JP2012531584A - デジタルホログラフィック撮像による卵又は胚の分析 - Google Patents

Abstract

本方法は少なくとも１の胚又は卵子を含むサンプルを分析する方法であり、デジタルホログラフィック撮像に基づいている。本方法は：ａ）少なくとも１の物体光束と少なくとも１の参照光束の光を作成するステップであって、当該少なくとも１の物体光束と少なくとも１の参照光束は相互にコヒーレントであり；ｂ）サンプルを前記少なくとも１の物体光束に露出させるステップと；ｃ）サンプルを通過した前記少なくとも１の物体光束と前記少なくとも１の参照光束を重畳させることで干渉縞を作成するステップと；ｄ）ホログラムと呼ばれる干渉縞を検出するステップと；ｅ）干渉縞から物体波面の位相及び／又は振幅情報を再構築するステップと；そしてｆ）少なくとも１の胚又は卵子の分析画像を構築し、位相及び／又は振幅情報からの少なくとも１の胚又は卵子の品質を示すパラメータを決定するステップと；を具える。
【選択図】図１

Description

本発明は、少なくとも１の卵子又は胚を含むサンプルを分析する方法に関連する。

体外受精（ＩＶＦ）は妊娠の成功の確率と健康な赤ちゃんを増やすため１９７０年代後半から実施されており、卵子と胚の品質をより正確に予測する需要はそれ以来増加している。現在の２又は３の胚を使用する胚移植の標準技術は、先天性疾患のリスクを伴う双子妊娠をひきおこす可能性がある。さらに現在の着床率は約４０％である。現在の技術は、しばしばいくつかの基本パラメータを用いた経験に基づいた主観的判断に依存している。通常、卵子と胚は位相差顕微鏡を介した視診で行うため、検査の品質は視診をする者の技術に強く依存している。現在、利用可能な定量的手法は、しばしば技術的及び環境的に要求が厳しいか、あるいは位相差画像をソフトウェア解析した単なる原始的なデータの提供である。ヒト胚の場合、胚は、通常、受精後２乃至５日後に試験される。

卵子又は胚の生残率の予測においては、使用した方法がこれらの細胞に影響を与えないことが最も重要である。そのため、様々な種類の染料や蛍光マーカーの使用ができず、強光源を含む他の技術も除外される。卵子又は胚の分類の絶対数は位相差顕微鏡、又は、例えば微分干渉顕微鏡などの位相差顕微鏡の変型でなされる。

位相差顕微鏡による卵子や胚の研究に際しては、画像が鮮明に見える焦点深度、すなわち深度が細胞の深さよりも小さいため、視診をする者が卵子や胚の様々な部分を観察するために焦点面をひっきりなしに手動であわせる必要がある。

胚などの生体組織サンプル中の細胞を計数する方法は、米国出願公開第２００８／００３２３２５号に開示されている。細胞数は、細胞クラスタの第１画像と第２画像を得て、第２画像の細胞の境界線に楕円を合わせて楕円体モデル細胞を作り出し、このモデル細胞を第１画像から差し引くことで差分画像を得て、同じように差分画像の細胞がなくなるまで両細胞を差し引くことで細胞数を計数する。細胞の数は、減算の数に対応している。第１画像を得る方法には光学直交顕微鏡（ＯＱＭ）、偏光干渉法、デジタルホログラフィー、フーリエ位相差顕微鏡法、ヒューバート位相差顕微鏡法、定量的位相差顕微鏡、又は回折位相顕微鏡があり、ＯＱＭが好ましい。第２画像を得る方法には微分干渉顕微鏡（ＤＩＣ）、ホフマン干渉コントラスト顕微鏡及び明視野顕微鏡があり、ＤＩＣが好ましい。この技術にはＯＱＭといった第１画像モダリティと、微分干渉顕微鏡といった第２画像モダリティの両方が必要であり、従って２つの顕微鏡技術を要する。ＯＱＭ顕微鏡はマッハツェンダー干渉計と全視野撮像光学装置を具えている。位相画像は４つの異なるカメラからの干渉画像を読み取って作成する。ここで、参照光を１／４波長板に通過させて、直交するＰ−直線偏光とＳ−直線偏光を９０°位相シフトさせる。次に、偏光光束スプリッタを用いてこれら２つの偏光方向の信号を分離し、２台の別々のカメラで検出する。更に２台のカメラを用いて、これらの信号強度を検出する。米国出願公開第２００８／００３２３２５号で使用されている顕微鏡のレンズの機能性は画像の作成、つまり、研究対象の描写である。

本発明の一つの目的は、人の判断を必要とせずに卵子や胚の生残率などの品質を分析し、分類できるようにすることである。判断の精度は、視診を行う者の技能や経験に強く依存している。本発明の更なる目的の一つは、既存の方法よりも、光学的要求が少なく、感度が低いと共に、より安価な機器で機能する定量的な方法を提供することである。

第一の態様によれば、少なくとも１の卵子や胚を含むサンプルを分析する方法であってデジタルホログラフィック撮像に基づいており：
ａ）少なくとも１の物体光と少なくとも１の参照光を作り出すステップであって、当該少なくとも１の物体光と少なくとも１の参照光は相互にコヒーレントであるステップと；
ｂ）前記少なくとも１の物体光に前記サンプルを露出させるステップと；
ｃ）前記サンプルを通過した物体光を前記少なくとも１の参照光と重畳させることで干渉縞を作り出すステップと；
ｄ）いわゆるホログラムである前記干渉縞を検出するステップと；
ｅ）前記干渉縞から物体波面の位相及び／又は振幅情報を再構築するステップと；
ｆ）少なくとも１の卵又は胚の分析画像を構築し、前記位相及び／又は振幅情報からの少なくとも１の卵又は胚の品質を示すパラメータを測定するステップと；
を具る方法によって上記目的及び更なる目的を解決できる。

上記の方法にしたがって決定する卵子や胚の品質を示すパラメータは、卵子や胚の品質の評価に使用することができる。

本発明の方法によれば、人の判断を要することなく卵子や胚の生残率などの品質の分析と分類を行うことができる。判断の精度は、目視検査を行う者の技能や経験に強く依存しており、このことは本発明の方法により回避できる。この方法は目視検査の補完としての使用もできる。

本発明の方法によれば、卵や胚に関する高度な情報を、１の撮像技術のみを使用した比較的安価な機器によって取得することができる。具体的には、本発明の方法は、４つの光学カメラを含むＯＱＭの高価で複雑な機器に比べて、安価な機器で分析が可能である。さらに、本発明に係る方法の実施に必要な機材は、特にＯＱＭの機器と比較して安定しており外的な障害に対して過敏でない。更に、本発明の方法は、卵子や胚の解析を行うのに１台のみのカメラがあるだけである。

