CN110799829B - 用于在环境室中的生物细胞样品的三维无标记光学成像的系统和方法 - Google Patents

用于在环境室中的生物细胞样品的三维无标记光学成像的系统和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种在环境室(例如成像培养箱)内实现的新颖的无标记层析成像干涉测量技术，其提供对生物细胞的三维(3D)折射率分布的快速捕获。

Description

用于在环境室中的生物细胞样品的三维无标记光学成像的系 统和方法
技术领域
本发明涉及一种用于容纳在环境室(environmental chamber)中的生物细胞样品的三维无标记光学成像的系统和方法。
背景技术
下面列出了被认为是与本公开的主题的背景相关的参考文献：
1.Choi,W.等人Tomographic phase microscopy.Nat.Methods 4,717–719(2007).
2.Isikman,S.O.等人Lens-free optical tomographic microscope with alarge imaging volume on a chip.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108,7296–7301(2011).
3.Kim,K.等人High-resolution three-dimensional imaging of red bloodcells parasitized by plasmodium falciparum and in-situ hemozoin crystalsusing optical diffraction tomography.J.Biomed.Opt.19,011005(2014).
4.Sung,Y.等人Optical diffraction tomography for high resolution livecell imaging.Opt.Express 17,266–277(2009).
5.Hsu,W.C.,Su,J.W.,Tseng,T.Y.&Sung,K.B.Tomographic diffractivemicroscopy of living cells based on a common-path configuration.Opt.Lett.39,2210–2213(2014).
6.Yoon,J.等人Label-free characterization of white blood cells bymeasuring 3D refractive index maps.Biomed.Opt.Express 6,3865–3875(2015).
7.Lue,N.等人Synthetic aperture tomographic phase microscopy for 3Dimaging of live cells in translational motion.Opt.Express 16,16240–16246(2008).
8.Charrière,F.等人Cell refractive index tomography by digitalholographic microscopy.Opt.Lett.31,178–180(2006).
9.Charrière,F.等人Living specimen tomography by digital holographicmicroscopy：morphometry of testate amoeba.Opt.Express 14,7005–7013(2006).
10.Habaza,M.,Gilboa,B.,Roichman,Y.&Shaked,N.T.Tomographic phasemicroscopy with rotation of live cells in suspension by holographic opticaltweezers.Opt.Lett.40,1881–1884(2015).
11.Kim,K.,Yoon,J.&Park,Y.K.Simultaneous 3D visualization and positiontracking of optically trapped particles using optical diffractiontomography.Optica 2,343–346(2015).
12.Shaked,N.T.Quantitative phase microscopy of biological samplesusing a portable interferometer.Opt.Lett.37,2016-2019(2012).
13.Girshovitz,P.&Shaked,N.T.Compact and portable low-coherenceinterferometer with off-axis geometry for quantitative phase microscopy andnanoscopy.Opt.Express 21,5701–5714(2013).
14.Kak,A.C.&Slaney,M.,Principles of Computerized Tomographic Imaging(IEEE Press,1988).
在本文对上面的参考文献的确认并不应被推断为意指这些参考文献以任何方式与本公开的主题的专利性相关。
背景
生物细胞是三维(3D)实体，当它们在体外时在三维中使它们成像而不使用染色来增强对比度是极大的挑战，因为它们在普通光学显微镜下大部分是透明的。作为例子，在体外受精(IVF)后需要使皿(dish)中的女性卵子(occyte)成像。在体外受精(IVF)之后且在植入子宫中之前的多达六天使受精卵成像的能力在IVF过程的成功中起重要作用，该成功在怀孕和健康婴儿的出生的成功中被估量。受精卵(例如其他活生物细胞)是不断调整它们的大小、形状和其他生物物理特征的3D动态物体。
