JP2002526788A - ハイスループット顕微鏡 - Google Patents
ハイスループット顕微鏡Info
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Classifications
-
- G—PHYSICS
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- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
- G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
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- G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
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- G02B21/26—Stages; Adjusting means therefor
Abstract
(57)【要約】
高分解能３次元蛍光顕微鏡における使用のためのシステムが、操作可能な組み合わせで以下の１以上を含む：無限結像手段を用いて観察するための複数のサンプルを示す円形回転可能ディスク；データ収集と一致した間隔で光を発するパルス光源；放射光路にあるビームスプリッターおよびフィルター（これらは、同じ原色光を複数のＣＣＤ検出器上に結像させる）；サンプルの温度を制御するための手段；ならびにサンプルの成分の特定の特徴を検出するパターンおよびサインを認識するための手段。
Description
【０００１】 （技術分野） 本発明は、一般に、高解像、三次元の蛍光顕微鏡システムおよびそれらの使用
方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、多次元蛍光イメージの捕捉および分
析のために設計された現存の広視野の光学的断面図示性の顕微鏡システムの具体
的な改良を説明する。
方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、多次元蛍光イメージの捕捉および分
析のために設計された現存の広視野の光学的断面図示性の顕微鏡システムの具体
的な改良を説明する。
【０００２】 （背景技術） 光学顕微鏡の分野は、共焦点および蛍光顕微鏡の広範囲に及ぶ使用によって、
近年発展してきた。レーザー照明およびデジタル画像処理の組み合わせで、これ
らの光学器具によって、生物学者は高解像、三次元蛍光イメージを得ることがで
きるようになった。
近年発展してきた。レーザー照明およびデジタル画像処理の組み合わせで、これ
らの光学器具によって、生物学者は高解像、三次元蛍光イメージを得ることがで
きるようになった。
【０００３】 デコンボリューション顕微鏡、これはレーザー走査共焦点顕微鏡への他のアプ
ローチであるが、は認められつつある。この技術は、高コストを抑えおよびレー
ザー照明の限定を避け、高解像および多波長が要求される生−細胞の研究に理想
的である。典型的なこの種の装置は、デルタビション（登録商標）顕微鏡システ
ムである。デルタビション（登録商標）システムは、広視野の光学断面図示性の
顕微鏡システムである。例えば、ｉｎｆｏ＠ａｐｉ．ｃｏｍおよび米国特許Ｎｏ
．５，６８４，６２８を参照たい。デルタビション（登録商標）システムに包含
される基本的なコンセプトは、以下を含む：高質電荷結合装置、すなわち、ＣＣ
Ｄ（シリコンチップ）領域検出器を使用するデジタル形式で直接のイメージデー
タの収集；近接する平面から焦点面へ、光漏れから起きるノイズ計算的除去、デ
ータの取り込みと分析のための容易なユーザインターフェースの提供。
ローチであるが、は認められつつある。この技術は、高コストを抑えおよびレー
ザー照明の限定を避け、高解像および多波長が要求される生−細胞の研究に理想
的である。典型的なこの種の装置は、デルタビション（登録商標）顕微鏡システ
ムである。デルタビション（登録商標）システムは、広視野の光学断面図示性の
顕微鏡システムである。例えば、ｉｎｆｏ＠ａｐｉ．ｃｏｍおよび米国特許Ｎｏ
．５，６８４，６２８を参照たい。デルタビション（登録商標）システムに包含
される基本的なコンセプトは、以下を含む：高質電荷結合装置、すなわち、ＣＣ
Ｄ（シリコンチップ）領域検出器を使用するデジタル形式で直接のイメージデー
タの収集；近接する平面から焦点面へ、光漏れから起きるノイズ計算的除去、デ
ータの取り込みと分析のための容易なユーザインターフェースの提供。
【０００４】 （発明の開示） 本発明は、標準の広視野顕微鏡システム、例えば、デルタビション（登録商標
）システムの改良に関する。この改良は、１日当たり、１，０００より多い、好
ましくは１０，０００より多いサンプル、例えば、抗体／抗原反応のイメージン
グを可能にする。これらの改良が適用される基本的なシステムは、蛍光顕微鏡の
特徴を一般に共有し、つまり、励起フィルタおよび発光フィルタ、対物レンズ、
移動可能なステージおよびＣＣＤによるイメージ記録である。そのような基本的
な器具は、さらに、伝達された光を結像し得る。
）システムの改良に関する。この改良は、１日当たり、１，０００より多い、好
ましくは１０，０００より多いサンプル、例えば、抗体／抗原反応のイメージン
グを可能にする。これらの改良が適用される基本的なシステムは、蛍光顕微鏡の
特徴を一般に共有し、つまり、励起フィルタおよび発光フィルタ、対物レンズ、
移動可能なステージおよびＣＣＤによるイメージ記録である。そのような基本的
な器具は、さらに、伝達された光を結像し得る。
【０００５】 この基本的な設計の改良を構成する特徴は、三つの概略カテゴリーに分けられ
る： 光学的特徴であり、これは本発明の改良を構成するもので、パルス状光源、光
ファイバー光源、コンピュータ−制御コンデンサ、無限フォーカシング、ポリク
