CN107743582A - 用于全场干涉显微成像的方法和系统 - Google Patents

用于全场干涉显微成像的方法和系统 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于三维散射样品(206)的全场干涉显微镜成像的系统(20)。所述系统包括：‑包括参考臂的干涉装置(200)，在该参考臂上布置有反射表面(205)，当样品被放置在目标臂上时，干涉装置适于在成像场的每个点产生通过在对应于成像场的所述点的反射表面(205)的基本表面上使入射光波反射而获得的参考波与通过在给定深度处样品切片的体素对入射光波的后向散射而获得的物体波之间的干涉；所述体素对应于成像场的所述点；‑获取装置(208)，其适于以目标臂与参考臂之间的固定光程差来获取由在成像场的每个点处产生的所述干涉所产生的N个二维干涉测量信号的时间序列；以及‑处理单元(220)，其被配置为计算表示所述N个二维干涉测量信号之间的强度时间变化的图像(IB,IC)。

Description

用于全场干涉显微成像的方法和系统
技术领域
本说明书涉及一种全场干涉显微成像方法和系统，其特别适用于细胞和细胞内成像。
背景技术
以全场OCT(OCT是“Optical Coherence Tomography(光学相干断层成像术)”的首字母缩写)这一名字为人们所知的通过非相干光全场干涉显微术获取图像的技术是一种非侵入性、非破坏性和内源性的方法，在获取生物组织的图像上非常强大。
例如在A.Dubois和C.Boccara的文章“Full-field optical coherencetomography”中描述了全场OCT成像技术，该文章取自“Optical Coherence Tomography-Technology and Applications”-Wolfgang Drexler-James G.Fujimoto-Editors-Springer 2009。在法国专利申请FR2817030中也描述了全场OCT成像技术。
全场OCT成像技术基于当样品被具有低相干长度的光源照射时使用由样品后向散射的光，在生物样品的情况下尤其是使用由显微镜细胞和组织结构后向散射的光。该技术利用光源的低相干性来隔离由样品深度方向上的虚拟切片后向散射的光。干涉仪的使用使得可以通过干涉现象产生表示从样品的给定切片选择性地发出的光的干涉信号，并且消除源自样品的其余部分的光。
全场OCT成像技术使得可以获得具有1μm量级的典型分辨率的三维图像，该分辨率大于其他常规OCT技术可能获得的10μm量级的分辨率，例如谱域中的OCT(由首字母缩写“傅立叶域OCT”或“谱域OCT”所知)。
通过这样的分辨率，可以观察到血管、血管壁、胶原蛋白、脂肪细胞等等的大部分组织结构。这种技术使得可以观察到各种生物组织(例如脑、乳房、皮肤、肝脏等)的微观结构，例如在O.Assayag等人的文章“Large Field,High Resolution Full-Field OpticalCoherence Tomography:A Pre-clinical Study of Human Breast Tissue and CancerAssessment”(《癌症研究与治疗技术》，第13卷，No.5，2014年10月)中所描述的。此外，这种技术被证明是特别快速的：因此可以使用全场OCT显微镜在几分钟内产生表示表面为几平方厘米的、深度方向的切片的图像。
图1是通过全场OCT技术获得的肝组织样品(在大鼠肝脏上进行的光学活组织检查)的图像的实例，其中特别可以看到胶原纤维。该图像(标记为IA)对应于800μm×800μm(微米)尺寸的样品区域。该图说明了这种技术用于揭示和观察非常精细的生物结构的可能性。
已经表明，全场OCT图像获取技术可以潜在地用于诸如诊断癌症的医学应用，因为微观结构和组织结构的观察使得在许多情况下能够在几分钟内以非破坏性的方式将健康组织与癌组织区别开来。在手术期间的全场OCT图像使得例如可以产生第一级诊断，甚至在例如癌症的情况下优化手术操作，从而可能避免在切除后几天组织学分析揭示存在肿瘤细胞的情况下重复手术。
此外，全场OCT技术允许活体内图像获取，并可能使用例如内窥镜进行原位获取，这增强了该技术在医疗领域的相关性。
然而，尽管全场OCT技术提供的理论空间分辨率足以生成细胞和细胞内尺度(三维尺寸为1μm的量级)的生物组织的图像，但申请人已经证明，在实践中，由于获得的图像的对比度不足，并不总是能够清楚地区分细胞，甚至细胞的核或内部结构(特别是膜、细胞核、细胞质)。
例如，在图1的示例中，由于脂质和蛋白质结构的高折射率，源自胶原纤维的后向散射信号表现出高强度。相反，源自细胞内部结构的后向散射信号强度非常低，比胶原纤维低约400倍。由细胞和组织的不同结构后向散射的信号强度的差异解释了：尽管全场OCT技术具有优异的空间分辨率，但是该技术不能够以足够的动态范围获取低强度的信号。
在解剖病理学中使用的其他显微镜技术使得可以通过显微镜观察组织样品上的细胞和细胞结构：这些技术包括将待分析区域中的组织样品取出，然后制备可以在传统的显微镜下观察的组织片。制备包括将组织放入石蜡中，切成3至5μm厚度的非常薄的切片，并在这些切片上应用造影剂或着色剂，使得可以提高细胞结构的对比度并因此便于解剖病理学医生对其进行观察。通常，将苏木精和伊红的组合应用于这些切片，以特异性地着细胞的色支持结构和细胞核。也可以应用其他着色，以允许更具体地观察某些结构。然后将得到的组织切片置于显微镜载玻片上，由解剖病理学家以各种放大倍数观察。低倍放大的肉眼检查和高倍放大的显微镜检查使得可以观察组织样品上存在的组织结构和细胞细节。一套阅读标准使得可以对癌症进行诊断，例如检查由肿瘤侵入引起的基质反应，甚至检查单个细胞水平的细胞核/细胞质比例。
