズマブおよびエルロチニブ）に関与する実験において、実施例１に記載されている手順を利用した。抗増殖薬（カペシタビン、ドセタキセル、フルオロウラシル、パクリタキセル、トポテカン、シスプラチンおよびオキサリプラチン）に関与する実験において、実施例２に記載されている手順を利用した。薬物の組み合わせに関与する実験において、実施例３に記載されている手順を利用した。患者細胞および細胞により検査した薬物のリストは、図４に特徴付けされている。
結果：収載されている細胞および薬物の様々な組み合わせにおいて行った５７種のＣＥＬｘ検査の概要結果を図４に示す。実験毎に、その対照細胞と比較した被験細胞の生理応答の変化を計算した。図４における各ボックスは、各実験において測定した生理応答の変化を、５０％超、５％〜５０％の間または５％未満のいずれかとして分類する。図４に表されている一連の検査は、広範な細胞経路を標的化する広範な薬物に曝露された後に、種々の共通がん細胞型において生じる生理的変化を測定するＣＥＬｘ検査の能力を例示する。ＣＥＬｘ検査予測および第三者臨床参照によって記録された結果の比較を図７に示す。この図は、ＣＥＬｘ検査結果が、患者および薬物組み合わせに関して報告された第三者臨床参照と相関したことを示す。
考察：本実施例に記載されている５７種の検査において、本明細書に記載されている本発明は、次のものによる有効性を実証した：
結腸、乳房および肺がん細胞；
ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ−ＴＫ、ＰＩ３Ｋ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＨＥＲ２受容体およびＶＥＧＦＲを包含する標的による、ＭＡＰＫ、ＲＨＯ、ＡＫＴ、ＦＡＫ１、ＲＡＳ／ＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ、ＭＡＫ、ＭＫＫ、ＭＥＫおよび細胞接着経路を阻害する標的化経路薬物；ならびに
トポイソメラーゼＩ、ＴＵＢＢ１、ＢＣＬ２、ＤＮＡ、プリン架橋（ＧＧ、ＡＧ、ＧＮＧ）およびチミジル酸シンターゼを包含する標的による、アポトーシス経路を標的化する抗増殖薬。
１種を除くＣＥＬｘ検査結果のそれぞれは、この患者細胞および薬物組み合わせの結果と相関した。
（実施例５）
異なるＣＲｅＭＳから得られた結果の間の一致検査
上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体を過剰発現する４名の乳がん患者（患者Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４）由来の細胞、１種の薬物セツキシマブおよびヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）を用いて、ＣＥＬｘ経路シャットダウン検査を行った。インピーダンスバイオセンサーＣＲｅＭＳおよび光学的バイオセンサーＣＲｅＭｓにより、検査における４名の患者の細胞の生理的変化を測定して、２種の異なるＣＲｅＭＳから得られた結果の相関を実証した。ＣＲｅＭＳから得られた出力を図５に記録する。本実施例は、どのようにしてＣＥＬｘ検査が、２種の異なるＣＲｅＭＳを用いて、患者の細胞における生理的変化の同じ測定値を得ることができるかを例示する。
材料と方法
ＣＲｅＭＳおよびマイクロプレート：本実施例において、２種の異なるＣＲｅＭＳを用いた。ある一連の検査において、全ウェルのインピーダンスを同時に測定しつつ定電圧を維持するよう設計されたＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（インディアナ州インディアナポリス）ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＳＰインピーダンスバイオセンサー内に、４”×６”、９６ウェルインピーダンスマイクロプレートを置いた。特定のウェルのインピーダンスの変化は、細胞の数および細胞とインピーダンスマイクロプレートとの付着の種類に比例する。インピーダンスの変化は、これらの小細胞集団の撹乱に対する応答を示す。他の一連の検査において、各ウェルにおいて８５０ナノメートル近赤外反射光を走査するよう設計されたＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（マサチューセッツ州ウォルサム）ＥｎＳｐｉｒｅ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ光学的バイオセンサー内に、４”×６”、３８４ウェル光学的マイクロプレートを置いた。特定のウェルの反射された波長の変化は、細胞の数および細胞と光学的マイクロプレートとの付着の種類に比例する。反射された波長の変化は、ウェルにおける小細胞集団の撹乱に対する応答を示す。
試薬およびバッファー：実施例１において使用される試薬およびバッファーは、用いた治療剤を除いて、実施例５において用いられるものと同じである。実施例５において、治療剤セツキシマブを検査した。セツキシマブは、医学調剤薬局から取得した。
細胞：両方の検査セットにおいて患者Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４由来の乳がん細胞を利用し、実施例１に記載されている様式と同じ様式で取り扱った。
手順：インピーダンスバイオセンサーＣＲｅＭＳを用いて行われる検査のセットにおいて、各ウェルにおいて６，０００〜１２，０００個の間の細胞を、１２０ｕＬの血清含有定着培地を含有するインピーダンスマイクロプレートに播種した。経路撹乱の２時間前に、４０マイクロリットルの薬物セツキシマブを、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４患者細胞のそれぞれ１セットを含有する無血清培地に加えた；Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４細胞の別の対照セットには、薬物を与えなかった。ＥＣ８０用量の受容体リガンド（２０ｕＬにおける６ｎＭ）を用いて経路撹乱を惹起した。生理的変化のインピーダンスＣＲｅＭＳ記録を、マイクロプレートに細胞が最初に播種されてから完全な細胞応答まで、２０〜４８時間の間に及び、連続的に維持した。３７℃、５％ＣＯ２、７５％相対湿度で検査を行った。