ロマチックビームスプリットおよび一つのＣＣＤ検出器よりもむしろ多重ＣＣＤ
検出器を備える。
る： 光学的特徴であり、これは本発明の改良を構成するもので、パルス状光源、光
ファイバー光源、コンピュータ−制御コンデンサ、無限フォーカシング、ポリク
ロマチックビームスプリットおよび一つのＣＣＤ検出器よりもむしろ多重ＣＣＤ
検出器を備える。
【０００６】 機械的特徴であり、これは本発明の改良を有するもので、従来のサンプルホル
ダーの替わりに回転可能円形デイスク（ここで、そのデイスクは、分離した小さ
いウエルを作る設計特徴をさらに有し得る）；試薬調剤器およびデイスクの周囲
に配置された読み出しステーション、調剤器および読み出しヘッドを半径方向へ
移動するアーム；ステージ傾斜装置、および温度制御された試料室を有し得る。
ダーの替わりに回転可能円形デイスク（ここで、そのデイスクは、分離した小さ
いウエルを作る設計特徴をさらに有し得る）；試薬調剤器およびデイスクの周囲
に配置された読み出しステーション、調剤器および読み出しヘッドを半径方向へ
移動するアーム；ステージ傾斜装置、および温度制御された試料室を有し得る。
【０００７】 さらに、その改良は、制御および計算プログラム、非均質の照明補償器、色収
差補償器、フーリエスペース特徴検出器、および現実のスペース特徴検出器を有
する計算の特徴を備える。
差補償器、フーリエスペース特徴検出器、および現実のスペース特徴検出器を有
する計算の特徴を備える。
【０００８】 本発明の一つの目的は、データ収集の割合に合った速度で光源をパルス化する
ことにより、サンプルに対する光損傷を小さくすることである。照明通路の中の
試料前および後に回転する２色フィルタを有する光ファイバー配線が、より効率
のよい自動操作を可能にする。自動コンデンサ（例えば、微分干渉および偏光イ
メージングのためにマスク内でスライドすること）はさらに有利である。
ことにより、サンプルに対する光損傷を小さくすることである。照明通路の中の
試料前および後に回転する２色フィルタを有する光ファイバー配線が、より効率
のよい自動操作を可能にする。自動コンデンサ（例えば、微分干渉および偏光イ
メージングのためにマスク内でスライドすること）はさらに有利である。
【０００９】 本発明の他の局面は無限結像に関する。これは高倍率および低倍率間を切り替
えることができるスライド素子を備えた対物レンズ、従来の回転ヘッド顕微鏡よ
りもより効率的なシステムを採用する。そのイメージは、対物レンズから光通路
の下流へ第２のレンズをスライドすることによってさらに焦点が合わされる。焦
点合わせのためのコンピュータ制御モータが物理的に外れて配置できるので、こ
れは対物レンズの配置を単純化する。”無限結像”は、さらに、倍率の可能性の
範囲を広げ、サンプルの近傍から移動部分を除去する。これは温度コントロール
、例えば、試料のパーミッテイング（ｐｅｒｍｉｔｔｉｎｇ）冷却を単純にする
。試料の冷却は色相の差異を認識する能力を高め放出線幅をシャープにする。
えることができるスライド素子を備えた対物レンズ、従来の回転ヘッド顕微鏡よ
りもより効率的なシステムを採用する。そのイメージは、対物レンズから光通路
の下流へ第２のレンズをスライドすることによってさらに焦点が合わされる。焦
点合わせのためのコンピュータ制御モータが物理的に外れて配置できるので、こ
れは対物レンズの配置を単純化する。”無限結像”は、さらに、倍率の可能性の
範囲を広げ、サンプルの近傍から移動部分を除去する。これは温度コントロール
、例えば、試料のパーミッテイング（ｐｅｒｍｉｔｔｉｎｇ）冷却を単純にする
。試料の冷却は色相の差異を認識する能力を高め放出線幅をシャープにする。
【００１０】 本発明のさらなる局面は、多重ＣＣＤ検出器上に結像されるのと同じ原色光を
通すフィルタと関連したビームスプリッタの使用である。多重検出器は、データ
の収集を早めることができ、および多重カラーの検出のイメージ記録をより信頼
できるようにする。
通すフィルタと関連したビームスプリッタの使用である。多重検出器は、データ
の収集を早めることができ、および多重カラーの検出のイメージ記録をより信頼
できるようにする。
【００１１】 機械的特徴において、一つの局面では、本発明は、典型的な顕微鏡スライドま
たは９６−ウエルプレートの代わりに、回転可能円形デイスクを採用する。これ
らのデイスクは、回転可能なステージ上に配置されている。典型的には、該デイ
スクは、４−インチ直径から９または１２インチまでサイズを変えることができ
る。デイスクの正確なサイズは問題ではない。これらのディスクはコンピュータ
チップ産業から入手できる。デイスクは、疎水性材料で塗装し得て、リソグラフ
ィー技術を用いるサンプルウエルを規定するバリヤを形成する。採用されるリソ
グラフィー技術は米国特許Ｎｏ．５，２１２，０２８に教示されているものと類
似する。その内容は、この明細書に参考として援用する。これらの技術を用いる
と、４−インチデイスクは塗装され得、例えば、１，０００のサンプルウエルを
生成する２ｍｍのセグメントを形成し、および２，５００のウエルを生成する１
ｍｍのセグメントを形成する。その代わりに、小さい試料キャリアを堆積させ得
る接着ラインが使用され得る。
たは９６−ウエルプレートの代わりに、回転可能円形デイスクを採用する。これ
らのデイスクは、回転可能なステージ上に配置されている。典型的には、該デイ
スクは、４−インチ直径から９または１２インチまでサイズを変えることができ
る。デイスクの正確なサイズは問題ではない。これらのディスクはコンピュータ
チップ産業から入手できる。デイスクは、疎水性材料で塗装し得て、リソグラフ
ィー技術を用いるサンプルウエルを規定するバリヤを形成する。採用されるリソ
グラフィー技術は米国特許Ｎｏ．５，２１２，０２８に教示されているものと類
似する。その内容は、この明細書に参考として援用する。これらの技術を用いる
と、４−インチデイスクは塗装され得、例えば、１，０００のサンプルウエルを
生成する２ｍｍのセグメントを形成し、および２，５００のウエルを生成する１