本発明の方法によれば、卵子や胚の品質を示すパラメータの測定や、これらのパラメータについての卵子や胚の分類の基礎とすることも可能である。

デジタルホログラフィは、マーカーや染色を必要とすることなく生細胞の研究を可能にし、研究対象の定量化を可能にする非常に易しい方法である。デジタルホログラフィによれば、時間とコストを要する対象の標識や染色をすることなく研究を行うことができる。従って、デジタルホログラフィによれば、生細胞や細胞増殖など細胞の発達を研究できる。デジタルホログラフィは、位相差顕微鏡と少なくとも同程度に易しい。

位相差顕微鏡は、対象物の屈折率と厚さの変動が画像コントラストの増加をもたらす技術である。デジタルホログラフィでは、これらの変動は、定量的に測定できる入射光の位相シフトをもたらす。これによって、この画像中の全ピクセルの光路長の測定が可能性となり、従って卵子や胚分類における正確なツールを提供する。

デジタルホログラフィは、参照光束と物体光束間の干渉を単に記録するだけであり、画像形成の光学素子ではない。基本的に、デジタルホログラフィック顕微鏡で使用するレンズの主な目的は、研究対象の画像作成ではなく、代わりに光を収集するのにレンズを使用している。そしてコンピュータによる再構成アルゴリズム使用し、研究対象の画像を取得する。このアルゴリズムは記録した干渉縞を用いて、選択した観測面または体積における複合光学波動場を再構築する。この方法は、最小限の光学部品を要し、デジタル撮像システムとして考えられるので数値的な焦点化と収差補正が組み込まれている。これは、レンズなどの顕微鏡の光学精度が特に高くなくてよいことを意味している。

デジタルホログラフィを使用する場合、焦点面を設定する必要はない。逆に、情報を収集し、その後に再構成アルゴリズムによって所望する観察面や観察物内の画像を取得できる。

第二の態様によれば、卵子や胚の品質の評価における第一の態様に係る方法にしたがって決定した卵子や胚の品質を示すパラメータの使用が提供されている。

第三の態様によれば、デジタルホログラフィック撮像に基づいて、少なくとも１の卵子や胚を含むサンプルを分析する装置が提供されている。この装置は：
少なくとも１の物体光束と１の参照光束を作成するように配置された少なくとも１の光源であって、少なくとも１の物体光束と少なくとも１の参照光束が相互にコヒーレントである光源と；
前記サンプルを前記少なくとも１の物体光束に露出させる手段と；
前記サンプルを通過した前記少なくとも１の物体光束に参照光束を重畳させることで干渉縞を生成する手段と；
この干渉縞を検出するように配置されたセンサーと；
対象の位相及び／又は振幅情報を再構築し、少なくとも１の卵子、又は胚の画像を構築すると共に対象の位相及び／又は振幅情報から少なくとも１の卵子、又は胚の品質を示すパラメータを測定するように構成された処理ユニットと；
を具える。

第一の態様の特徴と利点を、第二態様と第三態様にほぼ適用できる。

本発明のさらなる特徴および利点を以下で詳細に開示する。

図１は、受精の最初の兆候を示す二つの胚のスケッチである。 図２は、極体と単胚性細胞を取り囲む透明帯のスケッチである。 図３は、複数のセルを含む２の胚のスケッチである。 図４は、本発明の実施態様に係る装置の概略図である。

以下に本発明をより詳細に説明する。本明細書では、卵子や胚の品質を示すパラメータとは、少なくとも１の卵子や胚の品質に関する情報を提供するパラメータを意味する。具体的には、卵子や胚の品質を示すパラメータは、受精治療に関連するの少なくとも１の卵子や胚を品質に関する情報を提供する。卵子や胚の品質を示すパラメータは、少なくとも１の卵子又は胚の透明帯の半径方向の厚さ；少なくとも１の卵子又は胚の透明帯の光学密度；少なくとも１の卵子又は少なくとも１の胚内部の少なくとも１の細胞の乾燥重量、形態又は面積；少なくとも１の極体の乾燥重量、形態又は面積；１の卵子の少なくとも他の卵子に対する乾燥重量、形態又は面積の比；少なくとも１の胚内の細胞と少なくとも１の他の胚内の細胞の乾燥重量、形態又は面積の比；サンプル中の卵子の数の測定値；少なくとも１の胚内における細胞数の測定値；少なくとも１の胚又は卵子における前核数の測定値；少なくとも１の胚内の、少なくとも１の画定空間の全乾燥重量の測定値；少なくとも１の胚内と少なくとも１の他の胚内における１の画定空間の全乾燥重量の比；分裂レベル；同期の具合；少なくとも１の卵子又は胚、若しくは少なくとも１の胚内における１細胞の体積；少なくとも１の卵子又は胚内の少なくとも１の画定空間の屈折率；及び、これらの組み合わせ；から選択されうるが、これらに限定されない。

本発明に係る方法の一実施態様では、卵子又は胚の品質を示す２又はそれ以上のパラメータを測定し、これらのパラメータを、卵子又は胚の品質を表す１又はいくつかのパラメータに組み合わせる。

本発明に係る方法の一実施態様では、測定した卵子又は胚の品質を示すように各パラメータが特定のパラメータに関しては卵子又は胚の品質に応じた数値で表示される。例えば、測定した品質を示す各パラメータを１乃至１０の数値で表すことができる。測定した卵子又は胚の品質を示す各パラメータの値を、卵子又は胚の品質を示す特定の値と組み合わてもよい。好ましくは、卵子又は胚の品質を示す各パラメータの重要性を表す因子は、これらのパラメーターを組み合わせる際に使用する。この組み合わせた値は、各卵子又は胚の品質に関する非常に直接的な情報を与え、分析した卵子又は胚を優先度の高い順に配置する。

本発明に係る方法の一実施態様では、コヒーレント光源から発信された光束を、光束スプリッター手段などで２本の光束に分離することで相互にコヒーレントな、少なくとも１の物体光束と少なくとも１の参照光束を作成する。コヒーレント光源から発信される光束は、レーザー光束でよい。レーザー光束は、Ｈｅ−Ｎｅレーザやダイオードレーザなど、あらゆるレーザー光束でよい。好ましくは、ダイオードレーザーを使用する。

物体光束と参照光束は相互にコヒーレントであり、これは同じ周波数を持ち、時間的に一定の位相関係を示すことを示唆している。

物体光束は、少なくとも１の卵子又は胚を通過する。参照光束は、例えば光束スプリッタ手段、ミラー及び／又は光ファイバを用いて、物体光束とは別の光路に案内されるので、少なくとも１の卵子又は胚による影響を受けていない。