然而，这些显微镜技术存在几个缺点。首先，这些技术是破坏性的，因为，与使得能够获得组织样品的虚拟切片的图像的全场OCT技术相反，这些技术需要准备如所描述的样品的物理切片。因此，组织将不再可用于其他类型的分析。而且，这些技术依赖于样品的复杂制备，包括在多个步骤(放入石蜡、切割、标记)期间的物理处理以及使用外源造影剂如特定的细胞结构着色剂；因此，如此准备的样品的最终质量(因而相应诊断的质量)取决于操作者。最后，这些技术不适合围手术期使用，因为考虑到制备组织的不同步骤，在能够进行组织观察之前通常需要几天的时间。
因此需要一种成像技术来获取样品的图像，特别是生物组织的图像，其至少部分地补救了现有技术的局限性和/或缺点。
发明内容
根据第一方面，本说明书涉及用于散射三维样品的全场干涉显微镜成像的系统，其包括：
-干涉装置，其包括用于接收样本的目标臂和布置有反射表面的参考臂，当样品放置在干涉装置的目标臂上时，干涉装置适于在成像场的每个点处产生通过入射光波在与成像场的所述点相对应的反射表面的基本表面上的反射而获得的参考波与通过在给定深度处样品切片的体素对入射光波的后向散射而获得的物体波之间的干涉，所述体素对应于成像场的所述点，
-获取装置，其适于以所述目标臂与所述参考臂之间的固定光程差来获取由在所述成像场的每个点处产生的所述干涉产生的N个二维干涉测量信号的时间序列，
-处理单元，其被配置为计算表示所述N个二维干涉测量信号之间的强度时间变化的图像。
成像场的尺寸例如通过获取装置的有用检测表面或者通过成像系统的视场光阑来限制。因此，根据一个示例，样品切片(或相干切片)水平处的成像场是与获取装置的有用表面(或与视场光阑)共轭的区域。成像场的“点”在其尺寸上由获取装置的基本检测器的尺寸限定。
在本说明书中，对应于成像场的点的反射表面的基本表面表示在反射表面上定义的基本表面，并且其位置对应于关于与获取设备相关联的二维坐标系定义的成像场的点的位置。
在本说明书中，对应于成像场的点的体素表示在相干切片中定义的基本体积，并且其在相干切片中的位置对应于关于与获取设备相关联的二维坐标系定义的成像场的点的位置。由体素后向散射的波表示由存在于该体素中的所有基本散射结构后向散射的波的相干总和的振幅。
如此描述的成像系统使得可以获得表示具有固定光程差的干涉测量信号之间的强度时间变化的样品图像，并且申请人已经证明其使得能够访问通过根据现有技术的全场OCT技术获得的图像不可察觉的信息。在此，固定光程差应理解为参考臂和目标臂之间的光程变化是恒定的；例如，样品相对于反射表面的位置没有相对变化。
在细胞或细胞内成像领域中，与这种成像技术相关的优点特别来自于申请人对在细胞或细胞内水平发生的活动的观察结果，更具体地说，是导致干涉测量信号之间强度的时间变化的不同运动：液体的流动或循环，以及细胞骨架、细胞核、线粒体、溶酶体等不同器官(或“细胞器”)的细胞内运动。
根据成像系统的一个或多个实施方式，处理单元被配置为通过对于该图像中的给定位置的每个像素计算作为表示N个二维干涉测量信号的强度的时间变化的参数的值的函数的像素值来计算图像，所述N个二维干涉测量信号是在与获取装置相关联的二维坐标系中的相应位置的点处获取的。
提取表示在给定点处获取的干涉测量信号的强度在一段时间内的时间波动或变化的参数使得可以在计算的图像中显示其中有运动发生的样品的组织和细胞区域。
根据一个或多个实施方式，该参数是表示所考虑的N个二维干涉测量信号的强度的时间离散度的参数。这样的参数例如是强度的统计分布的标准偏差。以这种方式，执行表示在生物组织的给定点处后向散射的光强度的时间离散度的全局测量。
以图像形式来表示针对该参数获得的值使得能够揭示和观察发生运动的组织区域。
根据成像系统的一个或多个实施方式，图像的像素呈现至少一个相对于比色表示空间定义的分量，其值是所选参数的值的函数。例如，在灰度级的图像的情况下，因显著运动而活泼的、并因此该参数值较高的样品区域在这种图像中以高灰度级显现出来。另一方面，没有检测到运动并显示零参数值的部分将呈现非常低的灰度级。
这种图像获取方法在组织呈现多种结构并因此呈现多种扩散体的情况下特别有趣，对于这些扩散体，后向散射信号的动态范围非常宽。
根据成像系统的一个或多个实施方式：
-获取装置被配置为还针对干涉装置的两个臂之间的光程差的不同值获取相同样品切片的P个二维干涉测量信号，
-处理单元被配置为根据P个二维干涉测量信号的强度和上述强度的时间变化来计算称为组合图像的图像。
与通过根据现有技术的全场OCT成像方法获得的断层图像相比，组合图像构成样品的表示，其在存在于样品中的不同结构的信息上更全面和更丰富，因为其结合了根据现有技术的全场OCT成像方法可能获得的信息(这些信息表示由不同体素后向散射的信号的强度)和由表示由不同体素后向散射的信号强度的时间变化的信息。
根据成像系统的一个实施方式，处理单元被配置为通过对组合图像中给定位置的像素计算像素值来计算组合图像，该像素值一方面是所述P个二维干涉测量信号的强度的函数，所述P个二维干涉测量信号在与获取装置相关联的二维坐标系中的相应位置的点处获取；该像素值另一方面也是所述N个二维干涉测量信号的强度的时间变化的函数，所述N个二维干涉测量信号在与获取装置相关联的二维坐标系中的相应位置的点处获取。
根据本说明书的成像系统的不同实施方式可以彼此组合。
根据第二方面，本说明书涉及用于散射三维样品的全场干涉显微成像的方法，包括：
-将样品放置在干涉装置的目标臂上，
-通过干涉装置针对成像场的每个点产生参考波和物体波的干涉，所述参考波通过入射光波在干涉装置的参考臂的反射表面的基本表面上的反射而获得，所述基本表面对应于成像场的所述点，所述物体波通过在给定深度处样品切片的体素对入射光波的背反射而获得，所述体素对应于成像场的所述点，