ｍｍのセグメントを形成する。その代わりに、小さい試料キャリアを堆積させ得
る接着ラインが使用され得る。
【００１２】 本発明の機械的特徴の他の利点は、これらの多数試料デイスクの使用に関して
いる。従って、試薬調剤器および読み出しステーションはデイスクの周囲に配置
され得、そして調剤器および読み出しヘッドを半径方向に移動するアームで固定
され得る。他の機械的特徴は、無限フォーカス機能によって容易にされた、ステ
ージ傾斜装置および温度制御された試料室を備える。
いる。従って、試薬調剤器および読み出しステーションはデイスクの周囲に配置
され得、そして調剤器および読み出しヘッドを半径方向に移動するアームで固定
され得る。他の機械的特徴は、無限フォーカス機能によって容易にされた、ステ
ージ傾斜装置および温度制御された試料室を備える。
【００１３】 本発明のコンピュータ局面は、専用回路および対応するソフトウエアを有する
。これらは、データ読みとり、光再配置、特徴検出、計数および表示機能を有す
る領域でコンピュタ処理のためのものである。これらの評価は、制御および座標
データハンドリングを容易にする。さらに、回路および相当するソフトウエアは
、ラテックスビードのような粒状ラベルのサインカーブの認識を可能にする。こ
れは、システムが、個々のタグをカウントしおよび同定するようにする。代替の
フィルタはサンプル追跡のためのマイクロバーコードを読むように設計され得る
。
。これらは、データ読みとり、光再配置、特徴検出、計数および表示機能を有す
る領域でコンピュタ処理のためのものである。これらの評価は、制御および座標
データハンドリングを容易にする。さらに、回路および相当するソフトウエアは
、ラテックスビードのような粒状ラベルのサインカーブの認識を可能にする。こ
れは、システムが、個々のタグをカウントしおよび同定するようにする。代替の
フィルタはサンプル追跡のためのマイクロバーコードを読むように設計され得る
。
【００１４】 他のフィルタは、さらに計算的に規定し得、細胞計数の正確さを向上させる。
核の定義は、ＤＡＰＩのようなＤＮＡ染色を用いて達成し得るが、細胞の境界は
脂質溶解染料によって認識され得る。
核の定義は、ＤＡＰＩのようなＤＮＡ染色を用いて達成し得るが、細胞の境界は
脂質溶解染料によって認識され得る。
【００１５】 （発明の詳細な説明） 本発明は、例えば、この明細書に参考として援用する米国特許Ｎｏ．５，６８
４，６２８に記載の装置にある素子を含むシステムの改良を示す。そのような蛍
光顕微鏡は、イメージ収集の基礎を備える。従来の蛍光顕微鏡が図１に示されて
いる。試料は、蛍光タグでラベルされ、顕微鏡ステージ（１）上に配置されてい
る。これは、この従来の実施例では、デカルト座標系内で移動可能である。照射
光がアークランプ（２）から、適当なフィルタおよびシャッターを通して、およ
び光ファイバーシステムを通して対物レンズ（３）へ供給される。放射光がポリ
クロイックミラー（４）を通過してフィルタされ、視覚検査（５）のため目に偏
向され、または適当な回路（６）を使用した検査用ＣＣＤアレイへ偏向される。
４，６２８に記載の装置にある素子を含むシステムの改良を示す。そのような蛍
光顕微鏡は、イメージ収集の基礎を備える。従来の蛍光顕微鏡が図１に示されて
いる。試料は、蛍光タグでラベルされ、顕微鏡ステージ（１）上に配置されてい
る。これは、この従来の実施例では、デカルト座標系内で移動可能である。照射
光がアークランプ（２）から、適当なフィルタおよびシャッターを通して、およ
び光ファイバーシステムを通して対物レンズ（３）へ供給される。放射光がポリ
クロイックミラー（４）を通過してフィルタされ、視覚検査（５）のため目に偏
向され、または適当な回路（６）を使用した検査用ＣＣＤアレイへ偏向される。
【００１６】 本発明を含む改良を備えた、従来のシステムの変形形態が図２に示されている
。ＸＹＺ顕微鏡ステージは、回転可能なステージ（１１）（試料キャリア）によ
って置き換えられており、該試料キャリアは、円形デイスク（７）の試料ホルダ
ー（デイスク）を支持する。該試料デイスクは、個々のサンプル区画（８）（ウ
エル）に分割され、それは疎水性バリヤまたは接着セグメントによって分離され
たウエルであり得る。デイスク技術は、チップ処理の検査、操作および自動化の
ため、今や半導体チップ産業で入手可能である。図２に示されるシステムは、ま
た、多重位置ステージおよび／またはステージ傾斜装置に設けられたステージ上
にデイスクを配置できるように、変形することができる。該傾斜装置は、ある種
の光散乱ノイズを減少する種々の角度で、顕微鏡サンプルの調査を許容する。該
円形の試料デイスクは、さらにより定量的なチャネルが、さらに早く読み取り、
時間的現象の追跡、および多量のサンプルの処理を平行にすることを許容する。
システムは、自動化の可能性が増加する一つまたはそれ以上のデイスクカセット
を含むように設計される。該デイスクは、選択的に、カセットタワーから検査ス
テージへ移動し得、選択的に種々の角度で回転し得、所望により、検査ステージ
から取り外しでき、そして、選択的に、分離したカセットタワー内に配置できる
か、貯蔵のためまたはその後の検査のため、オリジナルのカセットタワーの同じ
位置へ逆戻りできる。これは手動であるいは自動で実施できる。例えば、米国特
許Ｎｏ．４，９３８，６５４；米国特許Ｎｏ．５，０９６，２９１；米国特許Ｎ
ｏ．５，１１９，４３４；米国特許Ｎｏ．５，１２９，００９および米国特許Ｎ
ｏ．５，４７１，０６６を参照されたい、これらはそれぞれ本明細書に参考とし
て援用する。器具は、ステージおよびデイスクによって記載された円周の回りの
試薬調剤器および多重読み出しステーションをさらに有し得る。その調剤器およ
び読み出しステーションは、半径方向に移動し得、そしてステージおよびデイス
クは多重サンプリング機会を与えるために回転し得る。
。ＸＹＺ顕微鏡ステージは、回転可能なステージ（１１）（試料キャリア）によ
って置き換えられており、該試料キャリアは、円形デイスク（７）の試料ホルダ
