CN102460124A - 使用数字全息成像对卵子或胚胎进行分析 - Google Patents

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Abstract

一种分析包含至少一个卵子或胚胎的样本的方法，该方法基于数字全息成像，该方法包括以下步骤：产生至少一个目标光束和至少一个参考光束，其中所述至少一个目标光束和至少一个参考光束彼此相干；将所述样本暴露到所述至少一个目标光束；将通过所述样本的所述至少一个目标光束叠加到所述至少一个参考光束，从而产生干涉图样；探测称作全息图的所述干涉图样；从所述干涉图样重构目标波阵面的相位和幅度信息；从所述相位和幅度信息构建至少一个卵子或胚胎的分析图像和确定至少一个卵子或胚胎质量表现参数。

Description

使用数字全息成像对卵子或胚胎进行分析
技术领域
本发明涉及一种分析包含至少一个卵子或胚胎的样本的方法。
背景技术
自从20世纪70年代末以来，已经实现了体外受精(IVF)，为了增加成功怀孕和健康婴儿的概率，更加精确地预测卵子或胚胎质量的需求从那开始已经增加。使用两个或三个胚胎的现代标准植入技术导致双胎妊娠的风险，这与先天条件的风险相关。此外，如今植入率接近40％。目前的技术通常依赖于基于在一些基本参数帮助下的经验的主观判断。卵子或胚胎通常通过相衬显微镜来目视检查，这样检查的质量强烈依赖于进行目视检查人的技能。目前可用的量化方法通常具有非常高的技术和环境要求或者仅提供通过相称图像的软件分析得到的初步数据。在人类胚胎情况下，通常在受精2天到5天后来研究胚胎。
在卵子或胚胎发育能力的预测中，所使用的方法不影响细胞是非常重要的。这就是不能够使用不同种类的染料和荧光标记的原因。涉及高功率光源的其他技术也被排除在外。所有卵子或胚胎中的绝大多数分类使用相衬显微镜或者相衬显微镜的变形来制作，例如，微分干涉差显微镜(DIC)。
当通过相衬显微镜研究卵子或胚胎时，进行目视检查的人几乎持续地手动设置焦平面以研究卵子或胚胎的不同部分，这是因为焦点深度(即在该深度范围内可看见清晰图像)比细胞深度要小。
在US 2008/0032325中公开了一种在活组织样本中计数细胞比如胚胎的方法。通过获得细胞团的第一和第二图像，在第二图像中使椭圆拟合细胞边界，通过其产生椭球模型细胞，从第一图像中减去模型细胞以获取减去后的图像，其后相同地减去每个细胞直到没有细胞留在减去后的图像中，从而对细胞进行计数。细胞数目对应于减法的数目。光学正交显微镜(OQM)、偏振干涉、数字全息、傅里叶相位显微镜，希尔伯特相位显微镜，定量相位显微镜或者衍射相位显微镜据说是获取第一图像的可行的方法，OQM是优选的方法。微分干涉差显微镜(DIC)，赫夫曼干涉差显微镜以及明场显微镜被公开作为获取第二图像的可行方法，DIC是优选的方法。在该技术中，第一成像方式，如OQM，和第二成像方式，如微分干涉差显微镜，都是所要求的。这样，需要两种显微镜方法。OQM显微镜包含马赫增德尔干涉仪和全视场成像光学装置。通过解释来自四个不同的相机的干涉图来产生相位图像，其中参考光穿过1/4波板以产生正交的P平面与S平面偏振的90度相移。偏振分光镜接着用以分开两个偏振方向的信号，所述两个信号然后在两个分开的相机上被探测到。另外两个相机也用以探测信号的共轭强度。在US 2008/0032325中使用的显微镜的镜头的功能是产生图像，即所研究目标的表示。
发明内容
本发明的一个目的是能够在不需要人的判断下分析和分类卵子或胚胎的质量，比如发育能力。判断的准确性强烈依赖于进行目视检查的人员的技能和经验。本发明的另一个目的是提供一种量化方法，相比于现有的方法，该方法能够以更少的光学要求、更低灵敏度、更少花费的设备完成。
根据第一方面，通过一种分析包含至少一个卵子或胚胎的样本的方法来实现以上目的和其他目的，该方法基于数字全息成像，该方法包括以下步骤：
a)产生至少一个目标光束和至少一个参考光束，其中所述至少一个目标光束和所述至少一个参考光束彼此相干；
b)将所述样本暴露到所述至少一个目标光束；
c)将通过所述样本的所述至少一个目标光束叠加到所述至少一个参考光束，从而产生干涉图样；
d)探测所述干涉图样，所述干涉图样称为全息图；
e)从所述干涉图样重构目标波阵面的相位和/或幅度信息；以及
f)从所述相位和/或幅度信息中构建至少一个卵子或胚胎的分析图像并确定至少一个卵子或胚胎质量表现参数。
根据以上方法确定的卵子或胚胎质量表现参数可用于评估卵子或胚胎质量。
本发明的方法在无需人的判读下使对诸如卵子或胚胎的发育能力的质量的分析和分类成为可能。判断的精确性强烈依赖于进行目视检查的人员的技能和经验，这点根据本发明的方法可以避免。本方法也可用作目视检查的补充。
