JP4662123B2

JP4662123B2 - レーザ共焦点顕微鏡システム

Info

Publication number: JP4662123B2
Application number: JP2004277161A
Authority: JP
Inventors: 健太御厨; 俊雄飯野
Original assignee: Yokogawa Electric Corp
Current assignee: Yokogawa Electric Corp
Priority date: 2004-09-24
Filing date: 2004-09-24
Publication date: 2011-03-30
Anticipated expiration: 2024-09-24
Also published as: JP2006091445A

Description

本発明は、細胞などを共焦点スキャナを用いて画像計測するレーザ共焦点顕微鏡システムに関し、特に燐光を活用して画像を観測するレーザ共焦点顕微鏡システムに関する。

レーザ共焦点顕微鏡は、レーザにより試料中の蛍光物質を励起し、蛍光物質から放射される蛍光を共焦点光学系を用いて測定している。この種の顕微鏡に使用される共焦点光スキャナの先行技術文献としては例えば次のようなものがある。

C.Genka, K.Ishida, K.Ichimori, Y.Hirota, T.Tanaami, H.Nakazawa、「Visualization of biphasic Ca2+ diffusion from cytosol to nucleus in contracting adult rat cardiac myocytes with an ultra-fast confocal imaging system」、セルカルシウム［Cell Calcium］ Volume 25、Issue 3、P.199-208

図１１はこの非特許文献１に記載の共焦点光スキャナの原理的構成図である。励起光であるレーザ光１は、マイクロレンズディスク２に配置された各マイクロレンズ３により個別の光束に集光され、マルチクロイックミラー（本来はマルチクロイックミラーと呼ぶべきであるが、ここではマルチ波長用ダイクロイックミラーと呼ぶ）４を透過後、ピンホールディスク（ニポウディスクともいう）５に設けられた個々のピンホール６を通過し、対物レンズ７により試料８に集光される。

試料８から発生した蛍光は再び対物レンズ７を通り、ピンホールディスク５の個々のピンホール上に集光される。個々のピンホール６を通過した蛍光はマルチ波長用ダイクロイックミラー４で反射され、リレーレンズ９により、カメラ１０上に蛍光画像を結像する。
ここで使用されるマルチ波長用ダイクロイックミラー４は、レーザ光１を透過し、試料８からの蛍光を反射するように設計されている。

マイクロレンズディスク２とピンホールディスク５は部材１１で機械的に連結され、回転軸１２の周りを一体で回転する。ピンホールディスク５上に形成された個々のピンホール６からの励起光が試料８の観察平面を走査するように、個々のマイクロレンズ３とピンホール６は配置されている。また、ピンホール６が並んでいる平面と、試料８の観察平面と、カメラ１０の受光面とが互いに光学的に共役な関係に配置されているため、カメラ１０上には試料８の光学的断面像、すなわち共焦点画像が結像される。

このようなニポウディスク型の共焦点光スキャナを用いたレーザ共焦点顕微鏡においては、蛍光は励起光に比べて非常に微弱であるため、蛍光を測定する際にはノイズ源となるレーザ光を除去することが必要である。通常、光学フィルタや回折格子などの分光手段によって、レーザ光を波長領域で分離し、蛍光だけを取り出して、測定している。

しかし、このような従来のレーザ共焦点顕微鏡では、次のような課題があった。
すなわち、蛍光は励起用レーザ光の百万分の１のオーダーの微弱な信号強度であり、そのように微弱な蛍光を観察するためには、信号である蛍光とノイズである励起用レーザ光のＳＮ比を確保する必要がある。そのためには、例えばレーザ光阻止能力が高い分光用光学フィルタを用いる必要があり、また光学系には蛍光ノイズを発生しない物質を使う必要があった。
なお、このようなレーザ共焦点顕微鏡においては、試料に、励起光の照射により燐光を発する物質を標識しておき、その燐光を検出して試料を観測することもできるが、この場合も上記と同様の課題がある。

本発明の目的は、このような課題を解決するもので、燐光を検出して試料の観測を行うレーザ共焦点スキャナを用いたレーザ共焦点顕微鏡システムにおいて、燐光の特性を巧みに利用し、高いＳＮ比で燐光を検出することができるようにしたレーザ共焦点顕微鏡システムを提供することにある。