ー（デイスク）を支持する。該試料デイスクは、個々のサンプル区画（８）（ウ
エル）に分割され、それは疎水性バリヤまたは接着セグメントによって分離され
たウエルであり得る。デイスク技術は、チップ処理の検査、操作および自動化の
ため、今や半導体チップ産業で入手可能である。図２に示されるシステムは、ま
た、多重位置ステージおよび／またはステージ傾斜装置に設けられたステージ上
にデイスクを配置できるように、変形することができる。該傾斜装置は、ある種
の光散乱ノイズを減少する種々の角度で、顕微鏡サンプルの調査を許容する。該
円形の試料デイスクは、さらにより定量的なチャネルが、さらに早く読み取り、
時間的現象の追跡、および多量のサンプルの処理を平行にすることを許容する。
システムは、自動化の可能性が増加する一つまたはそれ以上のデイスクカセット
を含むように設計される。該デイスクは、選択的に、カセットタワーから検査ス
テージへ移動し得、選択的に種々の角度で回転し得、所望により、検査ステージ
から取り外しでき、そして、選択的に、分離したカセットタワー内に配置できる
か、貯蔵のためまたはその後の検査のため、オリジナルのカセットタワーの同じ
位置へ逆戻りできる。これは手動であるいは自動で実施できる。例えば、米国特
許Ｎｏ．４，９３８，６５４；米国特許Ｎｏ．５，０９６，２９１；米国特許Ｎ
ｏ．５，１１９，４３４；米国特許Ｎｏ．５，１２９，００９および米国特許Ｎ
ｏ．５，４７１，０６６を参照されたい、これらはそれぞれ本明細書に参考とし
て援用する。器具は、ステージおよびデイスクによって記載された円周の回りの
試薬調剤器および多重読み出しステーションをさらに有し得る。その調剤器およ
び読み出しステーションは、半径方向に移動し得、そしてステージおよびデイス
クは多重サンプリング機会を与えるために回転し得る。
【００１７】 全ての試料コンパートメントを、図２において概略的に示すように、温度制御
環境（９）に配置され得る。例えば、発光スペルクトル分離能を向上させるため
に、非常に低い温度（例えば、液体窒素または液体ヘリウムの温度）が用いられ
得る。多数の色相がラテックスビーズなどの粒子支持体において生成され得る、
標識システムの詳細な説明は、１９９８年９月３日に出願された同時係属中の米
国特許出願０９／１４６，９８４号に記載され、これは本明細書中に参考として
援用される。つまり、粒子支持体において原色の色素の比を変えることによって
、または個々の色素の強度を変えることによって、多数の色相が生成され得る。
非常に低い温度への冷却によって、個々のこれらの色相を生成する際に使用され
る１０を超す原色が可能となり、色相は、ビーズに付着する原色の比として規定
される。ここで、ラテックスビーズは、±５％よりも高いドーピング精度でもっ
て生成され、これによって、１０の原色それぞれについて、わずか１０のグレー
スケールのレベルを特定するにせよ、１００億の識別タグが提供される。
環境（９）に配置され得る。例えば、発光スペルクトル分離能を向上させるため
に、非常に低い温度（例えば、液体窒素または液体ヘリウムの温度）が用いられ
得る。多数の色相がラテックスビーズなどの粒子支持体において生成され得る、
標識システムの詳細な説明は、１９９８年９月３日に出願された同時係属中の米
国特許出願０９／１４６，９８４号に記載され、これは本明細書中に参考として
援用される。つまり、粒子支持体において原色の色素の比を変えることによって
、または個々の色素の強度を変えることによって、多数の色相が生成され得る。
非常に低い温度への冷却によって、個々のこれらの色相を生成する際に使用され
る１０を超す原色が可能となり、色相は、ビーズに付着する原色の比として規定
される。ここで、ラテックスビーズは、±５％よりも高いドーピング精度でもっ
て生成され、これによって、１０の原色それぞれについて、わずか１０のグレー
スケールのレベルを特定するにせよ、１００億の識別タグが提供される。
【００１８】 当然、従来の蛍光標識ならびに上記援用した同時係属出願に記載される複数の
色相の蛍光タグを使用することも本発明の範囲内である。
色相の蛍光タグを使用することも本発明の範囲内である。
【００１９】 サンプルを収容する閉鎖チャンバ（９）が使用される実施態様では、対物レン
ズ（１０）は、一般的に、このチャンバへと突出する。軸運動を除くことが課題
であるので、密封を維持することが望ましい。ディスク（７）を備えるステージ
は、対物レンズから独立して移動可能である。試料に任意の所望の蛍光標識が付
与されると、これはディスクのサンプルウェル（８）に配置され、そしてステー
ジ（１１）に位置決めされ、そして目的の領域が通常の目視検査を用いて決定さ
れる。励起光が次に、対物レンズ（１０）または光ファイバー（単数または複数
）を介してサンプルに導入される。上記のように温度が制御され得る。加温によ
って、サンプルを生理学的に所望される温度範囲で維持することが可能となる。
ディスクまたは個々のサンプルの冷却によって、色相の分離を向上させる、発光
帯域幅が鋭くなり得る。
ズ（１０）は、一般的に、このチャンバへと突出する。軸運動を除くことが課題
であるので、密封を維持することが望ましい。ディスク（７）を備えるステージ
は、対物レンズから独立して移動可能である。試料に任意の所望の蛍光標識が付
与されると、これはディスクのサンプルウェル（８）に配置され、そしてステー
ジ（１１）に位置決めされ、そして目的の領域が通常の目視検査を用いて決定さ
れる。励起光が次に、対物レンズ（１０）または光ファイバー（単数または複数
）を介してサンプルに導入される。上記のように温度が制御され得る。加温によ
って、サンプルを生理学的に所望される温度範囲で維持することが可能となる。
ディスクまたは個々のサンプルの冷却によって、色相の分離を向上させる、発光
帯域幅が鋭くなり得る。
【００２０】 本発明の１実施態様において、光源（１２）は、サンプルのあらゆる光損傷（
ｐｈｏｔｏｄａｍａｇｅ）を制御するためにパルス化され、そして励起ビームが
光ファイバー管（１３）によって対物レンズを介して伝導される。