通过根据本发明的方法，可以通过仅使用一种成像技术的相对便宜的设备获得关于卵子或胚胎的更先进的信息。特别地，本发明的方法能够利用比在OQM(包括四个相机)中包括的昂贵且复杂的设备更便宜的设备进行分析。同时，特别是相比于在OQM包括的设备，执行根据本发明的方法所需的设备是稳定的且对外部干扰不是特别敏感。此外，本发明的方法仅需用一个照相机来实现对卵子或胚胎的分析。
通过本发明的方法，可以确定若干个卵子或胚胎质量表现参数和基于这若干个参数对卵子或胚胎进行分类。
数字全息是一种非常方便的方法，它不需要标记和染色剂就能够对活细胞进行研究且能够对所研究的目标进行量化。数字全息使得不需要标记或染色目标就能进行研究成为可能，所述标记或染色目标浪费时间和财物。如此，数字全息使得能够研究活细胞和细胞的发育情况如细胞生长。数字全息至少和相衬显微术一样方便。
相衬显微术是一种目标的折射率变化和厚度变化引起图像的对比度增加的技术。在数字全息中，这些变化引起入射光的相位移，所述相位移可定量测量。这样就为测量图像的每个像素的光路长度提供可能性，因此提供了对卵子或胚胎进行分类的精确工具。
数字全息不包括图像形成光学器件，因为它仅记录参考光束和目标光束之间的干涉。基本上，用在数字全息显微镜中的透镜的主要目的不是产生研究目标的图像，相反，该透镜用以聚光。之后，通过由计算机执行的重构算法，获取所研究目标的图像。该算法利用所记录的干涉图样以在选定的观察平面或体积上重构复杂的光波场。该方法要求最小数量的光学器件并包括数字聚焦以及色差补偿，因为它可以被认为是数字成像系统。这就暗示了对于显微镜比如镜头的光学精确度不需要特别高的要求。
当使用数字全息时，没有必要设置焦平面。相反，搜集信息，之后通过重建算法可以在任何希望的观察平面或体积获取图像。
根据第二方面，根据第一方面的方法确定的卵子或胚胎质量表现参数用于评估卵子或胚胎的质量的用途。
根据第三方面，提供了一种基于数字全息成像来分析包含至少一个卵子或胚胎的样本的设备。该设备包括：
至少一个光源，所述至少一个光源被布置以产生至少一个目标光束和至少一个参考光束，其中所述至少一个目标光束和至少一个参考光束彼此相干；
用于将所述样本暴露到所述至少一个目标光束的装置；
用于将通过所述样本的所述至少一个目标光束叠加到所述至少一个参考光束上，从而产生干涉图样的装置；
传感器，其被布置以探测干涉图样；以及
处理单元，其被布置以从所述干涉图样重构目标波阵面的相位和幅度信息，以从所述相位和幅度信息构建至少一个卵子或胚胎的分析图像，和确定至少一个卵子或胚胎质量表现参数。
第一方面的特征和优点一般适用于第二和第三方面。
本发明的更多特征和优点将在下文中详细公开。
附图简述
图1是两个胚胎的概略图，其示出了成功受精的第一迹象。
图2是包围极体和单个胚胎细胞的透明带的概略图。
图3是包括若干个细胞的两个胚胎的概略图。
图4是根据本发明的一个实施方式的设备的示意图。
本发明的详细描述
本发明的更多细节将在下文描述到。如其中所使用的，卵子或胚胎质量表现参数指提供有关至少一个卵子或胚胎的质量信息的任何参数。特别地，卵子或胚胎质量表现参数提供与用于受精治疗的至少一个卵子或胚胎有关的至少一个卵子或胚胎的质量信息。卵子或胚胎质量表现参数可选自但不限于以下各项：所述至少一个卵子或胚胎的透明带的径向厚度；所述至少一个卵子或胚胎的透明带的光学密度；所述至少一个卵子或所述至少一个胚胎内的至少一个细胞的干质量、形态和区域；至少一个极体的干质量、形态和区域；一个卵子相比于至少一个其他卵子的干质量、形态和区域；所述至少一个胚胎内的至少一个细胞相比于至少一个其他细胞的干质量、形态和区域；确定样本中卵子的数目；确定所述至少一个胚胎内的细胞的数目；确定所述至少一个卵子或胚胎内的原核的数目；确定所述至少一个胚胎内的至少一个限定空间的总的干质量；所述至少一个胚胎内的至少一个限定空间相比于至少一个其他空间的总的干质量；碎裂水平；同步程度；至少一个卵子或胚胎的体积或至少一个胚胎内的至少一个细胞的体积；至少一个卵子或胚胎内的至少一个限定空间的折射率；以及这些的组合。
根据本发明的方法的一个实施方式，确定两个或更多卵子或胚胎质量表现参数，这些参数被组合为表示卵子或胚胎的质量的一个或几个参数。
根据本发明的方法的一个实施方式，每个确定的卵子或胚胎质量表现参数可由取决于卵子或胚胎质量的有关该具体参数的值表示，例如每个确定的卵子或胚胎质量表现参数可由例如1-10范围的值表示。表示确定的卵子或胚胎质量表现参数的值可被组合成表示卵子或胚胎的质量的一个具体值。优选地，当组合这些参数时，使用表示每个卵子或胚胎质量表现参数重要性的因子。该组合值将提供关于卵子或胚胎质量的非常直接的信息以及按优先顺序放置所分析的卵子或胚胎。
根据本发明的方法的一个实施方式，通过将来自相干光源的光束比如通过分光镜分为两个光束，产生彼此相干的至少一个目标光束和至少一个参考光束。来自相干光源的光束可以是激光束。激光束可来自各种激光源，例如He-Ne激光器或二极管激光器。优选使用二极管激光器。
目标光束和参考光束彼此相干，这就暗示了它们有相同的频率且随着时间的推移表现恒定的相位。