このような課題を達成するために、本発明のうち請求項１記載の発明は、
レーザ光を励起光としたニポウディスク型の共焦点スキャナを使用したレーザ共焦点顕微鏡システムにおいて、
前記レーザ光を所定の時間間隔でオン・オフして計測対象を繰返し照射し、
前記計測対象から放射された燐光が前記共焦点スキャナにより結像した共焦点画像を前記レーザ光の各オフ後に前記カメラで撮像し、レーザ光のオン・オフ毎に取得される画像に基づいて前記計測対象の動態を計測するように構成したことを特徴とする。
本発明は、レーザ光の照射が終った後も発光を続けるという燐光の特性を巧みに利用したもので、レーザ光のオフ後に燐光共焦点スキャナからの共焦点画像を計測することにより、レーザ光がノイズとして混入しない高ＳＮ比の画像を容易に得る。

この場合、請求項２のように、カメラとしては、請求項３のように、前記電子シャッタを有するＣＣＤカメラを使用し、前記レーザ光がオンの間は受光した光を捨て去り、レーザ光がオフの間だけ受光する燐光を検出するように構成することができる。
また、請求項３のように、前記レーザ光がオンの期間中はメカニカルシャッタにより前記カメラに光が入らないようにすることができる。このような構成にすると、さらにＳＮ比を向上させることができる。

また、請求項４のように、前記レーザ光のオフ時からカメラの画像蓄積開始時までの間に所定のディレイタイムを設ければ、イメージインテンシファイヤなどの燐光ノイズを容易に除去することができる。
また、前記メカニカルシャッタとして、請求項５のように、光の遮断と透過を繰り返す回転式のシャッタを使用することができ、さらに、請求項６のように、回転式シャッタの回転を、前記共焦点スキャナに使用のマイクロレンズディスクの回転と同期させると、レーザ光をマイクロレンズアレイの１回転の間に高速に複数回オン・オフさせることができる。

また、前記カメラとして、請求項７のように、多色の分光カメラを使用することができる。また、請求項８のように、前記カメラに代えて、前記燐光共焦点スキャナからの光を分光する分光器と、この分光器からの分光をそれぞれに検出する複数個のモノクロカメラを使用することもできる。このような構成によれば、空間的に同時分光でき、高速な画像取得が可能となる。

請求項９の発明は、
請求項１ないし８のいずれかに記載のレーザ共焦点顕微鏡システムにおいて、各部の動作を同期して制御する同期制御回路と、計測動作の制御や取得した画像の表示あるいは保存を行うことができるワークステーションを備えたことを特徴とする。
このような構成によれば、オペレータはワークステーションを操作して、計測動作の開始や、取得した画像の画面の表示あるいは保存を適宜指示して実行させることができる。

以上説明したことから明らかなように、本発明によれば、燐光を測定する際に、不要なレーザ光をシャッタで遮光すると共に燐光のみを透過させてカメラで検出するようにしたことにより、燐光だけをＳＮ比良く検出することができる。

以下図面を用いて本発明を詳しく説明する。本発明のレーザ共焦点顕微鏡では、励起光を照射している間だけ発光する性質を持つ蛍光を利用するのではなく、励起光を遮断した後も発光を続ける性質を有した燐光を利用して、試料観測を行う。そして、燐光測定時には不要な励起光がカメラに入らない構成として、高いＳＮ比で燐光を検出している。なお、燐光を活用した共焦点スキャナをここでは燐光共焦点スキャナと呼ぶ。

図１は本発明に係るレーザ共焦点顕微鏡システムの一実施例を示す構成図である。図において、２０は励起光としてのレーザ光を発生する半導体レーザ（単にレーザという）である。レーザ光の波長は例えば４０５ｎｍである。３０は半導体レーザ２０からのレーザ光が励起光として入射される燐光共焦点スキャナである。

燐光共焦点スキャナ３０の詳細を図２に示す。図２において、図１１に示す共焦点スキャナ部分と同等部分には同一符号を付し、その説明は省略する。図１１に示す共焦点スキャナと異なるところは高反射ミラー４ａである。高反射ミラー４ａは、励起光波長域と試料からの戻り光（ここでは燐光）の波長域の全波長域（これを測定波長域という）で、例えば９６％程度の、高い反射率を確保したミラーである。このような高反射ミラーは、例えば、本願出願人が提案した特願２００３−１３５５９１号「共焦点光スキャナ」に記載されている。
なお、高反射ミラー４ａに代えてダイクロイックミラーを使用しても構わない。

再び図１に戻って説明する。４０は試料４１を載置した落射型の光学顕微鏡であり、燐光共焦点スキャナ３０からの励起光が対物レンズ（図示せず）を経て試料４１に照射され、試料４１からの燐光が対物レンズを通って再び燐光共焦点スキャナ３０に戻るように構成されている。