光学的バイオセンサーＣＲｅＭＳを用いて行われる検査のセットにおいて、各ウェルにおいて６，０００〜１２，０００個の間の細胞を、６０ｕＬの血清含有定着培地を含有する光学的マイクロプレートに播種した。経路撹乱の２時間前に、２０マイクロリットルの薬物セツキシマブを、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４患者細胞のそれぞれ１セットを含有する無血清培地に加えた；Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４細胞の別の対照セットには、薬物を与えなかった。ＥＣ８０用量の受容体リガンド（２０ｕＬにおける６ｎＭ）を用いて経路撹乱を惹起した。生理的変化の光学的ＣＲｅＭＳ記録を、マイクロプレートに細胞を最初に播種してから完全な細胞応答まで、２０〜４８時間の間に及び、連続的に維持した。２５℃〜３０℃、＜５％ＣＯ２、３０％相対湿度で検査を行った。
結果：図５は、薬物セツキシマブおよびＥＧＦを用いて、４名の乳がん患者（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４）由来の細胞において別々に行われた８種のＣＥＬｘ検査の概要結果を示す。細胞Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４における検査の１セットは、光学的バイオセンサーＣＲｅＭＳを用いて行い、同じ細胞における検査の別のセットは、インピーダンスバイオセンサーＣＲｅＭＳを用いて行った。ＣＲｅＭＳにより記録された出力のパーセンテージ変化の範囲を示す概要様式で結果を提示する。検査した患者細胞毎に、各ＣＲｅＭＳにより記録された生理的変化の量は、同一であった。これらの結果は、ＣＥＬｘ検査方法が、細胞における異なる生理的変化を測定する異なる種類のＣＲｅＭＳを利用できることを例示する。
考察：本実施例において、細胞生理的変化を測定するための異なるトランスデューサー界面を有する２種の異なるＣＲｅＭＳにおいてＣＥＬｘ検査を行った。処置に対する生理応答の取得に用いた機器の有意な差にもかかわらず、光学的バイオセンサーＣＲｅＭＳおよびインピーダンスバイオセンサーＣＲｅＭＳは、患者試料それぞれに対し同一結果を生じた。この結果は、多くのＣＲｅＭＳ種類への本発明の拡張と、薬物に対する治療応答を予測するために個々の患者の細胞生理的変化を用いる本発明の普遍性の例示に重要である。
実施例１〜５からのＣＥＬｘ検査結果および臨床予測の概要
実施例１〜４に記載されている全６５種の総ＣＥＬｘ検査の概要結果を図６に提示する。図６に記載されているＣＥＬｘ検査結果と、単一の薬物または薬物組み合わせに対する患者の応答性を記録した第三者臨床参照からの結果との間の相関（０％または１００％のいずれか）を図７に示す。１種を除く全６５種の検査において、ＣＥＬｘ検査予測および第三者測定値は、同じ結果を生じ、広範な細胞経路を標的化する１６種の異なる薬物に対する乳房、肺および結腸患者応答を予測するＣＥＬｘ検査の能力を例示する。
実施例１〜４において検査された様々な患者がん細胞のＣＥＬｘ検査予測、対、第三者記録を、図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃおよび図８Ｄに提示する。患者が、薬物または薬物組み合わせに応答することを的確に予測するＣＥＬｘ検査結果は、真陽性（ＴＰ）結果として表示される。患者が、薬物または薬物組み合わせに応答しないという的確な予測は、真陰性（ＴＮ）結果として表示される。患者が、薬物または薬物組み合わせに応答するという不確かな予測は、偽陽性（ＦＰ）として表示され、患者が、薬物に応答しないという不確かな予測は、偽陰性（ＦＮ）として表示される。
図８Ａは、単独でまたは１６種の異なる薬物と組み合わせて検査した１２種のがん患者細胞を用いた、実施例１〜４において行った全検査の結果、対、第三者記録の比較を記録する。図８Ｂは、単独および１３種の異なる薬物と組み合わせて検査した８種の乳がん患者細胞の結果、対、第三者記録の比較を記録する。図８Ｃは、単独および３種の異なる薬物と組み合わせて検査した２種の異なる結腸がん患者細胞の結果の比較を記録する。図８Ｄは、単独および３種の異なる薬物と組み合わせて検査した２種の異なる肺がん患者細胞の結果の比較を記録する。各図において、ＣＥＬｘ検査は、１事例を除いて、患者が特定の薬物または薬物の組み合わせに応答するかしないか的確に予測することが示されている。図８Ｂにおいて、ゲフィチニブに対しレスポンダーであることが予想された１種の患者乳がん細胞試料が、ＣＲｅＭＳ検査において応答を示さなかったことが分かる。
実施例１〜４において検査した患者細胞および薬物ならびに検査した患者、薬物、経路およびＣＲｅＭＳの種類のサブグループに対するＣＥＬｘ検査の感度および特異性を、図９に提示する。全体および試験したサブグループそれぞれの内において、ＣＥＬｘ検査は、高い感度（９８％＋）および特異性（９９．９％＋）を生じた。これらの結果は、実施例１〜５に記載されている異なるがん細胞型、薬物の種類、ＣＲｅＭＳの種類および検査において標的化される経路にわたる検査の予測力を例示する。
（実施例６）
細胞付着シグナル（ＣＡＳ）を使用する診断アッセイシステム
本明細書において使用される診断試験の分析物は、マイクロプレートのウェル中に置かれ、インピーダンスバイオセンサーで分析される場合、生存可能な患者細胞が、単独で、または細胞アンタゴニストの存在下で生成する細胞付着シグナル（ＣＡＳ）である。各試験につき、ＣＡＳは、患者細胞試料の２つの群ごとに測定され分析される。
１）患者細胞のみ（Ｃ）
２）患者細胞＋経路因子（ＣＦ）
３）患者細胞＋経路因子＋確認用薬剤（ＣＣＦ）。