目标光束通过至少一个卵子或胚胎。参考光束则不受至少一个卵子或胚胎的影响，因为参考光束例如通过分光镜、镜子或纤维光学器件被指引到与目标光束不同的另一路径上。
目标光束在通过包含至少一个卵子或胚胎的样本前有已知的波阵面。当目标光束通过至少一个卵子或胚胎时，卵子或胚胎基本不吸收任何光，但穿过卵子或胚胎的光相比较于穿过周围介质的光将经历光学路径的长度差异。从卵子或胚胎出现的波阵面，即目标波阵面将这样被相移。自然地，参考光束也有已知的波阵面。光学路径长度被定义为物理/几何厚度与折射率的乘积。
根据本发明的方法的一个实施方式，例如通过另一分光镜将两个光束聚在一起，来实现通过包含至少一个卵子或胚胎的样本的至少一个目标光束与至少一个参考光束的叠加。叠加引起干涉图样，干涉图样例如包括有关被至少一个卵子或胚胎影响的目标波阵面的信息。
根据本发明的方法的一个实施方式，干涉图样通过数字传感器例如CCD或CMOS被探测到。所探测到的干涉图样称为全息图。
为了叠加通过包含至少一个卵子或胚胎的样本的至少一个目标光束和至少一个参考光束，从而产生干涉图样并探测干涉图样，例如可以使用傅里叶方案或菲涅尔方案。优选使用菲涅尔方案。傅里叶方案与菲涅尔方案之间的差异被描述为光学配置的差异，这意味着要满足某些条件，所述条件使近似(例如菲涅尔近似)可应用于重构算法。该近似简化了图像重构的过程。在菲涅尔方案中，条件是，相比于目标的尺寸和传感器的尺寸，目标和传感器之间的距离很大。通过使用显微镜物镜来实现这点，所述显微镜物镜收集来自目标的散射光并将其以接近平行光束引向传感器。这就产生了远离传感器的虚拟目标。
从所探测到的干涉图样的相位和幅度信息，重构目标波阵面。该重构通过任何常见的数字重构过程比如傅里叶变换重构或卷积重构可以实现。幅度信息可用于设置所感兴趣的焦平面。重构信息例如可用以获取所研究的至少一个卵子或胚胎的二维或三维的表示的图像。
所获取的图像还用于由计算机执行的图像处理，以确定所研究目标的有用信息，比如关于所研究的卵子或胚胎质量的参数。
进一步的，若干个所获得的图像也可用于图像处理，以便确定关于所研究目标的额外的有用信息，比如关于所研究的卵子或胚胎质量的参数。
这种图像处理涉及分割算法，其中定位预定的形状。这些所定位的预定形状进一步被分析，比如关于其尺寸(面积或体积)、干质量、数目等。可能用到的一种分割算法是分水岭分割。
作为产生目标光束和参考光束的替代，可使用同轴数字全息。当研究本说明书时，如何修改本发明的方法以使用同轴数字全息对本领域技术人员来说很明显。
卵子(卵母细胞、卵细胞)通常由一个单细胞组成。成熟的人体卵母细胞将近100-120μm，使其成为人体中最大的细胞之一。卵母细胞基本上是圆的。正如本文所使用的，胚胎是受精的卵母细胞。在受精后的前几天，强烈表明该胚胎的质量一些事件发生。该卵细胞包括一个单原核，受精后胚胎包含两个在单细胞胚胎内可见为较小的圆形状的原核，如图1所示。单细胞胚胎称为受精卵。受精的第一个可视阶段为第二个原核的出现。当这出现时，胚胎发生第一次分裂，产生2个细胞。在设想发生同步细胞分裂的情况下，细胞经过进一步的有丝分裂(细胞分裂)形成4、8和16个细胞的阶段等。包含不止一个细胞的胚胎被称为桑葚胚。经过若干细胞分裂后，具有包围中央的液体填充腔(称为囊胚腔)的若干细胞的球形层的囊胚形成。囊胚的生长期间，即囊胚腔体积增大的期间是重要的。囊胚变换为具有内细胞团的胚泡，称为成胚细胞，细胞的外层称为滋养层，该滋养层后来形成胎盘以及位于滋养层内的囊胚腔。在内细胞团中的细胞的质量和密度很重要。在外层的滋养层的尺寸(即面积或体积)也很重要。在人体胚胎的情况中，囊胚在受精后5天左后形成。
胚细胞、滋养层和囊胚腔之间的比例提供了关于在囊胚阶段的胚胎质量的信息。因此，为了评估胚胎质量，这三个区域，即胚细胞、滋养层，囊胚腔可相互比较。比较这三个区域的干质量、面积以及光学密度很有价值。同时，总的干质量、面积和光学密度可给出关于胚胎的质量的信息。
本文用到的干质量指的是所研究的目标或者目标的一部分的非水细胞物质，比如蛋白质。光学路径长度与干质量直接相关。当基于水的液体被用作包围样本中的目标的介质时，光学路径长度是蛋白质含量的直接测量，因为细胞中的水对应于介质。
根据本发明的方法的一个实施方式，所述至少一个卵子或胚胎为至少一个卵子。
根据本发明的方法的一个实施方式，所述至少一个卵子或胚胎为至少一个胚胎。
根据本发明的方法的一个实施方式，所述至少一个胚胎包含至少一个细胞。
根据本发明的方法的一个实施方式，所述至少一个卵子或胚胎质量表现参数包括所述至少一个卵子或所述至少一个胚胎内的至少一个细胞的干质量、形态或面积。
根据本发明的方法的一个实施方式，所述至少一个卵子或胚胎是封装不止一个细胞的至少一个胚胎，通过确定所述至少一个胚胎内的至少一个限定空间的总的干质量来确定胚胎质量表现参数。
根据本发明的方法的又一个实施方式，确定所述至少一个胚胎内的不止一个限定空间的总的干质量，并将一个空间的总的干质量与至少一个其他空间进行比较。
