CN108319008B - 一种光学显微成像方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种光学显微成像方法及装置，属于光学显微成像领域。方法具体为：显示屏顺序显示条带图像序列；顺序显示的条带图像经物镜在样品面上形成移动的照明条带；移动的照明条带所照明或激发的样本区域经物镜成像到探测器；将成像所得的图像序列叠加，得到样品的完整图像。装置包括小型显示屏、透镜、滤光片、分光片、物镜和面阵列探测器。本发明通过在成像过程中，同时限制照明和探测区域的宽度，并将照明和探测过程进行同步，构成线扫描共聚焦成像方式，提高小显微镜成像对焦外信号的抑制能力；通过使用小型显示屏，无需使用机械扫描元件，便于显微镜系统的小型化集成化，适用于对生物过程进行活体原位的显微成像。

Description

一种光学显微成像方法及装置

技术领域

本发明涉及显微光学成像领域，具体涉及一种光学显微成像方法及装置，尤其适用于对生物过程进行活体原位的显微成像。

背景技术

传统上，对生物过程进行活体原位的显微成像观察，需要对实验动物进行麻醉和固定。但是，对于神经科学这样的研究领域，实验动物的麻醉显然会限制所能开展的研究，并可能对实验结果产生影响，而不能反映神经活动的真实过程。为了能够开展结合了认知和行为学实验的同步的显微成像，研究人员提出了多种针对清醒甚至自由活动实验动物的显微成像技术。

传统显微镜其光路和探测结构的整体尺寸通常远大于观察对象，为了对实验动物进行成像，需要对动物的待观察部位进行固定，无法实现动物自由活动状态下进行成像。

基于光纤束的显微成像技术通过将主要的显微成像光路置于远端，通过光纤束将激发或照明光导入到实验动物的待观察部位，并通过光纤束将信号光收集并传回远端的显微成像光路和探测器件。这种方法，可以用于自由活动动物的观察，但是，其成像视野，传输效率等受到光纤束的限制。同时，光纤束的存在，也使得成像过程容易因动物的活动，出现成像不稳定的问题。

通过将显微成像光路的主要组成部分，用小型化的器件进行替代，可以将传统显微镜的光路及探测结构整合在一起，制成1厘米尺度的集成化的小型显微镜。因为尺寸小，重量轻，小型显微镜可以直接固定在实验动物的待观测部位，实现实验动物“背着”显微镜进行自由活动的观察方式。这样还有另一个好处，即因为显微光路和成像元件固定在一起，成像的稳定性也更好。

但是，现有的集成化小型显微镜的实现均基于宽场成像，一般以单个LED为光源，进行宽场照明，再通过面阵列探测器进行成像。宽场成像方法缺少层析能力，成像结果会受到焦面上下信号的干扰。

发明内容

针对现有显微镜成像方法存在的问题，本发明的第一目的是提供一种基于线扫描成像的光学显微成像方法，并提出使用小型显示屏代替单个LED作为照明元件。通过在成像过程中，同时限制照明和探测区域的宽度，并将照明和探测过程进行同步，构成线扫描共聚焦成像方式，提高小显微镜成像对焦外信号的抑制能力。通过使用小型显示屏，无需使用机械扫描元件，便于显微镜系统的小型化集成化，适用于对生物过程进行活体原位的显微成像。

本发明的第二目的是提供一种实现上述方法的装置，基于线扫描成像的光学显微成像，并提出使用小型显示屏代替单个LED作为照明元件。通过在成像过程中，同时限制照明和探测区域的宽度，并将照明和探测过程进行同步，构成线扫描共聚焦成像方式，提高小显微镜成像对焦外信号的抑制能力。通过使用小显示屏，无需使用机械扫描元件，便于显微镜系统的小型化集成化，整个装置整体尺寸可<20×20×20mm³，适用于对生物过程进行活体原位的显微成像。