５０は燐光共焦点スキャナ３０から出力される燐光を分光する分光器、６０はカメラ７０に入射される光を断続的に遮断できるように構成されたメカニカルシャッタである。カメラ７０は、電子シャッター機能を有し、燐光共焦点スキャナ３０からの燐光像を撮像することのできるカメラである。このカメラとしては例えばＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラが使用される。

８０は同期制御回路であり、各部の動作を同期して制御する。９０はレーザ２０の発光と停止を制御するレーザ制御回路である。１００はシステムの動作の操作やカメラ７０で取得した画像の画面表示や保存などを行う機能を有したワークステーションである。

このような構成における動作を、図３のタイムチャートを参照して、次に説明する。
同期制御回路８０の制御によりレーザ制御回路９０を駆動し、半導体レーザ２０からレーザ光を発生［以下オン（ＯＮ）という］させる。レーザは燐光共焦点スキャナ３０を通って顕微鏡４０に送られ、測定対象の試料４１を照射する。

その後レーザ光の発生を停止［以下オフ（ＯＦＦ）という］して、試料４１から放射される燐光を燐光共焦点スキャナ３０を経由してカメラ７０で受光する。燐光はレーザ光をＯＦＦした後もしばらくの間発光が続くので、画像を蓄積することによってＳＮ比を向上させることができる。なお、光学系の中に燐光を発生する部分が存在する場合は、ノイズ光となる燐光の影響を受けないため、画像の蓄積は、図示のようにレーザ光をＯＦＦにした後、タイムディレイｔ_ｄ時間の経過後に画像蓄積を開始するのが望ましい。
このようにノイズとなるレーザ光をＯＦＦした後に画像を取得するので、ノイズ光の影響を受けずに燐光だけを検出して観察することが可能となる。
なお、このような計測動作の開始や、取得した画像の保存あるいは表示などは、ワークステーション１００からの指示に基づいて行われる。

繰り返し動作を行う場合のより実際的な動作を図４のタイミングチャートに示す。なお、分光が不要な場合、およびメカニカルシャッタ６０を使用しない場合の動作について説明する。

図４において、レーザ光がＯＮしているときに受光したレーザ光を捨てるために、ＣＣＤカメラ７０のもつ電子シャッタ機能により、電子シャッタを開けて（ＯＮにして）ＣＣＤに蓄積されたレーザ光を捨て去る。電子シャッタは、レーザ光のＯＮの前にＯＮとなり、レーザ光がＯＦＦしてディレイタイムｔ_ｄ経過後に、閉じる（ＯＦＦになる）。
このディレイタイムｔ_ｄは、イメージインテンシファイヤなどを使用している場合にはそこで発生する燐光ノイズを除去するのに役立つ。
その後、引き続き電子シャッタをＯＮにして、燐光共焦点スキャナ３０を介して受光される燐光だけ受光して撮像する。
以上の動作の繰返しにより、試料内の動態を容易に観測することができる。

次は、メカニカルシャッタ６０を使用する場合の動作を、図５に示すタイムチャートを参照して次に説明する。レーザ光ＯＮの直前から、レーザ光ＯＦＦ後のディレイタイムｔ_ｄの終了までの間、メカニカルシャッタ６０を閉じ、カメラ７０への入射光を遮断する。その後引続いて、メカニカルシャッタ６０を開いて、カメラ７０にてＣＣＤに画像を蓄積する。メカニカルシャッタ６０を複数回ＯＮ／ＯＦＦする間、ＣＣＤへ連続蓄積する。すなわち、連続蓄積時間を、メカニカルシャッタ６０の開閉の周期よりも長くする。図５に示す場合は、メカニカルシャッタ６０の２サイクルの間連続蓄積している。
このような動作によれば、さらに燐光の受光量を増やしてＳＮ比を向上させることができる。

図６は図１の構成においてメカニカルシャッタ６０として回転シャッタ６０ａを用いた場合の構成例である。図６に示す回転シャッタ６０ａは、図７に示すように透過部６２と遮光部６３を交互に配置して形成された回転羽根６１を有する。この回転羽根６１をレーザ光のＯＮ／ＯＦＦに同期して高速で回転し、図８に示すように、レーザ光ＯＮのときは遮光部６３によりカメラ７０への入力を遮光し、レーザ光ＯＦＦのときにカメラ７０への燐光を透過する。

この場合、さらに、回転羽根６１の回転数と位相を、図２に示す燐光共焦点スキャナのマイクロレンズディスク２の回転数と位相に同期させると、レーザ光をマイクロレンズディスク２の１回転の間に複数回ＯＮ／ＯＦＦさせることができるようになり、
回転数／秒×（回転式シャッタの回転羽根の開口部の数）
の速さで高速にＯＮ／ＯＦＦさせることができる。
例えば、3000RPM（＝50Ｈｚ）でマイクロレンズディスク２が回転していて、開口部の数が６個である場合は、300回／秒のＯＮ／ＯＦＦ切換えが可能となる。

