JP2008523376A5

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Publication number: JP2008523376A5
Application number: JP2007544985A
Authority: JP
Filing date: 2005-12-09
Publication date: 2012-07-26

Description

【書類名】明細書
【技術分野】
【０００１】
本発明は、撮像装置を用いて、１つ又は複数の生体を撮像する方法に関する。本発明はさらに、そのような方法を実行するように構成されるコンピュータソフトウェア及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、薬物の発見及び開発において、さらに一般的な生物学的研究において、細胞ベースアッセイ（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄａｓｓａｙｓ）を正確に実行するための方法及び装置に対する必要性が存在する。細胞ベースアッセイは化合物の生物活性を評価するために有利に使用される。
【０００３】
加えて、多数の化合物を迅速かつ安価にスクリーニングする必要性が存在する。この必要性は、様々な生化学的な目標（例えば、受容体、酵素及び核酸）に対する活性について化合物を試験することが一般的な、医薬産業で生じている。これらの化合物は、時には識別可能な化合物が１００万を超える、大きなライブラリ内に集められる。
【０００４】
細胞ベースアッセイの実行は、多くの場合、細胞画像を記録し、画像解析ソフトウェアのアルゴリズムを用いてこれら画像を定量化することに関与する。蛍光標識細胞（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙｌａｂｅｌｌｅｄｃｅｌｌｓ）を撮像するための器具が知られており、これら器具のソフトウェアは、例えば、蛍光標識細胞内の生物学的なタンパク輸送（ｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ）及び刺激に対するタンパク反応を定量化するためのいくつかの解析モジュールを有する。
【０００５】
そのような細胞画像を解析することは、細胞に対応する画像の領域を識別することに関与し、これは一般に蛍光標識細胞により放射される蛍光放射線を検出することによって実現される。そのような標識の一例は、細胞核を標識付けするマーカ染色液（ｍａｒｋｅｒｓｔａｉｎ）、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって生産されるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（商標）、又はＢｉｏｓｔａｔｕｓにより生産されるＤＲＡＱ５（商標）である。
【０００６】
細胞核を標識付けするために、これらの核染色液は細胞核の核酸構造と相互に作用する。長期にわたるこの相互作用は、細胞に毒性となることが判明している。細胞ベースアッセイを実行する際に収集されたデータは可能な限り正確であり、その結果、印付けを行い、比較的長期にわたって時々細胞応答を測定することが望まれる場合、核染色液の毒性が生細胞アッセイで使用されないようにすることが重要である。
【０００７】
細胞核以外の細胞小器官に印付けを行うことは、多くの場合、困難である。サイトゾル、原形質膜又はゴルジ装置用のマーカは、経時的に細胞内で劣化するか又は再局在する（ｒｅｌｏｃａｌｉｓｅ）ため、比較的長期的には効果的ではない。
【０００８】
生体の撮像におけるコントラスト造影剤の使用は、当技術分野で知られている。
【０００９】
米国特許第６，１８７，２８９号は、細胞の反射型共焦点撮像におけるコントラスト造影剤として酢酸の使用を開示している。
【００１０】
細菌の密集群内でバクテリオファージ由来溶菌班（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄｐｌａｑｕｅｓ）の視覚化を高めるために、沈殿性の染料と組み合わせてコントラスト着色染料を使用する方法は、米国特許第６，０９０，５４１号で報告されている。コントラスト着色染料は担体材を着色することができ、一方、沈殿性の染料は細菌酵素又はウィルス酵素が着色された沈殿物を作り出すための基質の役割を果たす。
【００１１】
金属錯塩造影剤（Ｍｅｔａｌｃｏｍｐｌｅｘｃｏｎｔｒａｓｔａｇｅｎｔｓ）はＷＯ０１／１７５６７で開示されるように、ＭＲＩ及びＸ線による撮像に関して知られている。
【特許文献１】米国特許第６，１８７，２８９号
【特許文献２】米国特許第６，０９０，５４１号
【特許文献３】ＷＯ０１／１７５６７
【特許文献４】米国特許第６，４００，４８７号
【特許文献５】米国特許第６，３８８，７８８号
【特許文献６】米国特許出願第１０／２２７，５２２号
【非特許文献１】Ｔｓｉｅｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１９９８），６７，５０９−５４４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、生物学的アッセイ（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｓｓａｙ）の際に、生体の改善された撮像の方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第１の態様によれば、撮像範囲の全域で画像を捕捉することができる撮像装置を用いて、１つ又は複数の生体を撮像する方法が提供される。前記方法は以下を含む：
ａ）前記１つ又は複数の生体を環境内に配置する工程；
ｂ）前記１つ又は複数の生体の外側の前記環境内で、画像内に前記１つ又は複数の生体と前記環境とのコントラストをもたらすコントラスト増強造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔｅｎｈａｎｃｉｎｇａｇｅｎｔ）を提供する工程；及び
ｃ）前記撮像装置を用いて、前記１つ又は複数の生体及び前記環境の画像を記録する工程であって、それによって、前記コントラスト増強造影剤によってもたらされるコントラストを前記画像内で用いて、前記１つ又は複数の生体に関する空間的定義を得ることが可能な工程。
【００１４】
