JP2008122725A - 共焦点顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】 任意のＣＣＤカメラに適用でき、ニポウディスクの走査周期とカメラの画像取り込み周期を完全に同期させてバンディングノイズを除去することができる共焦点顕微鏡装置を実現する。
【解決手段】 顕微鏡ユニットと、所定の走査周期で回転するニポウディスクを有する共焦点スキャナユニットから構成され、試料に照射される計測光の戻り光を結像させた共焦点画像を、フレーム転送型ＣＣＤ素子を備えるカメラにより撮像する共焦点顕微鏡において、
設定される前記ＣＣＤ素子の露光時間（Ｔ１）に基づいて、この露光時間の整数（ｎ≧１）分の１の周期（Ｔ２＝Ｔ１／ｎ）を持つ前記ニポウディスクの走査周期を生成するディスク走査周期生成手段を備える。
【選択図】 図１

Description

本発明は、顕微鏡ユニットと、所定の走査周期で回転するニポウディスクを有する共焦点スキャナユニットから構成され、試料に照射される計測光の戻り蛍光を結像させた共焦点画像を、フレーム転送型ＣＣＤ素子を備えるカメラにより撮像する共焦点顕微鏡に関するものである。

共焦点顕微鏡は、レーザ光（以下、計測光）による試料上の集光点を走査し、試料からの戻り蛍光を結像させて画像を得ることにより試料を観察するもので、生物やバイオテクノロジーなどの分野おける生きた細胞の生理反応観察や形態観察、あるいは半導体市場におけるＬＳＩの表面観察等に使用されている。

図５は、従来の共焦点顕微鏡の構成例を示す機能ブロック図である。共焦点スキャナユニット１は、顕微鏡ユニット２のポートに接続されている。計測光Ｌは、共焦点スキャナユニット１のマイクロレンズアレイディスク１１の形成されたマイクロレンズにより個別の励起光束Ｌ１に集光され、ダイクロイックミラー１２を透過後、ピンホールディスク（以下、ニポウディスク）１３の個々のピンホールを通過し、顕微鏡ユニット２の対物レンズ２１により、ステージ３上の試料４に集光される。

この励起光束Ｌ１の照射により、試料４が蛍光する。試料４から出た戻り蛍光Ｌ２は、再び対物レンズ２１を通り、ニポウディスク１３の個々のピンホール上に集光される。個々のピンホールを通過した戻り蛍光は、ダイクロイックミラー１２で反射され、リレーレンズ１４を介してカメラ５が備えるＣＣＤ素子５１の受光面に結像される。

マイクロレンズアレイディスク１１及びニポウディスク１３は、同軸結合され、モータドライバ１５により回転制御されるモータ１６により所定の速度で回転操作される。この回転によるニポウディスク１３上のピンホールの移動により試料４上への集光点を走査している。

ニポウディスク１３のピンホールが並んでいる表面と、試料４の被観察面と、ＣＣＤ素子５１の受光面とは互いに光学的に共役関係に配置されているので、ＣＣＤ素子５１には試料４の光学的断面像、即ち共焦点画像が結像される。ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡の詳細に関しては、特許文献１に開示されている。

このような機能構成をとる共焦点顕微鏡では、ニポウディスクの回転ムラにより生ずる共焦点画像に含まれる縞模様のノイズ（バンディングノイズ）を除去するために、ニポウディスクの回転走査周期と、カメラの撮像周期を整合させる必要がある。

特許文献２に開示されている整合の手法を図５により説明する。ニポウディスク１３の回転センサ１７の検出信号を入力する操作トリガ生成回路６で生成されるニポウディスク１３の走査トリガ信号が撮像トリガ供給部７に導かれる。

撮像トリガ供給部７は、走査トリガ信号とＣＣＤ素子５１の垂直転送時間を考慮した撮像トリガ信号を生成して撮像制御部８に渡し、撮像制御部８は撮像トリガ信号に基づいて共焦点画像を取得するカメラ５の撮像周期を制御する。