物体光束は、少なくとも１の卵子又は胚を含むサンプルを通過する前は既知の波面を持っている。物体光束が少なくとも１の卵子（卵）又は胚を通過する際、卵子又は胚は実質的に光は吸収されないが、卵子（卵）や胚を通過した光は、周囲の培地に比べて光路長の差が発生する。したがって卵子や胚から出てゆく波面である物体波面は、位相がシフトしている。当然、参照光束も既知の波面を持っている。光路長は、物理／幾何学的厚さに屈折率を乗じた厚さとして定義される。

本発明に係る方法の一実施態様では、少なくとも１の卵子又は胚を含むサンプルを通過した少なくとも１の物体光束と１の参照光束の、２光束を一つにするように、例えば光束スプリッタ手段によって一緒にすることで重畳させる。この重畳により、例えば、少なくとも１の卵子又は胚の影響を受けた物体波面に関する情報を含む干渉縞が生じる。

本発明に係る方法の一実施態様では、この干渉縞は、ＣＣＤやＣＭＯＳなどのデジタルセンサー手段によって検出される。検出された干渉縞がホログラムと呼ばれる。

少なくとも１の卵子や胚を含むサンプルを通過した少なくとも１の物体光束と少なくとも１の参照光束とを重畳させ、これにより干渉縞を作成し、この干渉縞を検出するのに例えばフーリエやフレネルの設定を使用してもよい。好ましくは、フレネルの設定を使用する。フーリエの設定とフレネルの設定の違いは、例えば、再構成アルゴリズムに適用できるフレネル近似などの近似を作る特定の条件を満たす光学的構成の違いとして説明することができる。この近似は画像形状の再構成プロセスを簡素化する。フレネルの設定の場合、この条件は、対象物とセンサー間の距離が、対象物のサイズとセンサーのサイズに比べて大きいことである。これは対象物からの散乱光を収集し、ほぼ平行な光線使用することでセンサーに導く顕微鏡対物レンズを使用することで可能になる。これにより、センサーから遠く離れた位置に仮想物体ができる。

検出した干渉縞の位相及び／又は振幅情報から物体波面が再構築される。再構築は、フーリエ変換再構成法又は重畳積分再構成法などの任意の一般的な数値的再構成プロセスによって行う。振幅情報は、目的の焦点面の設定に使用できる。再構築した情報は、例えば、研究用の少なくとも１の卵子や胚の二次元あるいは三次元表示画像の取得に使用してもよい。

取得した画像を、更に、コンピュータで画像処理をすることにより卵子や胚の品質に関連するパラメータなど研究対象に関連する有用な情報を測定する。得られた複数の画像は、更に、卵子又は胚の品質に関連するパラメータなど研究対象のその他の有用な情報を、決定する画像処理に使用する。

このような画像処理は、あらかじめ規定されている形状が設定されているセグメンテーションアルゴリズムを含む。これらの設定済みの規定された形状を、更に、サイズ（面積又は体積）、乾燥重量、数に関して分析してもよい。セグメンテーションアルゴリズムの一つである分水嶺セグメンテーション（watershed segmentation）を使用してもよい。

１の物体光束と１の参照光束を作成する代替手段として、インラインデジタルホログラフィを使用することができる。当業者にとっては本明細書を基に本発明の方法をインラインデジタルホログラフィを利用するように変更する方法は自明である。卵子（卵母細胞、卵）は、通常、単一細胞で構成されている。成熟ヒト卵母細胞は、体内で最も大きな細胞の一つであり約１００乃至１２０μｍである。卵母細胞は、基本的に円形である。本明細書中で使用される胚は、受精した卵母細胞である。受精後の最初の数日間に、胚の品質を強く表す多くの現象が生じる。卵母細胞は、単一の前核が含まれており、受精後の胚は、図１に示すように、単細胞の胚内に目に見える程の小さな円形状の２の前核を含んでいる。単一細胞の胚は、受精卵と呼ばれる。受精初期の目に見える段階は、第二前核（second pronucleus）の存在である。これが生じると初めて胚が分裂し、２の細胞が生まれる。この細胞は同調細胞分裂という仮定の下で、更に有糸分裂（細胞分裂）して、４、８及び１６細胞期となる。１以上の細胞を含む胚は桑実胚と呼ばれる。複数の細胞分裂後、胞胚は、胞胚腔と呼ばれる中央が液体で満たされた空洞を取り囲む球状層の複数の細胞が形成される。胞胚腔の体積が増加する胞胚の発生は重要である。胞胚は胚結節という内部細胞塊、後に胎盤を形成する栄養膜という外側細胞膜、栄養膜の内部にある卵割腔を有する胚盤胞に変化する。内部細胞塊の細胞の量と密度が重要である。また、外側層の栄養膜の大きさ（すなわち面積または体積）と密度が重要である。ヒト胚の場合には、胚盤胞は、受精後約５日目に形成される。

胚結節、栄養膜と卵割腔間の比率が胚盤胞期の胚の品質に関する情報を提供する。したがって、胚の品質を評価するためには、３つのゾーン、すなわち胚結節、栄養膜と卵割腔を互いに比較する。乾燥重量、面積並びにこれらの３つのゾーンの光学密度を比較することは有益である。総乾燥重量、面積及び光学密度は、胚の品質に関する情報を提供することができる。

本明細書で使用する場合、乾燥重量とは対象物または対象物の一部の、たんぱく質などの非水溶細胞物質を意味する。光路長は乾燥重量に直接関連している。水ベースの液体をサンプル中の対象物を囲む媒体として用いる場合、細胞内の水が媒体に対応するため光路長がたんぱく質含有量の直接的な指標である。

本発明に係る方法の一実施態様では、少なくとも１の卵子又は胚が、少なくとも１の卵子である。

本発明に係る方法の一実施態様では、少なくとも１の卵子又は胚が、少なくとも１の胚である。

本発明に係る方法の一実施態様では、少なくとも１の胚が、少なくとも１の細胞を含む。

本発明に係る方法の一実施態様では、少なくとも１の卵子又は胚の品質を示すパラメータは、少なくとも１の卵子又は少なくとも１の胚内部の少なくとも１の細胞の乾燥重量、形態又は面積を表す。

本発明に係る方法の一実施態様では、少なくとも１の卵子又は胚は、１以上の細胞を含む少なくとも１の胚であり、品質を示すパラメータは、少なくとも１の胚内の少なくとも１の画定空間の全乾燥重量を測ることで決まる。

本発明に係る方法の更なる実施態様において、少なくとも１の胚内部の１以上の画定領域の全乾燥重量を測定し、１空間の全乾燥重量と少なくとも１の他の空間の乾燥重量と比較する。