本発明は、生体の比較的正確な空間的定義データが、比較的長期にわたって実行される生体のアッセイから取得されることを可能にする。生体の外側の環境内にコントラスト増強造影剤を提供することによって、画像内の生体の位置を識別するために生体の中に毒性化合物を導入する必要がなく、その結果、アッセイの間、生体の健全性の低下を最小限に抑える。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、前記コントラスト増強造影剤は、その中で前記１つ又は複数の生体が支持される媒質内に提供される。
【００１６】
本発明の異なった好ましい実施形態では、方法は、その中で前記１つ又は複数の生体が支持される媒質を提供する工程と、前記媒質の外側の領域内に前記コントラスト増強造影剤を提供する工程とを含む。
【００１７】
媒質は、生体の健全性を維持する栄養素及び生存条件を提供する。コントラスト増強造影剤が媒質である好ましい実施形態では、媒質を提供することは比較的簡単に画像にコントラストをもたらす。別の好ましい実施形態では、コントラスト増強造影剤を媒質の外側に位置させることは、コントラスト増強造影剤を媒質に対して単独で提供することを可能にする。これにより、コントラスト増強造影剤を含む媒質を使用することが望ましくない場合、アッセイが本発明に従って実行されることが可能になる。
【００１８】
方法は、前記１つ又は複数の生体を含むレセプタクルを提供する工程を含み、前記レセプタクルの少なくとも一部は前記コントラスト増強造影剤で形成されることが好ましい。
【００１９】
レセプタクルは別々に媒質に提供され、画像内に生体と環境とのコントラストをもたらすことができる。これらのレセプタクルは標準的な寸法及び標準的な背景蛍光を有してもよく、本発明に従って実行されるアッセイで使用される場合、これらのレセプタクルはアッセイ条件が一貫していることを確実にする。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、方法は、前記１つ又は複数の生体を含むレセプタクルを提供する工程を含み、前記レセプタクルの内側表面は前記コントラスト増強造影剤の層を含むコーティングを含む。
【００２１】
コントラスト増強造影剤で形成されず、様々な寸法及び構成を有し、異なる製造者により生産されるレセプタクルは、本発明に従って使用され得る。そのようなレセプタクルの内側表面にコーティングを提供することにより、画像内に生体と環境とのコントラストがもたらされる。
【００２２】
方法は、前記１つ又は複数の生体が前記コーティングの表面に粘着するように前記コーティングに粘着性を提供する工程を含むことが好ましい。
【００２３】
コーティングに粘着された生体はコーティングとの接触が保たれ、これにより、比較的正確なアッセイが実行されることが可能になる。粘着性は、環境内に１つの生体の厚さを有する生体の層を形成するのを助けることができ、撮像装置の画像面内に生体を維持できる。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、前記方法は以下を含む：
ｉ）閾値処理された（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｅｄ）画像を作り出すように、比較的暗い画素と比較的明るい画素とを識別するために、前記画像に明るさの閾値を適用する工程；
ｉｉ）前記閾値処理された画像を生体範囲に分割する工程。
【００２５】
記録画像を閾値処理することは、画像内で生体及び環境に対応する可能性のある画素を識別するために、コントラスト増強造影剤によってもたらされたコントラストを使用する。分割は、生体に対応する閾値処理された画像の範囲を識別する。これらの生体範囲は、生体に関する空間的定義を得るために使用され得る。
【００２６】
好ましい実施形態では、前記１つ又は複数の生体は、前記１つ又は複数の生体内に１つ又は複数の成分を含み、前記方法は、画像内に前記成分と前記１つ又は複数の生体のその他の範囲とのコントラストをもたらす、第２のコントラスト増強造影剤により前記成分に印付けを行う工程を含む。
【００２７】
第２のコントラスト増強造影剤を用いて、生体の成分の空間的定義がさらに得られてもよい。生体は細胞であってもよく、そのような場合、成分は細胞より小さい成分（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）である。
【００２８】
前記コントラスト増強造影剤は、前記１つ又は複数の生体に対して非毒性であることが好ましい。
【００２９】
非毒性であるコントラスト増強造影剤は、生体の健全性の低下を最小限に抑え、その結果、比較的長期にわたり実行されるアッセイのために、生体に関する比較的正確な空間的定義を得ることが可能である。
【００３０】
本発明はまた、別の態様で、上述の方法を実行するために構成される装置を提供する。
【００３１】
本発明の別の態様によれば、撮像装置を用いて、撮像範囲の全域で画像を捕捉することによって作成される１つ又は複数の生体を解析する際に使用するためのコンピュータソフトウェアが提供され、前記画像は、
ａ）環境内に前記１つ又は複数の生体を配置する工程と、
ｂ）前記１つ又は複数の生体の外側の前記環境内で、画像内に前記１つ又は複数の生体と前記環境とのコントラストをもたらすコントラスト増強造影剤を提供する工程と、
ｃ）前記撮像装置を用いて、前記１つ又は複数の生体及び前記環境の画像を記録する工程とによって捕捉されており、
前記ソフトウェアは、前記コントラスト増強造影剤によってもたらされるコントラストを前記画像内で用いて、前記１つ又は複数の生体に関する空間的定義を得るように構成される。
【００３２】
本発明のさらに別の態様によれば、撮像されることになる１つ又は複数の生体の外側の環境内に使用するためのコントラスト増強造影剤と、環境内に１つ又は複数の生体を含むためのレセプタクルとが提供される。
【００３３】
本発明の別の特徴及び利点は、例としてのみ与えられている、添付の図面を参照する本発明の好ましい実施形態に関する以下の説明から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明は撮像範囲の全域で画像を捕捉することができる撮像装置を用いて、１つ又は複数の生体を撮像する方法を提供する。撮像装置は、１つ又は複数の生体に関する空間的定義が得られるように、機能性を含む画像解析コンピュータソフトウェアを有する撮像システムを備える。本発明の実施形態は以下で説明され、その説明において生体は細胞である。
撮像システム
