JP4384290B2

JP4384290B2 - 走査型共焦点顕微鏡

Info

Publication number: JP4384290B2
Application number: JP16243699A
Authority: JP
Inventors: 秀夫渡部
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1999-06-09
Filing date: 1999-06-09
Publication date: 2009-12-16
Anticipated expiration: 2019-06-09
Also published as: JP2000352670A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料に対する集束光の走査制御やデータ処理を改善して処理の高速化を図った走査型共焦点顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
走査型共焦点顕微鏡は、点状光源によって観察試料（以下、試料と称する）の表面を点状に照明し、この照明された試料表面からの透過光または反射光を再び点状に集光してピンホール開口を有する検出器に結像させ、この検出器により結像の輝度情報を得るという共焦点作用を利用した顕微鏡である。
【０００３】
図６は、一般的な走査型共焦点顕微鏡の概略構成図である。
【０００４】
点光源１から出射された点状光は、ハーフミラー２を通過したのち収差が補正された対物レンズ３によって試料４の表面に点状結像される。そして、この点状照明の試料４による反射光は、再び対物レンズ３を通過したのちハーフミラー２で反射されて集光する。この集光位置にはピンホール５が配置されており、このピンホール５を通過した上記反射光は光検出器６によって検出される。
【０００５】
このような点状照明をラスタ走査等により試料４の表面の測定領域全体にわたって２次元走査を行い、その反射光の光検出器６による検出信号を画像表示することにより、試料４の表面の２次元画像が得られる。
【０００６】
この２次元走査には例えばＸ方向にはガルバノスキャナやレゾナントスキャナ、Ｙ方向にはガルバノスキャナが用いられている。これらＸ，Ｙスキャナにガルバノスキャナを組み合わせた場合は、試料４の表面の走査速度は約１枚／秒程度になり、走査速度を少し向上させるためにＸスキャナにレゾナントスキャナを用いたものでは約５枚／秒程度となっている。なお、画素数は、１０２４×７６８画素となっている。
【０００７】
このような走査型共焦点顕微鏡では、上記共焦点作用により段差のある試料４の表面全てに合焦した画像を得られる走査が可能である（以下、エクステンド走査）。これは焦点位置で得られる試料４の輝度は最大輝度となることを利用したもので、ある対物レンズ３（又は試料４）位置にて得られる試料４の輝度情報と対物レンズ３（又は試料４）を光軸方向に微少位置ずらしたところで得られる試料４の輝度情報とを比較し、これら２枚の画像の同一画素同士で輝度の高い方の画素を残して行くことで、最終的にある光軸方向範囲で得られる試料４の画像が試料４表面全体に合焦した２次元画像となる。また、上記画素比較の際、輝度が高いと判断された場合、その時の光軸方向の位置を記憶させることで最終的に試料４の高さ（凹凸）の情報が得られる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、このようなエクステンド走査では、ある焦点位置における２次元走査による画像取込みが終了した後に、次の焦点位置に対物レンズ３（又は試料４）を所定ピッチでＺ軸移動して、２次元走査による次の画像取込みを行なうようにしている。ところが、一般的に、焦点位置における２次元走査による画像取込みの周期と焦点位置移動の時間が同期していないため、走査の帰線期間中に焦点位置の移動が終了しない間に２次元走査による画像取込みが開始され、無駄データとなる。このため、次の画像取込みを空振り（データ取得しない）の時間に充なくてはならず、所望する枚数の画像を取得するのに多大な時間を要するという問題が生じる。