ｐｈｏｔｏｄａｍａｇｅ）を制御するためにパルス化され、そして励起ビームが
光ファイバー管（１３）によって対物レンズを介して伝導される。
【００２１】 このシステムの自動画像収集の特徴が使用されて、一連の画像を得る。デコン
ボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）の後、画像が合わされ、試料の
三次元ビューを形成する。
ボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）の後、画像が合わされ、試料の
三次元ビューを形成する。
【００２２】 三次元ビューを形成するために使用される一連の画像は、試料を介して、対物
レンズ（１０）の焦点面を移動させることによって収集される。通常ｚ走査と呼
ばれるこの移動は、サンプルまたは対物レンズのいずれかを移動させることによ
って達成され得る。あるいは、第２のレンズ（１４）が、無限フォーカスシステ
ム（ｉｎｆｉｎｉｔｙ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）において、使用され
得る。セクション間の典型的な距離は、０．１ｕｍ〜５ｕｍの間の範囲であり、
全体範囲が５ｍｍである。無限フォーカスを包含する実施態様において、対物レ
ンズは、第２のスライディングエレメントレンズ（１４）に連結される。この第
２のレンズは、光路の後方に配置される。この組み合わせは、また、低倍率と高
倍率との間での制御シフトを容易にする。極度に精密なマイクロステップモータ
ーが使用され、必要最小限の移動を達成する。
レンズ（１０）の焦点面を移動させることによって収集される。通常ｚ走査と呼
ばれるこの移動は、サンプルまたは対物レンズのいずれかを移動させることによ
って達成され得る。あるいは、第２のレンズ（１４）が、無限フォーカスシステ
ム（ｉｎｆｉｎｉｔｙ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）において、使用され
得る。セクション間の典型的な距離は、０．１ｕｍ〜５ｕｍの間の範囲であり、
全体範囲が５ｍｍである。無限フォーカスを包含する実施態様において、対物レ
ンズは、第２のスライディングエレメントレンズ（１４）に連結される。この第
２のレンズは、光路の後方に配置される。この組み合わせは、また、低倍率と高
倍率との間での制御シフトを容易にする。極度に精密なマイクロステップモータ
ーが使用され、必要最小限の移動を達成する。
【００２３】 １実施態様において、光源は水銀光源であり、これはＵＶ〜近ＩＲの照明を提
供する。この光源は、顕微鏡サンプルへの光損傷を最小にするために、データ収
集速度と一致した速度でパルス化され得る。光学的な光ファイバー光スクランブ
ラーは、照射光を均一にし、アークランプワンダーを平滑化し、そして均一に対
物レンズの背面開口部を満たす。蛍光プローブの使用に適切な励起波長および発
光波長が、多空洞干渉フィルターによって選択される。これらのフィルターは、
所望の波長を透過し、同時に、スペクトルの他の領域から９９％を超す光をブロ
ッキングする。励起（１５）（励起フィルターホイール；ニュートラル密度（ｎ
ｅｕｔｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）フィルターホイール）と発光フィルター（１６
）との間に、可動カスタム多色ミラー（１７）が存在し、これは波長選択に重要
な成分である。このミラーは、慎重に選択された反射帯および透過帯から構成さ
れ、広範な一般的に使用される蛍光プローブを光学的な性能に提供するように設
計される。全てのプローブをイメージングするために単一のミラーを使用するこ
とは、アーティファクトがクリティカルパスにおいて移動する成分からは導入さ
れないことを意味する。これは、光学成分の運動から生じるアーティファクトが
頻繁に、真の情報と識別不可能となり、試料特性の誤認を招き得るので、重要で
ある。
供する。この光源は、顕微鏡サンプルへの光損傷を最小にするために、データ収
集速度と一致した速度でパルス化され得る。光学的な光ファイバー光スクランブ
ラーは、照射光を均一にし、アークランプワンダーを平滑化し、そして均一に対
物レンズの背面開口部を満たす。蛍光プローブの使用に適切な励起波長および発
光波長が、多空洞干渉フィルターによって選択される。これらのフィルターは、
所望の波長を透過し、同時に、スペクトルの他の領域から９９％を超す光をブロ
ッキングする。励起（１５）（励起フィルターホイール；ニュートラル密度（ｎ
ｅｕｔｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）フィルターホイール）と発光フィルター（１６
）との間に、可動カスタム多色ミラー（１７）が存在し、これは波長選択に重要
な成分である。このミラーは、慎重に選択された反射帯および透過帯から構成さ
れ、広範な一般的に使用される蛍光プローブを光学的な性能に提供するように設
計される。全てのプローブをイメージングするために単一のミラーを使用するこ
とは、アーティファクトがクリティカルパスにおいて移動する成分からは導入さ
れないことを意味する。これは、光学成分の運動から生じるアーティファクトが
頻繁に、真の情報と識別不可能となり、試料特性の誤認を招き得るので、重要で
ある。
【００２４】 発光フィルター（１５）の正確な位置決めは、ウェジング、ダスト、およびフ
ィルターの変動からのアーティファクトを最小化する。このようなアーティファ
クトが時折、デジタル処理技術によって最小化され得るが、汚れたオプティクス
によって不明瞭となったデテールは、最終的な画像に簡単には現れない。優れた
画像は、デコンボリューションの後に優れた結果を与える。正確なフィルターの
位置決めによって、種々の蛍光プローブが試料を移動させる前にイメージングさ
れ得る。このアプローチは、同時ローカライゼーション（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚ
ａｔｉｏｎ）研究に重要である、例示的な精密画像アライメントを提供する。各
プローブがイメージングされるために完全なｚ走査を行うシステムは、画像レジ
ストレーション問題を被り得る。
ィルターの変動からのアーティファクトを最小化する。このようなアーティファ
クトが時折、デジタル処理技術によって最小化され得るが、汚れたオプティクス
によって不明瞭となったデテールは、最終的な画像に簡単には現れない。優れた
画像は、デコンボリューションの後に優れた結果を与える。正確なフィルターの
位置決めによって、種々の蛍光プローブが試料を移動させる前にイメージングさ
れ得る。このアプローチは、同時ローカライゼーション（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚ
ａｔｉｏｎ）研究に重要である、例示的な精密画像アライメントを提供する。各
プローブがイメージングされるために完全なｚ走査を行うシステムは、画像レジ
ストレーション問題を被り得る。
【００２５】 少なくとも１つのＣＣＤ検出器は、典型的に、冷却され、科学等級であり、蛍
光画像を収集する。このタイプの検出器は非常に感度の高い光検出、低ノイズ、
および光の強度に対して限りなく直線的な応答を提供する。フィルターと連結し
たビームスプリッター（１８）は、ＣＣＤ検出器に対して、光路の前方に配置さ
れ得る。これによって、同一原色光が複数のＣＣＤ検出器（１９）へとイメージ
ングされ得る。複数の検出器によって迅速なデータ収集および信頼性の高いミッ
クス−アンド−マッチ（ｍｉｘ−ａｎｄ−ｍａｔｃｈ）カラー検出が可能となる
。複数のＣＣＤ検出器（１９）の使用が図２に示される。これによって、多色相
粒子間のさらに良好な識別が可能となり、そして多色相粒子検出スキームの使用
が容易となる。
光画像を収集する。このタイプの検出器は非常に感度の高い光検出、低ノイズ、
および光の強度に対して限りなく直線的な応答を提供する。フィルターと連結し
たビームスプリッター（１８）は、ＣＣＤ検出器に対して、光路の前方に配置さ
れ得る。これによって、同一原色光が複数のＣＣＤ検出器（１９）へとイメージ
ングされ得る。複数の検出器によって迅速なデータ収集および信頼性の高いミッ
クス−アンド−マッチ（ｍｉｘ−ａｎｄ−ｍａｔｃｈ）カラー検出が可能となる
。複数のＣＣＤ検出器（１９）の使用が図２に示される。これによって、多色相
粒子間のさらに良好な識別が可能となり、そして多色相粒子検出スキームの使用
が容易となる。
【００２６】 小型光子検出器エレメントによって、画像が過剰にサンプリングされ得、この
システムが有し得る分離能を向上させる。検出器によって得られた画像は、適切
な回路によって収集され、そしてそのデータは適切なソフトウェアによって管理
され、デジタルフォーマットで表示され、そして／または格納される。
システムが有し得る分離能を向上させる。検出器によって得られた画像は、適切
な回路によって収集され、そしてそのデータは適切なソフトウェアによって管理
され、デジタルフォーマットで表示され、そして／または格納される。
【００２７】 画像が収集された後、これらの画像は、種々の強力なツールを使用して視聴さ
れ、測定され得る。これらのツールは、選択された領域を回転、測定、強調し、
そして画像のコントラストを調節する能力を有する。デコンボリューション回路
は、計算的に、画像に存在するぼやけ（ｂｌｕｒ）を再分配する。アークフリッ
カーによる変動を補正した後、自動化されたデコンボリューションプロセスがト
リガーされ、専用回路が演算処理を加速させる。等価の回路が、より柔軟な回路
をプログラミングすることによって、または一時的な回路を作成するためのソフ
トウェアを使用して製作され得る。
れ、測定され得る。これらのツールは、選択された領域を回転、測定、強調し、
そして画像のコントラストを調節する能力を有する。デコンボリューション回路
は、計算的に、画像に存在するぼやけ（ｂｌｕｒ）を再分配する。アークフリッ
カーによる変動を補正した後、自動化されたデコンボリューションプロセスがト
リガーされ、専用回路が演算処理を加速させる。等価の回路が、より柔軟な回路
をプログラミングすることによって、または一時的な回路を作成するためのソフ
トウェアを使用して製作され得る。
【００２８】 本発明のデータ捕捉の局面において、各ＣＣＤチップは、データ転送および再
初期化のためのアクセサリサー回路を有する。これらは、照射システムおよび試
料識別名、ならびに制御機能および校正機能（例えば、不良画素またはレンズ上
の汚れを検査し、補正する機能）と協調することが必要である。付随の回路は、
また、光子の再配置（すなわち、フーリエ空間デコンボリューション）を実施す
る。実際の光子数は、点分散機能（ｐｏｉｎｔ−ｓｐｒｅａｄ ｆｕｎｃｔｉｏ
ｎ）および実際のサンプルのコンボリューションの結果である。異なる波長の焦
点における差の補正（色収差）は、この工程の後に最も都合よく補正され得る。
従って、計算システムは、光子の流れを画像画素へと屈折させ、そして画素単位
でゲインを調節する。
初期化のためのアクセサリサー回路を有する。これらは、照射システムおよび試
料識別名、ならびに制御機能および校正機能（例えば、不良画素またはレンズ上
の汚れを検査し、補正する機能）と協調することが必要である。付随の回路は、
また、光子の再配置（すなわち、フーリエ空間デコンボリューション）を実施す
る。実際の光子数は、点分散機能（ｐｏｉｎｔ−ｓｐｒｅａｄ ｆｕｎｃｔｉｏ
ｎ）および実際のサンプルのコンボリューションの結果である。異なる波長の焦
点における差の補正（色収差）は、この工程の後に最も都合よく補正され得る。
従って、計算システムは、光子の流れを画像画素へと屈折させ、そして画素単位
でゲインを調節する。
【００２９】 フーリエ空間におけるデコンボリューションの使用によって、球状ラテックス
ビーズなどの特定の特徴を識別することが可能となり、そして「バーコード」が
、この工程での読み出しのために、試料中に埋め込まれ得る。サンプルキャリア