撮像システムは、本発明に従って構成された撮像システムのデータ処理構成要素の略図を示す図１を参照して説明される。システムは、下で詳しく説明されるように、検出器Ｄ₁、Ｄ₂、Ｄ₃、Ｄ₄、Ｄ₅を含む共焦点顕微鏡などの撮像装置ＩＤ、スイッチＳＷ、制御装置１、画像データ記憶装置２及び入出力（Ｉ／Ｏ）装置４を含む。関連コンピュータ端末ＣＴは、中央演算処理装置（ＣＰＵ）８、メモリ１０、ハードディスクドライブ１２などのデータ記憶装置並びに、コンピュータＣＴを、Ｉ／Ｏ装置４を経由して撮像装置ＩＤ、及びスクリーンＩ／Ｏ装置３０を経由してスクリーン２８の表示要素３２の両方と相互接続することを促すＩ／Ｏ装置６を含む。オペレーティングシステムプログラム１４はハードディスクドライブ１２上に記憶され、知られているやり方で、コンピュータ端末ＣＴの低レベルの動作を制御する。プログラムファイル及びデータ２０もハードディスクドライブ１２上に記憶され、知られているやり方で、関連装置及びハードディスクドライブ１２上に記憶された出力データを経由してオペレータへの送出を制御する。関連装置は、スクリーン２８の要素としてディスプレイ３２、ポインティングデバイス（図示されず）、及び別のＩ／Ｏ装置（図示されず）を経由してオペレータから入力を受信し、かつオペレータへ情報を送出するキーボード（図示されず）を含む。ハードドライブ１２上に記憶されたプログラムファイル２０内に含まれるのは、アッセイ制御アプリケーション１６、画像処理及び解析ソフトウェアシステム１８、並びに撮像装置ＩＤとデータ処理の間に作り出された出力ファイルとから受信された画像データを記憶するためのデータベース２２である。画像解析ソフトウェアシステム１８は、知られている画像処理及び解析ソフトウェアパッケージのカスタム版であってもよい。
【００３５】
撮像装置ＩＤを使用したアッセイの実行は、制御アプリケーション１６を用いて制御され、画像データが取得される。少なくとも１つの検出器Ｄ₁、Ｄ₂、Ｄ₃により、マルチウェルプレート内の少なくとも１つのウェルに関する画像データの取得が終わってから、画像データはコンピュータ端末ＣＴに伝送され、コンピュータ端末ハードドライブ１２上のデータベース２２内に記憶され、その時点で、下でさらに詳しく説明されるように、画像データは画像処理及び解析ソフトウェアシステム１８を用いて処理されてもよい。
【００３６】
図２は、本発明の一実施形態を示し、そこで使用される撮像装置ＩＤは、米国特許第６，４００，４８７号及び第６，３８８，７８８号、並びに米国特許出願第１０／２２７，５２２号で説明されるＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＩＮＣｅｌｌＡｎａｌｙｚｅｒ（商標）システムに基づく共焦点顕微鏡である。顕微鏡は、例えば、光学距離３５０〜７５０ｎｍの電磁放射源１００又は１１０、円柱レンズ１２０、第１のスリットマスク１３０、第１のリレーレンズ１４０、二色性（ｄｉｃｈｒｏｉｃ）鏡１５０、対物レンズ１７０、サンプルウェルの二次元配列１８２を含むマルチウェルプレート１８０、チューブレンズ１９０、フィルタ２００、第２のスリットマスク２１０及び検出器２２０を含む。これらの要素は、図２の平面に直角に延びる、マスク１３０、２１０内のスリットアパーチャ（ｓｌｉｔａｐｅｒｔｕｒｅ）１３２、２１２を有する光軸ＯＡに沿って配置される。レンズ１４０、１７０及び１９０の焦点距離及びこれらのレンズ間の間隔、並びにマスク１３０とレンズ１４０との間、対物レンズ１７０とマルチウェルプレート１８０との間、及びレンズ１９０とマスク２１０との間の間隔は、共焦点顕微鏡を設置できるようなものとする。この実施形態では、ランプ１００又はレーザ１１０からの電磁放射線は、円柱レンズ１２０を用いて直線に焦点を合わせる。直線の形は第１スリットマスク１３０によって最適化される。スリットマスク１３０は、平面内で生体面と共役する（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）光学システムの画像面内に示される。スリットマスク１３０内でアパーチャ１３２によって形成される照明筋（ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎｓｔｒｉｐｅ）は、レンズ１４０、二色性鏡１５０及び対物レンズ１７０によって、サンプルウェルの二次元配列１８２を含むマルチウェルプレート１８０上に中継される。例示の都合上、図２の光学要素は断面図、マルチウェルプレートは遠近法によって示されている。マルチウェルプレート１８０上への照明線（ｌｉｎｅｏｆｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）の投影は、直線１８４によって示され、また図２の平面に直角となるものと解釈される。矢印Ａ及びＢによって示されるように、マルチウェルプレート１８０は、図示されない手段によって配列の寸法に沿って二次元（Ｘ、Ｙ）に移動できる。
【００３７】
サンプル範囲、例えば、サンプルウェル１８２内のサンプルの画像は、サンプル内の平面に照明線を投影し、そこから蛍光発光を検出器２２０上に撮像し、検出器２２０の読取りと同時に、プレート１８０を照明線に垂直方向に移動することにより得られる。図２に示される実施形態では、蛍光発光は対物レンズ１７０によって集められ、二色性ビームスプリッター１５０を介して投影され、フィルタ２００及び第２のスリットマスク２１０を介して、無限遠補正（ｉｎｆｉｎｉｔｙ−ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ）対物レンズ１７０を有する共焦点撮像システムに適するような検出器２２０上にレンズ１９０によって撮像される。二色性ビームスプリッター１５０及びフィルタ２００は、優先的に照明波長で光を遮断する。検出器２２０は例示的にカメラであり、一次元であっても二次元であってもよい。一次元の検出器が使用される場合、スリットマスク２１０は不要である。照明、検出及び変換の手順は、所定の範囲が撮像されるまで継続される。
【００３８】
多波長蛍光撮像を可能にする実施形態は、ある種のアッセイに関して好ましい。このように、複数の異なるカラーチャネルの各々で同時に撮像されている同じ範囲に関して画像データが作成され得る。
【００３９】