为了实现本发明的第一目的，本发明提供了一种光学显微成像方法，该方法具体为：

小型显示屏顺序显示条带图像序列；

顺序显示的条带图像经物镜在样品面上形成移动的照明条带；

移动的照明条带所照明或激发的样本区域经物镜成像到探测器；

将成像所得的图像序列叠加，得到样品的完整图像。

进一步地，所述图像序列叠加采用像素的加权叠加。

进一步地，所述条带图像宽度相同但位置不同。

进一步地，所述显示屏显示条带图像的时间与探测器成像的时间同步。

本发明方法的有益效果体现在：

本发明方法通过限制照明或激发区域于一个窄条，可以减小样品同层或离焦背景的干扰，提高成像的信噪比。当窄条的宽度足够小时，即相当于进行了一次线扫描共聚焦成像，因此也具有线扫描共聚焦的离焦背景抑制的能力。同时利用显示屏进行图像序列显示的方式，实现无扫描元件的线扫描照明，便于显微镜系统的小型化整合实现。

为了实现本发明的第二技术目的，本发明提供了一种光学显微成像装置，包括：小型显示屏、透镜、滤光片、分光片、物镜和面阵列探测器；

小型显示屏用于顺序显示条带图像序列，顺序显示的条带图像依次经过透镜、滤光片、分光片和所述物镜到达样品面，在样品面上形成缩小的照明条带；物镜用于将顺序显示的条带图像在样品面上形成移动的照明条带，以及将移动的照明条带所照明或激发的样本区域经物镜、分光片成像到探测器；面阵列探测器用于对移动的照明条带所照明或激发的样本区域成像。

进一步地，所述小型显示屏、透镜、滤光片、分光片、物镜和面阵列探测器固定封装在一体化的小显微镜镜体中

进一步地，还包括分别与面阵列探测器和显示屏连接的控制器，控制器包括：

供电电路，用于对显示屏和面阵列探测器供电；

显示驱动电路，用于控制显示屏顺序显示条带图像序列；

成像驱动电路，用于控制面阵列探测器的曝光成像；

图像采集电路，用于采集所得图像；

缓冲存储区，用于存储采集到的图像；

数据处理电路，用于将采集到的图像序列叠加，得到样品的完整图像。

进一步地，所述控制器还包括同步信号产生电路，用于触发显示驱动电路、成像驱动电路和图像采集电路同步工作。

进一步地，所述控制器还包括光强调节电路，用于调节显示屏的光强度。

所述图像序列中的条带宽度可以根据对于离焦背景抑制以及成像速度的需求进行设定。

本发明装置的有益技术效果体现在：

本发明照明光路由小型显示屏和照明光学元件组成。照明光学元件将显示屏成像于样品面。成像光路由面阵列成像器件和成像光学元件组成。成像光学元件将样品面成像于面阵列成像器件的光敏面。照明光路和成像光路封装于小尺寸镜体结构中。照明光路的小型显示屏通过线缆连接到显示控制单元。所述显示控制单元负责图像序列的缓存和显示时序控制。所述成像光路中的面阵列探测器通过线缆连接到图像采集单元。所述图像采集单元负责面阵列探测器的曝光控制和信号读出。所述成像光路和照明光路共用同一个物镜，两光路在分光片位置分开；同时通过使用小显示屏，无需使用机械扫描元件，便于显微镜系统的小型化集成化，适用于对生物过程进行活体原位的显微成像，本发明装置整体尺寸可<20×20×20mm³，满足了对生物过程进行活体原位的显微成像需求。另外，在成像过程中，同时限制照明和探测区域的宽度，并将照明和探测过程进行同步，构成线扫描共聚焦成像方式，提高小显微镜成像对焦外信号的抑制能力。

附图说明

图1为基于小型显示屏和面阵列探测器的小型显微镜系统示意图。

图2为一次成像过程中，小型显示屏显示图像序列过程的示意图。

图3为显示屏显示图像，样品照明区域，及面阵列探测器曝光区域的对应关系。

图4为显示屏和面阵列探测器的工作时序示意图。

图5为显微镜获取样品面一幅图像的流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

图1为本发明较佳的光学显微成像装置结构示意图。显微镜固定在样本1上，通过放置在样本表面或插入样本表面以下的物镜对样本的感兴趣区域进行成像。小型显示屏9上所显示的图像经过透镜10、滤光片11、分光片4和物镜2构成的照明光路，成一个缩小的像于样品面上。所成像的缩小比例等于透镜10和物镜2的焦距之比。