一般来说，使细胞现象可视化需要可以实现高数据采集速率同时持有观察细微的细胞特征的分辨率和对比度的显微技术。然而，(在皿中或在试管中的)体外细胞是大部分透明的3D物体，其具有与它们的周围环境非常相似的吸光度和反射特性，且因此传统的基于强度的光显微镜方法缺乏所需的灵敏度。传统的相差成像方法(例如Zernike的相差和微分干涉差(DIC))不是定量的，并且呈现显著的成像伪差。间接细胞分析依赖于使用外源标记剂(例如易于光漂白的荧光染料)对特定细胞实体的标记，且可能损害样品生存能力。
总体描述
在辅助生殖技术(ART)以及通常在细胞的体外诊断(IVD)的领域中的关键努力旨在实现负担得起的无标记成像，但在本领域中仍然存在提供细胞的全定量成像的需要。具体对于卵子来说，这种成像被用作评估它的质量的手段，同时在环境室(例如，成像培养箱)内部，提供所需的恒定温度和气体供应(因为为了成像而将卵子移入和移出培养箱损害它的生存能力)。用于在环境室中使受精卵成像的目前可用的成像技术使用无标记明视场显微术或无标记微分干涉差(DIC)显微术。无标记明视场显微术缺乏表征受精卵质量的所需成像对比度。DIC显微术不是定量成像技术；它只允许看到内部部件的边缘，但不允许从卵子上的所有点获得有意义的对比度。此外，在典型的0.13mm卵子中，它只允许大约10个轴向截面。
目前，不存在呈现获取受精卵在培养箱中时的3D图像而不在小于1微米的x-y-z分辨率处进行标记的可能性的无标记成像技术。
在体外的生物细胞在普通光学显微镜下是大部分透明的，且因此不能在没有外部着色剂或造影剂的情况下很好地成像，外部着色剂或造影剂可能对细胞是有害的并且在某些医疗程序中是不被允许的。因为离轴全息摄影术记录说明细胞折射率和物理厚度的定量相位剖面，所以本发明以极大的对比度且在不需要外部造影剂的情况下提供来自单次摄像机曝光的细胞的定量地形图(topographic map)。此外，即使在流式细胞术中使用造影剂，相位剖面是定量的并说明细胞内部折射率的事实也产生以前在流式细胞术中获取不到的具有医学相关性的新参数，例如细胞的干质量。
宽视场干涉测量相位显微术对在不使用标记的情况下使生物细胞定量地成像是有用的。这通过捕获样品的复合波前(complex wave front)来完成，该复合波前包含说明细胞厚度及其折射率内容的样品的二维(2D)光路延迟(OPD)图。为了获得OPD图，该技术在摄像机上产生在穿过样品的光和不包含空间样品信息的参考光束之间的干涉。在光束之间引入小的离轴角度以允许来自单次摄像机曝光的OPD图重建。
为了在无标记干涉测量相位成像中获得三个空间维度，层析成像干涉测量术捕获从不同角度穿过细胞透射的光的复合波前，使得能够进行样品的3D折射率图的计算。为了从多个角度观察样品，我们可以旋转照明光束，同时保持被测样本静止[1-6]。这种方法在数据采集期间对样品是非侵入的。然而，照明的接受角度通常被限制到140°，导致在角频谱(angular spectrum)中缺少数据点。可选地，细胞可以在层流期间但以有限的角度范围并且在没有对视角的经验证的控制[7]的情况下被成像。其他方法通过旋转整个样品[8]或膜片钳(patch clamp)单细胞[9]来允许全角度范围。然而，这些方法不允许在悬浮液中的细胞的非侵入性3D成像。为了应对这一障碍，最近提出了将全息光镊与层析成像干涉测量术结合在一起[10,11]。一种方法能够在整个180°范围内旋转小的且相对密集(dense)的细胞[10]。
本发明提供一种在环境室(例如成像培养箱)内部实现的新颖的无标记层析成像干涉测量技术，这种技术提供对生物细胞的三维(3D)折射率分布的快速捕获。根据本发明的一个广泛方面，提供一种用于在体外的生物细胞的样品的非侵入性成像而无需标记的系统。样品可以至少包含生物细胞，例如受精卵或癌细胞。在这方面，应当注意，本发明不限于任何类型的生物细胞。该系统尤其包括用于容纳样品的环境室。该环境室包括干涉测量层析成像模块，干涉测量层析成像模块被配置成和可操作来产生朝向样品的照明光束并在不同角度处产生生物细胞的多个干涉测量投影。该系统还包括控制单元，控制单元被配置成和可操作来执行照明光束的旋转和/或样品的旋转，接收干涉测量投影图像，处理这些图像以将相位投影创建到3D傅里叶空间中，以及生成样品的三维折射率分布。该新颖的技术通过旋转细胞本身或通过围绕细胞旋转照明光束来执行这种成像。为了获得层析成像，假设细胞在测量的时间(几秒钟)期间不是动态的。然后，可以改变照明角度以获得多个视点。可选地，照明角度保持不变，且使用显微操纵方法使细胞本身在3D中旋转。环境室可以包括捕集元件(trap element)，捕集元件被配置成和可操作来捕集样品并使样品在大约0°至大约360°的旋转角度范围内旋转。因此，捕集元件可包括光镊、介电电泳(DEP)或流控旋转元件中的至少一个，以在干涉测量投影被拍摄时实现在当在不同角度处产生样品的多个干涉测量投影期间使在环境室内的细胞的旋转。
然后，细胞的干涉测量投影由成像干涉测量层析成像模块拍摄，并由控制单元处理成整个细胞的3D折射率图。干涉测量层析成像模块可以包括离轴干涉仪和明视场显微镜。这通过使用滤波反投影或衍射理论重建算法将相位投影映射到3D傅里叶空间中来实现。接下来，细胞的定量参数和蛋白质含量可以由控制单元基于它的3D折射率分布来计算。在一些实施例中，控制单元被配置成和可操作来计算包括样品的3D蛋白质含量的定量参数，这些定量参数包括细胞的体积、表面积、3D形状和干质量密度中的至少一个。控制单元耦合到干涉测量层析成像模块用于接收干涉测量图像并处理这些图像。可以通过IR(红外)、RF(包括蓝牙的射频)或电缆控制来连接干涉测量层析成像模块和控制电路。应当注意，所有需要的处理操作(例如接收图像数据、旋转照明光束、旋转样品、将相位投影创建到3D傅里叶空间中、生成3D折射率分布、提供定量相位图)可以通过控制单元(例如DSP、微控制器、FPGA、ASIC等)或任何其他常规和/或专用计算单元/系统来执行。术语“控制单元”应该被宽泛地解释为覆盖具有数据处理能力的任何类型的电子设备，作为非限制性例子包括个人计算机、服务器、计算系统、处理器(例如，数字信号处理器(DSP)、微控制器、现场可编程门阵列(FPGA)、专用集成电路(ASIC)等)、智能电话、平板计算机和其它电子计算设备。控制单元可以包括用软件进行编程以执行下面在本文中描述的功能的通用计算机处理器。