卵子或胚胎被晕状透明带包围，在图2中可见。透明带为包围从早期卵细胞到早期胚胎的哺乳动物的多层糖蛋白覆层。在体内，透明带提供了防止多精受精即多个精子细胞受精以及免疫反应(由于精子可引起与宿主的免疫系统不兼容)的重要成分。在体外，透明带在保护卵子或胚胎免于植入的机械应力方面提供同等重要的作用。因此透明带的径向厚度是卵子或胚胎质量的重要特征。透明带的径向厚度指的是从透明带的内边界到外边界的径向距离。通过根据本申请的方法来研究透明带，可以获取卵子或胚胎的整个圆周的透明带的径向厚度的测量结果。透明带的径向厚度可表示为平均、最大或最小径向厚度以及可呈现为表示沿着卵子或胚胎的圆周的透明带的径向厚度图。因此，可获取透明带的径向厚度的变化。也可观察到透明带的径向厚度的逐渐变薄。
透明带的光学密度是卵子或胚胎质量的重要特征。透明带的光学密度也可以根据本发明所述方法来获取。与径向厚度一样，透明带的光学密度也可表示为平均、最大或最小光学密度以及呈现为表示沿着卵子或胚胎圆周的透明带的光学密度图。透明带的不同层的光学密度也是很重要的。同时，可通过本发明所述方法研究透明带的可能的裂缝。
通过研究透明带的生长情况也可获取胚胎的质量。在精子渗透后，皮质颗粒、卵子内的特殊细胞器，将其内容物释放到卵周隙，所述卵周隙是卵子或透明带之间的空隙(即极体位于其中)，这一事件称为皮质反应。皮质颗粒渗透液改变透明带的特性，这称为透明带反应，如此阻止多精受精渗透。透明带结构的变化，其导致透明带在受精过程中固化，伴随着透明带蛋白质的次要结构的变化(β结构含量的显著增加)。因此，受精后透明带的现有结构被重新排列，通过研究受精之前、受精期间和受精之后的卵母细胞/胚胎，可确定胚胎的质量。
根据本发明的方法的一个实施方式，所述至少一个卵子或胚胎质量表现参数包含从以下组中选出来的至少一个参数，所述组由至少一个卵子或胚胎的透明带的径向厚度和至少一个卵子或胚胎的透明带的光学密度构成。
极体是具有在减数分裂过程中在不对称的有丝分裂后形成的小量细胞质的细胞。极体随着时间的推移而退化和破碎。一个极体在受精前的卵细胞成熟过程中被挤出。第二个极体在受精后被挤出。发育的第一迹象是两个极体的出现。在胚胎的单细胞状态，第二极体的挤出通常被看作可能成功受精的早期迹象。极体的尺寸(即面积或体积)与胚胎质量有关，较大的极体与较低的受精机率和质量较差的胚胎相关。第一极体的碎裂与胚胎质量有关。通过测量极体的尺寸(即面积或体积)和数量(取决于时间点)，可以提高受精发生的几率和形成高质量的胚胎。
根据本发明的方法的一个实施方式，所述至少一个卵子或胚胎质量表现参数包含至少一个极体的干质量、形态或者面积。
原核是配子即结合受精前的精子和卵子的原子核。成功受精的首要迹象是两个原核的出现。应该出现不超过两个原核，否则胚胎就会是低质量的，应该优选被舍弃。可通过数结合前受精后的原核数量来确定胚胎的质量。而且，核仁的前体位于原核内(图1)，产生有关胚胎质量的信息。核仁前体的排列、原核的尺寸(即面积或体积)、核仁前体以及原核的位置相互关系与胚胎质量有关。
根据本发明的方法的一个实施方式，所述至少一个卵子或胚胎质量表现参数通过计数所述至少一个卵子或胚胎内的原核数目来确定。
胚胎细胞经过若干次减数分裂(细胞分裂)形成2、4、8和16个细胞阶段等。细胞数量和分裂球(胚胎中的原始细胞)的有丝分裂的同步是决定哪个胚胎最适合植入的另一个基本和重要的参数。细胞应该基本上在同一阶段，即细胞分裂应该同时在所有细胞中发生，虽然在实践中经常预期一些变化。同步涉及细胞分裂同时发生和细胞同时分裂就被认为是同步。通过根据本发明所述的方法计数胚胎内的细胞数目，可确定同步程度。在植入之前的几个时间点计数细胞数目以确保细胞分裂井然有序。
根据本发明的方法的一个实施方式，所述至少一个卵子或胚胎质量表现参数包含碎裂水平。
碎裂意味着细胞解体成较小的部分，这在图3中可见。卵子或胚胎中出现碎裂是该卵子或胚胎低质量的迹象，虽然这里经常出现一些程度的碎裂。增加的碎裂经常联系到在观察时间点胚胎内的细胞较少，这可能标志缺乏适当的有丝分裂。在研究卵子的情况中，增加的碎裂可联系到在观察时间点样本内的几个卵子或卵子碎片。通过根据本发明所述的方法计数样本中的卵子数目或胚胎内的细胞数目，可确定碎裂程度。碎裂可归因于基因、代谢缺陷或凋亡(死亡)的细胞或其他不明原因。
利用分割算法通过图像处理可确定卵子或胚胎的数目，其中定位预定的形状，特定类型的形状的数目对应于卵子或胚胎的数目。优选地，使用分水岭分割。
根据本发明的方法的一个实施方式，通过计数样本内的卵子的数目，来确定卵子质量表现参数；通过计数至少一个胚胎内的细胞的数目，来确定胚胎质量表现参数。
根据本发明的方法的一个实施方式，所述至少一个卵子或胚胎质量表现参数包含同步程度。