なお、本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。
例えば、上記実施例におけるカメラ７０として、図９に示すように、カラーの分光カメラ７０ａを使用してもよい。モノクロカメラ１台で分光を行うためには、カメラの前に分光器を設置して、時分割分光を行うことが必要であるが、図９に示すような分光が可能なカメラ（例えば、３板式カラーカメラ）を使用すれば、空間的に同時分光でき、高速な画像取得が可能である。
あるいはまた、図１０に示すような、空間的に分光を行う分光器７１の後にモノクロカメラ７２を必要な本数設置する構成としても、同様に空間的に同時分光でき、高速に画像を取得することができる。

本発明に係るレーザ共焦点顕微鏡システムの一実施例を示す構成図である。燐光共焦点スキャナの一実施例を示す構成図である。レーザ光オン・オフ制御とカメラ画像蓄積のタイミングを示すタイムチャートである。レーザ光オン・オフ制御と電子シャッタによるカメラ画像取得のタイミングを示すタイムチャートである。メカニカルシャッタ設置時のレーザ光オン・オフ制御とカメラ画像蓄積のタイミングを示すタイムチャートである。本発明の他の実施例を示す構成図である。回転シャッタの回転羽根の一実施例図である。回転シャッタのタイミングを示すタイムチャートである。本発明のさらに他の実施例を示す構成図である。本発明のさらに他の実施例を示す構成図である。従来の共焦点光スキャナの原理的構成図である。

符号の説明

１レーザ光
２マイクロレンズディスク
３マイクロレンズ
４ａ高反射ミラー
５ピンホールディスク
６ピンホール
７対物レンズ
９リレーレンズ
１１部材
２０レーザ
３０燐光共焦点スキャナ
４０顕微鏡
４１試料
５０分光器
６０メカニカルシャッタ
６０ａ回転シャッタ
６１回転羽根
６２透過部
６３遮光部
７０カメラ
７０ａ分光カメラ
７１分光器
７２モノクロカメラ
８０同期制御回路
９０レーザ制御回路
１００ワークステーション

Claims

レーザ光を励起光としたニポウディスク型の共焦点スキャナを使用したレーザ共焦点顕微鏡システムにおいて、
前記レーザ光を所定の時間間隔でオン・オフして計測対象を繰返し照射し、
前記計測対象から放射された燐光が前記共焦点スキャナにより結像した共焦点画像を前記レーザ光の各オフ後に前記カメラで撮像し、レーザ光のオン・オフ毎に取得される画像に基づいて前記計測対象の動態を計測するように構成したことを特徴とするレーザ共焦点顕微鏡システム。
前記カメラとして、電子シャッタを有するＣＣＤカメラを使用し、前記レーザ光がオンの間は受光した光を捨て去り、レーザ光がオフの間だけ受光する燐光を検出するように構成したことを特徴とする請求項１に記載のレーザ共焦点顕微鏡システム。
前記レーザ光がオンの期間中はメカニカルシャッタにより前記カメラに光が入らないようにしたことを特徴とする請求項１または２に記載のレーザ共焦点顕微鏡システム。
前記レーザ光のオフ時からカメラの画像蓄積開始時までの間に所定のディレイタイムを設け、燐光ノイズの影響を受けないように構成したことを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載のレーザ共焦点顕微鏡システム。
前記メカニカルシャッタとして、光の遮断と透過を繰り返す回転式のシャッタを使用したことを特徴とする請求項３または４に記載のレーザ共焦点顕微鏡システム。
前記回転式シャッタの回転を、前記共焦点スキャナに使用のマイクロレンズディスクの回転と同期するように構成したことを特徴とする請求項５に記載のレーザ共焦点顕微鏡システム。
前記カメラとして、多色の分光カメラを使用したことを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載のレーザ共焦点顕微鏡システム。
前記カメラに代えて、前記燐光共焦点スキャナからの光を分光する分光器と、この分光器からの分光をそれぞれに検出する複数個のモノクロカメラを使用したことを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載のレーザ共焦点顕微鏡システム。
各部の動作を同期して制御する同期制御回路と、計測動作の制御や取得した画像の表示あるいは保存を行うことができるワークステーションを備えたことを特徴とする請求項１ないし８のいずれかに記載のレーザ共焦点顕微鏡システム。