在一些实施例中，该技术通过假设恒定的旋转角度和全(360°)旋转的周期来提供在任何轴上的旋转角度范围的全覆盖以及关于视角的知识。
在一些实施例中，细胞通过介电电泳力以非侵入性和精确的方式被捕集并快速旋转。被旋转的细胞的干涉测量投影由控制单元获取并处理成细胞的3D折射率图。
在一些实施例中，由于系统的紧凑性，本发明的技术使得能够使在环境室内的生物细胞成像。环境室(例如成像培养箱)被配置成便于监控和/或控制环境因素，包括温度、压力、湿度、电场、氧气水平等。该新技术提供无需标记细胞的在3D中光学地成像并计算细胞的3D蛋白质含量。使用层析成像相位显微术(光学相位图像的计算机层析成像法(CT))，在环境室内部的细胞的图像使用干涉测量法从多个视点来获取，并且干涉测量投影用于在所有轴上在大约0.5微米分辨率处重建样品的3D折射率分布而无需标记。因此在一些实施例中，控制单元被配置成和可操作来重建样品的3D折射率分布。此外，使用重建的3D分布，计算临床值的各种参数，帮助临床医生选择最佳细胞。有价值的参数尤其包括胚胎3D非特异性蛋白质含量(干质量)、它的细胞器体积、表面积和3D形状。具体地，因为本发明能够便于在IVF中的受精卵的选择，因而可能导致妊娠率的增加。
在一些实施例中，环境室包括微流控通道，该微流控通道被配置成和可操作来执行下列操作中的至少一项：基于DEP力使至少一个生物细胞流动、被捕集、旋转，以及操纵样品。
在一些实施例中，该系统包括环境条件控制模块，该环境条件控制模块耦合到环境室并且被配置成和可操作来测量和维持在环境室内的环境条件。
在一些实施例中，干涉测量层析成像模块被配置成和可操作来同时在不同角度处照亮样品以从而执行光学多路复用，使得多个旋转全息图同时被投影。干涉测量层析成像模块可包括光栅元件，该光栅元件被配置成和可操作来将照明光束分成多个间隔开的光束以从而在空间频率域中分离复合波前。该系统可以包括检测器，该检测器被配置为同时一起获取在空间频率域中不重叠的多个离轴干涉图样。
在一些实施例中，环境室包括被配置成保持样品的采样保持器。采样保持器具有不平坦的底表面。采样保持器的底表面限定由至少两个倾斜交叉横截面形成的顶点。环境室可以包括照明源和在照明源下游的扫描旋转反射表面。扫描旋转反射表面可以被配置成接收来自照明源的照明光束，并且在不同角度处顺序地将照明光束导向样品。
根据本发明的另一个广泛方面，还提供了一种用于包含至少一个细胞的样品的非侵入性成像而不使用标记的方法。该方法包括下列步骤：将样品容纳在环境室内；使在环境室内的样品成像；旋转照明光束同时保持样品静止和/或旋转样品；在不同角度处生成多个3D干涉测量投影；以及处理图像以将相位投影创建到3D傅里叶空间中，并生成样品的3D折射率分布。
在一些实施例中，该方法还包括同时在不同角度处照亮样品。
在一些实施例中，该方法还包括将照明光束分成多个间隔开的光束以从而在空间频率域中分离复合波前，以及将多个旋转全息图同时投影到摄像机上。
在一些实施例中，该方法还包括同时一起获取在空间频率域中不重叠的多个离轴干涉图样。
在一些实施例中，旋转照明光束同时保持样品静止的步骤和/或旋转样品的步骤包括控制离轴干涉图样的条纹取向。
根据本发明的另一个广泛方面，还提供了一种用于保持待旋转的样品的环境室。该新颖的环境室不限于如上所述的系统的使用。该新颖的环境室包括容纳被配置成保持样品的采样保持器的壳体。采样保持器具有不平坦的底表面。采样保持器的底表面可以限定由至少两个倾斜交叉横截面形成的顶点。
在一些实施例中，环境室还包括干涉测量层析成像模块，干涉测量层析成像模块被容纳在壳体内并被配置成和可操作来在不同角度处生成样品的多个干涉测量投影，其中，干涉测量层析成像模块包括离轴干涉仪和明视场显微镜。
在一些实施例中，环境室还包括产生朝向样品的照明光束的照明源以及在照明源的下游的扫描旋转反射表面；其中，扫描旋转反射表面被配置成接收来自照明源的照明光束，并且在不同角度处顺序地将照明光束导向样品。照明源和扫描旋转反射表面可以被容纳在壳体内。
附图简述
为了更好地理解在本文公开的主题并且举例说明它可以如何在实践中被实现，现在将参考附图仅作为非限制性例子描述实施例，附图中：
图1a示出了本发明的系统的主要功能元件的示意性框图；
图1b示出了根据一些实施例的本发明的系统的可能的示意性光学设置方案；
图1c示出了根据一些实施例的本发明的系统的另一可能的示意性光学设置方案；
图1d示出了通过在不同角度处使用本发明的教导获得的同一样品的五张图片；一张图片显示在80°的角度处获得的样品的区域的放大，以及一张图片是四个样品光束的快速傅里叶变换(FFT)；
图1e示出了根据本发明的一些实施例的在内部包含照明扫描的环境室的可能配置的横截面视图；
图2示出了旋转周期时间的检测和当前视点的角度的估计；
图3a-3b示出了如基于图3a所示的反投影方法和图3b所示的衍射方法的从所有投影导出的傅里叶空间的ky–kz平面的映射；
图4a-4b示出了MCF-7癌细胞的所重建的折射率图的3D效果图；图4c-4h示出了在中心Z位置处的三种类型的白血细胞的折射率图(图4c-4e)和重合的3D效果图(图4f-4h)；以及
图5示出了基于通过使用本发明的技术获得的细胞的3D折射率图的计算，在悬浮液中的三种类型的活白血细胞的参数集。
实施例的详细描述
参考图1a，图1a示出了根据本发明的一些实施例的用于包括至少一个生物细胞的样品的非侵入性成像而不需要标记的系统100。系统100尤其包括用于容纳样品的环境室102。环境室102包括干涉测量层析成像模块104，干涉测量层析成像模块104被配置成和可操作来产生朝向样品的照明光束并在不同角度处产生细胞的多个干涉测量投影。干涉测量层析成像模块104放置在环境室102内，使得样品不应该从待检查的环境室中取出。系统100还包括控制单元106，控制单元106被配置成和可操作来执行下列步骤：(1)照明光束的旋转(即，顺序地启动至少一个光学元件用于通过在不同入射角处的照明来扫描样品)以及样品的旋转中的至少一个，(2)接收干涉测量投影图像，(3)处理图像以将相位投影创建到3D傅里叶空间中，以及(4)生成样品的3D折射率分布。