直到早期胚胎发育，总细胞质体积(不包含细胞核的细胞或分裂球的体积)不变，因此每个细胞分裂产生先前一半尺寸的细胞。直到16细胞阶段，这被证明是正确的。通过测量每个细胞的细胞面积或细胞体积并相互比较它们，能够识别具有不同步的细胞周期的胚胎，以及卵子或胚胎的碎裂。
在每个细胞阶段，在高质量胚胎内每个细胞的干质量是一样的。这样，通过比较每个细胞的干质量和胚胎的其他细胞的干质量可提供胚胎的质量信息。
根据本发明的方法的一个实施方式，所述样本包括不止一个卵子，通过比较一个卵子和至少一个其他卵子的干质量、形态或面积可确定卵子质量表现参数；或者所述至少一个胚胎封装了不止一个细胞，通过比较所述至少一个胚胎内的一个细胞和至少一个其他细胞的干质量、形态或面积可确定胚胎质量表现参数。
为了增加在至少一个卵子或胚胎的测量中所收集到的信息，可用到至少两个波长。折射率取决于波长。因此，通过使用两个波长，可以按每个像素测量物理/几何厚度和折射率，不仅是它们的乘积。这意味着可测量目标的准确厚度。这样，不仅可确定细胞面积，而且可确定细胞体积，例如胚胎内的卵子或细胞的体积，或者胚胎的体积。
同样，细胞的不同部分具有不同的折射率。例如，细胞核通常具有与细胞体不同的折射率，因此，通过使用至少两个波长，能够在数字全息图像中分别标记和测量细胞核。
通过使用至少两个不同的激光器或者其他光源，可以获得所述至少两个波长。
利用至少两个波长有助于与本发明方法相关的计算，因为可使用要求不高的算法。当收集针对两个不同波长的目标的干涉图样时，图样之间的差异可被解释为具有合成波长(频差波长)的干涉图样，所述合成波长长于照亮样本的波长。用这种技术，以2pi为模的光学路径长度的信息可以延伸比入射光束的波长长一倍，而没有相位模糊。这在具有较大的相位移的较大目标诸如卵子或胚胎的情形中特别有意思。此外，利用至少两个波长产生了具有较少噪声的图像。
根据本发明的方法的一个实施方式，使用了两个或更多的波长，对于每一个所使用的波长执行所述步骤a)到e)，构建所述至少一个卵子或胚胎的分析图像，所述至少一个卵子或胚胎质量表现参数通过利用所述两个或更多波长重构的相位和幅度信息来确定。
根据本发明的方法的一个实施方式，通过两个或更多不同的激光器或其他光源获得两个或更多波长。
当使用两个或更多波长时，基于通过使用该两个或更多波长收集到的信息来确定所述至少一个卵子或胚胎质量表现参数。同时，基于通过使用该两个或更多波长收集到的信息来构建所述至少一个卵子或胚胎分析图像。
在胚胎早期分裂过程中，在每个细胞中可能有比预期的多或少的单核。这种核数目中的不规则偏差被认为产生低质量的卵子或胚胎。核数目可以从根据本发明的方法获得的标准的卵子或胚胎分析图像确定，但是当使用至少两个不同波长时，可以更容易地确定，因为可以区分细胞核和细胞周围部分的不同折射率。
虽然通过利用至少两个波长可确定细胞比如卵子或胚胎的体积，但是其不可能获得细胞或胚胎的真实三维形态，因为其只知道每个像素中的总的物理厚度。其不知道在特定像素中的总的物理厚度是否是一个或几个物理厚度的总和，即在构成总的物理厚度的两个或更多距离之间是否存在某些未被占用的空间。基于与所研究的目标即细胞、卵子或胚胎的正常形态相关的假设，无论如何可以获得细胞或胚胎的三维图像。如果细胞或卵子位于平面上，将使这些假设更容易。然而，基于通过利用至少两个波长获得的信息来获得真实的三维图像是不可能的。
根据本发明的方法的一个实施方式，所述至少一个卵子或胚胎质量表现参数包含所述至少一个卵子或胚胎的体积或所述至少一个胚胎内的至少一个细胞的体积。
根据本发明的方法的一个实施方式，所述至少一个卵子或胚胎质量表现参数包含所述至少一个卵子或胚胎内的至少一个限定空间的折射率。
增加所收集的信息的另外方法是从不同角度拍摄几个图像。如果卵子或胚胎以不变的旋转速度旋转且以特定的时间间隔拍摄图像，该图像可用于胚胎的层析重构。可替代地，卵子或胚胎每次旋转特定的角度，每次旋转后拍摄图像。目标绕着不与目标光束平行的轴旋转。优选地，目标绕着垂直于目标光束的轴旋转。卵子或胚胎的旋转使得卵子或胚胎的真实的三维重构成为可能。
根据本发明的方法的一个实施方式，旋转包含至少一个卵子或胚胎的样本以及从不同角度拍摄卵子或胚胎的分析图像，用于产生真实的三维重构。
根据本发明的方法的一个实施方式，通过层析算法组合从不同角度拍摄的卵子或胚胎的分析图像，用于产生真实的三维重构。
当旋转卵子或胚胎时，可以获得基本球形的卵子或胚胎整个周围的透明带的径向厚度和光学密度，而不仅是沿着卵子或胚胎的二维投影的圆周的透明带的径向厚度和光学密度。
可机械地，例如通过支持卵子或胚胎的微量吸管，或通过光学镊子或微流体装置旋转卵子或胚胎。
所述两个方法，即利用至少两个波长或从不同角度拍摄图像，也可结合使用以最大化所收集到的信息。
上面提到的卵子或胚胎质量表现参数依赖于在预定的时间点获取的数字全息图像。在正确的培养条件下，通过非侵入性的定时成像可研究整个发育过程。例如，可以固定的时间间隔比如一小时、一天来获取图像，所获取的图像放在一起成为展示所分析的卵子或胚胎随着时间的发育过程的电影。用本发明的方法也可实现图像的连续获取。这样，可更进一步确定卵子或胚胎的质量。如果多核早期出现或者受精卵的卵裂早期出现是有利的。通过在不同时间点或连续地研究胚胎可以确定出现多核和受精卵卵裂的时间点。