独立した波長又は色の数は、実行されている特定のアッセイによって決まる。一実施形態では、３つの照明波長が用いられる。図３Ａ及び図３Ｂは、３色のラインスキャン共焦点撮像システム内の光線経路をそれぞれ平面及び側面から示す。一般に、システムは、いくつかの電磁放射源Ｓ_n、コリメータレンズ（ｃｏｌｌｉｍａｔｉｎｇｌｅｎｓｅｓ）Ｌ_n、及び円柱レンズＣＬによって第１の空間フィルタＳＦ₁で細長いビームに集束させる平行ビームを作り出するための鏡Ｍ_n、第１空間フィルタＳＦ₁と第２空間フィルタＳＦ₂との間の共焦点顕微鏡、撮像レンズＩＬ、ビームスプリッターＤＭ₁ 及びＤＭ₂、並びにサンプルから蛍光放射線の異なる波長成分を分離し、検出するための検出器Ｄｎを備える。空間フィルタＳＦ、並びにＳＦ₁ 及びＳＦ₂はスリットマスクであることが好ましい。
【００４０】
特に、図３Ａは、色λ₁、λ₂ 及びλ₃のための電磁放射源Ｓ₁、Ｓ₂ 及びＳ₃、並びにそれぞれの電磁放射源から光を平行にするレンズＬ₁、Ｌ₂ 及びＬ₃を示す。レンズＬ₁、Ｌ₂ 及びＬ₃は、システム内の他のレンズの任意の色度を補うために調整されることが好ましい。鏡Ｍ₁、Ｍ₂ 及びＭ₃は、電磁放射源Ｓ_nからの照明色を組み合わせるために使用される。鏡Ｍ₂ 及びＭ₁は、部分的に透過し、部分的に反射し、優先的に二色性である。例えば、Ｍ₂は優先的にλ₃を透過し、優先的にλ₂を反射する。したがって、λ₃はλ₂より大きいことが優先的である。
【００４１】
共焦点モードの顕微鏡の動作は、電磁放射源Ｓ_nからの組み合わされた励起ビームが生体面ＯＰ内で「直線」に、又は非常に偏心的な楕円に集束させることを必要とする。上で図２と関連して議論されたように、これを実現するために様々な構成が用いられてよい。図３Ａに示された実施形態では、組み合わされた照射ビームは、円柱レンズＣＬによって、空間フィルタＳＦ₁内のスリットと一致する細長い楕円形内に集束される。図３Ａ及び図３Ｂに描かれるように、スリットマスクＳＦ₁は、その長軸が図３Ａのページの平面内にある、照明光の伝搬に直角に並ぶシステムの画像面内に存在する。レンズＴＬ及びＯＬはＳＦ₁を含む平面から生体面ＯＰに照明線を中継する。反射鏡ＴＭは便宜上である。別の実施形態では、ＤＭ₃はＴＬとＯＬとの間にあり、ＣＬは照明光をＢＦＰに直接集束させる。別の実施形態は当業者には明らかであろう。
【００４２】
図３Ｂを参照すると、サンプルによって放射され、対物レンズＯＬによって集められた光は、チューブレンズＴＬによって空間フィルタＳＦ２上に撮像される。ＳＦ２は、優先的にはページの平面まで直角に延びるように並べられたスリットである。したがって、フィルタＳＦ２によって通された光は、実質的に照明線である。ＳＦ２は、一次画像面内又はそれに結合された任意の平面内に配置されてよい。ＤＭ３は部分的に反射し、部分的に透過し、「多色性（ｍｕｌｔｉｃｈｒｏｉｃ）」であることが好ましい。多波長の「二色性」鏡又は「多色性」鏡は、優先的にある種の波長帯域を反射し、優先的に他の波長帯域を透過することを実現できる。
【００４３】
ここでは、δλ₁はλ₁によって励起された蛍光発光であると定義されることになる。これは、一般に、λ₁よりも若干長い波長の分布であろう。δλ₂ 及びδλ₃は同じように定義される。ＤＭ₃は優先的にλ_nを反射し、優先的にδλ_nを透過する（ｎ＝１，２，３）。ＳＦ₂によって透過された光は、一次画像に結合された平面内に存在する検出装置上で撮像される。図３Ａでは、空間フィルタＳＦ２の画像はすべての３つの検出器Ｄ_n上でレンズＩＬによって生み出される。この実施形態は、それぞれの検出器によって作成された画像間に完全に近いレジストリ（ｎｅａｒ−ｐｅｒｆｅｃｔｒｅｇｉｓｔｒｙ）を必要とする応用例において好ましい。別の実施形態では、個々のレンズＩＬ_nは検出装置に関連し、レンズの対ＩＬ及びＩＬ_nは空間フィルタＳＦ₂の画像をそれぞれ検出器Ｄ_n上に中継する働きをする。この光は鏡ＤＭ₁ 及びＤＭ₂によって検出器間で分割される。鏡は部分的に透過し、部分的に反射し、優先的に二色性である。ＤＭ１は優先的にδλ₁を反射し、優先的にδλ₂とδλ₃を透過する。遮断フィルタＢＦ₁は、存在するすべての他の波長を効果的に遮断しながら、優先的にδλ₁を透過する。ＤＭ₂は優先的にδλ₂を反射し、優先的にδλ₃を透過する。遮断フィルタＢＦ₂ 及びＢＦ₃は、存在するすべての他の波長を効果的に遮断しながら、優先的にδλ₂ 及びδλ₃をそれぞれ透過する。
画像取得
撮像システムを用いて、細胞アッセイの画像が記録されてもよい。サンプル細胞培養は、複数のレセプタクル内、この例では、マルチウェルマイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅｐｌａｔｅ）のサンプルウェル内に配置され、異なる化合物が各ウェル内に配置されてよく、化合物の添加に続く所望の時期に、サンプルの画像取得が実行され得る。
【００４４】
図４は、本発明の一実施形態による、細胞培養を含む、撮像のためのサンプルウェル２３０の断面図を示す。サンプルウェル２３０は、先に説明されたサンプルウェル１８２と類似し、撮像システムの光軸ＯＡ上に配置される。ウェル２３０は、ウェル２３０がＵ型の断面を有するように、円筒壁の１つの端をカバーする底板２３４を伴い一体的に形成される円筒壁２３２を有する。ウェル２３０は細胞２３６に細胞培養の環境を提供する。細胞２３６は、ウェル２３０内部の底板２３４上に細胞２３６を配置することによって環境内に配置される。細胞２３６は、コントラスト増強造影剤（ＣＥＡ）の所定の濃度を含む、セル２３６の外側に配置される物質内に分布され、コントラスト増強造影剤はこの物質の全体にわたってほぼ均一的に分布される。この物質は、細胞２３６に対して非毒性であり、細胞２３６の健全性を維持する栄養素及び条件を提供することによって細胞２３６を支持し、細胞培養が成長するのを助ける媒質２３７である。細胞２３６は、底板２３５の全域で、およそ１個の細胞の厚さを有する層を形成する。別の実施形態では、この層は１つの細胞より大きい厚さを有してもよい。この実施形態では、ＣＥＡは撮像の間に所定の波長の蛍光放射線を放射するように構成される。ＣＥＡの濃度は、この放射線の所定量が放射されるように選択される。先に説明された共焦点顕微鏡は、サンプルの撮像範囲の全域で、細胞２３６及び環境の画像を記録する。撮像範囲は、光軸ＯＡに直角であり、細胞２３６の層を通過する平面２３８内にある。共焦点顕微鏡は、媒質２３７によって放射された蛍光放射線の所定の波長を検出することによって第１チャネル内の画像を記録する。細胞２３６によって占領される撮像範囲の範囲は、ＣＥＡによって放射される放射線により照射されてよい。良質の画像が記録されるようにこの照射を捉えるために、共焦点顕微鏡の設定が調整されてもよく、かつ媒質２３７内のＣＥＡの濃度が選択されてもよい。
【００４５】