卵子と胚は、図２に示す光輪のような透明帯に囲まれている。透明帯は、哺乳類細胞の初期卵母細胞から初期胚を取り囲む多層糖タンパク質の膜である。生体内において、透明帯は、複数の精子細胞による受精である精子液過多症や免疫応答（精子は宿主の免疫系との不適合性を生じさせる可能性がある）を防ぐ重要な要素を提供している。生体外では、透明帯は、着床の機械的ストレスから同様に卵子と胚を保護する不可欠な役割を果たしている。したがって、透明帯の半径方向の厚さは、卵子又は胚の品質の重要な特徴である。透明帯の半径の厚さとは、透明帯の内側の境界か外側の境界までの半径距離を意味する。本出願に記載の方法により透明帯を調べることにより、卵子又は胚の全周を通じる透明帯の半径方向の厚さの測定値を得ることが可能である。透明帯の半径方向の厚さは平均値、最大及び／又は最小半径値として表すことができるだけでなく、卵子又は胚の円周に沿った透明帯の半径方向の厚さを表すグラフとして視覚化することもできる。これにより透明帯の半径方向の厚さの変化を得ることができ、透明帯が徐々に薄くなっていることも観察できる。

透明帯の光学密度は、卵子又は胚の品質の重要な特徴であり、透明帯の光学密度も、本発明に係る方法により得ることができる。半径方向の厚さ同様に、透明帯の光学密度も平均、最大及び／又は最小光学密度として表すことができるだけでなく、卵子又は胚の円周に沿った透明帯の光学密度を表すグラフとして視覚化することもできる。透明帯の様々な層の光学密度も重要である。また、本発明の方法によって、透明帯に生じることがある亀裂も観察できる。

また、胚の品質は、透明帯の発達を観察することによって得ることができる。精子の浸入に続き、皮層反応と呼ばれる事象において、卵母細胞と透明体の間の極体が配置されている囲卵腔という空間に卵内の特殊なオルガネラである表層粒の内容物が放出される。表層粒の滲出液により、透明帯の性質が変化する透明帯反応が生じ、過多精液の浸入をブロックする。受精時に透明帯の硬化を引き起こす透明帯の構造の変化は、β構造含量の大幅な増加を伴う透明帯たんぱく質による二次構造の変化を伴う。したがって、受精後、透明帯の構造が再編成され、受精前、受精中、受精後に卵母細胞／胚を調べることで胚の品質を決定できる。

本発明に係る方法の一実施態様では、少なくとも１の卵子又は胚の品質を示すパラメータは、少なくとも１の卵子又は胚の透明帯の半径方向の厚みと、少なくとも１の卵子又は胚の透明帯の光学密度とから成る群から選択される少なくとも１のパラメータである。

極体は、減数分裂時に非対称の有糸分裂の後に形成される細胞質の量が少ない細胞である。極体は時間がたつと退化し、分裂化する。一の極体は受精前に、卵母細胞の成熟過程中に押し出される。第２の極体は受精が行われた後に押し出される。発生の最初の兆候の一つは、２極体の存在である。単一細胞状態の胚では、生残する可能性がある受精卵の初期兆候として、第二極体の押出しがしばしばみられる。極体の大きさ（すなわち面積または体積）は、受精率の低下や低品質の胚に関連するより大きな極体を伴う胚の質に関連する。第一極体の分裂化は、胚の質に関係する。極体の大きさ（面積又は体積）と量（時点による）を測定することで受精率と良質な胚の形成率を向上させることができる。

本発明に係る方法の一実施態様では、少なくとも１の卵子又は胚の品質を示すパラメータが、少なくとも１の極体の乾燥重量、形態又は面積である。

前核は、受精により融合する前の前核は配偶子、すなわち精子と卵子の核である。受精成功の最初の兆候の一つが２の前核の存在である。２以上は存在せず、そうでなければ胚が低品質であり、好ましくは廃棄すべきである。胚の品質は、このように受精後の融合前に前核を計数することで測定できる。さらに、核小体前駆体は前核内に位置し（図１）胚の品質に関する情報を生み出す。核小体前駆体の配置、前核の大きさ（面積または体積）及び、核小体前駆体と前核の相互の位置は胚の品質に関係している。

本発明に係る方法の一実施態様では、少なくとも１の卵子又は胚の品質を示すパラメータが少なくとも１の卵子又は胚の内の前核の数を計数することにより決まる。

胚の細胞は、何度か有糸分裂（細胞分裂）が行われて、２、４、８及び１６細胞期等を形成する。適切な移植胚の決定について、細胞数と、割球（胚の初期細胞）の有糸分裂の同期化はどの胚が最も着床に適しているかを決定する別の基本的かつ重要なパラメータとなる。実際には幾分かのばらつきが常に予想されるが、細胞は実質的に同じフェーズになくてはならない、すなわち、細胞分裂はすべての細胞で同じに生じるべきである。同期は同時におこる細胞分裂と関連し、同時に分裂する細胞は同期していると言われる。本発明の方法により胚内の細胞数を計数することで、同期の程度を決定することができる。着床前の複数の時点で細胞を計数して、規則正しい細胞分裂を確認することができる。

本発明に係る方法の一実施態様では、少なくとも１の卵子や胚の品質を示すパラメータが分裂レベルである。分裂は、細胞が小塊にわかれて細分化していることを意味しており図３に見ることができる。卵子又胚の分裂が生じることは、ある程度の分裂化はかなり頻繁にみられるとはいえ、その卵子又は胚が低品質である兆しである。分裂化の増加は、観察時点における胚内の細胞数の減少と関連することが多く、従って有糸分裂が適切に生じていない兆しかもしれない。卵を研究する場合、分裂化の増加は、観察時点における複数の卵又は卵の断片にリンクしている。本発明の方法によりサンプル内の卵子数又は胚内の細胞数を計数することで、分裂化の度合いを測定する。分裂化は、遺伝障害、代謝障害あるいはアポトーシス（死）細胞又はその他の未知の原因による。

セグメンテーションアルゴリズムを使用した画像処理により、卵子又は胚の数を測定することができ、ここでは、あらかじめ決められた形状が配置されており好ましくは分水嶺セグメンテーションが用いられる。

本発明に係る方法の一実施態様では、卵子の品質を示すパラメータが、サンプル中の卵子数の計数によって測定される；又は胚の品質を示すパラメータは、少なくとも１の胚内部の細胞数の計数によって測定する。

本発明に係る方法の一実施態様では、少なくとも１の卵子又は胚の品質のを示すパラメータが、同期の程度である。

全細胞質体積（核を除いた細胞や割球の体積）は初期胚発生まで常時増え、したがって各有糸分裂によって生じた細胞は、分裂前の半分のサイズである。この事実は、１６細胞期まで証明されている。細胞ごとに細胞の面積または細胞の体積を測定して、それらを互いに比較すると、細胞周期が非同期的な胚だけでなく、卵子や胚の分裂化を確認することができる。