通过在不同时间点或连续获取图像，可研究卵子或胚胎的发育情况。例如，研究卵子的可能变化将很有意义，比如当受精发生时，透明带的变化。
根据本发明的方法的一个实施方式，在不同时间点或连续地重复步骤b)到d)，以根据步骤e)重构相位和幅度信息和根据步骤f)构建在不同时间点或连续地获取的卵子或胚胎的分析图像。
根据本方法的一个实施方式，比较在一个时间点获取的卵子或胚胎分析图像和在更早时间点获取的卵子或胚胎分析图像。这样做是为了探测变化。例如，在不同时间获取的分析图像中可以确定和比较细胞的数目和尺寸。假若探测到变化，则存储探测到该变化的时间点。此外，可存储在探测到该变化的时间点获取的分析图像。而且，可基于至少一个卵子或胚胎质量表现参数的比较来比较分析图像。
在一个实施方式中，在保育器内执行至少步骤a)到d)。用这种方法，所述至少一个卵子或胚胎在其所培养的环境中可被方便地研究。而且，这样简化了对所述至少一个卵子或胚胎随着时间的研究，因为不必在每次分析时将所述至少一个卵子或胚胎从保育器里面取出来。
可选地，所述方法还包括将干涉图样从保育器内传输到保育器外的处理单元上。优选地，所述传输包括无线传输干涉图样。用这种方法，处理单元不必位于保育器内。例如，处理单元可位于远程服务器上。
现在将参照图4描述根据本发明的实施方式的设备。图4显示了用于分析样本10的设备100的示意图。设备100包括至少一个光源300、传感器500、分光镜7a和7b、反射表面9a和9b、和处理单元13。分光镜7a和7b与反射表面9a和9b一起充当用于将样本暴露到至少一个目标光束21的装置和将所述至少一个目标光束21叠加到至少一个参考光束23的装置。
光源300被布置以产生相干光的至少一个光束19。相干光的光束19可以是例如源自各种激光源的激光束，比如发射635nm波长的光的二极管激光器。这里，仅显示了一个光源。然而，一般而言，设备100可包含几个可同时使用的光源300。优选地，如果使用几个光源300，这些光源产生不同波长的光。这是有利的，因为样本10对不同波长的光有不同的反应。因此，通过利用具有不同波长的多个光源300，将获得更多有关样本的信息。
源自光源300的相干光光束19被引向分光镜7a。分光镜7a将所述至少一个相干光光束19分为至少一个目标光束21和至少一个参考光束23。用这种构建方法，所述至少一个目标光束21和至少一个参考光束23彼此相干，暗示着它们有相同的频率和随着时间的推移显示不变的相位关系。如果存在超过一个的光源300，分光镜7a可将源自光源300的每个光束19分为彼此相干的目标光束21和参考光束23。
当使用设备100时，包含至少一个卵子或胚胎11的样本10被布置在至少一个目标光束21的光路中。例如，反射表面9a可用以重定向所述至少一个目标光束21如此以使样本10暴露到至少一个目标光束21。由于目标光束21向样本10传播，目标光束21将通过样本10，尤其是穿过至少一个卵子或胚胎11。由于目标光束21通过样本10，由于折射率的差异，它将比诸如不通过所述样本的参考光束23的光束传播更长的光学路径长度。这将相应地导致所述目标光束21和参考光束23之间的相位移。光学路径长度被定义为物理/几何厚度与折射率的乘积。
反射表面9b被布置为反射从而重定向至少一个参考光束23。特别地，反射表面9a和9b被布置使得至少一个目标光束21和至少一个参考光束23被引向用于叠加的装置，在这里为分光镜7b的形式。分光镜7b叠加至少一个目标光束21和至少一个参考光束23并将所叠加的光束25引向传感器500。
传感器500被布置为探测由目标光束21和参考光束23引起的干涉图样。由于目标光束21和参考光束23彼此相干，它们将在传感器500产生干涉图样。特别地，由于所述至少一个目标光束21穿过样本10，目标光束21和参考光束23传播不同的光学路径长度，因此干涉图样指示目标光束21和参考光束23之间的相位移。传感器500可以是例如数字传感器，诸如CCD(电荷耦合器件)或CMOS(互补金属氧化物半导体)图像传感器。
传感器500还能可操作地连接到处理单元13，处理单元13可包括用于实现任何常见的重构过程的软件或硬件。重构过程可以从传感器500探测到的干涉图样重构相位和幅度信息。重构信息可以例如用以获取所研究的至少一个卵子或胚胎11的至少一个分析图像。该信息还可以例如用以确定所述至少一个卵子或胚胎11的形状和光学密度。特别地，处理单元13被布置为从所述相位和/或幅度信息确定至少一个卵子或胚胎质量表现参数。换句话说，处理单元13可被布置以执行根据本发明的实施方式的方法的任何数据处理步骤。
而且，设备100可包括存储介质或存储器(未示出)。存储介质或存储器能够可操作地连接到处理单元13。特别地，存储介质或存储器可被布置以存储分析图像和关于在分析图像中探测到变化的时间点的时间数据。