图1b示出了利用所捕集的细胞的全旋转的干涉测量层析成像术的光学设置方案。系统200包括环境室202，环境室202可以可选地包括用于细胞旋转的基于介电电泳(DEP)的微流控通道206和用于在细胞旋转期间获取离轴干涉图的干涉测量层析成像模块。在这方面，应当理解，尽管在图1b所示的具体且非限制性的例子中细胞在微流控流动环境中流动，但本发明不限于在微流控流动环境中流动的细胞，而是还包括通过细胞旋转或镜像/照明旋转而成像的静态细胞。在一些实施例中，系统200包括环境条件控制模块208，环境条件控制模块208耦合到环境室202并且被配置成和可操作来测量和维持在室202内的环境条件。环境条件尤其包括在环境室202内部的大气的CO2和氧含量中的至少一个。环境条件控制模块208包括用于测量环境条件的多个传感器和用于控制和保持在环境室202内的最佳条件的处理模块。处理模块可以被容纳在环境条件控制模块208内，或者可以被容纳在系统的控制单元(在该图中未示出)内，该控制单元可以被容纳在本发明的系统内，或可以不被容纳在本发明的系统内。为了说明起见，环境条件控制模块208被表示在环境室202的外部，但这种配置仅仅是为了说明起见，而且环境条件控制模块208可以被容纳在环境室202内。
从这些干涉测量投影可以重建细胞复合波前。该系统200包括两个成像通道：用于在细胞旋转期间获取离轴图像干涉图的干涉测量显微术以及用于使细胞成像并控制细胞捕集和旋转的明视场显微术。因此，干涉测量层析成像模块包括干涉测量显微镜204和明视场显微镜，明视场显微镜由它的被用作控制成像系统的显微镜物镜MO示出。被称为R的红色光束代表干涉测量显微镜，而被称为B的蓝色光束代表明视场显微镜。在图中所示的具体且非限制性的例子中，在干涉测量显微镜通道中，被标示为HeNe的来自氦-氖激光器的光由二向色镜DM1反射到样品，且然后被60倍浸油(immersion-oil)显微镜物镜放大。扩大的图像由管透镜TL投射到显微镜的出口上，离轴干涉测量模块204位于该出口处。离轴模块204可以具有在参考文献[12,13]中描述的类型。在该模块204中，使用光束分离器BS来分离放大的样品光束。使用透镜L1和L2以及仅选择低空间频率的针孔P，光束之一(one)在空间上被过滤，且因而有效地产生不包含来自样品的空间调制的参考光束。来自光束分离器BS的另外一个(the other)光束在小角度处通过后向反射器RR被投射，并与参考光束一起在摄像机1上创建离轴干涉图(或离轴全息图)。从该离轴干涉图可以重建在当前视点处的细胞的复合波前，如将在下面进一步描述的。在明视场成像通道中，被标示为卤素的钨卤素灯(lamp)在光谱上使用带通滤波器F1来过滤，被投射到样品上，被10倍或60倍浸油显微镜物镜放大，并通过管透镜TL、二向色镜DM2和光谱带通滤波器F2投射到摄像机2上。在这个具体且非限制性的例子中，干涉测量显微镜还包括三个反射镜，这三个反射镜被标示为旨在引导不同光束的M1-M3。在一些实施例中，反射镜M1是扫描反射镜，其旨在顺序地旋转照明光束，用于在透射模式中使所捕集的细胞成像以实现在约-70°至+70°的范围内的干涉测量投影。
如通过DEP旋转获得的、来自由捕集元件捕集的细胞的不同视点的干涉测量投影被获取用于层析成像。如上所述，氦-氖激光器(632.8nm，5mW，Thorlabs)用作倒置显微镜(Olympus IX81)的光源，用于产生照明光束并在透射模式中使所捕集的细胞成像。如图1b所示，光束由二向色镜DM1(短通(short-pass)，在550nm处截止(cut-off)，EdmundsOptics)反射到样品平面上，并通过显微镜物镜MO(Olympus PlanApo，60×，1.4NA，浸油)传播。在此干涉测量层析成像模块中，图像平面由透镜L1(f＝7.5cm)进行光学傅里叶变换，并由光束分离器BS分成两个单独的光束。光束之一(被称为参考光束)朝向针孔P(15μm的直径)传播，针孔P在空间上过滤光束并擦除样品高空间频率，将它转变为参考光束。反射镜M3反射过滤后的光束，且然后透镜L2(f＝7.5cm)将它傅里叶变换回到摄像机平面上。在光束分离器BS的出口处的另外一个光束(被称为样品光束)使用后向反射器RR被往回反射，后向反射器RR移动空间频率域的中心。由于这个移动，样品光束和参考光束在图1b中的摄像机1(CMOS摄像机，DCC1545，Thorlabs，具有1024×1280平方像素，每个像素为5.2μm)上在小角度处进行干涉。在光束之间的离轴角度被设置为使得条纹干涉周期包含三个像素。该离轴干涉图允许从单次曝光重建样品的复合波前。这个数字重建包括使用MatlabTM对所获取的离轴干涉图的傅里叶变换。然后，从空间频率域的中心移动的互相关项之一被数字地裁剪，并且傅里叶逆变换被应用于裁剪的结果。将2D相位展开算法应用于所得到的复合波前的参数(argument)解决了2π模糊性，并从细胞的单个视点产生样品的展开相位图。
明视场显微镜被用作控制系统，以便观察所捕集的细胞，估计旋转周期的粗略时间，并验证旋转在选择的轴上被执行。在该成像通道中，来自钨卤素灯的光通过带通滤波器F1(475/35nm)被过滤，透射通过样品并通过下列这两个显微镜物镜之一：用于在宽视场中使微通道成像的Olympus PlanApo、10×、0.25NA物镜或用于仅使在DEP场笼(field cage)中的细胞成像的Olympus PlanApo、60×、1.4NA油浸物镜。二向色镜DM2(长通，505nm，Edmunds Optics)将明视场图像反射穿过带通滤波器F2(475/28nm)到图1b中的摄像机2(Olympus F-View II，1376×1032像素，每个像素为6.45μm)上。
在一些实施例中，本发明提供了一种用于利用至少一个活细胞在任何轴上以小于2.5°的角分辨率的360°旋转的非侵入性地(即，不需要物理地接触细胞)干涉测量层析成像的新颖技术。