シグナル伝達経路が正常に機能しているかどうかを検出するために、患者の罹患細胞におけるシグナル伝達経路を撹乱して、結果得られた活性を、撹乱因子がそれらの健康な細胞のシグナル伝達経路活性に対して有する作用、または患者からの健康な細胞もしくは疾患を有さないことが公知の患者のシグナル伝達経路活性に対する撹乱因子の作用と比較する。アッセイは、罹患細胞におけるＣＦ細胞とＣ細胞との間のＣＡＳにおける変化と比べた、患者の健康な細胞におけるＣＦ細胞とＣ細胞との間のＣＡＳにおける変化を測定する。代替として、アッセイは、疾患を有さないことが公知の患者または患者のプールからの公知の結果と比較できる患者の罹患細胞におけるＣＦ細胞とＣ細胞との間のＣＡＳにおける変化を測定することができる。本質的に、シグナル伝達経路が異常である場合、健康な細胞と罹患細胞との間のＣＡＳの変化は、異なると予想される。対象からのＣＦ罹患細胞とＣＣＦ罹患細胞との間のＣＡＳにおける変化の測定は、ＣＦのＣＡＳが目的のシグナル伝達経路の活性を表すことの確認を提供する。ＣＣＦがＣＦと比べて変化しないケースにおいて、これは、ＣＦにおけるシグナル伝達経路活性は、目的の状態に関連しない何らかの他のシグナル伝達経路活性を表すことを示すと予想される。これらのケースにおいて、患者は、分析されている疾患を有するとみなされないと予想される。
原発性の非形質転換の悪性のおよび健康な上皮細胞に加えて細胞株における特異的な経路活性を測定するために、この細胞分析方法の能力を確認する研究を実行した。図１０および１１に、乳がんに関与する２つの重要な経路、ＰＩ３ＫおよびＥＲαに関するこれらの研究からの代表的なデータを示す。
図１０Ａおよび１０Ｂは、ＮＲＧ１、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路因子（すなわち、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路を撹乱する薬剤）は、予想通りに試験された細胞（図１０ＡではＢＴ４７４乳がん細胞株の細胞、図１０Ｂでは患者５４の初代乳がん細胞）において細胞付着シグナル（ＣＡＳ）を増加させたこと、および確認用薬剤、ラパチニブ、二重のＰＩ３ＫおよびＭＡＰＫ阻害剤はＣＡＳを低下させたことを示し、ＮＲＧ１だけを用いて測定されたＣＡＳは、ＰＩ３Ｋ経路に沿った活性に特異的であったことが確認される。図１０Ｃは、初代乳がん細胞（患者５４の細胞）と健康な乳がん細胞（Ｈ６２細胞）との間のＮＲＧ１への差次的な応答を示し、疾患活性の表現型バイオマーカーとしてシグナル伝達経路活性を使用することの有効性が実証される。
図１１Ａおよび１１Ｂは、エストラジオール、ＥＲα経路因子は、予想通りに試験された細胞（図１１ＡではＢＴ４７４乳がん細胞株の細胞、図１１Ｂでは患者５４の初代乳がん細胞）においてＣＡＳを変化させたこと、および確認用薬剤、フルベストラント、ＥＲα阻害剤は、ＣＡＳを逆転させたことを示し、エストラジオールだけを用いて測定されたＣＡＳは、ＥＲα経路に沿った活性に特異的であったことが確認される。図１１Ｃは、初代乳がん細胞（患者５４の細胞）と健康な乳がん細胞（Ｈ６２細胞）との間のエストラジオールへの差次的な応答を示し、疾患活性の表現型バイオマーカーとして経路活性を使用することの有効性が実証される。
（実施例７）
罹患細胞においてＨＥＲ２受容体非過剰発現および異常なＨＥＲ２のシグナル伝達経路活性を有する乳がん患者を同定するための、シグナル伝達経路活性の測定
本発明の価値および有用性、ならびに本発明が、臨床試験として有用であるのに十分に精密および正確であることを実証するために、有意な数の健康な患者および罹患した患者からの細胞を本発明を用いて分析した。具体的に言えば、この実施例は、どのようにして本発明が、がん細胞が、非過剰発現または非増幅レベルのＨＥＲ２受容体を有し、さらに現行のＩＨＣまたはＦＩＳＨ診断法に基づきＨＥＲ２標的化療法に適格な患者の経路活性と少なくとも同等の機能不全性である機能不全性のＨＥＲ２関連の経路の活性を有する患者の部分集団を同定するのかを実証する。これは、予想外で臨床的に重要な結果である。
ＨＥＲ２によって誘発されるがん：ＨＥＲ２によって誘発される乳がんは、現在のところ乳房上皮細胞で過剰発現または増幅したＨＥＲ２受容体を有する患者で発生した場合にのみ診断される（ＩＨＣまたはＦＩＳＨによって）。
がん細胞が非過剰発現または非増幅のＨＥＲ２受容体レベルを有し、さらにＨＥＲ２によって誘発されるがんを有する患者を同定できる方法は、現在のところ知られていない。本発明のこの実施例は、本明細書に記載される方法は、患者のＨＥＲ２受容体レベルが非過剰発現または非増幅であり、さらにＨＥＲ２によって誘発されるがんを有する患者を同定するための有効な試験を提供することを実証する。
ＨＥＲ２受容体は、ファミリーの他のあらゆるメンバーと対合することができるという点で、ＥｒｂＢ受容体ファミリーの遍在的なメンバー（ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４）である。ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバーは、それらの細胞のシグナル伝達機能を発揮するために、対合するかまたは二量体化する。ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバーは、それ自身とホモ二量体（例えばＨＥＲ２−ＨＥＲ２）として対合することもできるし、またはヘテロ二量体として、すなわち混成のファミリーメンバーの対合として対合することもできる（例えばＨＥＲ１−ＨＥＲ２またはＨＥＲ２−ＨＥＲ３）。ＨＥＲ２は、受容体チロシンキナーゼの酵素活性、この受容体ファミリーとの対合を介したこの経路でのシグナル伝達の開始における重要な要素を潜在的に供給することができる。ＨＥＲ２受容体の遍在的な性質は、細胞集団中のその機能的活性を定量することを難しくする可能性がある。ＨＥＲ２がＥｒｂＢファミリーの異なるメンバーと対合する場合、異なる経路シグナルが生成する可能性がある。ＨＥＲ２によって誘発されるがんは、主としてＨＥＲ２受容体とＨＥＲ１受容体との対合を介して、さらにＨＥＲ２とＨＥＲ３受容体との対合を介して起こると考えられる。ＨＥＲ２受容体は、公知の直接的に撹乱するリガンドを有しておらず、したがってＨＥＲ２−ＨＥＲ２対合の撹乱は起こらないと考えられている。ＨＥＲ１−ＨＥＲ２受容体の対合は、生存可能な細胞において、上皮増殖因子（ＥＧＦ）の添加により撹乱される可能性がある。ＨＥＲ２−ＨＥＲ３受容体の対合は、生存可能な細胞において、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）の添加により撹乱される可能性がある。本発明の一実施形態は、この実施例において実証されたように、ＨＥＲ２受容体が対合するＥｒｂＢファミリーメンバーに関係なく、ＨＥＲ２受容体の経路シグナル伝達活性への特異的な寄与を決定するために、２つの撹乱剤を採用する。撹乱剤は、ＥｒｂＢ経路受容体に特異的なものであり、確認用薬剤は、撹乱剤の機能におけるＨＥＲ２受容体の役割を崩壊させるのに特異的なものである。