-以目标臂和参考臂之间的固定光程差获取由成像场的每个点处产生的干涉所产生的N个二维干涉测量信号的时间序列，
-计算表示所述N个二维干涉测量信号之间的强度时间变化的图像。
根据成像方法的一个实施方式，计算图像的步骤包括针对图像中给定位置的每个像素计算作为参数的值的函数的像素值，该参数表示N个二维干涉测量信号的强度的时间变化，所述N个二维干涉测量信号在与获取装置相关联的二维坐标系中的相应位置的点处获取。
根据特定的实施方式，该参数表示所获取的N个二维干涉测量信号的强度的时间离散度。
根据成像方法的一个实施方式，图像的像素呈现至少一个相对于比色表示空间定义的分量，其值是所选参数的值的函数。
根据一个实施方式，成像方法还包括：
-针对干涉设备的两个臂之间的光程差的不同值获取样品切片的至少P个二维干涉测量信号，
-根据所述P个二维干涉测量信号的强度和上述强度的时间变化来计算称为组合图像的图像。
根据成像方法的一个实施方式，合成图像的计算包括对组合图像中给定位置的每个像素计算像素值，该像素值一方面是所述P个二维干涉测量信号的强度的函数，所述P个二维干涉测量信号在与获取装置相关联的二维坐标系中的相应位置的点处获取；该像素值另一方面也是所述N个二维干涉测量信号的强度的时间变化的函数，所述N个二维干涉测量信号在与获取装置相关联的二维坐标系中的相应位置的点处获取。
针对成像系统陈述的优点可以转换到根据本说明书的第二方面的成像方法。
根据本说明书第二方面的成像方法的不同实施方式可以相互组合。
本说明书的各个方面的不同特征和实施方式也可以彼此组合。
附图说明
参考附图阅读以下详细描述，上文提出的成像技术的其他优点和特征将变得显而易见，其中：
-图1(已经描述)是使用根据现有技术的全场OCT成像方法产生的具有胶原纤维的生物组织(大鼠肝脏)样品的被称为FFOCT图像的图像示例；这种方法在下文中将被称为FFOCT成像方法；
-图2是根据本说明书的成像系统的实施方式的理论框图；
-图3是根据本说明书的成像方法的实施方式的流程图；这种方法在下文中将被称为DC-FFOCT成像方法，
-图4是在相同的相干切片中相同的点处通过使用根据本说明书的DC-FFOCT成像方法获得的与图1所示相同样品的称为DC-FFOCT图像的图像示例；
-图5A和5B表示在DC-FFOCT成像方法的示例中在图4中呈现图像的样品的两个点处获得的信号的强度的变化曲线，形成部分区域的这两个点分别呈现了没有细胞内运动和有细胞内运动；
-图6A和6B表示信号强度的统计分布，其变化曲线分别在图5A和5B中表示；
-图7是用于生成组合图像的成像方法的实施方式的流程图；这种方法在下文中将被称为CDC-FFOCT(即“组合动态对比度FFOCT”)成像方法；
-图8是表示与图1和图4所示的相同的样品的、并且由参考图7描述的CDC-FFOCT成像方法在相同的相干切片中相同的点处产生的称为CDC-FFOCT图像的图像示例。
具体实施方式
成像系统
在图2中示意性地示出了适合于实现根据本说明书对三维样品成像的方法的成像系统20的实施方式。
成像系统20包括干涉装置200、获取装置208和至少一个处理单元220。
干涉装置200适于产生参考波和物体波的光学干涉。一方面，通过干涉设备的参考臂的反射表面205的每个基本表面使光源201发射的空间不相干且具有低相干长度的光反射而获得参考波；另一方面，通过样品206在深度方向上的切片的每个体素使相同来源发射的光后向散射而获得物体波，样品206被布置在干涉装置的目标臂上，所述体素和所述基本表面对应于成像场的相同点。
光源201是非相干或低相干长度(实践中，在1至20微米的范围内)的源，例如卤素灯或LED。根据一个或多个示例性实施方式，如图2的示例中那样，光源201可以形成成像系统20的一部分，或者可以是成像系统外部的元件，成像系统适于与由该源发出的光波协同工作。
获取装置208允许获取由参考波和物体波之间的干涉产生的至少一个二维干涉测量信号。
处理单元220被配置为执行至少一个处理由获取装置208获取的至少一个二维干涉测量信号的步骤和/或至少一个根据本说明书的至少一个成像方法的图像生成步骤，以便产生样品切片的至少一个图像。
在一个实施方式中，处理单元220是包括用于存储数字图像的第一存储器CM1(未示出)、用于存储程序指令的第二存储器CM2(未示出)以及数据处理器的计算装置，其能够执行存储在该第二存储器CM2中的程序指令，尤其是用于控制执行至少一个处理由获取装置208获取的至少一个二维干涉测量信号的步骤和/或至少一个根据本说明书的至少一个成像方法的图像生成步骤。
处理单元也可以以集成电路形式制造，其包括适合于实施本文件中针对处理单元描述的功能的电子组件。处理单元220也可以由一个或多个物理上不同的设备来实现。
获取装置208例如是CCD(电荷耦合器件)或CMOS(互补金属-氧化物-半导体)照相机型的图像传感器。该获取装置能够以高速率(例如以100Hz的频率)获取图像。根据所研究的样品的动力学，更具体地说是根据样品内部运动的动力学，可以使用从几赫兹到几千赫兹的相机。
根据一个实施方式，干涉仪200包括分束器元件202，例如非偏振分束器立方体，使得可以形成两个臂。在下文中将被称为“参考臂”的其中一个臂中，存在平坦的反射表面205，例如反射镜。在下文中将被称为“目标臂”的另一个臂旨在用于在操作中接收三维散射样品206，希望根据本说明书的方法之一在至少一个深度处产生该样品的切片的断层图像。
在图2的示例中，干涉仪是Linnik干涉仪型的，并且包括布置在每个臂上的两个相同的显微镜透镜203、204。反射表面205因此位于参考臂的透镜204的焦点处，并且样品206旨在位于目标臂的透镜203的焦点处。可以设想其他类型的干涉仪用于实现根据本说明书的方法，特别是迈克尔逊、米劳、菲佐及其他类型的干涉仪。
