JPWO2009048142A1

JPWO2009048142A1 - 観察装置

Info

Publication number: JPWO2009048142A1
Application number: JP2009537042A
Authority: JP
Inventors: 泰次郎清田
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2007-10-11
Filing date: 2008-10-10
Publication date: 2011-02-24
Also published as: WO2009048142A1; US20100208340A1

Abstract

本発明は、反射型観測手法において、試料の背景となる領域の輝度を制限し、試料のコントラストを明確に観察できるようにする観察装置に関する。照明光の射出側瞳面に配置される照射光量制限絞り１１は、その形状が円盤の中心に開口部が設けられたドーナツ型に形成されており、照明光の光束のうち、その外周部分を遮断し、その中心部分のみを通過させるようになされている。入射側瞳面に配置される入射光量制限絞り１４は、照射光量制限絞り１１とは反対に、光束の中心部分を遮蔽するよう、光束断面よりも小型の円形に形成されたものであり、反射光の光束のうち、その外周部分のみを通過させるようになされている。本発明は、倒立型顕微鏡に適用できる。

Description

本発明は、観察装置に関し、特に、試料に対して照射した照明光の反射光を観察する場合に用いて好適な観察装置に関する。

従来、細胞など微細な生体試料を観察する場合、位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡などによる透過型観察手法が適用されていた。この透過型観察手法は、試料に対して照明光を照射し、その透過光を観察するものである。

生体試料は９６ウェルプレートなどの比較的小さい培養漕（各ウェル）に静置される場合がある。しかしながら、この小さい培養漕では、培地（水等）が表面張力によって培養漕の壁面に対して盛り上がってしまうことによりレンズ作用を生じ、光学的誤差を発生させるメニスカス効果が生じてしまう。

したがって、生体試料を比較的小さい培養漕に静置した状態で透過型観察手法により観察すると、メニスカス効果によって、光学性能が影響を受けてしまい、正しい結像状態を得ることができなかった。

このような問題を解決するには、メニスカス効果を打ち消すためのレンズ系を設ける方法（例えば、特許文献１参照）の他、倒立型顕微鏡を用い、試料に対して照明光を照射し、その蛍光を観察する蛍光観察手法を採用することが考えられる。
特開平８-５９２９号公報

蛍光観察手法を採用する場合、蛍光色素を用いて試料を標識することにより、試料のコントラストが強調された観察結果を得ることができる。

しかしながら、生体試料に対しては、蛍光色素による生体への影響が否定し難いので、蛍光色素を用いないことが望ましい。

ところで、照射光の反射は、光の屈折率が異なる物質同士の界面で発生し、その反射角は、当該界面の角度に依存する。また、正反射における反射効率は、当該界面での屈折率差に依存する。

なお、生体試料の観察に関わる各物質の屈折率は以下の通りである。
培養漕（ポリスチレン）１．５９乃至１．６０
培地（水、２０℃）１．３３
生体試料（細胞質）１．３５乃至１．３８
生体試料（核）１．３９
生体試料（ミトコンドリア）１．４０乃至１．４２
生体試料（細胞膜）１．４６
生体試料（脂質）１．４８
生体試料（たんぱく質）１．５０乃至１．５８
生体試料（メラニン）１．７

したがって、反射型観察手法によって観察される培養漕の底面において、屈折率差が最も大きい界面、すなわち、反射効率の最も高い界面は、培養漕（１．５９）と培地（１．３３）との界面であることがわかる。

このように、培養漕と培地との界面で反射効率が最も高いので、培養漕の底面を観測すると、当該底面のうち、観察される画像において生体試料の背景となる領域（培養漕と培地との界面）が明るくなり過ぎてしまい、この結果、生体試料と培地との界面のコントラストが目立たなくなり、生体試料を明確に観察し難くなってしまうという課題があった。

本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、反射型観測手法において、試料の背景となる領域での反射光が観察されないようにすることにより、試料のコントラストが明確に観察できるようにするものである。