【０００９】
そこで、画像の取込み時間を短縮するため、２次元走査による画像取込みを行いながら対物レンズ３（又は試料４）の焦点移動を行なうようにしたものもあるが、このようにしたものでは、画像取込みの走査中に焦点位置が移動しているので、取得された画像は、試料を斜めに走査したものとなり、エクステンド走査により高さの情報を得る過程を考えると、正確な情報となり得ないという問題があった。
【００１０】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、短い時間で、正確な画像情報を取得することができる走査型共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、試料に対して集束光を照射して前記試料からの光を受光し、この受光強度に応じた検出信号を前記試料の画像情報として得る走査型共焦点顕微鏡において、前記試料に対して集束光を２次元走査する２次元走査手段と、前記試料に対する集束光の焦点位置を調整する焦点位置調整手段と、前記２次元走査手段および前記焦点位置調整手段のそれぞれの動作を制御し、前記２次元走査手段による１フレームの走査が終了するごとに、前記焦点位置調整手段による焦点位置の調整開始を指示するとともに、前記２次元走査手段の垂直帰線期間中に前記焦点位置調整手段の前記調整が完了する場合は、前記２次元走査手段の２次元走査を前記垂直帰線期間で禁止せず、前記２次走査手段の垂直帰線期間中に焦点位置調整手段の調整が完了しない場合は、前記垂直帰線期間終了時点で前記２次元走査手段の２次元走査を一時禁止する制御手段と、を具備したことを特徴としている。
【００１２】
請求項２記載の発明は、試料に対して集束光を照射して前記試料からの光を受光し、この受光強度に応じた検出信号を前記試料の画像情報として得る走査型共焦点顕微鏡において、前記試料に対して集束光を２次元走査する２次元走査手段と、前記試料に対する集束光の焦点位置を調整する焦点位置調整手段と、前記２次元走査手段及び前記焦点位置調整手段のそれぞれの動作を制御する制御手段と、を有し、前記制御手段は、前記２次元走査手段による１ライン走査ごとに出力される水平同期信号、１フレーム走査ごとに出力される垂直同期信号、及び前記垂直同期信号に続けて出力される制御信号を管理し、前記垂直同期信号により前記焦点位置調整手段による焦点位置の調整開始を指示するとともに、前記焦点位置調整手段による焦点位置の調整完了が前記制御信号より前に通知された場合は、前記２次元走査手段の２次元走査を禁止せず、前記焦点位置調整手段による焦点位置の調整完了が前記制御信号より後に通知された場合は、前記制御信号の発生時点で前記２次元走査手段の２次元走査を一時禁止し、前記焦点位置の調整終了をまって前記２次元走査手段の２次元走査を開始させることを特徴としている。
【００１３】
請求項３記載の発明は、請求項２記載の発明において、前記制御信号は、前記２次元走査手段の垂直帰線期間終了時点で出力されることを特徴としている。
【００１４】
この結果、本発明によれば、エクステンド走査における２次元走査手段での２次元走査と焦点位置調整手段による焦点位置移動の同期を取ることで、無駄な２次元走査期間（データを取得できない空振り期間）を取り除くことができる。
【００１５】
また、本発明によれば、２次元走査手段の垂直同期信号に続けて出力される制御信号との間の期間も焦点位置調整手段による焦点位置の調整に利用することができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００１７】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明が適用される走査型共焦点顕微鏡の概略構成を示している。
【００１８】