分析物および測定量：本明細書において使用される診断試験の分析物は、インピーダンスバイオセンサーのマイクロプレートのウェル中に置かれ、電気インピーダンスに関して連続的に測定される場合、生存可能な患者細胞が、単独で、または特異的な細胞シグナル伝達経路の撹乱因子の存在下で生成する細胞付着シグナル（ＣＡＳ）である。各試験につき、ＣＡＳは、同じ患者からの患者細胞試料の最大４つの部分について連続的に測定され、測定量のアルゴリズムで使用される。
１．患者細胞のみ（Ｃ）
２．患者細胞＋撹乱する経路因子１（ＣＦ１）
３．患者細胞＋撹乱する経路因子２（ＣＦ２）（必要に応じて）
４．患者細胞＋撹乱する経路因子＋確認用薬剤（ＣＣＦ）。
ＣＡＳは、試験された患者試料の最大４つの部分（Ｃ、ＣＦ１、ＣＦ２、ＣＣＦ）のそれぞれにつき定量化される。患者の罹患細胞のシグナル伝達経路活性を定量化するために、ＣＦ１および／またはＣＦ２部分で測定されたＣＡＳは、Ｃ部分で測定されたＣＡＳと比較される。これは、ＣＣＦ試料部分とＣＦ試料部分との間のＣＡＳにおける変化と比べた、ＣＦ試料部分とＣ試料部分との間のＣＡＳにおける変化の決定を可能にし、ＣＦとＣとの間の変化のうちどれほどが目的のシグナル伝達経路に関するのかを確認することができる。
この実施例で使用される確認用薬剤である抗体薬物は、ＨＥＲ２受容体の二量体化アームが、他のＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ１受容体、ＨＥＲ３受容体、またはＨＥＲ４受容体との対合を立体化学的にブロックする作用機序を有する。この確認用薬剤を使用して、ＣＦ１および／またはＣＦ２のＣＡＳとＣのＣＡＳとの間の差を、ＨＥＲ２の関与に正確に割り当てることができる。この確認用薬剤が撹乱剤の前に細胞試料に適用される場合、撹乱剤はＨＥＲ２受容体関連の活性からブロックされ、それによってＣＦ１および／ＣＦ２のＣＡＳ値未満のＣＣＦのＣＡＳ値が、Ｃと比べたＣＦ１および／またはＣＦ２の変化におけるＨＥＲ２受容体の関与に比例する量で生成される。
小分子などの異なる確認用薬剤を使用することができる。これらは、ＥｒｂＢファミリー中の受容体チロシンキナーゼのＡＴＰ結合部位にそれらが結合する作用機序を有する。これらの確認用薬剤は、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ１受容体、ＨＥＲ３受容体、またはＨＥＲ４受容体の開始のシグナル伝達酵素の機能を立体化学的にブロックする。これらの小分子の確認用薬剤は、撹乱因子のシグナルを、撹乱因子の添加時におけるそのＣＡＳシグナル変化への受容体チロシンキナーゼ酵素の関与に正確に割り当てることを可能にする。これらの確認用薬剤が撹乱剤の前に個々に細胞試料に適用される場合、撹乱剤は、受容体関連の酵素活性からブロックされ、それによってＣＦ１および／またはＣＦ２のＣＡＳ値未満のＣＣＦのＣＡＳ値が、受容体酵素の機能の関与に比例する量で生成される。
時間対ＣＡＳ試験のデータから導出された非線形のユークリッドの時点ベクトルから測定量を計算するのに使用される方程式：
式中、変数は、以下のように定義される：
ｉ＝試験中にＣＡＳが記録される１分ごとのステップ
Ｆ１＝ＮＲＧ１撹乱因子
Ｆ２＝ＥＧＦ撹乱因子
Ｃｉ＝対照、試験細胞への撹乱因子の添加なし
ＣＦ１ｉ＝撹乱因子（Ｆ１）を有する細胞
ＣＦ２ｉ＝撹乱因子（Ｆ２）を有する細胞
ＣＣＦ１ｉ＝Ｆ１およびＨＥＲ２経路の確認用（Ｃ）薬剤を有する細胞
ＣＣＦ２ｉ＝Ｆ２およびＨＥＲ２経路の確認用（Ｃ）薬剤を有する細胞。
留意すべきことに、個々の撹乱因子の寄与につき測定量を計算するためのアルゴリズムは、上記で示される完全なアルゴリズムにおける加算演算子（ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｐｅｒａｔｏｒ）（＋）の両側に見出される。
試薬および緩衝液：血清非含有、抗生物質（例えばペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン）、およびＨＥＰＥＳ緩衝液含有のＤＭＥＭ／Ｆ１２に基づく標準培地を購入し、ＶＷＲ（Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ）またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から送達されたとおりのものを使用した。追加の増殖因子／撹乱剤（約６ＫＤａのヒトＥＧＦ、約８ＫＤａのＮＲＧ１）をＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入し、増殖因子も血清も含まない緩衝化した細胞培地中で調製した。増殖因子も血清も含まない緩衝化した細胞培地中で調製された、使用された小分子の確認用薬剤（ラパチニブ、アファチニブ、ネラチニブ）を、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ＴＸ、ＵＳＡ）から購入した。使用された抗体の確認用薬剤はペルツズマブ、ヒト化モノクローナル抗体であり、臨床的な医療施設から得た。
細胞試料：商業的な供給源（例えばＤＳＭＺ、Ｌｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ＧＥＲＭＡＮＹ）からの標準的な寿命が長い乳がん上皮細胞株、縮小手術（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ ｓｕｒｇｅｒｙ）を受けた健康な女性からの乳房上皮細胞、および患者からの乳がん細胞を利用した。
細胞試料のリスト
・３５人のＨＥＲ２陰性患者
・６人の疾患を有さない健康な患者
・１０人のＨＥＲ２過剰発現陽性細胞株
・９人のＨＥＲ２非過剰発現陰性細胞株。