本発明の観察装置は、容器に静置された試料に対し、前記容器の底面側から照明光を照射し、前記照明光の反射光を観察する観察装置において、前記照明光を、その光束断面の外周側を遮断し、中心側を通過させる照明光量制限手段と、前記照明光量制限手段によって制限された前記照明光を、前記容器に静置された試料に対し、前記容器の底面側から照射させる照射制御手段と、前記容器の底面側から照射された前記照明光の反射光を、その光束断面の中心側を遮断し、外周側を通過させる入射光量制限手段とを備えることを特徴とする。

前記照明光量制限手段は、前記照明光の射出側瞳面に設けられ、前記入射光量制限手段は、前記反射光の入射側瞳面に設けられるようにすることができる。

前記照明光量制限手段は、前記照明光の中心側を通過させるための開口部を有し、前記入射光量制限手段は、前記反射光の中心側を遮断するための遮断部を有し、前記開口部または前記遮断部の少なくとも一方は、その大きさが可変であるようにすることができる。

本発明の観察装置は、前記入射光量制限手段によって制限された前記反射光に基づいて画像データを生成する撮像手段をさらに備えることができる。

本発明によれば、反射型観測手法において、試料の背景となる領域の輝度を制限することができる。よって、試料のコントラストを明確に観察することができる。

本発明を適用した倒立型顕微鏡における対物光学系周辺の構成例を示す図である。観察される生体試料と培養漕の断面図である。界面の傾きと反射光の進路との関係を示す図である。本発明を適用した倒立型顕微鏡によって観察される画像のイメージ図である。

符号の説明

１１照射光量制限絞り
１２ハーフミラー
１３対物光学系
１４入射光量制限絞り
２１生体試料
２２培養漕
２３培地

以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。

図１は、本発明の一実施の形態である倒立型顕微鏡の対物光学系付近の構成例を示している。

なお、不図示の光源は、発光波長λ＝４６０乃至４９０ｎｍのLEDである。

当該倒立型顕微鏡において、照明光の射出側瞳面に配置される照射光量制限絞り１１は、その形状が円盤の中心に開口部が設けられたドーナツ型に形成されており、照明光の光束のうち、その外周部分を遮断し、その中心部分のみを通過させるようになされている。
よって、照射光量制限絞り１１により、照明光の光量を制限することができる。

照射光量制限絞り１１を通過した照明光は、ハーフミラー１２によって反射され、対物光学系１３に入射される。対物光学系１３は、ハーフミラー１２からの照明光を試料面（反射面）に集光させる。また、対物光学系１３は、観察対象面（反射面）で反射された照明光（以下、反射光と称する）を平行に整形する。対物光学系１３からの反射光は、ハーフミラー１２を透過する。

入射側瞳面に配置される入射光量制限絞り１４は、照射光量制限絞り１１とは反対に、光束の中心部分を遮蔽するよう、光束断面よりも小型の円形に形成されたものであり、反射光の光束のうち、その外周部分のみを通過させるようになされている。

そして、入射光量制限絞り１４を通過した反射光は、CCDなどの撮像素子上に入射されて結像され、撮像素子によって生成される画像データが観測結果として得られることになる。

なお、照射光量制限絞り１１における開口部の大きさと、入射光量制限絞り１４の大きさとを可変とし、ユーザからの操作に対応して、両者の大きさを連動させて調整できるようにしてもよい。

また、照射光量制限絞り１１における開口部の大きさにより、照射光による照射面積が決まるので、生体試料を静置する培養漕の大きさに応じ、照射光量制限絞り１１における開口部の大きさを変更するようにしてもよい。

次に、当該倒立型顕微鏡の観測対象とされる生体試料について、図２を参照して説明する。ただし、勿論、当該倒立型顕微鏡により生体以外の試料を観察することもできる。

生体試料２１は、培地（水等）２３が入れられている培養漕２２に静置され、当該倒立型顕微鏡の観察対象面に配置される。

ここで、生体試料２１と培地２３との界面のうち、図示する箇所を界面ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆとする。また、培養漕２２と培地２３との界面のうち、図示する箇所を、界面ｇ，ｈとする。さらに、生体試料２１と培養漕２２との界面のうち、図示する箇所を界面ｉとする。

同図において、培養漕２２の底面を、水平方向の傾きの基準（０）とすれば、界面ｇ，ｈ，ｉの傾きも０であり、界面ｅ，ｄの傾きもほぼ０であることがわかる。その他の界面ａ，ｂ，ｃ，ｆの傾きは０よりも大きな角度を有することがわかる。これらの傾きが、各界面における照射光の反射角を決定することになる。