図において、１００は顕微鏡本体で、この顕微鏡本体１００にはレーザー光源１０が設けられている。このレーザー光源１０は試料４の表面を走査するスポット光（集束光）としてのレーザー光を発生させるものである。このレーザー光源１０の光路上にはミラー１１が配置されている。このミラー１１は、このレーザー光源１０からのレーザー光を２次元走査機構１２に導くための反射鏡である。
【００１９】
２次元走査機構１２は、ミラー１１を介して得たレーザー光源１０からのレーザー光を２次元走査駆動制御回路１３での制御のもとで、スポット光として、ＸＹ方向に２次元走査するためのものである。
【００２０】
２次元走査機構１２を介して２次元走査されたスポット光は、対物レンズ１４を介してステージ１６上に載置された試料４に照射されるようにしている。この場合、対物レンズ１４は、レボルバ１５に取付けられている。このレボルバ１５は、倍率の異なる複数の対物レンズ１４を保持したもので、これら対物レンズ１４のうちの所望の倍率を持つものを顕微鏡の観察光路中に位置設定可能にするとともに、後述する焦点移動機構２３の指示により対物レンズ１４を光軸方向に焦点移動できるようにしている。
【００２１】
一方、試料４からの反射光は、対物レンズ１４を通り２次元走査機構１２に戻り、この２次元走査機構１２からハーフミラー１７へと戻されるようになっている。このハーフミラー１７は、２次元走査機構１２に対するレーザー光源１０の出射光路上に設けられ、２次元走査機構１２を介して得られる試料４からの反射光を検出系に導くための半透明鏡である。
【００２２】
そして、ハーフミラー１７介して得た試料４からの反射光は、レンズ１８を透過され、ピンホール板１９のピンホールを介して光検出器２０で受光されるようにしている。レンズ１８は、試料４からの反射光を集光するものであり、ピンホール板１９は所要の径のピンホールを有し、光検出器２０の受光面の前面のレンズ１８の焦点位置に配置されている。また、光検出器２０は、ピンホール板１９のピンホールを介して得られる光をその光量対応の電気信号に変換する光検出素子からなっている。
【００２３】
光検出器２０で光電変換された信号は、２次元走査駆動制御回路１３からのタイミング信号と共にコンピュータ２１に送られ、コンピュータ２１において画像化されモニタ２２に、試料４の表面情報として表示されるようになっている。
【００２４】
コンピュータ２１には、焦点移動機構２３が接続されている。この焦点移動機構２３は、レボルバ１５に接続されるとともに、２次元走査駆動制御回路１３に接続されていて、コンピュータ２１の指示によりレボルバ１５の焦点移動と２次元走査機構１２による２次元走査を同期して制御できるようにしている。
【００２５】
図２は、このように構成された走査型共焦点顕微鏡の要部をさらに詳述するための図である。
【００２６】
この場合、２次元走査機構１２は、Ｘ軸方向走査用として例えばガルバノミラーまたはレゾナントスキャナからなるＸスキャナ１２１とＹ軸方向走査用として例えばガルバノミラーからなるＹスキャナ１２２を有し、Ｘスキャナ１２１は、ドライバ１２３により駆動されて２次元走査の主走査を行ない、Ｙスキャナ１２２は、ドライバ１２４により駆動されて２次元走査の副走査を行なうようにしている。
【００２７】
焦点移動機構２３は、ドライバ２３１を有し、レボルバ１５による対物レンズ１４の焦点移動を行なうようにしている。
【００２８】
２次元走査駆動制御回路１３は、Ｘ波形生成回路１３１、Ｙ波形生成回路１３２および同期生成回路１３３を有している。Ｘ波形生成回路１３１は、例えばアドレスカウンタや波形メモリを有し、２次元走査機構１２のドライバ１２３に対して駆動信号ＸＤＲＩＶＥを出力してＸスキャナ１２１の２次元走査の主走査を制御するとともに、１ラインの走査ごとに水平同期信号ＨＤを出力し、また、Ｙ波形生成回路１３２は、例えばアドレスカウンタや波形メモリを有し、同期生成回路１３３を経由したＸ波形生成回路１３１からのタイミング信号ＨＤ’で動作し、２次元走査機構１２のドライバ１２４に対して駆動信号ＹＤＲＩＶＥを出力してＹスキャナ１２２の２次元走査の副走査を制御するとともに、１フレームの走査ごとに垂直同期信号ＶＤを出力する。また、同期生成回路１３３は、Ｘ波形生成回路１３１の１ライン走査ごとの水平同期信号ＨＤとＹ波形生成回路１３２の１フレーム走査ごとの垂直同期信号ＶＤにより、モニタ２２に試料４の画像を表示させるのに必要な同期信号ＳＹＮＣを出力し、また、焦点移動機構２３のドライバ２３１に対しレボルバ１５による焦点移動の移動開始信号ＺＳＴＡＲＴを出力するとともに、レボルバ１５が所定距離だけ移動したところで、ドライバ２３１より移動終了信号ＺＥＮＤを受取るようにしている。