商業的な供給源の細胞株をドライアイス上で受け取り、商業的な供給者による推奨に従って培養した。生存可能な初代患者材料を病院から直接受け取り、そこで典型的には血清非含有、抗生物質含有の緩衝化された乳房上皮の増殖培地を含有するすぐに細胞培養可能なプラスチック製フラスコ中で、３７℃、５％ＣＯ２、８５％湿度で、それらを標準的なヒト上皮細胞の取り扱い手順に従って培養した。インピーダンスマイクロプレートに添加する前、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を含むそれらの増殖容器から細胞を取り出し、計数し、抗生物質を含むが、血清も他の増殖因子も含まない培地に再懸濁した。
手順：使用された試験手順（下記でＣＥＬｘと称される）は、全て５％ＣＯ２、８５％湿度、３７℃で実行された以下のステップを含んだ：
１．細胞の播種：抗生物質を含むが、血清も他の増殖因子も含まない乳房上皮増殖培地中の、各患者または細胞株からの１５，０００個の生存可能な上皮細胞を含有する１８０ｕＬのアリコートを、インピーダンスマイクロプレートの各々の指定されたウェル（Ｃ、ＣＣＦ、ＣＦ１、ＣＦ２）に分配した。後述するステップ２〜４にわたりインピーダンスを連続的に測定した。
２．各細胞試料につき特定前のＣＣＦウェルへの播種の６時間後に、確認用薬剤（２０ｕＬ）を添加した。確認用薬剤を受けていないウェルに、対照として培地を入れた。
３．各試料につき特定前のＣＦウェルへの播種の１８時間後に、撹乱因子（２０ｕＬ）を添加した。撹乱因子を受けていないウェルに、対照として培地を入れた。
４．典型的には撹乱剤を添加してから少なくとも１５時間後に、各患者の各試験ウェルにつき連続的なインピーダンス記録を作製した。
結果および図面の説明：
インピーダンスＣＲｅＭＳによって収集されたデータが各図面に提示され、Ｘ軸には時間が分で示され、Ｙ軸には細胞指数が示される。細胞指数は、試験中に添加される異なる薬剤に関する試験中における異なる細胞の生理学的な変化を表す。
蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して、この実施例で使用された異なる患者細胞の受容体レベルを決定した。患者の生存可能な細胞に、ＨＥＲ２受容体の細胞外の部分に結合するよう指向された蛍光抗体でタグ付けした。図１２は、この実施例で試験された異なる患者材料のＨＥＲ２受容体レベルに関するＦＡＣＳデータを示す。このＦＡＣＳデータから、この実施例のために試験された異なるクラスの細胞は、ＨＥＲ２受容体の異なるレベルを有することが確認される。データから、ＨＥＲ２非発現がん患者は、健康な患者およびＨＥＲ２非発現細胞株と類似したＨＥＲ２受容体タンパク質レベルを有し、これらは、ＨＥＲ２過剰発現細胞株の受容体レベルより十分に低かったことが示される。
図１３は、生存可能な細胞と、より生存可能性が低い細胞（試験できない細胞）とを対比させた細胞付着ＣＡＳを示す。本発明は、生存可能な細胞のみをリアルタイムで連続的に試験することが意図される。各試験において、生存可能な細胞のみが試験されることが保証される。
図１４は、１人のがん患者（Ｒ１１２）のＣＥＬｘ試験中に収集されたデータを提示する。ＥＧＦおよびＮＲＧ撹乱因子を用いた、がん患者Ｒ１１２の実施例の時間経過（Ｘ軸）対インピーダンス（Ｙ軸）が示される。各撹乱因子の添加も、ＨＥＲ２関与の確認用因子の添加と共に図面に示される。
以下の表１６に、ＮＲＧについてはＣ、ＣＦ、ＥＧＦについてはＣＦ、および各撹乱因子についてはＣＣＦに関する患者Ｒ１１２の計算された測定量の値の表を見出すことができる。
これらの結果から、受容体リガンドを用いて確認用因子添加を用いない全経路の撹乱が、このＨＥＲ２非過剰発現患者で最も高い細胞指数を生成したことが示される（ＣＦ−Ｃ）。２種の異なる受容体撹乱剤試料への確認用因子の添加から、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３受容体に連結された経路のシグナル伝達またはＨＥＲ２−ＨＥＲ４受容体に連結された経路のシグナル伝達のＮＲＧ１撹乱が９０％であったが、ＨＥＲ１−ＨＥＲ２受容体に連結された経路のシグナル伝達の撹乱が、この患者の場合、より有意に低いＨＥＲ２受容体の関与を示したことが実証される。各患者は、２種の撹乱のそれぞれにおいて異なるレベルのＨＥＲ２の関与を示すことから、さらに、各患者におけるＨＥＲ２によって誘発される経路のシグナル伝達の両方の態様の個別化した試験の重要性が実証される。
図１５Ａ〜Ｄは、１つのＨＥＲ２過剰発現細胞株（ＳＫＢｒ３；図１５Ａ）、ＨＥＲ２により誘発される疾患を有する１人のＨＥＲ２非過剰発現患者（Ｒ３９；図１５Ｂ）、ＨＥＲ２により誘発される疾患を有さない１人のＨＥＲ２非過剰発現患者（Ｒ４９；図１５Ｃ）、および１人の健康な患者（Ｒ６２；図１５Ｄ）のＮＲＧ１撹乱のデータ比較に関する棒グラフの測定量を提示する。ＨＥＲ２過剰発現細胞株（図１５Ａ、ＳＫＢＲ３）およびＨＥＲ２非過剰発現患者の試料（図１５Ｂ、Ｒ３９）は、匹敵するＮＲＧ１によって誘発される活性を示す。ＨＥＲ２二量体ブロッカー（ペルツズマブ）確認用薬剤の阻害の結果から、測定されたＰＩ３Ｋ活性の大部分は、これらの患者の場合、ＨＥＲ２受容体を含むことが確認される。留意すべきことに、ペルツズマブ阻害の量は、ＨＥＲ２非過剰発現患者試料（Ｒ３９）においてより大きい。ＨＥＲ２により誘発される疾患がないＨＥＲ２非過剰発現がん患者の試料における経路のシグナル伝達活性のＮＲＧ１撹乱（図１５Ｃ、Ｒ４９）は、この実施例で試験されたＨＥＲ２非過剰発現患者の試料の８０％で示され、代表的な健康な患者試料に匹敵する（図１５Ｄ、Ｒ６２）。留意すべきことに、腫瘍試料（図１５Ｄ；Ｒ４９）および健康な試料（図１５Ｄ、Ｒ６２）の両方で測定されたＮＲＧ１活性のレベルは、左側のＳＫＢＲ３試料およびＲ３９試料で測定された活性の２５％未満である。
ＣＥＬｘ試験を使用して、ＨＥＲ２非過剰発現がん患者を健康な罹患していない患者と統計学的に分離できない帰無仮説を試験するための研究を遂行した。図１６は、本発明の実施例で試験された異なる患者集団の四分位数を定義する箱ひげ図のプロットを提示する。ＣＥＬｘ試験は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３受容体における経路のシグナル伝達応答のＮＲＧ１撹乱を測定する。細胞株および初代試料の結果は一致している。データは、異常なＨＥＲ２経路がＨＥＲ２非過剰発現患者に存在することを示す。ＨＥＲ２過剰発現細胞株およびＨＥＲ２非過剰発現患者の上位２０番目のパーセンタイルにおけるＨＥＲ２経路のシグナル伝達活性のＮＲＧ１撹乱は、より低いＣＡＳを有する健康な集団と明確に区別できる。