図５は、この実施形態に従って記録された画像２４０を概略的に示す。ＣＥＡは、画像２４０内に撮像範囲内の細胞２３６の位置に対応する画像の比較的暗い範囲２４２と、環境に対応する画像の比較的明るい範囲２４４とのコントラストをもたらす。
【００４６】
図６及び図７は、この実施形態に従って記録された画像の例を示す。この例では、細胞２３６はＨｅｌａ細胞であり、媒質２３７は、細胞２３６が培養されているＣｙＤｙｅ（商標）（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＢｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国）誘導化合物である。媒質２３７は細胞２３６によって排除される。
【００４７】
次に図４及び図８を参照して、本発明の異なる実施形態が説明される。この実施形態の特徴及び要素は、先の実施形態で説明された特徴と類似しており、１０００だけ増分された同じ参照番号を用いて参照される。対応する説明は、この場合も適用されると解釈されたい。先の実施形態で説明された共焦点顕微鏡ではなく、この実施形態の撮像システムは、環境を介して、したがって、撮像範囲を介して放射線を透過し、細胞及び環境の画像を記録するために透過された放射線を検出する透過顕微鏡である。異なる実施形態では、波長はあるいは電磁スペクトルの異なる領域（例えば、紫外線領域）に存在する可能性があるが、この例では、透過された放射線は電磁スペクトルの可視光線領域に存在する波長を有する。透過顕微鏡は明視野タイプ又は位相差タイプのものであってよい。
【００４８】
この実施形態では、ＣＥＡは、媒質１２３７が透過された放射線に対する細胞１２３６の透過率より低い透過された放射線の透過率を有するように選択される。ＣＥＡは、媒質１２３７が透過された放射線に対して不透明であるように、物質内に所定の濃度を有する。異なる実施形態でのＣＥＡの濃度は、透過された放射線に対して媒質１２３７の異なるレベルの不透明性を得るために制御されてよい。図８は、この実施形態に従って記録された画像２４６を概略的に示す。ＣＥＡは、画像内に撮像範囲内の細胞１２３６の位置に対応する画像の比較的明るい範囲２４８と、環境に対応する比較的暗い範囲２５０とのコントラストをもたらす。
【００４９】
次に図４及び図５を参照して、本発明の別の実施形態が説明される。この実施形態の特徴及び要素は、先の実施形態で説明された特徴と類似しており、２０００だけ増分された同じ参照番号を用いて参照される。対応する説明は、この場合も適用されると解釈されたい。
【００５０】
この実施形態では、細胞２２３６は、細胞２２３６の健全性を維持し、細胞培養が成長するのを助ける栄養素及び条件を提供することによって細胞２２３６を支持するが、ＣＥＡを含まない媒質２５２内で分布される。細胞２２３６は、図４を用いて先に説明されたサンプルウェル２３０に類似するが、ＣＥＡを含む物質で形成されるマイクロタイタープレートのサンプルウェル２５４内の環境内に配置される。このように、物質は媒質２５２の外側の領域内に配置される。異なる実施形態では、サンプルウェル２５４の一部だけが物質で形成されてもよい。あるいは、物質はサンプルウェルの部分内に埋め込まれてもよく、又は物質で形成されたビーズ、もしくは物質内でコーティングされたビーズをサンプルウェルの部分内に組み込んでもよい。ＣＥＡは撮像の間に蛍光放射線を放射し、この実施形態の撮像システムは先に説明された共焦点顕微鏡である。物質内のＣＥＡの濃度は、ＣＥＡが画像２２４０内に細胞２２３６と環境とのコントラストをもたらすよう、ＣＥＡによって放射された蛍光放射線が撮像範囲の平面２２３８内に放射するように選択される。図５を参照すると、細胞２２３６は、細胞２２３６によって占有される平面２２３８内に存在する範囲内で、共焦点顕微鏡による検出に利用可能な放射された放射線の存在を制限するか、あるいは妨げる。このように、記録された画像２２４０の比較的暗い範囲２２４２は細胞２２３６に対応し、比較的明るい範囲２２４４は媒質２５２に対応する。
【００５１】
次に図５及び図９を参照して、本発明の別の実施形態が説明される。この実施形態の特徴及び要素は先の実施形態で説明された特徴と類似しており、３０００だけ増分された同じ参照番号を用いて参照される。対応する説明は、この場合も適用すると解釈されたい。
【００５２】
図９を参照すると、サンプルウェル３２３０は物質で形成されておらず、媒質３２５２は物質を含まない。底板３２３４の内側表面は、所定の濃度のＣＥＡを有する物質の層２５６を含むコーティングを含む。物質は、細胞３２３６がコーティングの表面２５８に粘着するように提供される。これは、１つの細胞の厚さを有する細胞３２３６の層を形成する助けとなり得る。物質は、例えば、ポリリシン、ポリオルニチン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン又はゼラチンなどの正電荷を持つポリマーである。ＣＥＡは、物質に標識を付けるために使用される蛍光染料（例えば、ＣｙＤｙｅ（商標））である。例えば、ポリリシンは蛍光染料Ｃｙ５により標識付けされてもよい。ＣＥＡを有する物質（この例では、ＣｙＤｙｅ（商標）共役ポリマー（ｐｏｌｙｍｅｒｃｏｎｊｕｇａｔｅ））の安定性は、細胞培養に曝された場合に、共役が一定の期間内（例えば、およそ４８時間から７２時間）分解しないように予め決定されてよい。異なる実施形態では、コーティングは複数の異なる層を含んでもよい。
【００５３】
ＣＥＡの濃度は、撮像の間に、ＣＥＡが撮像範囲の平面３２３８内に放出する蛍光放射線を放射するように選択される。細胞３２３６は、細胞３２３６によって占有される撮像範囲の範囲内で、共焦点顕微鏡による検出に利用可能な、放射された放射線の存在を制限するか、あるいは妨げる。図５を参照すると、画像３２４０は共焦点顕微鏡により記録され、ＣＥＡは画像内に比較的暗い範囲３２４２と比較的明るい範囲３２４４とのコントラストをもたらす。
【００５４】