设备100可适于在保育器15内操作。通过这样的布置，为了分析，样本10可不需要从培养它的保育器中取出来。如图4显示的，光源300、传感器500、光学组件比如分光镜7a和7b以及反射表面9a和9b都包括在保育器15内。处理单元13可置于保育器15内或者保育器15外。如果处理单元置于保育器15外，优选处理单元可与传感器500无线通信。例如，设备可包含发射机(未被显示)，该发射机被布置以发射关于来自传感器500的干涉图样的信息到可操作地连接到处理单元13的接收机。发射机可形成被布置为发射信号并从处理单元13接收信号的收发机的一部分。可替代地，设备100可包括保育器15。在这种情况下，保育器15优选与设备100一体地形成。这样的布置提供了非常紧凑和灵活的方案。例如，包括一体形成的保育器的设备100可放置在工作台上或根据需要可方便地移到另一位置。有利地，通过使保育器15和设备100一体地形成，并不是设备中的所有组件都必须被布置到保育器内。例如，诸如分光镜7a和7b及反射表面9a和9b的一些光学组件，其对保育器内的条件比较敏感，可被布置到保育器的外部。在一个实施方式中，仅固定样本10的样本固定器位于保育器15内。
设备100可还包括控制器(未被显示)，所述控制器用于控制保育器15内的湿度、温度和二氧化碳百分比中的至少一个。通过这种方法，可获得用于培养至少一个卵子或胚胎的最理想条件。培养细胞需要某些严格规定的参数。首先，细胞培养介质需要将pH值保持在7.4。由于细胞培养介质最常用碳酸盐缓冲，这可通过提供5％的二氧化碳到空气中来获取，尽管可用有机缓冲剂比如HEPES替代。为了阻碍介质的蒸发，空气应该是水饱和的。例如，湿度为大约90-95％或以上。培养细胞在37摄氏度更适宜生长，尽管这依赖于细胞物种。例如哺乳动物细胞更适合37摄氏度，昆虫细胞更适合20摄氏度，而鸟类细胞更适合40-42摄氏度。
而且，不同的策略可用于设备100，特别是设备100的光学组件，比如分光镜7a和7b和反射表面9a和9b，以应对保育器15内的条件。根据一个策略，设备100被布置在保育器15内，同时保育器内的温度和室内温度基本相同。接着，以较低的速率升高保育器内的温度。通过这种方法，将避免在设备100的光学组件发生凝结，因为在光学组件和保育器15内的空气之间没有温差。根据另外一个策略，光学组件比如分光镜7a和7b及反射表面9a和9b可被布置和/或处理以应对保育器15内的条件。特别地，光学组件可被处理以避免凝结。通过这种方法，当保育器15内的温度和室内温度不是基本相同时，设备100可被布置到保育器15内。结果，可避免以上缓慢升高温度的程序。
如技术人员容易理解的，参照图4所描述的实施方式仅仅是该套装备的说明和示意性的例子，其将落在所附权利要求的范围内。许多变化和修正是可能的。例如，关于将样本暴露到至少一个目标光束及将至少一个目标光束与至少一个参考光束叠加的特定的几何和光学装备，将有很多可能的变化。
附图的详细描述
图1中，两个胚胎(1)显示了成功受精的第一迹象，因为超过一个原核(3)在单个胚胎细胞(2)可见。左边的胚胎有两个原核(3)，这是正常的，因此被认为具有高质量。然而，右边的一个显示了三个原核(3)，因此被认为具有低质量。可看到核仁前体为原核内的微小的点。
图2中，透明带(5)围绕胚胎(1)的极体(4)和单个胚胎细胞(2)。
图3中，可见到包含几个细胞(6)的两个胚胎(1)。上面的胚胎(1)是具有8个细胞(6)的桑椹胚。上面的胚胎(1)包含具有实质上相同的大小的细胞(6)，因此被认为具有高质量。下面的胚胎(1)发生了严重的碎裂(具有不同大小的几个细胞和细胞碎片(6))，因而被认为具有低质量。图3中的胚胎的透明带(5)弱于受精卵。

Claims (27)

1.一种分析包含至少一个卵子或胚胎的样本的方法，所述方法基于数字全息成像，所述方法包括以下步骤：
a)产生至少一个目标光束和至少一个参考光束，其中所述至少一个目标光束和所述至少一个参考光束彼此相干；
b)将所述样本暴露到所述至少一个目标光束；
c)将通过所述样本的所述至少一个目标光束与所述至少一个参考光束叠加，从而产生干涉图样；
d)探测称作全息图的所述干涉图样；
e)根据所述干涉图样来重构目标波阵面的相位和/或幅度信息；以及
f)根据所述相位和/或幅度信息来构建至少一个卵子或胚胎分析图像和确定至少一个卵子或胚胎质量表现参数。
2.根据权利要求1所述的方法，其中至少所述步骤a)到d)是在保育器内执行的。
3.根据权利要求2所述的方法，还包括将所述干涉图样从所述保育器内传输到所述保育器外的处理单元。
4.根据前述任何一个权利要求所述的方法，其中所述至少一个卵子或胚胎质量表现参数包含从由至少一个卵子或胚胎的透明带的径向厚度和至少一个卵子或胚胎的透明带的光学密度构成的组中选出来的至少一个参数。