およそ２０％のＨＥＲ２非過剰発現がん患者は、ＨＥＲ２過剰発現患者の上位５０番目のパーセンタイル（点線の上）と一致するＨＥＲ２経路シグナル伝達活性のＮＲＧ１撹乱を有する。これらの結果から、帰無仮説は、健康な集団とＨＥＲ２非過剰発現集団との区別に関して退けられ、ＨＥＲ２過剰発現群の活性とＨＥＲ２非過剰発現群のシグナル伝達経路活性とのオーバーラップを確認することが示される。
図１７は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１受容体二量体による、ＣＥＬｘのＥＧＦで撹乱された経路のシグナル伝達活性に関するデータを提示する。これは、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１はＨＥＲ２により誘発される疾患に関与することが公知であるため示される。データから、ＥＧＦ撹乱された経路のシグナル伝達活性は、ＨＥＲ２過剰発現およびＨＥＲ２非過剰発現試料において類似していることが示される。データから、ＮＲＧ１で撹乱された経路のシグナル伝達活性で見出されたように、上位の四分位数のＨＥＲ２非過剰発現およびＨＥＲ２過剰発現試料のＣＥＬｘのＥＧＦで撹乱された経路のシグナル伝達活性における類似の上昇が示される。またデータから、ＨＥＲ２非過剰発現のＣＥＬｘのＥＧＦで撹乱された経路のシグナル伝達活性は、健康な集団と比較して上昇されることも示される。
以下の表１７は、ＣＥＬｘ試験に従ってＨＥＲ２により誘発される疾患を有すると決定された５人の患者について、ＨＥＲ２により誘発される疾患を有するＨＥＲ２非過剰発現がん患者の代表的なＮＲＧ１確認用薬剤（この確認用薬剤は治療薬物である）のデータを提示する。
表１７に記載のデータは、ＨＥＲ２経路のシグナル伝達における治療用阻害剤の応答を示す。各阻害剤を臨床的に関連する単一の濃度で使用して、各患者につき薬物応答を実証した。共役受容体チロシンキナーゼ阻害剤薬物（ＲＴＫｉ）であるネラチニブおよびアファチニブは、これらの患者の場合、ＮＲＧ１およびＥＧＦによって促進される活性の最も高いパーセンテージの減衰（ＮＲＧ１データのみ示す）を生じた。非共役型のＲＴＫｉ、ラパチニブ、およびモノクローナル抗体（ペルツズマブ）は、経路のシグナル伝達の有意な減衰を生じたが、共役型のＲＴＫｉの減衰より少なかった。意外なことに、ＨＥＲ２薬物は、ＨＥＲ２非過剰発現患者において、ＨＥＲ２過剰発現細胞株より高いパーセンテージのＨＥＲ２によって誘発される経路のシグナル伝達活性を阻害する。
実施例７の結果の考察
この実施例に記載される結果は、本明細書に記載される発明および方法の主要な態様を実証し、予想外の結果を提供する。ＨＥＲ２非過剰発現がん細胞試料は、ＨＥＲ２受容体レベルが健康な乳房細胞で見出されるレベルと同等に低く、ＨＥＲ２過剰発現がん患者のＨＥＲ２受容体レベルより有意に低いことが確認された。したがって、ＨＥＲ２非過剰発現がん細胞で測定された経路のシグナル伝達活性は、これらの対象群間のＨＥＲ２受容体レベルにおける差が原因とみなすことはできない。この実施例も、本方法は、特異的なＨＥＲ２／ＨＥＲ３およびＨＥＲ２／ＨＥＲ１経路活性を区別し定量することができることを確認した。さらに、実施例は、異常なＨＥＲ２シグナル伝達活性が、ＨＥＲ２非過剰発現がん患者に存在し、ＨＥＲ２非過剰発現がん患者の部分集団（１５％）が、ＨＥＲ２過剰発現がん患者に類似したＨＥＲ２経路のシグナル伝達活性を有するという仮説を確認した。この予想外の結果は、これらの方法の価値を実証する。別の予想外の結果は、ＨＥＲ２非過剰発現がん患者において、ＨＥＲ２過剰発現がん患者より高いパーセンテージのＨＥＲ２シグナル伝達経路活性を阻害するＨＥＲ２標的化薬物の能力であった。まとめて、この実施例で説明される結果から、本方法は、活性なＨＥＲ２−シグナル伝達ネットワークを有するＨＥＲ２非過剰発現患者を同定する、診断する、および処置することができることが確認される。この実施例は、全てのＨＥＲ２非過剰発現乳がん患者のおよそ１５％が、診断されておらずまた処置されていないＨＥＲ２によって誘発される乳がんを有することを示唆するため、これは有意な結果である。本発明は、この患者集団がＥｒｂＢシグナル伝達経路を標的化する治療剤での処置のために選択され得るように、この患者集団を同定することを可能にする。
（実施例８）
シグナル伝達経路活性の測定における新鮮なベース培地の影響
多くの細胞のスクリーニングアッセイは、細胞が試験される前とその間の短時間で細胞が置かれる簡易化した培地緩衝液を規定している。生存可能な初代患者細胞を用いた本発明は、連続的な測定の全試験時間にわたり、細胞集団は生存可能なままであり、個々の細胞型のその不均質性および細胞周期の異なる期を表す正常な細胞分布を保持するように生存可能な初代細胞試料を維持するのに使用されるベース培地を用いて実行される。ベース培地は、目的のシグナル伝達経路を撹乱することが公知の試薬を含有しない。本方法のさらなる態様は、撹乱剤または確認用薬剤との接触を開始させる７２時間以内に、ベース培地を新鮮なベース培地で置き換えることを含む。
図１８は、細胞試料のＭＡＰＫシグナル伝達経路活性に対する新鮮ではないベース培地使用の影響を実証するデータを提示する。撹乱前に新鮮ではないベース培地中で培養された後に細胞試料Ｃ５４がＥＧＦで撹乱される場合、ＣＡＳは、Ｃ５４がＥＧＦで撹乱されない場合より少ない。実際には、シグナル伝達経路活性は測定されない。これは、細胞試料Ｃ５４が、ＥＧＦとの接触の前に新鮮なベース培地中で培養される場合に測定されたＣＡＳとは極めて対照的である。新鮮なベース培地の実施例において、測定されたＣＡＳは、Ｃ５４試料において有意なＭＡＰＫシグナル伝達経路活性があることを示唆する。データから、細胞試料を撹乱剤または確認用薬剤と接触させる前に新鮮なベース培地中で細胞を培養することの重要性が強調される。

Claims (28)

  1. がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記ヒト対象のがん細胞は、非過剰発現非増幅ＥｒｂＢ２受容体を有し、前記方法は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与える標的化治療剤を前記対象に投与することを含み、前記対象は、