本発明の別の実施形態では、生体（この場合は細胞）内の１つ又は複数の成分は、記録された画像内に細胞の成分とその他の範囲とのコントラストをもたらす第２のＣＥＡを用いて印付けされる。この場合、成分は細胞より小さい成分、例えば、細胞の顆粒、ゴルジ装置、細胞核及び細胞の細胞膜である。細胞核の場合、第２のＣＥＡは（ＤＲＡＱ５（商標）又はＨｏｅｃｈｓｔ（商標）染料、例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２などの）毒性介在核染料（ｔｏｘｉｃｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇｎｕｃｌｅａｒｄｙｅｓ）のうちの１つなどの核マーカであってもよい。あるいは、ＮＬＳ蛍光性融合タンパク（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｆｕｓｉｏｎ）などの非毒性マーカが使用されてもよい。例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（商標）ｐＨｃＲｅｄ１−Ｎｕｃベクターは、本発明従って細胞株内に核酸が取り込まれる（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）場合、細胞核内に赤い蛍光シグナルを作り出す。他の知られている蛍光マーカを用いて、異なるカラーチャネル内で、細胞質などのその他の範囲を印付けてもよい。
【００５５】
次に図１０を参照すると、１つのそのような実施形態では、撮像システムは先の実施形態に従って記録された画像に加えて、撮像システムの第２のチャネル内の撮像範囲の全域で細胞及び環境の第２の画像２６０をさらに記録する。第２のＣＥＡは、細胞の細胞核に対応する第２の画像の比較的明るい範囲２６２と、細胞質及び媒質を含む、細胞核を取り囲む範囲に対応する比較的暗い範囲２６４とのコントラストをもたらす。これらの２つの記録された画像は、各画像の画素が一列に並ぶように再登録される。これは、画像スタックとして知られるファイル内に保存される。画像スタックは、解析目的で論理的に共に属する画像の集まりである。ほとんどの場合、所与の画像スタックは共通の取得を共有する画像を含む。
【００５６】
次に図１１を参照すると、異なる実施形態では、先の実施形態による共焦点顕微鏡を用いて記録された細胞及び環境の画像に類似するが、細胞より小さい成分の画像も含む画像２６６が記録される。第２のＣＥＡは、細胞核に対応する画像の比較的明るい範囲２６８と、細胞質に対応する比較的暗い範囲２７０とのコントラストをもたらす。細胞及び成分の画像を有する１つの画像を記録することは、撮像システムの２つのチャネルではなく、１つのチャネルのみの使用を必要とする。したがって未使用のチャネルは、撮像範囲の全域で細胞の異なる特性及び媒質を検出するために使用されてもよい。撮像システムの別のチャネルは、細胞培養の別の異なる特性を撮像するために使用されてもよく、これらの異なる画像は画像スタックを形成するために他の画像と共同登録されてもよい。
【００５７】
第２の画像２６０又は細胞より小さい成分及び細胞の画像を含む画像２６６内で第２のＣＥＡによってもたらされたコントラストは、後で説明されるように、１つ又は複数の成分に関する空間的定義を得ることを可能にする。
【００５８】
本発明の別の実施形態では、ＣＥＡ及び／又は第２のＣＥＡは、あるいは、異なる波長の放射線を放射しても、又は異なる種類の放射線、例えば、化学発光及び燐光などの発光放射線を放射してもよい。サンプルウェルの寸法、撮像範囲の平面の位置及び物質の化合物、ＣＥＡ、第２のＣＥＡ及び媒質は、上で説明されたものと異なってもよい。先に説明された媒質は、非生体媒質であるが、異なる実施形態では、この媒質はその代わりに生体媒質であってもよい。
画像処理及び解析
空間的定義は、いくつかの工程に従って画像処理及び解析ソフトウェアシステムを用いて、画像を解析することによって予め記録された画像のうち任意の１つの中の細胞に関して得ることが可能である。画像解析は完全に自動化されてもよく、又は画像解析ソフトウェアシステムによって提供されるグラフィカルユーザインターフェースを経由してユーザによって変更された設定によって制御されてもよい。
【００５９】
画像解析の工程を詳しく述べる図１２を参照する。これらの工程は、図５を参照して説明される実施形態で記録された画像２４０に関して下で説明される。画像の比較的暗い画素と比較的明るい画素を識別するために、明るさ閾値が記録された画像２４０に適用されるＳ１。明るさ閾値のレベルは、ＣＥＡによってもたらされる、異なる明るさ強度を有する撮像範囲に基づき設定される。図１３は、画像２４０の閾値処理された画像２７２を示す。閾値の適用は、域値に満たない明るさ強度を有する、記録された画像２４０の画素に対応する比較的暗い画素の範囲２７４及び閾値を超える明るさ強度を有する、比較的明るい画素の範囲２７６の両方を有する、閾値処理された画像２７２を作り出す。比較的暗い画素の１つの範囲２７７は、細胞のうちの１つに対応する。
【００６０】
閾値処理された画像２７２は、次いで分割された生体範囲に分割されるＳ２。各生体範囲は、１つの細胞に対応する閾値処理された画像２７２の１つの範囲に対応する。分割は、グレースケール分割アルゴリズム、粒状分割（ｇｒａｎｕｌａｒｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）アルゴリズム、バイナリ分割アルゴリズム、又は多層（ｍｕｌｔｉ−ｓｃａｌａｒ）分割アルゴリズムなどの分割アルゴリズムによって実行される。
【００６１】
分割された生体範囲は、次に細胞として割り当てられＳ３、これら分割された範囲の外側の領域は媒質として割り当てられる。ＣＥＡが放射線を放射する、先に説明された実施形態の場合、画像の比較的暗い生体範囲は分離されて、細胞として割り当てられる。ＣＥＡが透過された放射線に対して不透明である、先に説明された実施形態の場合、閾値処理された画像の比較的明るい生体範囲が分離されて、細胞として割り当てられる。
【００６２】
これに続き、細胞に対応する、画像の分割された生体範囲の各々に関して空間的定義が得られるＳ４。図１４は、１つの細胞に対応する、閾値処理された画像２７２の１つの範囲２７７に関して得られた空間的定義２７８を概略的に示す。細胞のうちの１つに対応する撮像範囲を画定するために、各空間的定義は記録された画像２４０内の画素を識別する。
【００６３】
第２のＣＥＡによってもたらされるコントラストを有する記録された画像のために、類似の画像解析が使用される。図１５は、図１０を参照して説明された第２の記録された画像２６０に対して明るさ閾値を適用することによって作り出される閾値処理された画像２８０を概略的に示す。比較的明るい画素の範囲２８２は細胞核に対応し、比較的暗い画素の範囲２８５は細胞核を取り囲む範囲に対応する。比較的明るい画素の１つの範囲２８５は、細胞核のうちの１つに対応する。閾値処理された画像２８０は、次いで細胞より小さい成分に対応する生体成分範囲に分割される。各生体成分範囲は、細胞核のうちの１つに対応する。各生体成分範囲は細胞核として割り当てられ、各細胞核に関する空間的定義が得られる。図１６は、１つの細胞核に対応する閾値処理された画像２８０の１つの範囲２８５に関して得られた空間的定義２８６を概略的に示す。