5.根据前述任何一个权利要求所述的方法，其中所述至少一个卵子或胚胎质量表现参数包含所述至少一个卵子的或所述至少一个胚胎内的至少一个细胞的干质量、形态或者面积。
6.根据前述任何一个权利要求所述的方法，其中所述至少一个卵子或胚胎质量表现参数包含至少一个极体的干质量、形态或者面积。
7.根据前述任何一个权利要求所述的方法，其中所述样本包含不止一个卵子，且卵子质量表现参数通过比较一个卵子和至少一个其他卵子的干质量、形态或面积来确定；或者所述至少一个胚胎封装不止一个细胞，且胚胎质量表现参数通过比较所述至少一个胚胎内的一个细胞和至少一个其他细胞的干质量、形态或面积来确定。
8.根据前述任何一个权利要求所述的方法，其中卵子质量表现参数通过计数所述样本中的卵子数目来确定；或者胚胎质量表现参数通过计数所述至少一个胚胎内的细胞数目来确定。
9.根据前述任何一个权利要求所述的方法，其中所述至少一个卵子或胚胎质量表现参数通过计数所述至少一个卵子或胚胎内的原核数目来确定。
10.根据前述任何一个权利要求所述的方法，其中所述至少一个卵子或胚胎是封装不止一个细胞的至少一个胚胎，且胚胎质量表现参数通过确定所述至少一个胚胎内的至少一个限定空间的总的干质量来确定。
11.根据权利要求10所述的方法，其中确定所述至少一个胚胎内的不止一个限定空间的总的干质量，并将一个空间的总的干质量与至少一个其他空间的总的干质量进行比较。
12.根据前述任何一个权利要求所述的方法，其中所述至少一个卵子或胚胎质量表现参数包含碎裂水平。
13.根据前述任何一个权利要求所述的方法，其中所述至少一个卵子或胚胎质量表现参数包含同步程度。
14.根据前述任何一个权利要求所述的方法，其中使用两个或更多波长，对于每一个所使用的波长执行所述步骤a)到e)，并构建所述至少一个卵子或胚胎分析图像，所述至少一个卵子或胚胎质量表现参数根据利用所述两个或更多波长重构的相位和/或幅度信息确定。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述两个或更多波长通过两个或多个不同的激光器或其他光源获得。
16.根据权利要求14和15中的任何一个所述的方法，其中所述至少一个卵子或胚胎质量表现参数包含所述至少一个卵子或胚胎的体积、或者所述至少一个胚胎内的至少一个细胞的体积。
17.根据权利要求14和15中的任何一个所述的方法，其中所述至少一个卵子或胚胎质量表现参数包含所述至少一个卵子或胚胎内的至少一个限定空间的折射率。
18.根据前述任何一个权利要求所述的方法，其中旋转包含所述至少一个卵子或胚胎的所述样本，并从不同角度获取卵子或胚胎的分析图像以建立真实的三维重构。
19.根据权利要求18所述的方法，其中从不同角度获取的卵子或胚胎的分析图像被通过层析算法进行组合以建立真实的三维重构。
20.根据前述任何一个权利要求所述的方法，其中在不同的时间点或连续地重复步骤b)到d)以根据步骤e)重构相位和/或幅度信息，并根据步骤f)构建在所述时间点或连续地获取的卵子或胚胎分析图像。
21.根据权利要求20所述的方法，还包括以下步骤：
将在所述时间点中的一个时间点或连续地获取的卵子或胚胎分析图像与在更早时间点获取的卵子或胚胎分析图像进行比较；基于所述比较步骤的结果来探测是否有变化发生；而且，如果探测到变化，则存储探测到所述变化的时间点。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述比较包括比较至少一个卵子或胚胎质量表现参数。
23.根据前述任何一个权利要求所述的方法确定的卵子或胚胎质量表现参数用于评估卵子或胚胎质量的用途。
24.一种用于基于数字全息成像来分析包含至少一个卵子或胚胎的样本的设备，所述设备包括：
至少一个光源，其被布置以产生至少一个目标光束和至少一个参考光束，其中所述至少一个目标光束和所述至少一个参考光束彼此相干；
用于暴露的装置，其用于将所述样本暴露到所述至少一个目标光束；
用于叠加的装置，其用于将通过所述样本的所述至少一个目标光束与所述至少一个参考光束叠加从而产生干涉图样；
传感器，其被布置以探测所述干涉图样；以及
处理单元，其被布置以根据所述干涉图样重构目标波阵面的相位和/或幅度信息，并根据所述相位和/或幅度信息构建至少一个卵子或胚胎分析图像，和确定至少一个卵子或胚胎质量表现参数。
25.根据权利要求24所述的设备，还包括保育器，其中所述至少一个光源、所述用于暴露的装置、所述用于叠加的装置和所述传感器都位于所述保育器内。
26.根据权利要求25所述的设备，其中所述处理单元位于所述保育器外，其中所述设备还包括发射器，所述发射器被布置为将所述干涉图样从所述传感器传输到所述处理单元。
27.根据权利要求24-26中的任何一个所述的设备，还包括用于控制所述保育器内的湿度、温度、以及二氧化碳百分比中的至少一个的控制器。
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