【００２９】
次に、以上のように構成した実施の形態の作用について説明する。
【００３０】
いま、レーザー光源１０から出力されたレーザー光は、ミラー１１で２次元走査機構１２に導かれ、この２次元走査機構１２でＸＹ軸方向に２次元走査され、走査されたレーザー光は、対物レンズ１４を通して試料４上にスポット光として走査されながら照射される。
【００３１】
一方、この試料４からの反射光は、対物レンズ１４を通って２次元走査機構１２に戻り、この２次元走査機構１２からハーフミラー１７、レンズ１８、そしてピンホール板１９を通って光検出器２０に入射され、この光検出器２０で光電変換され電気信号としてコンピュータ２１に送出される。
【００３２】
この場合、２次元走査機構１２での２次元走査は、２次元走査駆動制御回路１３により制御されるが、図２に示すＸ波形生成回路１３１では、波形メモリに図３に示す波形パターンを用意していて、２次元走査が開始されると図示しないアドレスカウンタが動作し、Ａ→Ｂ→Ｃ→Ａとアドレスが進むことで、図４（ａ）に示す周期的な駆動波形ＸＤＲＩＶＥを２次元走査機構１２のドライバ１２３に出力する。ドライバ１２３は、駆動波形ＸＤＲＩＶＥを受取ると、Ｘスキャナ１２１を駆動して２次元走査の主走査を行なう。同時に、駆動波形ＸＤＲＩＶＥのうちの帰線期間の始まりを知らせる信号、つまり、１ラインの走査ごとの水平同期信号ＨＤ（図４（ｂ））を出力する。
【００３３】
これにより、試料４の１ライン分の画素データが駆動波形ＸＤＲＩＶＥのＡ−Ｂ間（例えば１０２４画素分）で得られることになる。
【００３４】
一方、Ｘ波形生成回路１３１より水平同期信号ＨＤが出力されると、同期生成回路１３３を経由して図４（ｃ）に示すタイミング信号ＨＤ’がＹ波形生成回路１３２に与えられる。この場合、Ｙ波形生成回路１３２は、Ｘ波形生成回路１３１と同様な図３に示す波形パターンを波形メモリに用意していて、同期生成回路１３３を経由したタイミング信号ＨＤ’を受けて１ラインごとにアドレスを進め、Ａ→Ｂ→Ｃ→Ａに応じた図４（ｄ）に示す周期的な駆動波形ＹＤＲＩＶＥを２次元走査機構１２のドライバ１２４に出力する。ドライバ１２４は、駆動波形ＹＤＲＩＶＥを受取ると、Ｙスキャナ１２２を駆動して２次元走査の副走査を行なう。同時に、駆動波形ＹＤＲＩＶＥのうちの帰線期間の始まりを知らせる信号、つまり、１フレームの走査ごとに図４（ｅ）に示す垂直同期信号ＶＤを出力する。
【００３５】
これにより、試料４の１フレームごとの画素データが駆動波形ＹＤＲＩＶＥのＡ−Ｂ間（例えば７６８ライン分）で得られ、これらの動作を繰り返すことにより、試料４の画像がコンピュタ２１を介してモニタ２２に表示される。
【００３６】
次に、エクステンド走査を説明する。
【００３７】
この場合、予め、コンピュータ２１より焦点移動機構２３のドライバ２３１に対して１フレームごとのレボルバ１５の移動距離が設定されている。
【００３８】
この状態から、コンピュータ２１より２次元走査駆動制御回路１３の同期生成回路１３３にエクステンド走査が指示され、Ｙ波形生成回路１３２が同期生成回路１３３を経由して与えられるタイミング信号ＨＤ’を、例えば図４（ｃ）のａ点のように受取ると、図４（ｄ）のｂ点のように駆動波形ＹＤＲＩＶＥを２次元走査機構１２のドライバ１２４に出力する。この場合、波形メモリの図３に示すＡ点からＹスキャナ１２２により２次元走査の副走査を行ない、同図Ｂ点までで１フレーム分（７６８ライン分）の画像データを取込み、同時に、図４（ｅ）のｃ点で垂直同期信号ＶＤを出力する。
【００３９】