在干涉仪200的输出处有光学器件207，例如消色差双合透镜，其焦距适于允许由获取装置208对样品206进行适当的采样，并且其使得可以将位于两个透镜的焦点处的平面结合在干涉装置的输出处的同一平面上。获取装置208被放置在这同一个平面中以获取由干涉装置产生的干涉信号。为了不限制由显微镜透镜203和204所允许的分辨率，光学器件207的焦距的选择将符合香农准则(Shannon criterion)。光学器件207的焦距例如为几百毫米，典型地为300毫米。
如果需要的话，玻璃板209、210设置在每个臂上以补偿分散。
由于光源201具有较低的相干长度，所以只有当两臂中的光程相等时(相差大约相干长度)，由反射表面205反射的光(参考波)与由样品206后向散射的光之间的干涉才发生。因此，在样品的给定深度处，参考波与由位于与目标臂的光轴成直角的平面中的切片(称为相干切片)的每个体素后向散射的光之间发生干涉，体素是在相干切片中定义的基本体积。由每个体素后向散射的光表示由存在于该体素中的所有散射基本结构后向散射的波的相干总和的振幅。
由获取装置208在时刻t并行获取由参考波与不同体素后向散射的波之间的光学干涉产生的干涉测量信号。所产生的结果是对应于相干切片在给定时刻t的干涉状态的干涉测量图像S。位于相对于与获取装置208相关联的二维坐标系定义的给定位置(x,y)处的干涉测量图像元素或图像像素呈现对应于在时刻t、位置(x,y)处获取的干涉测量信号强度的值S(x,y,t)，该干涉测量信号由样品中对应位置的体素后向散射的波与对应位置的、参考臂的反射表面的基本表面反射的参考波之间的干涉产生。
更具体地说，由获取装置208在位置(x,y)和时刻t获取的干涉测量信号的光强度S(x,y,t)可以表示为：
其中：
S0是干涉仪输入处入射波的光强度；
RA(x,y)是与样品后向散射的、不干涉的光(即样品的位于相干切片之外的结构后向散射的光)的强度成比例的等效反射系数；
RB(x,y,t)是与在给定位置(x,y)和给定时刻t在相干切片中由样品206的体素后向散射的光的强度成比例的等效反射系数；
Rref是参考表面(反射表面205)的反射系数；
φ(x,y,t)是参考波与在时刻t由样品在位置(x,y)的体素后向散射的波之间的相对相位。
处理单元220被配置为根据由获取装置208获取的至少一个二维干涉测量信号生成样品206的图像。
在下文中更详细地描述用于使用这个成像系统以及用于从由这个成像系统产生的二维干涉测量信号生成图像的不同方法。
DC-FFOCT成像方法
参照图3描述根据本说明书的成像方法的实施方式的主要步骤，该方法称为DC-FFOCT(即“动态对比度FFOCT”)。该方法特别应用于细胞内成像，并且可以通过成像系统20来实施。
在初始步骤300中，初始化DC-FFOCT成像方法，并将样本206放置在干涉装置200的目标臂中可以分析第一样品切片的位置处。该第一切片是下面描述的步骤310至330的第一次执行的当前切片。
在步骤310中，在目标臂与参考臂之间具有固定光程差的情况下，获取装置208获取样品206的当前切片的N个二维干涉测量信号的时间序列。特别地，在这种情况下不产生光程差的变化，这与根据现有技术的全场OCT成像方法不同。
根据一个实施方式，通过将参考臂中的反射表面和干涉装置200的目标臂中的样品206保持在固定位置处来使光程差保持固定。在光程差不存在变化的情况下，对获得的样品切片的干涉信号的分析使得可以获得二维干涉测量信号，针对该样品切片中存在的结构清楚地显示样品206内部的运动。
获取二维干涉测量信号的序列和/或获取频率(以及因此获取的二维干涉测量信号的数量)的时间段可以以适合于要显示的细胞或细胞内运动的特征的方式来选择。例如，这些运动的速度越快，选择的获取频率越高，以便有针对性地对给定点的干涉测量信号的不同强度进行采样。另一方面，对于较慢的运动，较低的频率和较长的获取时间可能更适合。对于每秒100和1000个图像之间的获取频率(通常是每秒100个图像)，通常选择数量N在102和104之间(例如大约为1000)，即在0.1和100秒之间(通常为10秒左右)的一个时间段内进行一次获取。这些参数可以根据目标应用而变化：根据细胞的性质、根据要产生图像的不同病理学或根据使用的波长。在摄像机工作频率从几赫兹到一千赫兹的情况下，可以获得适合不同应用的采样。
二维干涉测量信号的获取(步骤310)产生N个干涉测量图像SNi(x,y)，其中SNi(x,y)是在相对于与获取装置208相关联的二维坐标系的位置(x,y)处由获取装置获取的信号的强度，i是从1到N变化的整数，(x,y)表示位置。这些干涉测量图像被存储在第一存储器CM1中，其可以被图像处理单元220访问或者被发送到处理单元220。
根据上面的等式(1)，在时刻t＝ti、位置(x,y)处获取的干涉测量信号的每个光强度SNi(x,y)采取以下形式：
其中，S0、RA(x,y)、Rref在上面的等式(1)中定义，RBi(x,y)是与在相干切片中的给定位置(x,y)处在时刻ti由样品206的体素后向散射的光强成比例的反射系数，而φi(x,y)是参考波与在时刻ti由样品在位置(x,y)的体素后向散射的波之间的相对相位。
实践中，申请人已经证明，散射体沿着平行于目标臂的光轴的轴线的移动(“垂直”移动)导致参考波与后向散射波之间的相对相位φ(x,y)的变化，而散射体在与目标臂的光轴成直角的平面中的移动(“水平”移动)导致与后向散射光强度成比例的反射系数RB(x,y)的变化。实践中，光强度SNi(x,y)之间的强度波动源自“水平”和“垂直”运动。