【００６４】
図１１を参照して説明される実施形態の場合、記録された画像２６６は同様に閾値処理される。この閾値処理された画像の比較的明るい画素の範囲は、細胞核及び媒質に対応し、比較的暗い画素の範囲は細胞質に対応する。閾値処理された画像は、次いで生体範囲と、後にそれぞれ細胞及び細胞核として割り当てられる生体成分範囲とに分割される。次いで、細胞及び細胞核に関する空間的定義が得られる。
【００６５】
画像を分割する前に、フラットフィールド校正、雑音除去及びシェーディング除去など、前処理アルゴリズムが画像に適用されてもよい。分割前に、ふるい分け、生体のクランピング除去、テセレーション（ｔｅｓｓｅｌａｔｉｏｎ）、分割された画像生体の侵食又は膨張など、後処理アルゴリズムが適用されてもよい。
【００６６】
得られた空間的定義は、細胞の記録画像をさらに処理するために使用されてもよい。加えて、撮像システムの１つ又は複数のチャネル内に記録される、細胞の別の記録された画像は、やはり得られた空間的定義を用いて処理されてもよい。一例では、得られた空間的定義は画像マスクを形成するために用いられてもよい。図１７は、図１６で参照される１つの細胞核の空間的定義２８６に対応する細胞核マスク２９１と、図１４で参照される１つの細胞の空間的定義２７８に対応する細胞質マスク２９２の両方を有するが、１つの細胞核の空間的定義２８６を伴わないマスク２９０を概略的に示す。１つの細胞の細胞マスクは、細胞質マスク２９２と細胞核マスク２９１とを共に含む。そのようなマスクは１つ又は多くのチャネル内に記録された、細胞培養の記録された画像をさらに処理するために使用されてもよい。例えば、マスクは細胞、細胞質及び／又は細胞核に対応する、そのような別の画像の領域を空間的に画定するために使用されてもよい。
【００６７】
図１８ａは、緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）、特にＥＧＦＰ（ＢＤＣｌｏｎｔｅｃｈ）を表現する２つのＣＨＯ細胞２３６の画像２４０を示す。エメラルド（Ｔｓｉｅｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１９９８），６７，５０９−５４４）又は赤色（Ｊ−Ｒｅｄ）（Ｅｖｒｏｇｅｎ）などの他の形式の蛍光タンパクが知られている。ＧＦＰは細胞質２７０内に局在し、細胞核２６８の比較的暗い範囲と排除された媒質２３７とによりコントラストをもたらす。閾値処理に続いて、図１８ｂでビットマップオーバーレイの白色領域２７０によって示されるように、蛍光細胞質タンパクが識別される。この情報から、細胞核２６８の周囲の内側周囲長２６５が計算によって識別され（例えば、周囲長内の画素に１の値が与えられ、周囲長外の画素に０の値が与えられ）細胞核「マスク」（図１８ｃ）を作り出すことができる。この例では、周囲長は細胞質の明るい範囲を用いて定義されてよい点に留意されたい。生み出された細胞核マスクは、報告され得る寸法（例えば、範囲、直径、周囲長、中心など）を有する。マスクはその時点で（強度などの）細胞核測定が取得できるように、細胞核の源画像（ｓｏｕｒｃｅｉｍａｇｅ）に問い合わせる（ｉｎｔｅｌｌｏｇａｔｅ）ために使用されてもよい。図１８ｄは、細胞質２７０源の画像上に重ね合わされた細胞核ビットマップを示し、細胞核ビットマップは各細胞の細胞核領域２６８を正確に識別することを立証する。
【００６８】
当業者は、第１の源画像から特定のマスクが作り出されると、第２の源画像に問合せを行うためにこのマスクが使用されてよい点を理解されよう。例えば、特定の薬物（例えば、Ａｄ−Ａ−ｇｅｎｅｖｅｃｔｏｒｓ，ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＧＦＰＡｓｓａｙｓ：Ｌｉｖｅ−ＣｅｌｌＴｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎＡｓｓａｙｓ，ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に応じて、細胞質と細胞核との間を移動できる蛍光プローブが知られている。第１の源画像からの細胞核マスクを使用することによって、第２の源画像内のプローブに問い合わせ、細胞核領域内のプローブの量を定量化することが可能である。
【００６９】
本発明は、疾病治療のための薬理学的薬剤を特定するのに役立つ。本発明は、生体及び／又は生体の成分を特定するために使用される化合物が、アッセイの期間中に細胞培養の健全性の低下を引き起こさないことが重要である場合、様々な生物学的アッセイを行うための、潜在的に自動化された、処理能力の高い方法を提供する。そのようなアッセイは、化合物に対して又は、コンビナトリアルライブラリ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｌｉｂｒａｒｉｅｓ）内に見つかるようなものなどの薬物候補を含むがこれに限定されない、任意の生物学的対象の分子に対して行われることができ、生物学的対象の化合物の処理能力の高いスクリーニングを可能にする。
【００７０】
上記の実施形態は、本発明の説明のための例として理解されたい。本発明の別の実施形態が想定される。いずれの一実施形態に関して説明されたいずれの特徴は、単独で、又は説明された別の特徴と組み合わせて使用されてもよく、いずれのその他の実施形態の１つもしくは複数の特徴と組み合わせて、又はいずれのその他の実施形態の任意の組合せで使用されてもよい点を理解されたい。さらに、添付の特許請求の範囲で定義される、本発明の範囲から逸脱せずに、上に説明されない均等物及び変更物を使用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明の一実施形態に従って構成された撮像システム内のデータ処理構成要素を示す略図である。
【図２】本発明に従ってサンプルを撮像するために使用されるラインスキャン共焦点顕微鏡（ｌｉｎｅ−ｓｃａｎｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）の第１の実施形態の概略図である。
【図３ａ−ｂ】それぞれ走査鏡を伴わない、本発明の多色性の実施形態の光線経路（ｒａｙｐａｔｈ）の平面図及び側面図である。
【図３ｃ】シングルビームオートフォーカス（ｓｉｎｇｌｅｂｅａｍａｕｔｏｆｏｃｕｓ）の光線経路の平面図である。