在一些实施例中，如下所述，该系统提供细胞在由捕集元件使用DEP力捕集、操纵和全程地旋转时的干涉测量成像。DEP可用于细胞显微操纵以及检测可用于细胞分选的固有细胞特征(例如膜电容、电导率、核酸含量以及细胞大小和变形性)。与DEP结合的微流控技术在非侵入性地捕集和控制细胞时实现小体积液体的操纵。本发明在对视角的控制下以非侵入性方式提供对在细胞流动环境中暂时捕集到的单个细胞的3D折射率图的完全捕获。本发明的发明人执行了提供大癌细胞和三种类型的白血细胞的3D无标记成像的实验。然而，这项技术不限于这些活细胞，且也可适用于受精卵的成像。本发明允许在给定时间在知道投射的角度的情况下的对细胞在任何轴上的完整旋转的完全在实验上测量的层析成像。应该注意，在数据的记录期间，细胞不经历物理接触，且只经历非常适度的曝光。这两个特征都将可能影响细胞的状态或它们的生存能力的任何不利影响减到最低。
在一些实施例中，活细胞在暂时被捕集和旋转时是未附着的活细胞。悬浮的细胞旋转足够稳定(具有小于0.5％的误差)以至于允许利用对大细胞(例如癌细胞)和小细胞(例如白血细胞)的全程旋转的层析成像术，如在实验上证明的。这些结果说明本发明的技术是用于3D细胞无标记成像和分析的集成无标记快速方法。由于它的非侵入性和在检查之后的细胞的直接恢复，这种技术使无标记细胞分选、监控在体液中且特别是在血液中的细胞病理状况以及用于治疗目的成为可能。
图1c示出了本发明的另一方面，其中基于光栅元件的不同光学多路复用设置将光束之一分成几个副本(在没有分辨率或放大损失的情况下多达六个)，使得在光栅的出口处的光束的横向位置控制在摄像机上的条纹取向。以这种方式，几个旋转的离轴全息图被同时投射到摄像机上。更具体地，由于它的紧凑性，本发明的干涉测量层析成像模块302被容纳在环境室300的壳体中，并且连接到控制单元106，控制单元106被配置成和可操作来执行照明光束的旋转和/或样品的旋转，接收干涉测量投影图像，处理图像以将相位投影创建到3D傅里叶空间中，并且生成样品的三维折射率分布。在这个具体且非限制性的例子中，干涉测量层析成像模块302包括用于接收激光照明光束并将该照明光束分成被称为S光束的第一样品光束和被称为R光束的第二参考光束的第一光束分离器/组合器BS1。第一光束穿过被配置成和可操作来将样品光束分离成多个间隔开的光束的特殊光栅元件G。使用光栅元件G，以便同时从不同角度照亮样品。例如，这个具体且非限制性的设置能够同时在四个角度处照射样品。然而，本发明不限于任何具体数量的角度。在没有分辨率或放大损失的情况下，同时在多达六个角度处照射样品是可能的。光栅元件G被配置成和可操作来在空间频率域中将多个复合波前分离成间隔开的光束，每个复合波前具有样品的另一角度投影。间隔开的光束在不同几何位置处穿过第一透镜元件L1，第一透镜元件L1将每个间隔开的样品光束聚焦到第一反射表面M1上。每个样品光束穿过被配置成和可操作来选择正确照明角度的孔并穿过第二透镜元件L2，第二透镜元件L2将每个样品光束聚焦到位于相对于第一反射表面M1的平行平面处的第二反射表面M2的不同几何位置上。孔选择光束，使得它们在数字摄像机或光学检测器D上引起具有正确取向的离轴条纹。因为每个光束产生具有预定取向的不同条纹取向并且重合的复合波前在空间频率域中被分离，所以所有角度投影都将从重合的离轴全息图重建，同时被投射到数字摄像机或光学检测器D上。然后，每个样品光束被导向定义相对于第二反射表面M2的某个角度的第三反射表面M3。然后，每个样品光束被导向将每个样品光束聚焦到照射样品的第一显微镜物镜MO1上的第三透镜L3。可选地，呈现入射在样品上的输入光的振幅和相位调制的每个放大光束然后被导向第二显微镜物镜MO2并通过第四透镜元件L4，第二显微镜物镜MO2被配置成和可操作来放大样品图像，第四透镜元件L4将间隔开的样品光束聚焦到位于相对于第一反射表面M1和第二反射表面M2的平行平面处的第四反射表面M4上。间隔开的样品光束然后穿过形成4-f透镜配置的四个透镜元件L5、L6、L7和L8，且然后被导向被配置成和可操作来将每个间隔开的样品光束与来自第一光束分离器BS1的参考光束组合在一起的第二光束分离器BS2。光学检测器D被配置为同时一起获取在多个样品光束和参考光束之间的多个离轴干涉图样。多个同时获得的干涉图样在空间频率(傅里叶)域中不重叠，使得它们全部都可以同时被获取。以这种方式，将样品的几个透视图多路复用成单个全息图被获得。光学检测器D获取来自多个视角(perspective)的样品的多个全息图，这允许执行样品的计算机层析成像和样品的完整三维折射率分布的重建。因为干涉测量模块300提供多个视角的多路复用并同时获取它们，所以层析成像的角度扫描更快，这允许以更快的动态特性获取样品的三维折射率分布。例如，在光学设置使得能够同时在四个角度处照射样品的情况下，可以通过将扫描照明光束仅从0°旋转到90°来对每个样品光束执行样品的扫描，在四分之一的时间段内给出360°的总角度扫描。因此，与常规系统相比，本发明的干涉测量模块还为层析成像提供较小的角度扫描。因此，本发明提供具有对照明的快速扫描的层析成像。因此，在同一干涉测量投影上产生在不同角度处的多个规则离轴全息图，形成可在单次曝光中获取的多路复用离轴全息图。
图1d示出了通过使用本发明的教导在不同角度处获取的同一样品的五个图片。图片A-B示出了在不同角度处获取的同一样品的图像。图片A示出了在0°或90°的角度处获取的样品的图像。图片B示出了在30°的角度处获取的样品的图像。图片C示出了在45°的角度处获取的样品的图像。图片D示出了在60°的角度处获取的样品的图像。图片E示出了在80°的角度处获取的样品的图像。图像E的一部分在图片F中被放大。图片G示出了由本发明的如上面参考图1c所述的光学检测器获取的快速傅里叶变换图像，该快速傅里叶变换图像示出了指示照射在样品上的四个不同角度的四个不同样品光束的干涉图样。从这些图片中可以看到，包含四个投影的多路复用全息图被同时投射到摄像机上，每个投影以不同的条纹取向被编码。