当小型显示屏9所显示的图像强度足够强时，则经照明光路的成像过程，实际也是对样本的照明或激发过程。在物镜2的焦面位置，也即显微镜的物面位置，只有对应于图像上亮区的样本被照明或激发。由于小型显示屏9所显示的图像其最终目的只是对样本的相应区域进行照明和激发，因此小型显示屏9优选为单色显示屏，在使用RGB彩色显示屏时，亮区的每个像素显示为白色，且通过调节RGB三色的强度值，使得各像素的输出光谱在可见光区尽可能平坦。根据成像模式的需要，选择滤光片11的通光光谱区间。如果成像模式为明场成像时，分光片4为半透半反镜。成像模式为荧光成像时，分光片4为二向色分光片。物镜2，分光片4，滤光片5和透镜6构成显微镜的成像光路，将样品面成像于面阵列探测器7上。

所述成像光路和照明光路共用同一个物镜，两光路在分光片位置分开。

小型显示屏可采用小型显示屏指LED背光的LCD屏或OLED屏。

上述照明光路和成像光路固定封装在整个显微装置的镜体结构中。镜体外侧设置面阵列探测器的连接接口8和小型显示屏9的连接接口12。显微镜通过接口8和接口12上的连接电缆，连接到显微镜的控制器13上。

控制器13中包括对显示屏和面阵列探测器供电的供电电路、显示频9的显示驱动电路、面阵列探测器的驱动电路、图像采集电路、面阵列探测器所采集图像的缓冲存储区以及将采集到的图像序列叠加的数据处理电路。本发明中要求同步显示屏的显示过程与面阵列探测的曝光和数据读出过程，因此控制器13中还可包括同步信号产生电路，用于触发显示驱动电路和图像采集电路同步开始工作。为了实现照明亮度的调节，对于LCD显示屏，控制器13中有LCD背光强度的调节电路。

所采集的图像通过图像缓冲区的缓冲存储，再通过控制器13中的通信接口单元上传到控制电脑14中。显微镜成像和图像采集参数在控制电脑14上进行设置，并通过通信接口，发送到显微镜控制器13上。

图2为对显微装置的视场进行一次成像过程时，小型显示屏9上依次显示一个图像序列的过程。显示的第一帧图像如图2的f1所示，所显示图像为一个白色矩形亮条。其竖直方向长度等于显示屏竖直方向所有像素长度之和，图中显示其水平方向宽度为2个像素。在实际操作过程中，矩形亮条的宽度范围为1到n，其中n为显示屏水平方向总像素数。在图像f1的显示期间，进行一次面阵列探测器的曝光和数据读出过程。之后，进行图像f2的显示和面阵列探测器的第二次曝光和数据读出过程。图像f2为大小等同于f1的矩形，但其水平方向位置有一个相对偏移，偏移量大于或等于1个像素尺寸，但小于或等于矩形的宽度。类似地，f2之后的下一帧图像为与f2大小相同的矩形亮条，但水平方向相对f2有相对偏移，偏移量及偏移方向与f2相对f1的偏移相同。依此类推，依次显示从f1到fn的矩形亮条图像序列。f1和fn所显示的矩形亮条分处显示屏的两个相对的显示边沿，从而f1到fn的矩形亮条图像的叠加可以覆盖显示屏的全部显示范围。

图3为小型显示屏显示图像，样品照明区域，及面阵列探测器曝光区域的对应关系。显示屏9上显示的矩形亮条31，会通过显微镜的照明光路，在样品1上形成一个照明亮条33。照明亮条区域内的样本被照明或激发，再通过显微镜的成像光路，成像于面阵列探测器7上。所成像的范围如32所示。令显微镜照明光路的放大倍数为f_il，其成像光路的放大倍数为f_im。则显示屏显示的矩形亮条的宽度Wd，样品面照明亮条宽度Ws和面阵列探测器上所成矩形像的宽度Wc之间满足，Wd/Ws＝f_il,Wc/Ws＝f_im。