次に、各界面の傾きと反射光の進路との関係について、図３を参照して説明する。

図３において、照射光量制限絞り１１を通過した照明光の光線Ｌ₀に注目する。この光線Ｌ₀は、ハーフミラー１２により対物光学系１３側に反射される。対物光学系１３では、光線Ｌ₀が照明光の光軸に対して入射角θで反射面（図２に示した各界面ａ乃至ｈ）に集光される。

ここで、図２の界面ｇ，ｈ，ｉのように、反射面の傾きが０である場合、光線Ｌ₀の反射光は、照明光の光軸からの傾きがθの光線Ｌ₁となる。また、反射面の傾きがφ₁である場合、光線Ｌ₀の反射光は、照明光の光軸からの傾きが（θ＋φ₁）の光線Ｌ₂となる。さらに、反射面の傾きがφ₂である場合、光線Ｌ₀の反射光は、照明光の光軸からの傾きが（θ＋φ₂）の光線Ｌ₃となる。

図３から明らかなように、反射面の傾きが０に近いほど、光線Ｌ₀の反射光は、照明光の光軸からの傾きが小さい光線となる。換言すれば、図２の界面ｄ，ｅ，ｇ，ｈ，ｉのように、傾きが０に近い反射面で反射された光線Ｌ₀は、反射光の光束の中心側に集まる。

したがって、本願発明を適用した倒立型顕微鏡のように、入射側瞳面に入射光量制限絞り１４を設けることにより、図２の界面ｄ，ｅ，ｇ，ｈ，ｉのように、傾きが０に近い反射面で反射された光線を遮断することができる。

よって、観察される画像は、図４に示すように、界面ｇ，ｈ，ｉ（生体試料２１の背景となる領域）が明るくなってしまうことを抑止できる。この結果、生体試料２１と培地２３との界面のうち、その傾きが０に近くない界面（例えば、図２の界面ａ，ｂ，ｃ，ｆ）のコントラストが明確となる。

ここで、図４の観察画像は、ＮＡ０．１３、倍率４×の対物レンズ、照明光量制限絞り１１の開口直径は１０ｍｍ、入射光量制限絞り１４の直径は１０ｍｍのものを用いて取得した場合のモデル図である。

なお、上述したように、照射光量制限絞り１１における開口部の大きさと、入射光量制限絞り１４の大きさとを可変とすれば、ユーザは、観察される画像を見ながら、生体試料２１のコントラストが明確となって観察し易くなるように、両者の大きさを連動させて調整することができる。

なお、本発明は、上述した実施の形態の他、蛍光観察時に使用する蛍光ブロックカセットホルダなどに適用することができる。

なお、本発明は、倒立型顕微鏡のみならず、試料に対して底面側から照明光を照射し、その反射光を観察する場合に適用することができる。

本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。

Claims

容器に静置された試料に対し、前記容器の底面側から照明光を照射し、前記照明光の反射光を観察する観察装置において、
前記照明光を、その光束断面の外周側を遮断し、中心側を通過させる照明光量制限手段と、
前記照明光量制限手段によって制限された前記照明光を、前記容器に静置された試料に対し、前記容器の底面側から照射させる照射制御手段と、
前記容器の底面側から照射された前記照明光の反射光を、その光束断面の中心側を遮断し、外周側を通過させる入射光量制限手段と
を備えることを特徴とする観察装置。
前記照明光量制限手段は、前記照明光の射出側瞳面に設けられ、
前記入射光量制限手段は、前記反射光の入射側瞳面に設けられる
ことを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
前記照明光量制限手段は、前記照明光の中心側を通過させるための開口部を有し、
前記入射光量制限手段は、前記反射光の中心側を遮断するための遮断部を有し、
前記開口部または前記遮断部の少なくとも一方は、その大きさが可変である
ことを特徴とする請求項１または２に記載の観察装置。
前記入射光量制限手段によって制限された前記反射光に基づいて画像データを生成する撮像手段を
さらに備えることを特徴とする請求項１乃至４に記載の観察装置。