各細胞期で、各細胞の乾燥重量は、高品質の胚では同じでなくてはならない。従って、各細胞の乾燥重量を、胚の他の細胞の乾燥重量と比較することにより、胚の品質に関する情報を得ることができる。

本発明に係る方法の一実施態様においては、サンプルが１以上の卵子を含み、卵子の品質を示すパラメータが、ある卵子と、少なくとも１の他の卵子の乾燥重量、形態又は面積を比較することによって測定され；又は少なくとも１の胚が１以上の細胞を包んでおり、胚の品質を示すパラメータが、少なくとも１の胚内のある細胞と少なくとも１の他の細胞乾燥重量、形態又は面積を比較することによって測定される。

少なくとも１の卵子又は胚の測定で収集する情報を増やすために少なくとも２の波長を使用することができる。屈折率は波長に依存しているため２の波長を使用することで物理的／幾何学的な厚さと屈折率の両方を、それらの生成系だけでなく各ピクセルで測定することができる。これは、対象物の正確な厚さを測定することができることを意味している。このように、卵子又は胚の内側の細胞などの細胞の面積だけでなく体積も測定できる。

また、細胞の異なる部分は異なる屈折率を有する。例えば、細胞核は、通常、細胞体とは異なる屈折率を有する。したがって少なくとも２の波長の使用することで細胞核にマークを付けたりデジタルホログラム画像上で別々に測定することができる。

これら少なくとも２の波長は、少なくとも２の異なるレーザーや他の光源を使用することにより達成できる。

少なくとも２の波長の使用は、比較的厳しくないアルゴリズムを使用することができるので、本発明の方法に係る計算を容易にする。対象の干渉縞を集めて２の異なる波長を得る場合、これらのパターンの違いは、サンプルの照射に使われるものより長い合成波長（ビート波長）との干渉縞として解釈することができる。この手法により、Ｍｏｄｕｌｏ２πの光路長の情報は、位相を不明瞭にすることなく、入射光束の１倍よりも長く引き伸ばすことができる。これは、卵子や胚のように、大きな位相シフトを持つ大きな対象物の場合、特に興味深いものとなる。また、少なくとも２の波長の使用することでノイズの少ない画像が得られる。

本発明に係る方法の一実施形態では、２以上の波長を使用しており、使用する波長のそれぞれに対してａ）乃至ｅ）の手順を実行し、少なくとも１の卵子又は胚の解析画像を構築し、少なくとも１の卵子又は胚の品質を示すパラメータは、２以上の波長を用いて再構築した位相及び／又は振幅情報から測定される。

本発明に係る方法の一実施形態では、２以上の波長は、２以上の異なるレーザー又はその他の光源によって達成される。

２又はそれ以上の波長が使用されている場合、少なくとも１の卵子又は胚の品質を示すパラメータは、２又はそれ以上の波長を使用して収集した情報に基づいて決定される。また、少なくとも１の卵子や胚の解析画像は、２又はそれ以上の波長を使用して収集した情報に基づいて構築される。

胚の初期細胞分裂の際、各細胞に、予想よりも単核が多い又は少ないことがある。このような核数の不規則な偏差は、低品質の卵子や胚を生じると考えられる。核数は、本発明の方法によって達成される標準的な卵子や胚の解析画像から決定することができるが、細胞核とその周囲の部分とでは屈折率が異なるので少なくとも２の異なる波長を用いることでより簡単に区別できる。

卵子などの細胞、又は細胞の体積は、少なくとも２の波長を使用をすることで決定できるが、各ピクセルの全体の物理的な厚さがわかっているだけなので、実３次元画像を得ることはできない。特定のピクセルの全体の物理的な厚さが１又は複数の物理的な全体の厚さであるか否かはわからない。すなわち物理的な全体の厚さを作っている２又はそれ以上の距離間に何もないにスペースがあるかどうかはわからない。しかしながら、細胞または胚の三次元画像は、細胞、卵子または胚といった調べた対象物の正常な形態に関連する仮定に基づいて取得できる。細胞または胚が平面上に配置されている場合、これらの仮定は役に立つ。しかし、少なくとも２の波長を用いて得られた情報に基づいて、実際の三次元画像を得ることは不可能である。

本発明に係る方法の一実施形態では、少なくとも１の卵子や胚の品質を示すパラメータが、少なくとも１の卵子や胚の体積または少なくとも１の卵子又は胚内部の少なくとも１の細胞の体積を表している。

本発明に係る方法の一実施形態では、少なくとも１の卵子や胚の品質を示すパラメータが、少なくとも１の卵子や胚内部の少なくとも１画定空間の屈折率である。

収集した情報を増やす別の方法は、様々な角度から複数の画像を撮影することである。卵子や胚が一定の回転速度で回転しており画像を特定のインターバルで撮影すると、その画像を胚のトモグラフィー再構成に使用できる。代替的に、卵子や胚を一度に特定の角度で回転させて、各回転後に画像を撮影する。対象物は、物体光束と平行でない軸を中心に回転する。好ましくは、対象物は、物体光束に直交する軸を中心に回転する。卵子又は胚のこの回転により卵子や胚の実際の三次元再構成が可能になる。

本発明に係る方法の一実施形態では、少なくとも１の卵子又は胚を含むサンプルを回転させて様々な角度から撮影した卵子や胚の分析画像により実際の三次元再構成を作成している。

本発明に係る方法の一実施形態において、様々な角度から撮影した卵子や胚の解析画像をトモグラフィーのアルゴリズムに組み合わせて実際の三次元再構成を作成する。

卵子や胚を回転させた場合、卵子や胚の二次元投影の円周に沿ってだけでなく、実質的な球状の卵子や胚の回り一帯の透明帯の半径方向の厚さと、透明帯の光学密度を得ることができる。

卵子や胚は、例えば、卵子や胚を保持しているマイクロピペットや光ピンセットやマイクロ流体デバイスを用いて機械的に回転させる。

少なくとも２の波長を使用する方法と、異なる角度から画像を撮る方法の２の方法を組み合わせて収集した情報を最大限にするように使用できる。

上述した卵子や胚の品質を示すパラメータは、予め決められた時点で撮影したデジタルホログラム画像に依存することがある。正確な培養条件のもと非侵襲的な低速度撮影を通じて発生の全体を研究することが可能になる。例えば、画像を一時間又は一日といった一定間隔で撮影し、撮影した画像を分析する卵子や胚の経時的な発生を表すフィルムにまとめることができる。連続的な画像の撮影も本発明の方法で達成することができる。これにより、卵子や胚の品質を更に測定することが可能である。多核化や受精卵の開裂が初期に生じた場合にこれが有効である。多核化が生じた時点及び受精卵の開裂が生じた時点は、複数の時点で又は連続的に胚を観察することで決めることができる。