计算机层析成像(CT)图像常常遭受由系统的未对准的扫描仪几何形状引起的伪像。在图像重建之前必须进行校准(calibration)和校正(correction)。在锥形光束CT系统中，要特别注意确保x射线焦点、系统的旋转中心和探测器的中心落在一条直线中。为了解决这个问题，已经提出了用于层析成像系统的几何校准的几种方法以计算或估计x射线CT的几何形状。图1e示出了根据本发明的一些实施例的环境室400的可能配置的横截面视图。在一些实施例中，采样保持器402被配置成保持具有至少部分地弯曲的外表面的细胞(例如受精卵)，并且在层析成像期间被容纳在环境室400(即壳体)的底部中心内。采样保持器402可以具有不平坦的底表面，并且具有由至少两个倾斜交叉横截面形成的顶点，使得由于重力，因为细胞具有弯曲形状，所以它总是被准确地定位在采样保持器的中心中。细胞坐落在采样保持器400的底部处，其中由于重力，弯曲的细胞被定位在中心处。采样保持器402的底部的3D形状可能是圆锥形或类似菱形的形状(后者避开可能影响光束形状的玻璃曲率)。以这种方式，样品的旋转中心不移位，消除了用于找出细胞的中心的校准方法的使用。在这方面，应该注意，采样保持器的这种构造解决了找出具有至少部分地弯曲的外表面的任何细胞的旋转中心的问题，并且可以与任何光学显微检查系统一起使用。采样保持器的配置不限于本发明的环境室的使用。
在一些实施例中，环境室400可集成在任何干涉测量显微镜中，利用照明扫描将任何普通显微镜转变成层析成像显微镜。以这种方式，环境室400可以被配置为层析成像相位显微术环境室。在该特定且非限制性的例子中，环境室400包括被表示为产生照明光束的激光器的照明源，所产生的照明光束被顺序地旋转以在不同角度处扫描样品。照明源可以被容纳在环境室400的壳体内。更具体地，环境室400包括采样保持器402，采样保持器402具有容纳扫描元件和至少一个角度方向元件的顶部扫描部分以及保持被检查样品的底部部分。采样保持器402包括用于插入样品的至少一个开口。顶部和底部部分可以被配置为两个单独的隔室(chamber)，或者可以集成在同一隔室中。采样保持器402的顶部部分可以包括被称为R的扫描旋转反射表面(例如，反射镜或衍射光栅)，该扫描旋转反射表面被放置在照明源的下游，并且被配置成接收来自照明源的照明光束并且被配置成在不同角度处朝向采样保持器402的侧部顺序地引导照明光束。在这方面，应当理解，环境室400可以用于一次在一个角度处使样品成像。为此目的，扫描旋转反射表面由反射镜实现。可选地，如上所述，环境室400可以用于利用角度多路复用来使样品成像。为此目的，扫描旋转反射表面可以由将光束分成多个光束的衍射光栅实现，多个光束同时从不同角度照射样品。扫描旋转反射表面连接到致动该元件的控制单元(未示出)。如果扫描旋转反射表面是反射镜，则旋转是机械的。如果扫描旋转反射表面是衍射光栅，则控制单元产生对衍射光栅的电气控制。采样保持器402可以包括被称为M的具有环形构造的反射镜，反射镜M在扫描反射镜R的下游被放置在采样保持器402的顶部部分的侧部处。反射镜M被配置成接收扫描照明光束并且将扫描照明光束朝向样品反射。例如，反射镜M可以是倾斜反射镜多边形环，其中多边形的面等于扫描角的数量。在图中，在样品周围和上方的多边形环的两个部分被表示在采样保持器402的顶部的相对侧处。环境室的扫描范围通常被显微镜物镜的数值孔径(典型地为-70°至+70°)限制。应该理解，在这个特定且非限制性的例子中，与在本领域中已知的环境室相反，所有扫描元件(R和M)都被容纳在环境室内部(在环境室的壳体中)，提供一种将现有的市场上可买到的显微镜转换成层析成像显微镜的方式。此外，这种构造使得能够提供一次性环境室。参考光束和样品的复合波前对于每个角度被叠加在被称为显微镜物镜(数字全息显微镜)的摄像机上。使用层析成像相位显微术算法，来自所有角度的所有记录的复合波前被处理成细胞的3D折射率图。
图2示出了通过将在细胞旋转期间的定量相位图中的细胞直径拟合到正弦波的对旋转周期时间的检测和对当前视点的角度的估计。通过将来自细胞投影的细胞直径值拟合到正弦波，在确定系数R2＝0.85的情况下确定细胞旋转的频率。对于实验演示，150个干涉测量投影是从360°的完整角度范围并以相等的离散跳跃来拍摄的。当映射到与现有点重叠的在3D傅里叶空间中的点时，点值被取平均。然后，所有的相位投影被数字地处理以通过经过滤的反向投影和衍射理论重建算法来创建细胞的3D折射率图，如例如在参考文献[14]中所述的。在该重建过程中，每个投影被映射到3D傅里叶空间中的表面，其中由DEP提供的全程旋转实现傅里叶空间的全角度覆盖，与拥有有限角度范围的以前的方法[1-7]不同。通过执行3D折射率图的空间推导并确定在半极大处全宽度来将(y,z)和x空间折射率分辨率分别估计为0.31μm和0.4μm。
然后，通过经过滤的反向投影算法或衍射理论算法来数字地处理复合波前投影以创建细胞的3D折射率图。两种重建算法都可以使用MatlabTM来实现。首先，定义反向投影层析成像方法和光学衍射层析成像方法的投影的相位，并对它执行傅里叶变换。图3a-3b分别示出了基于反向投影方法和衍射方法的在傅里叶空间的ky-kz平面上的所有投影的映射的结果。在将投影映射到傅里叶空间之后，执行三维傅里叶逆变换，并且根据重建方法来提取折射率。
参考图4a-4b，图4a-4b示出了如在图1b所示的微流控通道中在DEP旋转期间通过干涉测量法获取的在悬浮液中的大MCF-7癌细胞的所重建的折射率图的3D效果图。图4c-4h示出了在中心Z位置处的三种类型的白血细胞的折射率图(图4c-4e)和重合的3D效果图(图4f-4h)。图4c和图4f示出了T细胞的所得到的3D折射率图。如从这些图中可以看到的，与图4d和图4g所示的单核细胞相比，这些细胞相对小并且具有大体积的核区。如从图4d和图4g中可以看到的，单核细胞呈现相对大的且不太球形的形状，具有较大的细胞核和细胞质体积。相反，图4e和图4h中所示的嗜中性粒细胞是球形的并且呈现大的细胞质体积，与先前的基于标记的成像研究相对应。在这些图中，能够清楚地看到细胞形状、细胞质、细胞核和核小体区，折射率值与以前的工作相对应。因此，本发明的技术也用于获取三种类型的白血细胞，说明它的在血液测试之后的无标记细胞分选。