然后使用成像系统的处理单元220来计算表示由获取装置208所获取的这N个二维干涉测量信号之间的强度时间变化的图像(称为动态对比度图像或DC-FFOCT图像)。该动态对比度图像的计算包括下面的步骤320和330。
在步骤320中，针对由获取设备208获取的干涉测量图像中的像素的每个可能位置(x,y)，计算至少一个参数VN(x,y)的值，参数VN(x,y)表示步骤310中在样品206的当前切片的对应位置(x,y)处获取的二维干涉测量信号SNi(x,y)的强度的时间变化。
二维干涉测量信号SNi(x,y)的强度的时间变化特别是由于系数RBi(x,y)和相对相位φi(x,y)的时间变化，例如由于扩散体的移动(例如在细胞的情况下，在体素内的某些细胞内元素的移动)，其他项在获取N个干涉测量信号的时段内基本恒定。
在一个实施方式中，参数VN(x,y)表示所获取的二维干涉测量信号的强度的统计分布特性，特别是这些强度的时间离散度。
该参数VN(x,y)例如是该N个干涉测量图像序列中的强度SNi(x,y)的标准偏差的函数，i从1到N变化。例如：
其中
该参数VN(x,y)也可以是分别在N个干涉测量图像的不同子集上计算的标准偏差的平均值。
可以使用其他统计学或数学参数来表征像素的强度的时间变化的幅度和/或这些强度的离散度，诸如方差(标准偏差平方)、四分差、范围(最高值与最低值之间的差)等。
参数VN(x,y)也可以通过各种时空信号处理方法获得：为每个像素(x,y)获得的时间信号SNi(x,y)的自相关系数，或者例如奇异值分解。
在步骤330中，计算动态对比度图像IB或DC-FFOCT图像，其表示样品206的当前切片的N个二维干涉测量信号之间的强度时间变化。
在一个实施方式中，位于给定位置(x,y)处的图像IB的每个像素IB(x,y)表示针对该给定位置计算的在步骤320中选择的参数的值。例如，位于给定位置(x,y)处的图像IB的像素和/或关于比色表示空间定义的该像素的至少一个分量，呈现作为一计算值的函数的值，该计算值为在对应位置(x,y)处从步骤310中获取的N个干涉测量信号的的强度SNi(x,y)(i＝1到N)针对所关注的参数计算的值。
例如，当用于图像IB的比色表示空间是灰度级上的表示时，像素IB(x,y)的值可以等于值VN(x,y)或者是值VN(x,y)的函数(相差一比例因子)，以便例如获得在给定数量的比特上编码的灰度级。
根据另一示例，当用于图像IB的比色表示空间是根据RGB(红、绿、蓝)比色表示空间的表示时，IB图像中位置(x,y)处的像素IB(x,y)的至少一个分量R、G或B将等于VN(x,y)或者是VN(x,y)的函数(相差一比例因子)，以例如获得在给定数量的比特上编码的比色分量。
根据又一示例，当用于图像IB的比色表示空间是根据YUV(亮度/色度)比色表示空间的表示时，B图像中位置(x,y)处的像素IB(x,y)的至少一个分量Y、U或B将等于VN(x,y)或者是VN(x,y)的函数(相差一比例因子)，以例如获得在给定数量的比特上编码的分量。
然后可以将所产生的动态图像IB显示在链接到图像处理单元的显示屏230上。
图4表示通过DC-FFOCT成像方法针对与图1的图像中所示的样品的相同相干切片产生的动态图像IB的示例。该图像的像素以灰度级编码。图像对应于从大鼠肝脏提取的800μm×800μm大小的样品区域。在该图像中，精细结构是可辨别的，特别是单个细胞，这在图1中是不存在的。不仅可辨别肝细胞C1、C2(见虚线所示的区域)，而且可辨别它们的细胞核(在肝细胞C1的中间更深的圆形区域N1)。在根据现有技术的全场OCT成像技术针对相同样品切片获得的图1的图像中，这些细节不存在或不可见。
图4的示例特别说明了根据本说明书的方法对细胞和细胞内成像的益处，并且特别突出显示了细胞和细胞内结构的对比度的显著增强。
在微观尺度上，特别是在细胞或细胞内水平上，发生各种运动：液体的流动或循环，以及不同组织器官(或“细胞器”)如细胞核、线粒体、溶酶体等的细胞内运动。不仅适用于活人体和动物或植物的体内组织，而且适用于新鲜取自活人体和动物或植物的样品。例如，样品的人类细胞的完全死亡(细胞凋亡)仅发生在从活人体采集该样品24-48小时后。在此期间，可以检测到持续的生命和运动，特别是在细胞中。
生物组织还表现出光学后向散射特性，使得入射光束的大约千分之几到百万分之几的功率被这些组织后向散射，这是由于在这些组织中存在不同结构(在下文中被称为“散射体”)，其尺寸小于或接近光束的波长。
存在于组织中的精细结构如细胞内结构的运动产生后向散射束的相位差，并且通过干涉产生由干涉显微镜获得的信号的光强度的时间变化。通过以给定频率获取相同样品切片的二维干涉测量信号序列，可以在给定时间段内检测这些强度的时间变化。通过在目标臂和参考臂之间具有固定光程差的情况下继续获取二维干涉测量信号，申请人已经表明可以以期望的速率对由样品切片中连续发生的干涉状态所产生的二维干涉测量信号进行采样，并且继续分析这些二维干涉测量信号之间的强度时间变化，以便产生样品的组织区域的图像，在这些组织区域中发生的运动是这些强度的时间变化的源头。
作为示例，图5A和图5B示出了获取装置208针对与图4所示的图像IB中的两个位置(x1,y1)和(x2,y2)分别对应的两个位置获取的二维干涉测量信号的强度的时间变化。图6A和6B表示分别在图5A和5B中示出变化曲线的信号强度的统计分布。对于与获取装置208相关联的二维坐标系中的第一位置(x1,y1)，在图5A中可以看出，记录在12位上的信号的强度总体上在3445和3450之间变化(即，约5个单位的变化)，其时间和平均分布随时间基本稳定。在该位置(x1,y1)，例如位于图4所示的区域S2中的以胶原纤维为中心的位置，推断不存在运动。对于第二位置(x2,y2)，例如位于图4所示的区域S3中的肝细胞内部的位置，在图5B中可以看出，信号的强度总体上在3231和3239之间变化(即约9个单位的变化)，随着时间的推移具有更大的时间离散度和基本上可变的平均值。图5B另一方面表示存在细胞内运动的位置(x2,y2)。通过与图6A和图6B比较可以观察到，相对于图5A所示示的信号的强度的时间离散度(图6A所示)，图5B所示的信号的强度的分布有更大的时间离散度(图6B所示)。