複数の時点で又は連続的に画像を撮影することで、卵子又は胚の発生を調べることができる。これは例えば、受精時に生ずる透明帯の変化といった卵子に起こり得る変化を調べる場合に重要であろう。

本発明に係る方法の一実施形態によれば、複数の時点で又は連続的にステップｂ）乃至ｄ）を繰り返すことでステップｅ）による位相及び／又は振幅情報を再構築し、前記時点で、又は連続的に撮影したステップｆ）により卵子又は胚の解析画像を構築する。

本方法の一実施形態において、ある時点で撮影した卵子又は胚の解析画像は、その時点よりも前に撮影された卵子又は胚の解析画像と比較される。これは変化を検出するために行う。例えば、複数の時点で撮影された解析画像の細胞数及び／又は細胞の大きさを測定し、比較できる。変化が検出された場合、その変化が検出された時点を記憶しうる。代替的に、変化が検出された時点に撮影された分析画像を保存するようにしてもよい。更に、分析画像の比較は、少なくとも１の卵子又は胚の品質を示すパラメータの比較に基づいてできる。

一実施態様では、少なくともａ）乃至ｄ）のステップはインキュベータ内で行う。この方法で、少なくとも１の卵子又は胚を、それらが培養されている環境内で容易に調べることができる。そのうえ、少なくとも１の卵子又は胚を分析するたびにインキュベータから取り出す必要がないため、少なくとも１の卵子又は胚の長期間にわたる調査を簡易化する。

選択的に、この方法は更にインキュベータの内部からインキュベータ外部の処理ユニットに干渉縞を送信するステップ含みうる。好ましくは、この送信するステップは、無線で干渉縞を送信するステップを含む。このようにすることで処理ユニットをインキュベータの内部に設置する必要がない。例えば、処理ユニットはリモートサーバーに設置できる。

本発明の実施態様に係る装置は、ここで図４を参照して説明する。図４は、サンプル１０を分析する装置１００の概略図である。装置１００は、少なくとも１の光源３００、センサ５００、光束スプリッタ７ａと７ｂ、反射面９ａと９ｂ及び処理ユニット１３から成る。光束スプリッター７ａと７ｂは反射面９ａと９ｂと共に、少なくとも１の物体光２１にサンプルを露出させる手段及び、少なくとも１の参照光２３と少なくとも１の物体光２１を重畳させる手段としての役割をなす。

光源３００は、コヒーレント光の少なくとも１の光束１９を作成するように配置されている。コヒーレント光の光束１９は、例えば６３５ｎｍの波長の光を放射するダイオードレーザーなど、あらゆるレーザー光源から派生するレーザー光束でよい。ここでは、ただ１の光源が示されているが、一般的に装置１００は、同時に使用できる複数の光源３００を含んでよい。好まくは、複数の光源３００が使用される場合、異なる波長の光を作る。このことは、サンプル１０が異なる波長の光に対し、異なる反応をする可能性があるため、利点になりうる。したがって、異なる波長を有する複数の光源３００を使用することでサンプルに関する詳細な情報を取得することができる。

光源３００に由来しているコヒーレント光の光束１９は光束スプリッタ７ａに向けられている。光束スプリッタ７ａは、少なくとも１の光束１９のコヒーレント光を、少なくとも１の物体光束２１と少なくとも１の参照光束２３に分割する。この構造により、少なくとも１の物体光束２１と、少なくとも１の参照光束２３は相互にコヒーレントになる。つまり、それらは同じ周波数を持ち、時間的に一定な位相関係を示すことを意味している。１以上の光源３００が存在する場合、光束スプリッタ７ａは、光源３００に由来している各光束１９を相互にコヒーレントな物体光束２１と参照光束２３に分割する。

装置１００を使用する際、少なくとも１の卵子又は胚１１を含むサンプル１０は、少なくとも１の物体光束２１の光路に配置されている。例えば、反射面９ａを用いて、少なくとも１の物体光束２１にサンプル１０が露出するように少なくとも１の物体光束２１の向き変える。物体光束２１はサンプル１０の内部に入射し、サンプル１０、特に少なくとも１の卵子又は胚１１を通過する。サンプル１０を通過する物体光束２１は、参照光束２３などのサンプルを通過しない光束と比較して、屈折率の違いから、より長い光路長を移動する。これが物体光束２１と参照光束２３との間の位相シフトにつながる。光路長は物理的／幾何学的距離に屈折率を乗じた値である。

反射面９ｂは、少なくとも１の参照光束２３を反射させ、それによって少なくとも１の参照光束２３の方向を変えるように配置されている。具体的には、反射面９ａと９ｂは、少なくとも１の物体光束２１と少なくとも１の参照光束２３が、ここでは光束スプリッタ７ｂである重畳手段に向けられている。光束スプリッタ７ｂは、少なくとも１の物体光束２１と少なくとも１の参照光束２３とを重畳させ、そして重畳した光束２５をセンサ５００へ向ける。

センサ５００は、物体光束２１と参照光束２３から生じる干渉縞を検出するように配置されている。物体光束２１と参照光束２３は相互にコヒーレントなので、これらはセンサ５００で干渉縞を作り出す。具体的には、少なくとも１の物体光束２１のサンプル１０を通る経路により、少なくとも１の物体光束２１と少なくとも１の参照光束２３とが異なる光路長を移動したため干渉縞は物体光束２１と参照光束２３の位相シフトを表している。センサ５００は、例えば、ＣＣＤ（電荷結合素子）やＣＭＯＳ（相補型金属酸化膜半導体）イメージセンサーといったのデジタルセンサであってよい。

センサ５００は、更に、任意の一般的な再構築プロセスを実行するソフトウェア及び／又はハードウェアを含む処理ユニット１３に作動可能に接続されてもよい。この再構築プロセスは、センサ５００によって検出された干渉縞から位相及び／又は振幅情報を再構築する。再構築された情報は、例えば、調査した少なくとも１の卵子又は胚１１の少なくとも１の分析画像を取得するのに使用されることがある。この情報は、例えば、少なくとも１の卵子又は胚１１の形状と光学密度の決定に使用されることもある。具体的には、処理ユニット１３は、位相及び／又は振幅情報から、少なくとも１の卵子又は胚の品質を示すパラメータを測定するように配置されている。言い換えると、処理ユニット１３は、本発明の実施態様による方法の任意のデータを処理するステップを実行するように配置されている。