図６は、走査トリガ周期Ｔ１、垂直転送時間Ｔ２，読み出し時間Ｔ３、露光時間Ｔ４（＝Ｔ１）、撮像トリガ周期Ｔ５の関係を示すタイムチャートである。この方式の特徴は、露光時間Ｔ４を走査トリガ周期Ｔ１と一致させると共に、撮像トリガ周期Ｔ５を、走査トリガ周期Ｔ１と垂直転送時間Ｔ２の和とした点にある。

特開平５−６０９８０号公報 特開２００６−１４５６３４号公報

バンディングノイズを無くすには、カメラの撮像トリガとニポウディスクの走査トリガを完全に同期させる必要がある。しかしながら、特許文献２の開示された手法では、カメラの画像取込み周期を単純に、露光時間（＝走査トリガ周期）とＣＣＤの垂直転送時間の合計としたため、カメラの取込み周期とニポウディスクの走査周期に、垂直転送時間分のずれが生じ、両者は全く同期することができない。

一方、一般的なＣＣＤカメラには、取込みのタイミングを外部より受けるための撮像トリガ端子を持ち、外部トリガに同期して、露光や転送を行う機能を備えている。また、ニポウディスクは、外部からのパルス信号に同期して走査する機能を備えている。

特許文献２に開示された従来技術を一般的なＣＣＤカメラに適用した場合、一つの同期信号源から、ＣＣＤの撮像タイミングとニポウディスクの走査を同期させようとすると、ＣＣＤの撮像タイミングが優先するため、逆にＣＣＤの露光時間とニポウディスクの走査周期の間にＣＣＤの垂直転送時間分だけずれ、露光のむら（照射光量のむら）が生じ、バンディングノイズが発生する。従って、従来技術の適用は特殊なカメラに限定される。

本発明は上述した問題点を解決するためになされたものであり、任意のＣＣＤカメラに適用でき、ニポウディスクの走査周期とカメラの画像取り込み周期を完全に同期させてバンディングノイズを除去することができる共焦点顕微鏡装置の実現を目的としている。

このような課題を達成するために、本発明は次の通りの構成になっている。
（１）顕微鏡ユニットと、所定の走査周期で回転するニポウディスクを有する共焦点スキャナユニットから構成され、試料に照射される計測光の戻り光を結像させた共焦点画像を、フレーム転送型ＣＣＤ素子を備えるカメラにより撮像する共焦点顕微鏡において、
設定される前記ＣＣＤ素子の露光時間（Ｔ１）に基づいて、この露光時間の整数（ｎ≧１）分の１の周期（Ｔ２＝Ｔ１／ｎ）を持つ前記ニポウディスクの走査周期を生成するディスク走査周期生成手段を備えることを特徴とする共焦点顕微鏡。

（２）前記ディスク走査周期生成手段より前記走査周期（Ｔ２）を取得し、前記ＣＣＤ素子の垂直転送時間（Ｔ３）との差を演算した調整時間（Ｔ４＝Ｔ１−Ｔ３）を生成するカメラ取り込み周期生成手段を備えたことを特徴とする（１）に記載の共焦点顕微鏡。

（３）前記カメラ取り込み周期生成手段は、前記露光時間（Ｔ１）と前記垂直転送時間（Ｔ３）と前記調整時間（Ｔ４）との和を演算したカメラ取り込み周期（Ｔ５＝Ｔ１＋Ｔ３＋Ｔ４）を生成することを特徴とする（１）または（２）に記載の共焦点顕微鏡。

（４）前記カメラ取り込み周期（Ｔ５）を取得し、この周期の逆数の周波数を持つカメラ撮像トリガ信号を前記カメラに渡す同期制御部を備えることを特徴とする（１）乃至（３）のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。

（５）前記同期制御部は、前記カメラ撮像トリガ信号の周波数を（ｎ＋１）逓倍した周波数を持つディスクトリガ信号を前記ニポウディスクの回転を制御するモータドライバに渡すことを特徴とする（４）に記載の共焦点顕微鏡。