に存在し得るか、またはサンプルに添加され得るプラスチックのロッドもしくは
チップ上に、１次元または２次元のパターンを作成するために、フォトリソグラ
フィーが使用され得る。従って、検証中のサンプルの同定が、大いに援助される
。同様に、デコンボリューションされた実空間画像において、特定の標的が同定
され得る。例えば、細胞核は、特徴的な寸法を有し、典型的には、細胞膜によっ
て互いに分離されている。
ビーズなどの特定の特徴を識別することが可能となり、そして「バーコード」が
、この工程での読み出しのために、試料中に埋め込まれ得る。サンプルキャリア
に存在し得るか、またはサンプルに添加され得るプラスチックのロッドもしくは
チップ上に、１次元または２次元のパターンを作成するために、フォトリソグラ
フィーが使用され得る。従って、検証中のサンプルの同定が、大いに援助される
。同様に、デコンボリューションされた実空間画像において、特定の標的が同定
され得る。例えば、細胞核は、特徴的な寸法を有し、典型的には、細胞膜によっ
て互いに分離されている。
【００３０】 ＨＴＭによって生成される過剰な情報は、回路によって管理され得る。例えば
、組織の分類において、デコンボリューションされた画像は、カーツーンへと圧
潰され、ここで、親油性色素で染色された外膜を有する標的として認識される白
血球の表面に、多色相ビーズ（各々は別個の種類の抗体を有する）が存在する場
合、これらが計数されるのみであり、この膜は、例えば、ＤＡＰＩで染色された
核を囲んでいる。これらは、白血球の表面に存在しないビーズ、ならびに核を有
さない赤血球と結合したビーズと区別され得る。この用途において、単細胞の表
面におけるビーズの色相は、一致すべきである。
、組織の分類において、デコンボリューションされた画像は、カーツーンへと圧
潰され、ここで、親油性色素で染色された外膜を有する標的として認識される白
血球の表面に、多色相ビーズ（各々は別個の種類の抗体を有する）が存在する場
合、これらが計数されるのみであり、この膜は、例えば、ＤＡＰＩで染色された
核を囲んでいる。これらは、白血球の表面に存在しないビーズ、ならびに核を有
さない赤血球と結合したビーズと区別され得る。この用途において、単細胞の表
面におけるビーズの色相は、一致すべきである。
【００３１】 従って、本発明によって提供される複数の改良点によって、多数のサンプル（
各々は多数の検出剤でプローブされている）を分析するための真の高いスループ
ットシステムが可能となる。多くの用途は、組織の種類、抗原−抗体相互作用の
同定、成分の細胞内運動のリアルタイムでの観察などを包含する。本発明の技術
の詳細な用途は、１９９８年８月３１日に出願された同時係属中の米国特許出願
０９／１４４，６０９にさらに記載されて、これは、本明細書中に参考として援
用される。
各々は多数の検出剤でプローブされている）を分析するための真の高いスループ
ットシステムが可能となる。多くの用途は、組織の種類、抗原−抗体相互作用の
同定、成分の細胞内運動のリアルタイムでの観察などを包含する。本発明の技術
の詳細な用途は、１９９８年８月３１日に出願された同時係属中の米国特許出願
０９／１４４，６０９にさらに記載されて、これは、本明細書中に参考として援
用される。
【図１】 図１は、先行技術の高解像蛍光顕微鏡を示し、これは光源（１）、対物レンズ
（３）、アイピース（５）および他の列挙する要素を有する。
（３）、アイピース（５）および他の列挙する要素を有する。
【図２】 図２は、本発明の高いスループット顕微鏡（ＨＴＭ）システムの実施例を示す
。
。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０２Ｂ 21/16 Ｇ０２Ｂ 21/16 21/34 21/34 21/36 21/36 (72)発明者 セダット， ジョン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94127， サン フランシスコ， ヤーバ ブエナ 294 Ｆターム(参考） 2G043 AA03 AA04 BA16 DA06 DA08 EA01 FA01 FA02 GA04 GA07 GB07 GB19 HA01 HA05 HA09 HA11 JA02 KA01 KA02 KA03 KA08 LA03 MA06 NA05 2G058 AA09 CB04 GA02 GC02 GE01 2G059 AA05 BB12 CC16 DD12 DD13 DD16 FF02 FF03 GG08 HH01 HH02 HH03 JJ02 JJ07 JJ11 JJ17 JJ22 JJ23 KK04 MM09 NN07 2H052 AA09 AC04 AC12 AC13 AC26 AC30 AD16 AD21 AD22 AD23 AE00 AE13 AF25
Claims (19)
- 【請求項１】 高分解能３次元蛍光顕微鏡における使用のためのシステムに
おける改良であって、該システムが、以下： 対物レンズ； 該レンズを介して見られる１以上のサンプルを含むための手段を受容および配
置するための顕微鏡ステージ； ＵＶ波長〜近ＩＲ波長の光を提供する光源； 該光源から該レンズを通って該サンプルへの励起光路であって、該励起光路が
、該光源から該レンズへ光を方向付けるための手段、および励起のために所望さ
れる波長を選択するための手段を含む、励起光路； 該サンプルから該対物レンズを通って少なくとも１つのＣＣＤへの放射光路で
あって、該放射光路が、光路セレクターおよび放射フィルター手段を含む、放射
光路；ならびに 該ＣＣＤに接続されたコンピュータ画像化手段、 を含み、 ここで、該改良が、該顕微鏡ステージを回転させ、観察のために該１以上のサ
ンプルを含む手段として回転可能円形ディスクを利用する手段を提供することを
包含する、改良。 - 【請求項２】 前記回転可能円形ディスクがガラスである、請求項１に記載
の改良。 - 【請求項３】 前記回転可能円形ディスクが複数のサンプル受容エリアに分
割される、請求項２に記載の改良。 - 【請求項４】 前記エリアが疎水性バリアによって規定される、請求項３に