更に、装置１００は、記憶媒体やメモリ（図示せず）を具えていてもよい。記憶媒体やメモリは、処理ユニット１３に作動可能に接続される。具体的には、記憶媒体やメモリは、分析画像と分析画像の変化が検出された時点に関連する分析画像と時間のデータを記憶するように配置されている。

装置１００は、インキュベータ１５内で動作するように適合させてよい。このような配置にすることでサンプル１０を分析するために培養インキュベータから取り出す必要がなくなる。図４に示すように光源３００、センサ５００、及び光束スプリッター７ａと７ｂや反射面９ａと９ｂなどの光学部品は、インキュベータ１５の内部に設けられている。処理ユニット１３は、インキュベータ１５の内部やインキュベータ１５の外部のどちらに配置することもできる。処理ユニットがインキュベータ１５の外部に配置されている場合は、処理ユニットがセンサ５００と無線通信できることが好ましい。例えば、この装置は、センサ５００からの干渉縞に関連する情報を処理ユニットに作動可能に接続された受信機に送信するように配置された送信機（図示せず）を具えている。送信機は、処理ユニット１３に信号を送信し受信するように配置した無線通話機の一部を形成しもよい。
代替的に、装置１００は、インキュベータ１５を含んでもよい。この場合、インキュベータ１５は、好ましくは装置１００と一体に形成されている。このような構成は非常にコンパクトで柔軟なソリューションを提供する。例えば、インキュベータと一体的に形成された装置１００は、作業机の上に置くことができ、必要に応じて別の場所に移動することができて便利である。有利なことに、インキュベータ１５と一体的に形成された装置１００を有することにより、この装置のすべての構成部品をインキュベータ内部に配置する必要がない。例えば、インキュベータの内部条件に敏感な光束スプリッタ７ａと７ｂ及び反射面９ａと９ｂといった特定の光学部品はインキュベータの外に配置してもよい。一実施態様ではサンプル１０を保持するだけのサンプルホルダのみが、インキュベータ１５内に配置されている。

装置１００は、更に、インキュベータ１５の内部の湿度、温度及び二酸化炭素の割合の少なくとも１つを制御するコントローラ（図示せず）を具えていてもよい。この方法で、少なくとも１の卵子又は胚の培養のための最適な条件を達成できる。培養細胞は、特定の厳密に制御されたパラメータが必要である。まず第一に細胞培養培地はｐＨ７．４を保持する必要がある。細胞培養培地は、ほとんどの場合、炭酸塩で緩衝されるので、大気中に５％のＣＯ_２を供給することにより達成されるが、ＨＥＰＥＳといった有機バッファを代わりに使用できる。培地の蒸発防止に、大気と水飽和させる必要がある。例えば、湿度は約９０乃至９５パーセント以上であってもよい。培養細胞は好ましくは、３７℃で成長するが細胞種依存的である。例えば哺乳動物の細胞は３７℃、昆虫細胞は２０℃を好み、一方で鳥類細胞は４０乃至４２℃を好む。

更に、装置１００特に、光束スプリッタ７ａと７ｂ及び反射板９ａと９ｂといった光学部品には別の手法を用いることがある。一つの手法によれば、装置１００は、インキュベータ１５内に配置されており、インキュベータ内部の温度は基本的に室温と等しい。その後、インキュベータの内部温度を低い率で増加させる。このようにすると、光学部品とインキュベータ１５の内部の空気との間に温度差が生じないので、装置１００の光学部品の結露を避けることができる。別の手段では、光束スプリッタ７ａ及び７ｂと反射面９ａ及び９ｂといった光学部品は、インキュベータ１５内の条件に対処できるように配置及び／又は処理することがある。特に、光学部品は結露を避ける処理をする。インキュベータ１５の内部の温度が室温と基本的に同じではない場合、この方法により装置１００をインキュベータ１５内に配置することがある。その結果、徐々に温度を上げる上記の手順を回避することができる。

当業者が容易に理解できるように、図４を参照して説明した実施態様は、添付した特許請求の範囲内に収まる単なる例示と回路図の設定例である。多くの変形例及び変更例があり得る。例えば、少なくとも１の物体光束にサンプルを露出させ、少なくとも１の物体光束と、少なくとも１の参照光束を重ね合わせる特定の幾何学的及び光学的設定に関しては多くの可能な変形例がある。

図面の詳細な説明
図１では単一の胚性細胞（２）の中に１又はそれ以上の前核（３）が見えるため、２つの胚（１）は受精が成功した兆候を示している。左の胚は、２つの前核（３）を有する正常な胚であり、したがって高品質であると考えられる。一方で、右の胚は３つの前核を有し、したがって低品質であると考えられる。核小体前駆体が小さなスポットとして見ることができる。
図２では胚（１）の透明体（５）が極体（４）と単一の胚性細胞（２）を包んでいる。
図３は複数の細胞（６）を含む２つの胚（１）である。上側の胚（１）は８細胞を有する桑実胚（６）であり、基本的に同一サイズの細胞で構成されているため、高品質と考えられる。下側の胚（１）はひどく分裂化している（様々なサイズの細胞と細胞断片から成る）ため低品質と考えられる。従って図３の透明体（５）は受精体のものよりも脆弱である。

Claims (27)