すると、同期生成回路１３３より図４（ｆ）のｄ点で焦点移動機構２３のドライバ２３１に対しレボルバ移動信号ＺＳＴＡＲＴが出力され、このレボルバ移動信号ＺＳＴＡＲＴによりレボルバ１５の予め定められた距離の移動が開始される。同時に、図４（ｅ）のｃ点の垂直同期信号ＶＤにより図４（ｃ）のｅ点からＹ波形生成回路１３２のアドレスカウンタを駆動するタイミング信号ＨＤ’をマスクする。この場合、アドレスカウンタを止められたＹ波形生成回路１３２は、図３のＢ点の位置で保持され、これにより、レボルバ１５が移動される間は、２次元走査の副走査は一時停止されることになる。
【００４０】
その後、レボルバ１５の所定距離の移動が完了すると、図４（ｇ）のｆ点でドライバ２３１より同期生成回路１３３に移動完了信号ＺＥＮＤが出力される。この移動完了信号ＺＥＮＤを同期生成回路１３３が受取ると、図４（ｃ）のｇ点でタイミング信号ＨＤ’をマスクが解除され、次の主走査のタイミングで有効とすることで、Ｙ波形生成回路１３２は、通常動作に戻り、次のフレーム走査に移行される。
【００４１】
以下、同様にして、焦点位置における２次元走査による１フレームの画像取込みを終了するごとに、所定の移動量で焦点移動を行ない、次の焦点位置に移動して、次の２次元走査による１フレームの画像取込みを行なうエクステンド走査が行なわれることになる。
【００４２】
従って、このような構成によれば、エクステンド走査の際のレボルバ１５による焦点位置の移動に基づいて２次元走査機構１２のＹスキャナ１２２による２次元走査の副走査期間を制御し、レボルバ１５の移動距離に対応させて次フレーム走査への処理に移行させるようにできるので、エクステンド走査中の隣り合う２つの焦点位置間の２次元走査と焦点位置調整移動の非同期性を吸収できるようになり、従来の走査の帰線期間中に焦点位置の移動が終了しないと、次の画像取込みを空振り（データ取得しない）とするものと比べ、無駄な２次元走査期間（データを取得できない空振り期間）を取り除くことができ、画像の取込み時間を大幅に短縮でき、また、従来の画像の取込み時間を短縮するため、２次元走査による画像取込みを行いながら焦点移動を行なうため取得された画像が試料を斜めに走査するものと比べて、常に正確な画像情報を取得することができる。
【００４３】
（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態について説明する。
【００４４】
この場合、第１の実施の形態で述べた図１および図２については、第２の実施の形態でも同様なので、これら図１および図２を援用し、また、図３に示すＸ波形生成回路１３１の波形メモリの波形パターンも、同図を援用するものとする。
【００４５】
また、Ｙ波形生成回路１３２の波形メモリの波形パターンは、図５に示すように波形メモリのアドレスＢに垂直同期信号ＶＤを、アドレスＣに制御信号ＥＮをそれぞれ出力するようにしている。
【００４６】
このようにしても、ある１フレームの画像データの取得が行なわれると、予め設定された距離だけレボルバ１５が焦点移動されるようになるが、ここまでの動作は、第１の実施の形態と同様である。
【００４７】
この場合、図５に示す波形パターンの垂直帰線期間（アドレスＢ→Ｃ間）中も２次元走査は止まらないようになっており、仮に、レボルバ１５の焦点移動の距離（時間）が小さく、垂直帰線期間Ｂ→Ｃ間でレボルバ１５の移動が完了してしまい、ドライバ２３１からの移動完了信号ＺＥＮＤよりも制御信号ＥＮの方が後から同期生成回路１３３に通知されるような場合は、２次元走査を止めることなく、連続したフレームでデータ取得を行うようになる。また、レボルバ１５の焦点移動の距離（時間）が大きく、垂直帰線期間Ｂ→Ｃ間でレボルバ１５の移動が完了せずに、次フレーム内に完了時点が食い込んでしまい制御信号ＥＮよりも移動完了信号ＺＥＮＤが後で同期生成回路１３３に通知されるような場合は、制御信号ＥＮの発生時点で２次元走査を一時停止し、ドライバ２３１からの移動完了信号ＺＥＮＤを待ってから次のフレームの走査を再開するようになる。
【００４８】
従って、このようにすれば、垂直帰線期間Ｂ→Ｃも有効に焦点位置調整のためのレボルバ１５の移動期間に利用することができるので、さらに効率のよい画像情報の取得を期待することができる。