    前記対象から得られた生存可能な初代がん細胞の試料を調製して、ベース培地中で前記試料を培養するステップ；
    （１）前記対象から得られた生存可能な初代がん細胞の前記試料の第１の部分を撹乱剤と接触させ、（２）前記試料の第２の部分を撹乱剤および確認用薬剤と接触させるステップであって、前記撹乱剤は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に選択的に影響を与え、前記確認用薬剤は、同じＥｒｂＢシグナル伝達経路に対する前記撹乱剤の作用を選択的に阻害する、ステップ；
    前記試料の各部分において、前記生存可能な初代がん細胞の生理応答パラメータを連続的に測定するステップ；
    前記生理応答パラメータの連続的な測定の数学的分析によって測定量を決定して、前記試料の前記第１の部分と前記試料の前記第２の部分との値における差を同定するステップ；ならびに
    前記測定量を、ＥｒｂＢシグナル伝達経路活性の正常な参照インターバルから導出されたカットオフ値と比較するステップ
    を含む方法を使用して、処置のために選択されたものであり、
    前記測定量が前記カットオフ値より大きい場合、対象は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与える標的化治療剤での処置のために選択される、方法。
  2. 前記生理応答パラメータが、細胞接着または付着である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記試料を培養するのに使用される前記ベース培地が、それらを前記撹乱剤と接触させる１２時間前以前７２時間前以降に、新鮮なベース培地で置き換えられる、請求項１に記載の方法。
  4. 前記生理応答パラメータが、細胞代謝産物のレベルである、請求項１に記載の方法。
  5. 前記生理応答パラメータが、ミトコンドリアの機能に関する細胞の酵素のレベルである、請求項１に記載の方法。
  6. 前記対象が、ＥｒｂＢ２受容体非過剰発現非増幅乳がんを有する、請求項１に記載の方法。
  7. 前記撹乱剤が、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＨＢ−ＥＧＦ、アンフィレグリン、ベータセルリン、エピジェン、エピレグリン、ニューレグリン−１、ニューレグリン−２、ニューレグリン−３、ニューレグリン−４、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  8. （１）前記対象から得られた生存可能ながん細胞の前記試料の第１の部分をニューレグリンと接触させ、（２）前記試料の第２の部分をニューレグリンおよび確認用薬剤と接触させるステップ；および／または（３）前記試料の第３の部分を上皮増殖因子と接触させ、（４）前記試料の第４の部分を上皮増殖因子および確認用薬剤と接触させるステップ；ならびに
    前記生理応答パラメータの連続的な測定の数学的分析によって測定量を決定し、前記試料の前記第１の部分と前記試料の前記第２の部分との値における差および／または前記試料の前記第３の部分と前記試料の前記第４の部分との値における差を同定するステップ
    を含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記標的化治療剤が、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ラパチニブ、アファチニブ、ネラチニブ、ＡＤＸＳ−ＨＥＲ２、ＴＡＫ−２８５、ＭＭ−３０２、ＭＭ−１２１、ＭＭ−１１１、ＲＥＧＮ１４００、セパチニブ、ダコミチニブ、ポジオチニブ、ＡＳＬＡＮ００１、ＬＩＭ７１６、ＡＶ−２０３、デュリゴツズマブ、ルムレツズマブ、パニツムマブ、ＲＥＧＮ９５５、ＭＭ−１５１、セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  10. 前記標的化治療剤が、ＨＥＲ２の細胞外セグメントのドメインＩＩ；ＨＥＲ２の細胞外セグメントのドメインＩＶ；ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２の細胞質アデノシン三リン酸結合部位；ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２のアデノシン三リン酸結合部位におけるシステイン残基；およびそれらの組合せからなる群より選択される部位に結合する、請求項１に記載の方法。
  11. 前記対象が、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与えない治療剤でも処置される、請求項１に記載の方法。
  12. 前記対象が、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、膠芽腫、肝細胞癌、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、卵巣がん、子宮頸がん、膵臓がん、前立腺癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非ホジキンリンパ腫および甲状腺癌または頭頸部がんからなる群より選択される、ＥｒｂＢ非過剰発現非増幅陰性がんを有する、請求項１に記載の方法。
  13. 前記確認用薬剤が、２Ｃ４マウスモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
  14. ＥｒｂＢ２非過剰発現非増幅乳がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記方法は、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与えるラパチニブを前記対象に投与することを含み、前記対象は、
    前記対象から得られた生存可能な初代乳がん細胞の試料を調製して、ベース培地中で前記試料を培養するステップ；
    前記試料を培養するのに使用される前記ベース培地を、前記試料を撹乱剤と接触させる１２時間前以前７２時間前以降に、新鮮なベース培地で置き換えるステップ；