本発明によれば、次のような効果を期待することができる。
（１）本発明では、ＣＣＤ素子の垂直転送時間を考慮した調整時間を設けることにり、カメラの画像取込みのタイミングと、ニポウディスクの走査タイミングを完全に１つの周波数のトリガで同期させることができ、ニポウディスクの回転むらによるバンディングノイズを消すことができる。

（２）一般的なＣＣＤカメラが備える外部同期端子をそのまま利用できるため、カメラを選ばず、広く応用することができる。

以下、本発明を図面により詳細に説明する。図１は、本発明を適用した共焦点顕微鏡の一実施形態を示す機能ブロック図である。図５で説明した従来構成と同一要素には同一符号を付して説明を省略する。以下、本発明の特徴部につき説明する。

実際の生細胞観察の場合、適切な明るさの画像を取得するため、ユーザは最初にカメラの露光時間等の条件を設定する。

トリガ生成部１００において、ディスク走査周期生成手段１０１は、ユーザにより設定されるＣＣＤ素子５１の露光時間（Ｔ１）に基づいて、この露光時間の整数（ｎ≧１）分の１の周期（Ｔ２＝Ｔ１／ｎ）を持つニポウディスクの走査周期を生成する。

カメラ取り込み周期生成手段１０２は、ディスク走査周期生成手段１０１よりニポウディスクの走査周期（Ｔ２）を取得し、ＣＣＤ素子５１の垂直転送時間（Ｔ３）との差を演算した調整時間（Ｔ４＝Ｔ１−Ｔ３）を生成する。

更に、カメラ取り込み周期生成手段１０２は、露光時間（Ｔ１）と垂直転送時間（Ｔ３）と調整時間（Ｔ４）との和を演算した周期（Ｔ５＝Ｔ１＋Ｔ３＋Ｔ４）を有するカメラ取り込み周期を生成する。

同期制御部２００は、トリガ生成部１００よりカメラ取り込み周期（Ｔ５）を取得し、この周期Ｔ５の逆数の周波数を持つカメラ撮像トリガ信号ｆ１を生成してカメラ５に渡す。

さらにこの同期制御部２００は、トリガ生成部１００より整数ｎを取得し、カメラ撮像トリガ信号の周波数ｆ１を（ｎ＋１）逓倍した周波数ｆ２を持つディスクトリガ信号を生成し、ニポウディスクの回転を制御するモータドライバ１５に渡す。

図２は、本発明が適用された共焦点顕微鏡の一実施形態の動作を説明するタイムチャートである。この実施形態では、整数ｎをｎ＝１に選定した場合を示している。図２（Ａ）は、（Ｅ）のカメラ撮像トリガ周期毎に同期して発生する、ユーザ設定の露光時間Ｔ１を示す。

図２（Ｂ）は、ディスク走査トリガ周期Ｔ２を示しており、ｎ＝１であるため、露光時間Ｔ１と一致している。図２（Ｃ）は露光時間Ｔ１の終了毎に発生するＣＣＤ素子の垂直転送時間Ｔ３を示している。

図２（Ｄ）は、垂直転送時間Ｔ３の終了毎に生成される調整時間Ｔ４であり、ディスク走査トリガ周期Ｔ２と垂直転送時間Ｔ３の差を計算して生成される。図２（Ｅ）は、カメラ撮像トリガ周期Ｔ５であり、露光時間Ｔ１と垂直転送時間Ｔ３と調整時間Ｔ４の和を計算して生成される。

本発明では、ディスク走査トリガ周期Ｔ２を露光時間Ｔ１の整数分の１とすると共に、調整時間Ｔ４を設けることにより、カメラ撮像トリガ信号ｆ１とディスク走査トリガ信号ｆ２とを完全に同期させることが可能である。

ディスク走査トリガ信号ｆ２の周波数は、カメラ撮像トリガ信号ｆ１の周波数を（ｎ＋１）逓倍した周波数であり、この実施形態ではｎ＝１のため、ｆ２はｆ１を２逓倍した周波数となる。