【００４９】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、エクステンド走査中の連続する焦点位置の移動にともなう２次元走査手段での２次元走査と焦点位置調整手段による焦点位置移動の非同期性を吸収できるので、無駄な２次元走査期間（データを取得できない空振り期間）を取り除くことができ、短い時間で、正確な画像情報を効率よく取得することができる。
【００５０】
また、本発明によれば、２次元走査手段の垂直同期信号に続けて出力される制御信号との間の期間も焦点位置調整手段による焦点位置の調整に利用することができるので、さらに効率のよい画像情報の取得を期待することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】第１の実施の形態の要部を詳述するための図。
【図３】第１の実施の形態の動作を説明するための図。
【図４】第１の実施の形態の動作を説明するためのタイムチャート。
【図５】本発明の第２の実施の形態を説明するための図。
【図６】従来の走査型共焦点顕微鏡の概略構成を示す図。
【符号の説明】
４：試料、
１０：レーザ光源、
１１：ミラー、
１２：２次元走査機構、
１２１：Ｘスキャナ
１２２：Ｙスキャナ
１２３、１２４：ドライバ
１３：２次元走査駆動制御回路、
１３１：Ｘ波形生成回路
１３２：Ｙ波形生成回路
１３３：同期生成回路
１４：対物レンズ、
１５：レボルバ、
１６：ステージ、
１７：ハーフミラー、
１８：レンズ、
１９：ピンホール板、
２０：光検出器、
２１：コンピュータ、
２２：モニタ、
２３：焦点移動機構、
２３１：ドライバ

Claims

試料に対して集束光を照射して前記試料からの光を受光し、この受光強度に応じた検出信号を前記試料の画像情報として得る走査型共焦点顕微鏡において、
前記試料に対して集束光を２次元走査する２次元走査手段と、
前記試料に対する集束光の焦点位置を調整する焦点位置調整手段と、
前記２次元走査手段および前記焦点位置調整手段のそれぞれの動作を制御し、前記２次元走査手段による１フレームの走査が終了するごとに、前記焦点位置調整手段による焦点位置の調整開始を指示するとともに、前記２次元走査手段の垂直帰線期間中に前記焦点位置調整手段の前記調整が完了する場合は、前記２次元走査手段の２次元走査を前記垂直帰線期間で禁止せず、前記２次走査手段の垂直帰線期間中に焦点位置調整手段の調整が完了しない場合は、前記垂直帰線期間終了時点で前記２次元走査手段の２次元走査を一時禁止する制御手段と、
を具備したことを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。
試料に対して集束光を照射して前記試料からの光を受光し、この受光強度に応じた検出信号を前記試料の画像情報として得る走査型共焦点顕微鏡において、
前記試料に対して集束光を２次元走査する２次元走査手段と、
前記試料に対する集束光の焦点位置を調整する焦点位置調整手段と、
前記２次元走査手段及び前記焦点位置調整手段のそれぞれの動作を制御する制御手段と、を有し、
前記制御手段は、前記２次元走査手段による１ライン走査ごとに出力される水平同期信号、１フレーム走査ごとに出力される垂直同期信号、及び前記垂直同期信号に続けて出力される制御信号を管理し、前記垂直同期信号により前記焦点位置調整手段による焦点位置の調整開始を指示するとともに、前記焦点位置調整手段による焦点位置の調整完了が前記制御信号より前に通知された場合は、前記２次元走査手段の２次元走査を禁止せず、前記焦点位置調整手段による焦点位置の調整完了が前記制御信号より後に通知された場合は、前記制御信号の発生時点で前記２次元走査手段の２次元走査を一時禁止し、前記焦点位置の調整終了をまって前記２次元走査手段の２次元走査を開始させること、
を特徴とする走査型共焦点顕微鏡。
前記制御信号は、前記２次元走査手段の垂直帰線期間終了時点で出力されることを特徴とする請求項２記載の走査型共焦点顕微鏡。