記載の改良。 - 【請求項５】 前記サンプル受容エリアが接着された接着剤によって規定さ
れる、請求項３に記載の改良。 - 【請求項６】 請求項１に記載の改良であって、該改良が、少なくとも１つ
の試薬調剤手段および／または前記回転可能円形ディスクの外周に近位の少なく
とも１つの読出しステーションを提供することをさらに包含する、改良。 - 【請求項７】 前記分散手段および／または読出しステーションを放射状に
移動させる手段をさらに備える、請求項６に記載の改良。 - 【請求項８】 ステージ傾斜デバイスをさらに含む、請求項１に記載の改良
。 - 【請求項９】 高分解能３次元蛍光顕微鏡用途における使用のためのシステ
ムにおける改良であって、該システムが、以下： 対物レンズ； 該レンズを介して見られる１以上のサンプルを含むための手段を受容および配
置するための顕微鏡ステージ； ＵＶ波長〜近ＩＲ波長の光を提供する光源； 該光源から該レンズを通って該サンプルへの励起光路であって、該励起光路が
、該光源から該レンズへ光を方向付けるための手段、および励起のために所望さ
れる波長を選択するための手段を含む、励起光路； 該サンプルから該対物レンズを通って少なくとも１つのＣＣＤへの放射光路で
あって、該放射光路が、光路セレクターおよび放射フィルター手段を含む、放射
光路；ならびに 該ＣＣＤに接続されたコンピュータ画像化手段、 を含み、 ここで、該改良が、該対物レンズに加えて第２のレンズを提供し、その結果、
無限結像システムが得られることを包含する、改良。 - 【請求項１０】 前記顕微鏡ステージを包囲する温度制御されるチャンバを
さらに含む、請求項９に記載の改良。 - 【請求項１１】 請求項１０に記載の改良であって、前記顕微鏡ステージを
回転させ、観察のために前記１以上のサンプルを含む手段として回転可能円形デ
ィスクを利用する手段を提供することをさらに包含する、改良。 - 【請求項１２】 高分解能３次元蛍光顕微鏡用途における使用のためのシス
テムにおける改良であって、該システムが、以下： 対物レンズ； 該レンズを介して見られる１以上のサンプルを含むための手段を受容および配
置するための顕微鏡ステージ； ＵＶ波長〜近ＩＲ波長の光を提供する光源； 該光源から該レンズを通って該サンプルへの励起光路であって、該励起光路が
、該光源から該レンズへ光を方向付けるための手段、および励起のために所望さ
れる波長を選択するための手段を含む、励起光路； 該サンプルから該対物レンズを通って少なくとも１つのＣＣＤへの放射光路で
あって、該放射光路が、光路セレクターおよび放射フィルター手段を含む、放射
光路；ならびに 該ＣＣＤに接続されたコンピュータ画像化手段、 を含み、 ここで、該改良が、データ収集の速度と一致する速度で光を放射するパルシン
グ光源を提供することを包含する、改良。 - 【請求項１３】 請求項１２に記載の改良であって、該改良が、該顕微鏡ス
テージを回転させ、観察のために前記１以上のサンプルを含む手段として回転可
能円形ディスクを利用する手段を提供することをさらに包含する、改良。 - 【請求項１４】 高分解能３次元蛍光顕微鏡用途における使用のためのシス
テムにおける改良であって、該システムが、以下： 対物レンズ； 該レンズを介して見られる１以上のサンプルを含むための手段を受容および配
置するための顕微鏡ステージ； ＵＶ波長〜近ＩＲ波長の光を提供する光源； 該光源から該レンズを通って該サンプルへの励起光路であって、該励起光路が
、該光源から該レンズへ光を方向付けるための手段、および励起のために所望さ
れる波長を選択するための手段を含む、励起光路； 該サンプルから該対物レンズを通って少なくとも１つのＣＣＤへの放射光路で
あって、該放射光路が、光路セレクターおよび放射フィルター手段を含む、放射
光路；ならびに 該ＣＣＤに接続されたコンピュータ画像化手段、 を含み、 ここで、該改良が、同じ原色光を複数のＣＣＤ検出器上に結像させる該放射光
路に、複数のＣＣＤ検出器およびビームスプリッターおよびフィルターを提供す
ることを包含する、改良。 - 【請求項１５】 請求項１４に記載の改良であって、該改良が、前記対物レ
ンズに加えて第２のレンズを提供し、その結果、無限結像システムが得られるこ
とをさらに包含する、改良。 - 【請求項１６】 請求項１４に記載の改良であって、前記顕微鏡ステージを
回転させ、観察のために前記１以上のサンプルを含む手段として回転可能円形デ
ィスクを利用する手段を提供することをさらに包含する、改良。 - 【請求項１７】 高分解能３次元蛍光顕微鏡用途における使用のためのシス
テムにおける改良であって、該システムが、以下： 対物レンズ； 該レンズを介して見られる１以上のサンプルを含むための手段を受容および配
置するための顕微鏡ステージ； ＵＶ波長〜近ＩＲ波長の光を提供する光源； 該光源から該レンズを通って該サンプルへの励起光路であって、該励起光路が
、該光源から該レンズへ光を方向付けるための手段、および励起のために所望さ
れる波長を選択するための手段を含む、励起光路； 該サンプルから該対物レンズを通って少なくとも１つのＣＣＤへの放射光路で
あって、該放射光路が、光路セレクターおよび放射フィルター手段を含む、放射
光路；ならびに 該ＣＣＤに接続されたコンピュータ画像化手段、 を含み、 ここで、該改良が、曲線サインに基づいて特定の球体を検出するパターンおよ
びサインを認識するための手段を提供することを包含する、改良。 - 【請求項１８】 請求項１７に記載の改良であって、該改良が、前記対物レ
ンズに加えて第２のレンズを提供し、その結果、無限結像システムが得られるこ
とをさらに包含する、改良。 - 【請求項１９】 請求項１７に記載の改良であって、該改良が、前記顕微鏡
ステージを回転させ、観察のために前記１以上のサンプルを含む手段として回転
可能円形ディスクを利用する手段を提供することをさらに包含する、改良。
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