图4为显示屏和面阵列探测器在成像过程中的工作时序。41为显微镜控制器中的同步信号产生电路生成的同步脉冲序列。在样品面一幅图像的获取过程中，产生n个同步脉冲44。曲线42为显示屏的帧同步信号的时序。显示屏控制电路对于同步脉冲的每次触发，产生m个帧同步信号，也就是对矩形亮条图像进行m次刷新显示过程。其目的是通过多次显示，保证对样本的照明时间。如图4所示，在第一个同步脉冲的触发下，产生m＝3个帧同步信号45，对矩形亮条图像f1进行多次显示。类似地，在第二个同步脉冲的触发下，产生m＝3个帧同步信号46，对图像f2进行多次显示。依此类推。与此同时，每一个同步信号脉冲，也会触发面阵列探测器的曝光和数据读出过程。如图4所示，每一个同步脉冲44也触发面阵列探测器控制电路产生相应的同步信号43。每一个同步脉冲44触发产生一个对应的脉冲47。面阵列探测器控制器在该脉冲的作用下，产生相应的曝光控制和读出控制信号。在样品面一幅图像的获取过程中，共有n个同步脉冲44，相应地，面阵列探测器也进行从r1到rn的n次曝光和数据读出，从而产生n个中间图像，并通过显微镜控制器中缓冲存储区的中转，传输到显微镜控制电脑上进行处理和合成。

图5所示为获取样品面一幅完整图像IMs的步骤流程。具体如下：

51：根据样本强度以及背景抑制能力的需求，设定样品面完整的图像的获取由多少次矩形亮条的照明过程组成，即设定参数n。根据对于照明时间的需求，设定参数m，即在一次曝光过程中，显示屏会对同一矩形亮条图样进行m次刷新显示。

52：初始化循环变量i为1。

53：产生第i个矩形亮条fi，矩形亮条图样如图2所示。其宽度由显示屏的像素数和n决定。

54：显示屏对矩形亮条fi，进行m次的刷新显示。

55：在显示屏显示fi的同时，进行面阵列探测器的曝光和数据读出过程。

56：步骤55的数据读出得到第i帧图像，IMi。

57：循环变量i自增1。

58：判断i是否小于等于n，如果是，则按53步和55步开始下一循环的操作。如果否则进行到下一步。

59：根据前面步骤得到的图像数据，IM1，IM2，...，IMn，进行叠加计算得到样品面的完整图像IMs。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种光学显微成像方法，其特征在于，该方法具体为：

小型显示屏顺序显示条带图像序列；

顺序显示的条带图像经物镜在样品面上形成移动的照明条带；

移动的照明条带所照明或激发的样本区域经物镜成像到探测器；

将成像所得的图像序列叠加，得到样品的完整图像。

2.根据权利要求1所述的光学显微成像方法，其特征在于，所述图像序列叠加采用像素的加权叠加。

3.根据权利要求1或2所述的光学显微成像方法，其特征在于，所述条带图像宽度相同但位置不同。

4.根据权利要求1或2所述的光学显微成像方法，其特征在于，所述小型显示屏显示条带图像的时间与探测器成像的时间同步。

5.一种光学显微成像装置，其特征在于，包括：小型显示屏、透镜、滤光片、分光片、物镜和面阵列探测器；

小型显示屏用于顺序显示条带图像序列，顺序显示的条带图像依次经过透镜、滤光片、分光片和所述物镜到达样品面，在样品面上形成缩小的照明条带；物镜用于将顺序显示的条带图像在样品面上形成移动的照明条带，以及将移动的照明条带所照明或激发的样本区域经物镜、分光片成像到面阵列探测器；面阵列探测器用于对移动的照明条带所照明或激发的样本区域成像。

6.根据权利要求5所述的光学显微成像装置，其特征在于，所述小型显示屏、透镜、滤光片、分光片、物镜和面阵列探测器固定封装在一体化的小显微镜镜体中。

7.根据权利要求5或6所述的光学显微成像装置，其特征在于，还包括分别与面阵列探测器和小型显示屏连接的控制器，控制器包括：

供电电路，用于对小型显示屏和面阵列探测器供电；

显示驱动电路，用于控制小型显示屏顺序显示条带图像序列；

成像驱动电路，用于控制面阵列探测器的曝光成像；

图像采集电路，用于采集所得图像；

缓冲存储区，用于存储采集到的图像；

数据处理电路，用于将采集到的图像序列叠加，得到样品的完整图像。

8.根据权利要求7所述的光学显微成像装置，其特征在于，所述控制器还包括同步信号产生电路，用于触发显示驱动电路、成像驱动电路和图像采集电路同步工作。

9.根据权利要求7所述的光学显微成像装置，其特征在于，所述控制器还包括光强调节电路，用于调节小型显示屏的光强度。

10.根据权利要求7所述的光学显微成像装置，其特征在于，所述小型显示屏为单色显示屏。