1. 少なくとも１の胚又は卵子を含むサンプルを分析する方法であり、デジタルホログラフィック撮像に基づく方法であって：
   ａ）少なくとも１の物体光束と少なくとも１の参照光束を作成するステップであって、当該少なくとも１の物体光束と当該少なくとも１の参照光束は相互にコヒーレントであるステップと；
   ｂ）前記サンプルを前記少なくとも１の物体光束に露出させるステップと；
   ｃ）前記サンプルを通過した前記少なくとも１の物体光束を前記少なくとも１の参照光束と重畳させることで干渉縞を作成するステップと；
   ｄ）ホログラムと呼ばれる前記干渉縞を検出するステップと；
   ｅ）前記干渉縞から物体波面の位相及び／又は振幅情報を再構築するステップと；
   ｆ）少なくとも１の胚又は卵子の分析画像を構築し、前記位相及び／又は振幅情報からの少なくとも１の胚又は卵子の品質を示すパラメータを測定するステップと；
   を具えることを特徴とする方法。
2. 請求項１に記載の方法において、ステップａ）乃至ｄ）がインキュベータの内部で行われることを特徴とする方法。
3. 請求項２に記載の方法が、更に、前記インキュベータの内部から前記インキュベータの外部の処理ユニットへ前記干渉縞を送信することを特徴とする方法。
4. 請求項１乃至３に記載の方法において、前記少なくとも１の胚又は卵子の品質を示すパラメータが、前記少なくとも１の胚又は卵子の透明体の半径方向の厚みと、前記少なくとも１の胚又は卵子の透明体の光学密度から成る群から選択されるパラメータの少なくとも１つであることを特徴とする方法。
5. 請求項１乃至４に記載の方法において、前記少なくとも１の胚又は卵子の品質を示すパラメータが、前記少なくとも１の卵子又は前記少なくとも１の胚内の少なくとも１の細胞の乾燥重量、形態、又は面積であることを特徴とする方法。
6. 請求項１乃至５に記載の方法において、前記少なくとも１の胚又は卵子の品質を示すパラメータが、少なくとも１の極体の乾燥重量、形態、又は面積であることを特徴とする方法。
7. 請求項１乃至６に記載の方法において、前記サンプルが１以上の卵子を含み、ある卵子の品質を示すパラメータが、少なくとも１の他の卵子の乾燥重量、形態又は面積を比較することによって決定され；又は、前記少なくとも１の胚が、１以上の細胞を被包しており、ある胚の品質を示すパラメータが、当該少なくとも１以上の胚内の、ある細胞と他の細胞の乾燥重量、形態又は面積を比較することによって決定されることを特徴とする方法。
8. 請求項１乃至７項に記載の方法において、ある卵子の品質を示すパラメータが、サンプル中の卵の数の計数によって決定され；又は、ある胚の品質を示すパラメータが、少なくとも１の胚内部の細胞の数の計数によって決定されることを特徴とする方法。
9. 請求項１乃至８に記載の方法において、前記少なくとも１の胚又は卵子の品質を示すパラメータが、少なくとも１の胚又は卵子の前核の数の計数によって決定されることを特徴とする方法。
10. 請求項１乃至９に記載の方法において、前記少なくとも１の胚又は卵子が、１以上の細胞を被包している少なくとも１の胚であり、ある胚の品質を示すパラメータが、当該少なくとも１の胚内部の少なくとも１の画定空間の全乾燥重量を測ることで決まることを特徴とする方法。
11. 請求項１０に記載の方法において、前記少なくとも１の胚内部の１以上の画定空間の前記全乾燥重量が測定され、ある空間の前記全乾燥重量は、少なくとも１以上の他の空間と比較されることを特徴とする方法。
12. 請求項１乃至１１に記載の方法において、前記少なくとも１の胚又は卵子の品質を示すパラメータが、分裂の度合であることを特徴とする方法。
13. 請求項１乃至１２に記載の方法において、前記少なくとも１の胚又は卵子の品質を示すパラメータは、同期の程度であることを特徴とする方法。
14. 請求項１乃至１３に記載の方法において、２又はそれ以上の波長が使用され、前記ステップａ）乃至ｅ）が前記使用された各波長でについて行われ、前記少なくとも１の胚又は卵子の分析画像が構築され、前記少なくとも１の胚又は卵子の品質を示すパラメータが前記２又はそれ以上の波長を使用して再構築された位相及び／又は振幅情報から決定されることを特徴とする方法。
15. 請求項１４に記載の方法において、前記２又はそれ以上の波長が、２又はそれ以上の異なるレーザー若しくはその他の光源によって達成されることを特徴とする方法。
16. 請求項１４または１５に記載の方法において、前記少なくとも１の胚又は卵子の品質を示すパラメータが、前記少なくとも１の胚内部の少なくとも１の細胞の体積又は、前記少なくとも１の卵子内部の少なくとも１の細胞の体積であることを特徴とする方法。
17. 請求項１４または１５に記載の方法において、前記少なくとも１の胚又は卵子の品質を示すパラメータが、前記少なくとも１の胚又は卵子の少なくとも１の画定空間の屈折率であることを特徴とする方法。
18. 請求項１乃至１７に記載の方法において、実際の３次元再構築の作成のために、前記少なくとも１の胚又は卵子を含んだサンプルを回転させ、卵子又は胚分析画像が異なる角度から撮影されることを特徴とする方法。
19. 請求項１８に記載の方法において、実際の３次元再構築の作成のために、異なる角度から撮影された前記卵子又は胚の分析画像をトモグラフィックアルゴリズムと組み合わせることを特徴とする方法。
20. 請求項１乃至１９に記載の方法において、ステップｅ）にしたがって位相及び／又は振幅情報を構築するために、異なる時点又は連続的にステップｂ）乃至ｄ）が繰り返され、前記時点で又は連続的に撮影されたステップｆ）による卵子又は胚の分析画像を構築することを特徴とする方法。
21. 請求項２０に記載の方法は、更に、前記時点で又は連続的に撮影された卵子又は胚の分析画像を、それ以前に撮影された卵子又は胚の分析画像と比較するステップを具え；前記比較するステップの結果に基づいて変化が生じたか否かを検出するステップと；及び、変化が検出された場合、前記変化が検出された時点を記憶するステップと；を具えることを特徴とする方法。
22. 請求項２１に記載の方法において、前記比較するステップが、少なくとも１の胚又は卵子の品質を示すパラメーターを比較するステップを具えることを特徴とする方法。
23. 請求項１乃至２２に記載の方法により決定された卵子又は胚の品質を示すパラメータの卵子又は胚の品質の評価における使用。
24. デジタルホログラフィック撮像に基づいて少なくとも１の胚又は卵子を含むサンプルを分析する装置において：
    少なくとも１の物体光束と少なくとも１の参照光束の光を作成するように構成された少なくとも１の光源であって、当該少なくとも１の物体光束と当該少なくとも１の参照光束は相互にコヒーレントである光源と；
    前記少なくとも１の物体光束を前記サンプルに露出させる手段と；
    前記サンプルを通過した前記少なくとも１の物体光束と前記少なくとも１の参照光束を重畳させる手段であってこれにより干渉縞を作成する手段と；
    前記干渉縞を検出するように配置されたセンサーと；及び
    少なくとも１の卵子又は胚の分析画像を構成するのに前記干渉縞から物体波面の位相及び／又は振幅情報を再構築し、及び前記位相及び／又は振幅情報からの少なくとも１の胚又は卵子の品質を示すパラメータを決定するように配置された処理ユニットと；
    を具えることを特徴とする装置。
25. 請求項２４に記載の装置が、更に、インキュベータを具え、前記少なくとも１の光源と、前記露出の手段と、前記重畳の手段と、前記センサーとが当該インキュベータ内部に設置されることを特徴とする装置。
26. 請求項２５の装置において、前記処理ユニットが前記インキュベータの外部に位置し、前記装置は更に前記センサーから前記処理ユニットに前記干渉縞を送信するように配置された送信機を具えることを特徴とする装置。
27. 請求項２４乃至２６に記載の装置が、更に、前記インキュベータ内の、湿度、温度、及び二酸化炭素の割合の少なくとも１つを制御するコントローラを具えることを特徴とする装置。

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