在3D折射率图的重建之后，计算白血细胞的各种定量参数。通过计算在细胞的3D折射率图内部的体素的数量乘以体素大小来得到细胞体积V。细胞质和细胞核体积以与总体积相同的方式但分别在低折射率和高折射率(其值在正文中针对每种细胞类型被详细说明)的位置处被计算。在定位细胞的3D折射率图的边界之后，计算表面积S。细胞的球形度被定义如下[6]：π1/3(6V)2/3/S。干质量密度被计算如下：ρ＝(n-nm)/α，其中n是细胞质的平均折射率值，nm是周围介质的折射率，以及α是特定折射率增量并被设置为0.2mL/g。总干质量密度在细胞体积上的积分产生细胞干质量。图5呈现基于通过本发明的技术获得的细胞3D折射率图的计算的在悬浮液中测量的三种类型的活白血细胞的各种参数。这些参数包括细胞总体积、细胞核与细胞质折射率比、表面积、干质量密度和总干质量。基于细胞折射率值(T细胞：细胞核，1.4045±0.0087，细胞质，1.3748±0.0088；单核细胞：细胞核，1.3949±0.0050，细胞质，1.3777±0.0085；嗜中性粒细胞：细胞核，1.4061±0.0108，细胞质，1.3759±0.0091)来在三维中区分细胞核和细胞质体积。这种基于3D成像的参数集可以帮助白血细胞的分选过程而不需要进行标记。
本申请还涉及以下方面：
1).一种用于对在体外的生物细胞的样品的非侵入性成像的系统，所述系统包括：
环境室，其用于容纳所述样品；所述环境室包括干涉测量层析成像模块，所述干涉测量层析成像模块被配置成和可操作来产生朝向所述样品的照明光束并在不同角度处产生所述生物细胞的多个干涉测量投影；以及
控制单元，其被配置成和可操作来执行所述照明光束的旋转和所述样品的旋转中的至少一个，接收干涉测量投影图像，处理所述图像以将相位投影创建到3D傅里叶空间中，并生成所述样品的3D折射率分布。
2).根据1)所述的系统，其中，所述环境室包括微流控通道，所述微流控通道被配置成和可操作来执行下列操作中的至少一个：基于介电电泳力使至少一个样品流动、被捕集、旋转以及操纵所述样品。
3).根据1)或2)所述的系统，其中，所述环境室包括被配置成和可操作来捕集所述样品并使所述样品在大约0°至大约360°的旋转角度范围内旋转的捕集元件。
4).根据3)所述的系统，其中，所述捕集元件包括光镊或流控旋转元件中的至少一个，以实现在不同角度处产生所述样品的所述多个干涉测量投影期间实现在所述环境室内的所述生物细胞的旋转。
5).根据1)到4)中的任一项所述的系统，其中，所述干涉测量层析成像模块包括离轴干涉仪和明视场显微镜。
6).根据1)到5)中的任一项所述的系统，其中，所述控制单元被配置成和可操作来计算包括所述样品的3D蛋白质含量的定量参数，所述定量参数包括细胞体积、表面积、3D形状和干质量密度中的至少一个。
7).根据1)到6)中的任一项所述的系统，其中，所述控制单元被配置成和可操作来在所有轴上在大约0.5微米的分辨率下重建所述样品的3D折射率分布。
8).根据1)到7)中的任一项所述的系统，包括环境条件控制模块，所述环境条件控制模块耦合到所述环境室并且被配置成和可操作来测量和维持在所述环境室内的环境条件。
9).根据1)到8)中的任一项所述的系统，其中，所述干涉测量层析成像模块被配置成和可操作来同时在不同角度处照射所述样品，从而执行光学多路复用，使得多个旋转全息图同时被投影。
10).根据9)所述的系统，其中，所述干涉测量层析成像模块包括光栅元件，所述光栅元件被配置成和可操作来将所述照明光束分成多个间隔开的光束，从而在空间频率域中分离复合波前。
11).根据1)到10)中的任一项所述的系统，还包括被配置为同时一起获取在空间频率域中不重叠的多个离轴干涉图样的检测器。
12).根据1)到11)中的任一项所述的系统，其中，所述环境室包括被配置成保持所述样品的采样保持器；所述采样保持器具有不平坦的底表面。
13).根据12)所述的系统，其中，所述采样保持器的所述底表面限定由至少两个倾斜交叉横截面形成的顶点。
14).根据1)到11)中的任一项所述的系统，其中，所述环境室包括照明源和在所述照明源下游的扫描旋转反射表面；其中，所述扫描旋转反射表面被配置成接收来自所述照明源的所述照明光束，并且在不同角度处顺序地将所述照明光束导向所述样品。
15).一种用于对包含至少一个生物细胞的样品的非侵入性成像而无需标记的方法，所述方法包括：
将所述样品容纳在环境室内；
对在所述环境室内的所述样品成像；
旋转(1)照明光束同时保持所述样品静止和(2)所述样品中的至少一个；
在不同角度处生成多个三维干涉测量投影；以及
处理所述图像以将相位投影创建到3D傅里叶空间中，并产生所述样品的三维折射率分布。
16).根据15)所述的方法，还包括同时在不同角度处照射所述样品。
17).根据16)所述的方法，还包括将所述照明光束分成多个间隔开的光束从而在空间频率域中分离复合波前，并将多个旋转全息图同时投射到摄像机上。
18).根据17)所述的方法，还包括同时一起获取在所述空间频率域中不重叠的多个离轴干涉图样。
19).根据18)所述的方法，其中，所述旋转包括(1)照明光束同时保持所述样品静止和(2)所述样品中的至少一个包括控制所述离轴干涉图样的条纹取向。
20).一种用于保持待旋转的样品的环境室，包括容纳采样保持器的壳体，所述采样保持器被配置成保持所述样品；所述采样保持器具有不平坦的底表面。
21).根据20)所述的环境室，其中，所述采样保持器的所述底表面限定由至少两个倾斜交叉横截面形成的顶点。
22).根据20)或21)所述的环境室，还包括干涉测量层析成像模块，所述干涉测量层析成像模块被容纳在所述壳体内并被配置成和可操作来在不同角度处生成所述样品的多个干涉测量投影，其中，所述干涉测量层析成像模块包括离轴干涉仪和明视场显微镜。
23).根据20)到22)中的任一项所述的环境室，还包括产生朝向所述样品的照明光束的照明源以及在所述照明源的下游的扫描旋转反射表面；其中，所述扫描旋转反射表面被配置成接收来自所述照明源的所述照明光束，并且在不同角度处顺序地将所述照明光束导向所述样品。
24).根据23)所述的环境室，其中，所述照明源和所述扫描旋转反射表面被容纳在所述壳体内。