在对给定相干切片计算了DC-FFOCT图像之后，在步骤340中确定是否获取另一样品切片的DC-FFOCT图像。在肯定的情况下，在步骤340期间沿着目标臂的光轴调整样品的位置，并且对成为当前切片的该样品的第二切片重复步骤310到330。否则，该方法终止。
因此，可以通过改变样品206的位置并因此改变在干涉装置的两个臂中的光程相等的情况下相干切片在样品206的深度方向的位置，以及通过对该相干切片重复干涉测量信号获取和图像生成过程来获得样品206的三维图像。
生成动态图像IB的步骤320和330也可以在步骤340之后执行，针对每个样品切片将在步骤310中获取的N个干涉测量图像保留在存储器中。
样品切片的图像获取步骤310也可以与样品206的前一切片的动态图像的生成步骤320和330并行执行。
CDC-FFOCT成像方法
参考图7和图8描述用于生成组合图像的方法的实施方式的步骤，也称为CDC-FFOCT(即“组合动态对比度FFOCT”)成像方法。
通过使用成像系统20和调制装置211来实现CDC-FFOCT成像方法，该调制装置211适合于改变参考波和后向散射波之间的相对相位。根据一个示例，调制装置使得可以产生反射表面相对于样品的相对运动，例如借助用于反射表面的运动的压电板；所产生的结果是干涉装置200的目标臂和参考臂之间的光程差的变化，如将在下文中更详细描述的。
在初始步骤700中，CDC-FFOCT成像方法被初始化，并且样品206被放置在干涉装置200的目标臂中可以分析第一样品切片的位置处。该第一切片是用于下面描述的步骤710至730的第一次执行的当前片段。
步骤710与针对DC-FFOCT成像方法描述的步骤310相同。具体而言，在目标臂与参考臂之间具有固定光程差的情况下，获取装置208获取样品206的当前切片的N个二维干涉测量信号的时间序列。
在步骤720中，根据一个示例性实施方式，针对干涉装置200的目标臂与参考臂之间的光程差的不同值，获取装置208获取样品206的当前切片的P个二维干涉测量信号的序列。光程差的变化例如通过借助于压电板211使参考表面205平行于参考臂的光轴移动来产生，例如根据产生光程差调制的正弦函数的移动。然后，由获取装置208执行的与图像捕获的同步可以使得为二维干涉测量信号的相位的预定值记录干涉测量图像。
从步骤720中的干涉测量信号的获取产生表示为SP j的P个干涉测量图像，其中SPj(x,y)是针对参考波与后向散射波之间的相对相位在位置(x,y)处获取的干涉测量信号的强度，j是从1到P变化的整数，P≥2，并且(x,y)表示相对于与获取装置208相关联的二维坐标系的位置。这些干涉测量图像SP j(x,y)被存储在处理单元220可访问的存储器CM1中，或者被发送到处理单元220。
获取装置208针对位置(x,y)和相对相位获取的干涉测量信号的光强度SP j(x,y)可以写成如下形式：
其中，S0、RA(x,y)、Rref在上面的等式(1)中已经定义，RB(x,y)是与在相干切片中的给定位置(x,y)处由样品206的体素后向散射的光强成比例的等效反射系数，而φj(x,y)是参考波与由样品在位置(x,y)的体素后向散射的波之间的相对相位。
根据已知方法，通过强度值SP j(x,y)的组合来获得所得到的全场OCT图像的每个像素值(与系数RB(x,y)相对应)。
例如，在由反射面相对于样品的相对运动的时间调制导致相位变化的情况下，相位φj(x,y)对应于在时刻t＝tj处参考波和由样品在位置(x,y)处的体素后向散射的波之间的相对相位。然而，申请人已经证明，系数RB(x,y)的时间波动相对于所寻求的系数RB(x,y)是非常低的(通常差1000倍)。因此，可以合理地将RB(x,y)近似为相对于时间为常数。
在一个实施方式中，针对与相对相位φj(x,y)之间的相移π相对应的两个光程差值，获取P＝2个干涉测量图像。因此，针对相对相位的第一值φ1(x,y)记录第一干涉测量图像，并针对相对相位的第二值φ2(x,y)记录第二干涉测量图像，例如φ2(x,y)＝φ1(x,y)+π。通过计算针对两个相对相位值φ1(x,y)和φ2(x,y)分别获得的两个强度值SP 1(x,y)和SP 2(x,y)之间的差值，然后通过计算这两个值SP 1(x,y)和SP 2(x,y)之差的绝对值，来获得对应于系数RB(x,y)的所得到的全场OCT图像的每个像素值。
之前描述的获取P个二维干涉测量信号的技术对应于根据现有技术的FFOCT成像方法中使用的技术。可以使用根据现有技术的全场FFOCT成像方法的任何其他方法计算RB(x,y)。
特别地，可以以已知的方式进行光程差的调制以及由检测装置同步的检测，以便针对P个光程差值获取P干涉测量信号以确定FFOCT图像。也可以将干涉测量信号在部分调制周期(例如4个周期)上进行积分，以获得干涉测量信号的振幅和相位。
也可以在同一时间(同一时刻)获取与不同的相对相位值(例如由π分开的两个相对相位值，例如通过以π的相移对2个光束进行空间分裂)对应的数个干涉测量图像。
在步骤730中，然后使用成像系统的处理单元220来计算被称为组合图像或CDC-FFOCT图像的图像，该图像还表示通过获取装置208在步骤710中获取的N个二维干涉测量信号之间的强度时间变化。
组合图像IC由一方面在步骤720中通过获取装置208获取的P个二维干涉测量信号的强度以及另一方面在步骤710中通过获取装置208获取的N个二维干涉测量信号之间的强度时间变化来计算。