    （１）前記対象から得られた生存可能な初代乳がん細胞の前記試料の第１の部分を、撹乱剤としてのニューレグリンと接触させ、（２）前記試料の第２の部分をニューレグリンおよび確認用薬剤と接触させるステップであって、前記確認用薬剤は、ニューレグリンと同じＥｒｂＢシグナル伝達経路を選択的に阻害する、ステップ；および／または（３）前記試料の第３の部分を、撹乱剤としての上皮増殖因子と接触させ、（４）前記試料の第４の部分を上皮増殖因子および確認用薬剤と接触させるステップであって、前記確認用薬剤は、上皮増殖因子と同じＥｒｂＢシグナル伝達経路を選択的に阻害する、ステップ；
    前記撹乱剤と接触させた前記生存可能な初代乳がん細胞の細胞接着または付着を連続的に測定するステップ；
    生理応答パラメータの連続的な測定の数学的分析によって測定量を決定し、前記試料の前記第１の部分と前記試料の前記第２の部分との値における差および／または前記試料の前記第３の部分と前記試料の前記第４の部分との値における差を同定するステップ；
    前記測定量を、ＥｒｂＢ経路活性に関する正常な参照インターバルから導出されたカットオフ値と比較するステップ
    を含む方法を使用して、処置のために選択されたものであり、
    前記測定量が前記カットオフ値より大きい場合、対象は、ラパチニブでの処置のために選択される、方法。
  15. 前記対象が、ＥｒｂＢ２非過剰発現非増幅およびＥＧＦＲ非過剰発現非増幅乳がんを有する、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記対象が、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与えない治療剤でも処置される、請求項１４に記載の方法。
  17. エストロゲン受容体非過剰発現乳がんと診断されたヒト対象を処置する方法であって、前記方法は、エストロゲン関連のシグナル伝達経路に影響を与える標的化治療剤を前記対象に投与することを含み、前記対象は、
    前記対象から得られた生存可能な初代乳がん細胞の試料を調製して、ベース培地中で前記試料を培養するステップ；
    （１）前記対象から得られた生存可能な初代乳がん細胞の前記試料の第１の部分を、前記エストロゲン関連のシグナル伝達経路を上方調節または下方調節することが公知の撹乱剤と接触させ、（２）前記試料の第２の部分を、前記撹乱剤および同じエストロゲン関連のシグナル伝達経路活性を阻害することが公知の確認用薬剤と接触させるステップ；
    前記試料の各部分において、前記生存可能な初代乳がん細胞の生理応答パラメータを連続的に測定するステップ；
    前記生理応答パラメータの連続的な測定の数学的分析によって測定量を決定して、前記試料の前記第１の部分と前記試料の前記第２の部分との値における差を同定するステップ；ならびに
    前記測定量を、エストロゲン受容体経路活性に関する正常な参照インターバルから導出されたカットオフ値と比較するステップ
    を含む方法を使用して、処置のために選択されたものであり、
    前記測定量が前記カットオフ値より大きい場合、対象は、エストロゲンに関連するシグナル伝達経路に影響を与える標的化治療剤での処置のために選択される、方法。
  18. 前記試料を培養するのに使用される前記ベース培地が、それらを前記撹乱剤と接触させる１２時間前以前７２時間前以降に、新鮮なベース培地で置き換えられる、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記生理応答パラメータが、細胞接着または付着である、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記生理応答パラメータが、細胞代謝産物のレベルである、請求項１７に記載の方法。
  21. 前記生理応答パラメータが、ミトコンドリアの機能に関する細胞の酵素のレベルである、請求項１７に記載の方法。
  22. 前記撹乱剤が、エストラジオール、エストロン、ラロキシフェン、エストリオール、ゲニステイン、ＤＨＥＡ、アンドロステンジオン、アンドロステンジオール、プロゲステロン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、それらの硫酸化型、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
  23. 前記標的化治療剤が、フルベストラント、タモキシフェン、レトロゾール、エキセメスタン、アナストロゾール、パルボシクリブ、アベマシクリブ、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
  24. 前記標的化治療剤が、アロマターゼ酵素（ＣＹＰ１９Ａ）のシトクロムＰ４５０サブユニット、エストロゲン受容体の活性化機能１（ＡＦＰ−１）ドメイン、サイクリン依存性キナーゼ４（サイクリンＤ１）、サイクリン依存性キナーゼ６（サイクリンＤ３）、およびそれらの組合せからなる群より選択される部位に結合する、請求項１７に記載の方法。
  25. 前記対象が、エストロゲン受容体に関連するシグナル伝達経路に影響を与えない治療剤でも処置される、請求項１７に記載の方法。
  26. 前記対象が、化学療法、ＣＤＫ４／ＣＤＫ６阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤、およびそれらの組合せからなる群より選択される療法でも処置される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記対象が、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与える標的化治療剤で処置される、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記対象が、以前にエストロゲンに関連する標的化療法を受け、それに応答しなかったことがあり、ＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を与える標的化治療剤での処置が、エストロゲンに関連する標的化療法の機能を強化する、請求項２７に記載の方法。
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