図３は、本発明が適用された共焦点顕微鏡の他の実施形態の動作を説明するタイムチャートである。この実施形態の特徴は整数ｎをｎ＝３に選定した場合を示している。図２との差は、図３（Ｂ）のディスクトリガ走査周期Ｔ２が、露光時間Ｔ１の１／３となる点である。

この実施形態ではｎ＝３のため、ｆ２はｆ１を４逓倍した周波数となる。この実施形態では、ニポウディスクの走査周波数を上げ、回転を高速化して、１露光時間の間に、励起光が試料を３度スキャンするため、スキャンの平均化が図られ、ディスクの偏芯によるバンディングノイズを軽減することができる。

図４は、本発明が適用された共焦点顕微鏡の他の実施形態の動作を説明するタイムチャートである。この実施形態例では、垂直転送時間Ｔ３がニポウディスクの走査トリガ周期Ｔ２を超える場合を示す。トリガタイミングは本質的に図３と同じである。

本発明を適用した共焦点顕微鏡の一実施形態を示す機能ブロック図である。 本発明が適用された共焦点顕微鏡の一実施形態の動作を説明するタイムチャートである。 本発明が適用された共焦点顕微鏡の他の実施形態の動作を説明するタイムチャートである。 本発明が適用された共焦点顕微鏡の更に他に実施形態の動作を説明するタイムチャートである。 従来の共焦点顕微鏡の構成例を示す機能ブロック図である。 走査トリガ周期、垂直転送時間，読み出し時間、露光時間、撮像トリガ周期の関係を示すタイムチャートである。

符号の説明

１ 共焦点スキャナユニット
１１ マイクロレンズアレイディスク
１２ ダイクロイックミラー
１３ ニポウディスク
１４ リレーレンズ
１５ モータドライバ
１６ モータ
２ 顕微鏡ユニット
２１ 対物レンズ
３ ステージ
４ 試料
５ カメラ
５１ ＣＣＤ素子
１００ トリガ生成部
１０１ ディスク走査周期生成手段
１０２ カメラ取り込み周期生成手段
２００ 同期制御部

Claims (5)

1. 顕微鏡ユニットと、所定の走査周期で回転するニポウディスクを有する共焦点スキャナユニットから構成され、試料に照射される計測光の戻り光を結像させた共焦点画像を、フレーム転送型ＣＣＤ素子を備えるカメラにより撮像する共焦点顕微鏡において、
   設定される前記ＣＣＤ素子の露光時間（Ｔ１）に基づいて、この露光時間の整数（ｎ≧１）分の１の周期（Ｔ２＝Ｔ１／ｎ）を持つ前記ニポウディスクの走査周期を生成するディスク走査周期生成手段を備えることを特徴とする共焦点顕微鏡。
2. 前記ディスク走査周期生成手段より前記走査周期（Ｔ２）を取得し、前記ＣＣＤ素子の垂直転送時間（Ｔ３）との差を演算した調整時間（Ｔ４＝Ｔ１−Ｔ３）を生成するカメラ取り込み周期生成手段を備えたことを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
3. 前記カメラ取り込み周期生成手段は、前記露光時間（Ｔ１）と前記垂直転送時間（Ｔ３）と前記調整時間（Ｔ４）との和を演算したカメラ取り込み周期（Ｔ５＝Ｔ１＋Ｔ３＋Ｔ４）を生成することを特徴とする請求項１または２に記載の共焦点顕微鏡。
4. 前記カメラ取り込み周期（Ｔ５）を取得し、この周期の逆数の周波数を持つカメラ撮像トリガ信号を前記カメラに渡す同期制御部を備えることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。
5. 前記同期制御部は、前記カメラ撮像トリガ信号の周波数を（ｎ＋１）逓倍した周波数を持つディスクトリガ信号を前記ニポウディスクの回転を制御するモータドライバに渡すことを特徴とする請求項４に記載の共焦点顕微鏡。

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