在第一实施方式中，根据在步骤710中由获取装置208获取的N个二维干涉测量信号之间的强度时间变化计算第一中间图像IB或动态对比度图像，并根据在步骤720中由获取装置208获取的P个二维干涉测量信号的强度来计算被称为断层图像的第二中间图像IA。然后通过这两个中间图像IA和IB的像素对应像素的组合来计算组合图像IC。像素对应像素的组合在这里应该被理解为是指图像IA中位置(x,y)处的像素IA(x,y)与图像IB中相同位置(x,y)处的像素IB(x,y)组合。
在第二实施方式中，不生成中间图像，并且通过从所获取的干涉测量信号的强度直接计算组合图像的像素来计算组合图像IC。具体地，对于组合图像IC中给定位置(x,y)处的像素，像素值IC(x,y)被计算为：一方面作为在与获取装置相关联的二维坐标系中的相应位置的点处获取的P二维干涉测量信号的强度的函数，另一方面作为在与获取装置相关联的二维坐标系中的相应位置的点处获取的N个二维干涉测量信号的强度时间变化的函数。
在第一实施方式中，如在第二实施方式中那样，通过组合两个像素值IA(x,y)和IB(x,y)来计算组合图像中给定位置(x,y)的像素值IC(x,y)，其中：
-根据针对位置(x,y)的光程差的不同值获取的P个二维干涉测量信号的强度来计算值IA(x,y)，并且其表示与由样品的相干切片的给定体素后向散射的波的强度成比例的系数RB(x,y)，并且
-根据以固定光程差获取的N个二维干涉测量信号的强度来计算值IB(x,y)，并且其表示在与获取装置相关联的二维坐标系中的相应位置的点处获取的N个二维干涉测量信号之间确定的强度时间变化。
例如，根据针对步骤330所描述的方法来计算值IB(x,y)。特别地，值IB(x,y)可以作为至少一个参数VN(x,y)的值的函数来计算，参数VN(x,y)表示N个干涉测量信号之间的强度SNi(x,y)的时间变化。
这里假设对于像素值的组合，已经执行了步骤710和720中执行的信号的获取，使得在步骤710中针对位置(x,y)获取的信号SNi(x,y)与在步骤720中为位置(x,y)获取的信号SPj(x,y)来源于样品206的相同体素：如果在步骤710和720的执行期间样品206和获取装置208都不移动，并且获取装置208在步骤710和720中获取相同分辨率的图像并且通过使用相同的二维坐标系统，则情况将如此。
执行像素值IA(x,y)和IB(x,y)的组合，使得分别包含在图像IA(x,y)和IB(x,y)中的针对样品206的给定体素的信息存在于所得到的组合图像IC中。可以执行这种组合，使得观看所得到的图像IC的用户能够将图像IA(断层图像)中显示的结构与图像IB(动态对比度图像)中显示的结构的波动区分开。
特别地，位于图像IC中的给定位置(x,y)的组合图像的像素的值IC(x,y)是位于断层图像IA中的相同位置(x,y)的像素的值IA(x,y)的函数以及针对该位置(x,y)计算的在步骤720中使用的参数的值的函数。像素IC(x,y)可以呈现关于比色表示空间定义的分量。
因此，对于样品206的给定点，用户将能够观看包含来源于非相干光的已知全场干涉显微成像的信息和关于通过根据本说明书的DC-FFOCT成像方法显示的样品206的精细结构的运动的信息的图像。
用于组合这些值IA(x,y)和IB(x,y)的各种方法是可能的，下文描述的方法作为非限制性示例给出。
第一组合方法在于，对于组合图像的区域中的每个位置(x,y)，将像素值IA(x,y)分配给图像IC的像素IC(x,y)的第一比色分量IC，并将像素值IB(x,y)分配给该像素IC(x,y)的第二比色分量。例如，通过使用根据RGB比色表示空间的表示，图像IC中位置(x,y)处的像素IC(x,y)的分量R将等于像素值IA(x,y)，并且图像IC中位置(x,y)处的像素IC(x,y)的分量B(蓝色)将等于像素值IB(x,y)，反之亦然。
第二组合方法在于定义两个查找表TA、TB(由首字母缩写词LUT表示)：用于像素值IA(x,y)的第一查找表TA和用于像素值IB(x,y)的第二查找表TB。每个查找表TA或TB分别用于针对组合图像的区域中的每个可能位置(x,y)计算像素值TA(x,y)或TB(x,y)，分别由像素值IA(x,y)或IB(x,y)通过查找表TA或TB的变换而来。然后通过像素值TA(x,y)和像素值TB(x,y)的组合函数来获得图像IC中位置(x,y)处的像素IC(x,y)的值。该组合函数例如是像素值TA(x,y)和TB(x,y)的“逻辑或”，或者是这两个像素相加的函数，或者是平均值或由加权系数加权的和值的计算。
取决于所选择的组合方法，得到的图像IC可以是彩色图像或灰度图像。
然后在步骤730中，如此生成的组合图像IC可以被显示在连接到图像处理单元的显示屏230上。
图8表示由图1所示的图像IA与图4所示的图像IB的组合得到的图像IC的示例。用于组合的方法例如是如上所述的第二种方法。这些图像中的每一个代表与图1A和1B(大鼠肝脏的生物组织)中成像的区域和切片相同的同一区域及具有800μm×800μm大小的同一样品切片。通过将图1的图像IA与图8的图像IC相比较，清楚地显现出，图像IC在精细结构上比图像1A丰富得多，但其仍然包括图1的图像IA的信息。图像IC的这些精细结构实际上对应于所关注的样品切片中检测到的波动：图8的图像的精细结构是源自已经与图像IA(图1)组合的图像IB(图4)。
作为一个示例，在图1的图像IA中可以辨别大量的胶原纤维、胶原纤维集中的区域S2和区域S1中大毛细血管，但是不能辨别单独的细胞。相比之下，在图4的图像IB中，在区域C1、C2或S3中能辨别单独的细胞，但不能辨别区域S2的胶原纤维或区域S1的大毛细血管。在图像IC中，胶原纤维(区域S2)、大毛细血管(区域S1)和单个细胞(区域C1、C2或S3)均能辨别。