Claims (21)

1.一种用于对在体外的生物细胞的样品的非侵入性成像的系统，所述系统包括：
环境室，包括被配置成保持所述样品的采样保持器；所述采样保持器具有容纳扫描旋转反射表面和至少一个反射镜的顶部部分以及保持所述样品的底部部分，所述至少一个反射镜具有环形构造，所述扫描旋转反射表面被放置在照明源的下游并且被放置在所述样品的上游，并且所述至少一个反射镜在所述扫描旋转反射表面的下游被放置在所述采样保持器的所述顶部部分的侧部处；其中，所述扫描旋转反射表面被配置用于接收来自所述照明源的照明光束和用于生成多个扫描照明光束并且在不同角度处将每个扫描照明光束导向所述反射镜；所述至少一个反射镜被配置用于接收所述扫描照明光束并且用于将所述扫描照明光束导向所述样品；以及
控制单元，其被配置成和可操作来执行所述照明光束的旋转和所述样品的旋转中的至少一个，接收干涉测量投影图像，处理所述图像以将相位投影创建到3D傅里叶空间中，并生成所述样品的3D折射率分布。
2.根据权利要求1所述的系统，其中，所述环境室包括微流控通道，所述微流控通道被配置成和可操作来执行下列操作中的至少一个：基于介电电泳力使至少一个样品流动、被捕集、旋转以及操纵所述样品。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的系统，其中，所述环境室包括被配置成和可操作来捕集所述样品并使所述样品在0°至360°的旋转角度范围内旋转的捕集元件。
4.根据权利要求3所述的系统，其中，所述捕集元件包括光镊或流控旋转元件中的至少一个，以实现在不同角度处产生所述样品的多个干涉测量投影期间实现在所述环境室内的所述生物细胞的旋转。
5.根据权利要求1所述的系统，其中，所述环境室包括离轴干涉仪和明视场显微镜。
6.根据权利要求1所述的系统，其中，所述控制单元被配置成和可操作来计算包括所述样品的3D蛋白质含量的定量参数，所述定量参数包括细胞体积、表面积、3D形状和干质量密度中的至少一个。
7.根据权利要求1所述的系统，其中，所述控制单元被配置成和可操作来在所有轴上在0.5微米的分辨率下重建所述样品的3D折射率分布。
8.根据权利要求1所述的系统，包括环境条件控制模块，所述环境条件控制模块耦合到所述环境室并且包括多个传感器和处理模块，所述多个传感器被配置成和可操作来测量环境条件，所述处理模块用于控制和维持在所述环境室内的所述环境条件。
9.根据权利要求1所述的系统，还包括所述照明源，所述照明源被配置成和可操作来同时在不同角度处照射所述样品，从而执行光学多路复用，使得多个旋转全息图同时被投影。
10.根据权利要求9所述的系统，其中，所述环境室包括光栅元件，所述光栅元件被配置成和可操作来将所述照明光束分成多个间隔开的光束，从而在空间频率域中分离复合波前。
11.根据权利要求1所述的系统，还包括被配置为同时一起获取在空间频率域中不重叠的多个离轴干涉图样的检测器。
12.根据权利要求1所述的系统，其中，所述采样保持器具有不平坦的底表面。
13.根据权利要求12所述的系统，其中，所述采样保持器的所述不平坦的底表面限定由至少两个倾斜交叉横截面形成的顶点。
14.根据权利要求1所述的系统，其中，所述环境室包括所述照明源，并且所述扫描旋转反射表面被配置成在不同角度处顺序地将所述照明光束导向所述样品。
15.一种用于对包含至少一个生物细胞的样品的非侵入性成像而无需标记的方法，所述方法包括：
将所述样品容纳在环境室内；
接收照明光束，生成多个扫描照明光束并且在不同角度处将每个扫描照明光束导向所述环境室内的所述样品；
对在所述环境室内的所述样品成像；
在不同角度处生成多个三维层析成像投影；以及
处理所述样品的图像以将相位投影创建到3D傅里叶空间中，并产生所述样品的三维折射率分布，
所述环境室包括被配置成保持所述样品的采样保持器；所述采样保持器具有容纳扫描旋转反射表面和至少一个反射镜的顶部部分以及保持所述样品的底部部分，所述至少一个反射镜具有环形构造，所述扫描旋转反射表面被放置在照明源的下游并且被放置在所述样品的上游，并且所述至少一个反射镜在所述扫描旋转反射表面的下游被放置在所述采样保持器的所述顶部部分的侧部处；其中，所述扫描旋转反射表面被配置用于接收来自所述照明源的照明光束和用于生成多个扫描照明光束并且在不同角度处将每个扫描照明光束导向所述反射镜；所述至少一个反射镜被配置用于接收所述扫描照明光束并且用于将所述扫描照明光束导向所述样品。
16.根据权利要求15所述的方法，还包括同时或顺序地在不同角度处照射所述样品。
17.根据权利要求16所述的方法，还包括将所述照明光束分成多个间隔开的光束从而在空间频率域中分离复合波前，并将多个旋转全息图同时投射到摄像机上。
18.根据权利要求17所述的方法，还包括同时一起获取在所述空间频率域中不重叠的多个离轴干涉图样。
19.根据权利要求18所述的方法，还包括控制所述离轴干涉图样的条纹取向。
20.一种用于保持待旋转的样品的环境室，所述环境室包括：容纳采样保持器的壳体，所述采样保持器被配置成保持所述样品；所述采样保持器具有限定由至少两个倾斜交叉横截面形成的顶点的不平坦的底表面；所述采样保持器具有容纳扫描旋转反射表面和至少一个反射镜的顶部部分以及保持所述样品的底部部分，所述至少一个反射镜具有环形构造，所述扫描旋转反射表面被放置在照明源的下游并且被放置在所述样品的上游，并且所述至少一个反射镜在所述扫描旋转反射表面的下游被放置在所述采样保持器的所述顶部部分的侧部处；其中，所述扫描旋转反射表面被配置用于接收来自所述照明源的照明光束和用于生成多个扫描照明光束并且在不同角度处将每个扫描照明光束导向所述反射镜；所述至少一个反射镜被配置用于接收所述扫描照明光束并且用于将所述扫描照明光束导向所述样品。
21.根据权利要求20所述的环境室，还包括干涉测量层析成像模块，所述干涉测量层析成像模块被容纳在所述壳体内并被配置成和可操作来在不同角度处生成所述样品的多个干涉测量投影，其中，所述干涉测量层析成像模块包括离轴干涉仪和明视场显微镜。
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