【図４】本発明の実施形態による生体を含むレセプタクルの断面図である。
【図５】本発明の実施形態による生体の画像を概略的に示す図である。
【図６】本発明の一実施形態に従って記録された生体の例示的画像を示す図である。
【図７】本発明の一実施形態に従って記録された生体の例示的画像を示す図である。
【図８】本発明の一実施形態による生体の画像を概略的に示す図である。
【図９】本発明の一実施形態による生体を含むレセプタクルの断面図である。
【図１０】本発明の一実施形態に従って記録された生体成分の画像を概略的に示す図である。
【図１１】本発明の一実施形態に従って記録された生体及び生体成分の画像を概略的に示す図である。
【図１２】本発明の一実施形態に従って空間的定義を得るための工程の流れ図である。
【図１３】本発明の一実施形態による生体の閾値処理された画像を概略的に示す図である。
【図１４】本発明の一実施形態による生体の空間的定義を概略的に示す図である。
【図１５】本発明の一実施形態による生体成分の閾値処理された画像を概略的に示す図である。
【図１６】本発明の一実施形態による生体成分の空間的定義を概略的に示す図である。
【図１７】本発明の一実施形態によるマスクを概略的に示す図である。
【図１８ａ−ｄ】本発明の一実施形態に従って記録され、撮像された生体の例示的な画像を示す図である。

Claims

撮像範囲の全域で画像を捕捉できる撮像装置を用いて、１つ又は複数の生体を撮像する方法であって、当該方法が、
ａ）前記１つ又は複数の生体を環境内に配置する工程と、
ｂ）画像内に前記１つ又は複数の生体と前記環境とのコントラストをもたらす、コントラスト増強造影剤を提供する工程と、
ｃ）前記撮像装置を用いて、前記１つ又は複数の生体及び前記環境の画像を記録する工程であって、前記環境を通して放射線を透過させて、前記透過した放射線を検出することを含む工程と、
ｄ）前記コントラスト増強造影剤によってもたらされる画像内のコントラストを用いて、前記１つ又は複数の生体に関する空間的定義を得る工程と
を含んでいて、前記工程ｂ）において前記コントラスト増強造影剤が前記１つ又は複数の生体の外側の前記環境内に提供される、方法。
前記コントラスト増強造影剤が、前記１つ又は複数の生体が支持される媒質中で提供される、請求項１記載の方法。
前記工程ｃ）の記録する工程の間、前記環境を通して放射線を透過させる工程と、前記透過した放射線を検出する工程とを含む、請求項２記載の方法。
前記透過した放射線に対する前記１つ又は複数の生体の透過率よりも低い前記透過した放射線の透過率を有する前記コントラスト増強造影剤を構成する工程を含む、請求項３記載の方法。
前記画像の比較的明るい範囲を分離する工程と、前記１つ又は複数の生体として前記比較的明るい範囲を割り当てる工程とを含む、請求項４記載の方法。
前記造影剤が放射線を放射するように前記造影剤を構成する工程と、前記工程ｃ）の記録する工程の間、前記放射された放射線を検出する工程とを含む、請求項２記載の方法。
前記画像の比較的暗い範囲を分離する工程と、前記１つ又は複数の生体として前記比較的暗い範囲を割り当てる工程とを含む、請求項６記載の方法。
前記１つ又は複数の生体が支持される媒質を提供する工程と、前記媒質の外側の領域内で前記コントラスト増強造影剤を提供する工程とを含む、請求項１記載の方法。
前記１つ又は複数の生体を含むレセプタクルを提供する工程を含み、前記レセプタクルの少なくとも一部が前記コントラスト増強造影剤で形成される、請求項８記載の方法。
前記１つ又は複数の生体を含むレセプタクルを提供する工程を含み、前記レセプタクルの内側表面が前記コントラスト増強造影剤の層を含むコーティングを含む、請求項８記載の方法。
前記１つ又は複数の生体が前記コーティングの表面に粘着するように、前記コーティングに粘着性を提供する工程を含む、請求項１０記載の方法。
放射線を放射するように前記造影剤を構成する工程と、前記工程ｃ）の記録する工程の間、前記放射された放射線を検出する工程とを含む、請求項８乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
前記１つ又は複数の生体が、前記１つ又は複数の生体内で、検出に利用可能な前記放射された放射線の存在を制限するように、又は妨げるように、前記コントラスト増強造影剤を構成する工程を含む、請求項１２記載の方法。
前記画像の比較的暗い範囲を分離する工程と、前記１つ又は複数の生体として前記比較的暗い範囲を割り当てる工程とを含む、請求項８乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
ｉ）閾値処理された画像を作り出すように、比較的暗い画素と比較的明るい画素とを識別するために、前記画像に明るさの閾値を適用する工程と、
ｉｉ）前記閾値処理された画像を生体範囲に分割する工程と
を含む、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の方法。
前記空間的定義が前記画像内の画素を識別する、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
前記１つ又は複数の生体が、前記１つ又は複数の生体内に１つ又は複数の成分を含み、当該方法が、前記成分を、画像内に前記１つ又は複数の生体の前記成分とその他の範囲とのコントラストをもたらす第２のコントラスト増強造影剤で印付ける工程を含む、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法。
前記撮像装置を用いて、前記１つ又は複数の生体及び前記環境の第２の画像を記録し、それによって、前記第２のコントラスト増強造影剤によってもたらされる前記第２の画像内のコントラストを用いて、１つ又は複数の前記成分に関する空間的定義を得ることができる工程を含む、請求項１７記載の方法。
前記第２のコントラスト増強造影剤によってもたらされる、工程ｃ）で記録された画像内のコントラストを用いて、１つ又は複数の前記成分に関する空間的定義を得ることができる、請求項１７記載の方法。
前記コントラスト増強造影剤が生体物質又は非生体物質である、請求項１乃至請求項１９のいずれか１項記載の方法。
前記コントラスト増強造影剤が蛍光タンパク又は蛍光染料である、請求項１乃至請求項２０のいずれか１項記載の方法。
前記コントラスト増強造影剤が、前記１つ又は複数の生体に対して非毒性である、請求項１乃至請求項２１のいずれか１項記載の方法。
前記１つ又は複数の生体が細胞である、請求項１乃至請求項２２のいずれか１項記載の方法。