借助于组合图像IC，用户可以得到包含关于存在于样品切片中的结构的大量视觉信息的单个图像，比如表示该相同的样品切片的运动和细胞或细胞内活动的波动的信息。
一旦针对样品的给定相干切片计算了CDC-FFOCT组合图像，就在步骤740中确定是否为另一相同样品切片产生CDC-FFOCT组合图像。在肯定的情况下，在步骤740中沿着目标臂的光轴调整样品的位置，并且针对成为当前切片的该第二样品切片重复步骤710到730。否则，该方法终止。
因此，可以通过改变样品206的位置并因此改变在干涉装置的两个臂中的光程相等的情况下相干切片在样品206的深度方向的位置，以及通过对该相干切片重复干涉测量信号获取和图像生成过程来获得样品206的三维图像。
上文所述的DC-FFOCT和CDC-FFOCT成像方法特别适用于获取细胞或细胞内图像的图像，并且可证明特别适用于诊断癌症，其中细胞细节的检查被证明是必要的。特别地，DC-FFOCT和CDC-FFOCT成像方法产生的对比度的动态起源可以使得除了观察细胞的细节之外还可以观察细胞的活动并辨别细胞的代谢状态(过度活跃、死亡细胞、坏死)。
它们也可以被普遍地应用于其中待分析样品的相干切片的不同体素显现出运动、活动、功能、机制或物理化学性质导致由这些体素反射的光强度的时间变化的所有情况。它们也适用于任何样品，无论这些样品是否是生物样品。

Claims (12)

1.一种用于散射三维样品(206)的全场干涉显微成像的系统(20)，包括：
-干涉装置(200)，其包括用于接收样品的目标臂和布置有反射表面(205)的参考臂，当样品放置在干涉装置的目标臂上时，干涉装置适于在成像场的每个点处产生通过在与成像场的所述点相对应的反射表面(205)的基本表面上使入射光波反射而获得的参考波与通过在给定深度处样品切片的体素对入射光波的后向散射而获得的物体波之间的干涉，所述体素对应于成像场的所述点，
-获取装置(208)，其适于以目标臂与参考臂之间的固定光程差来获取由在成像场的每个点处产生的所述干涉所产生的N个二维干涉测量信号的时间序列，
-处理单元(220)，其被配置为计算表示所述N个二维干涉测量信号之间的强度时间变化的图像(IB,IC)。
2.根据权利要求1所述的成像系统，其中，处理单元(220)被配置为通过对于所述图像中的给定位置的每个像素计算像素值来计算所述图像，所述像素值为表示在与获取装置相关联的二维坐标系中的对应位置的点处获取的所述N个二维干涉测量信号的强度的时间变化的参数的值的函数。
3.根据权利要求2所述的成像系统，其中，所述参数表示所述N个二维干涉测量信号的强度的时间离散度。
4.根据权利要求2和3中任一项所述的成像系统，其中，所述像素呈现至少一个相对于比色表示空间定义的分量，所述分量的值是所述参数的值的函数。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的成像系统，其中，
-获取装置进一步被配置为针对干涉装置的两个臂之间的光程差的不同值获取样品切片的P个二维干涉测量信号，
-处理单元被配置为根据所述P个二维干涉测量信号的强度和所述强度时间变化来计算称为组合图像的图像(IC)。
6.根据权利要求5所述的成像系统，其中，处理单元(220)被配置为通过对于所述组合图像中的给定位置的像素计算像素值来计算所述组合图像，所述像素值一方面作为在与获取装置相关联的二维坐标系中的相应位置的点处获取的所述P二维干涉测量信号的强度的函数，另一方面作为在与获取装置相关联的二维坐标系中的相应位置的点处获取的所述N个二维干涉测量信号的强度时间变化的函数。
7.一种用于散射三维样品(206)的全场干涉显微成像方法，包括：
-将样品放置在干涉装置的目标臂上，
-通过干涉装置(200)针对成像场的每个点产生参考波和物体波的干涉，所述参考波通过在干涉装置的参考臂的反射表面(205)的基本表面上使入射光波反射而获得，所述基本表面对应于成像场的所述点，所述物体波通过在给定深度处样品切片的体素对入射光波的后向散射而获得，所述体素对应于成像场的所述点，
-以目标臂和参考臂之间的固定光程差获取由成像场的每个点处的干涉所产生的N个二维干涉测量信号的时间序列，
-计算表示所述N个二维干涉测量信号之间的强度时间变化的图像(IB,IC)。
8.根据权利要求7所述的成像方法，其中，图像的计算步骤包括针对所述图像中的给定位置的每个像素计算像素值，所述像素值为表示在与获取装置相关联的二维坐标系中的相应位置的点处获取的所述N个二维干涉测量信号的强度时间变化的参数的值的函数的。
9.根据权利要求8所述的成像方法，其中，所述参数表示所述N个二维干涉测量信号的所述强度的时间离散度。
10.根据权利要求8和9中任一项所述的成像方法，其中，所述像素呈现至少一个相对于比色表示空间定义的分量，所述分量的值是所述参数的值的函数。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的成像方法，还包括：
-针对干涉设备的两个臂之间的光程差的不同值获取样品切片的至少P个二维干涉测量信号，
-根据所述P个二维干涉测量信号的强度和所述强度时间变化来计算称为组合图像的图像(IC)。
12.根据权利要求11所述的成像方法，其中，对于组合图像的给定位置的每个像素，计算组合图像包括计算像素值，所述像素值一方面作为在与获取装置相关联的二维坐标系中的相应位置的点处获取的所述P二维干涉测量信号的强度的函数，另一方面作为在与获取装置相关联的二维坐标系中的相应位置的点处获取的所述N个二维干涉测量信号的强度时间变化的函数。
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