JPS61140843A - 微生物検査方法 - Google Patents
微生物検査方法Info
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- JPS61140843A JPS61140843A JP26350784A JP26350784A JPS61140843A JP S61140843 A JPS61140843 A JP S61140843A JP 26350784 A JP26350784 A JP 26350784A JP 26350784 A JP26350784 A JP 26350784A JP S61140843 A JPS61140843 A JP S61140843A
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- microorganisms
- time
- excitation light
- intensity
- fluorescent
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
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- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
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- Immunology (AREA)
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- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の利用分野〕
本発明は微生物検査方法に係り、特に病院の臨床検査部
門におし）５て迅速な微生物の定量を行うことができる
微生物検査方法に関する。
門におし）５て迅速な微生物の定量を行うことができる
微生物検査方法に関する。
従来微生物検査方法として検体中に含まれる微生物の数
を吸光光度法によって測定する従来例が存在する。この
吸光光度法による微生物の検査方法では微生物の検出感
度が１０６〜１０’ＣＦＵ／ ｍｌであることは知られ
ておシ、測定にあたっては最低１．５Ｘ１０８ＣＦＵ／
ｍｌの菌液／ｍｌ（測定開始時の菌濃度として２〜４
Ｘ １０’ ｃＦＵ／ｍ７りを必要とする。
を吸光光度法によって測定する従来例が存在する。この
吸光光度法による微生物の検査方法では微生物の検出感
度が１０６〜１０’ＣＦＵ／ ｍｌであることは知られ
ておシ、測定にあたっては最低１．５Ｘ１０８ＣＦＵ／
ｍｌの菌液／ｍｌ（測定開始時の菌濃度として２〜４
Ｘ １０’ ｃＦＵ／ｍ７りを必要とする。
しかしながら、微生物、特に菌種によっては分離培地上
の発育が遅く、このような多量の菌を釣菌することが困
難なものが多い。例えば、普通寒天の分離培地上で２４
時培養した場合大腸菌などは１．コロニーより１０７〜
１０’ＣＦＵの釣菌が可能であるが、表皮ブドウ球菌、
化膿連鎖球菌では１０６前後の釣菌しかできない。
の発育が遅く、このような多量の菌を釣菌することが困
難なものが多い。例えば、普通寒天の分離培地上で２４
時培養した場合大腸菌などは１．コロニーより１０７〜
１０’ＣＦＵの釣菌が可能であるが、表皮ブドウ球菌、
化膿連鎖球菌では１０６前後の釣菌しかできない。
このような場合、分離培地上のコロニーが十分発育する
までさらに２４〜３６時間培養を続けるが、釣菌した後
に液体培地がどで２４時間以上純、粋培誉する必要があ
る。従って、微生物の菌数を迅速に測定する必要がある
場合にはそのまま応用できないという問題がある。
までさらに２４〜３６時間培養を続けるが、釣菌した後
に液体培地がどで２４時間以上純、粋培誉する必要があ
る。従って、微生物の菌数を迅速に測定する必要がある
場合にはそのまま応用できないという問題がある。
上記吸光光度法より高感度な微生物検査方法として散乱
強歴を用いる方法がある。この方法は特開昭５７−１３
２８９９号において明らかにされているように、ウンベ
リフェロン誘導体を蛍光マーカーとする雑菌数の測定で
ある。ウンベリフェロン誘導体はそれ自身は発光性が小
さいものであるが菌体内酵素（エステラーゼ）によって
加水分解されると蛍光性のウンベリフェロンを遊離する
ため、菌数濃度と比例する蛍光強度を測定することによ
って菌数を決定することができる。しかし、この散乱強
度を用いる従来例では１０’ＣＦＵ／ｍｌの大腸菌の増
殖曲線より、増殖が明確に判定できるのは４〜５時間後
である。すなわち、１ｏフＣＰＵ／ａｔと１０’ＣＦＵ
／ｍｌの増殖曲線の上昇は２〜３時間、１０１１ＣＦＵ
／ｍｌでは３〜４時間、１０’ ＣＰＵ／ｍｌでは４〜
５時間であり、このことはこの従来例の検出感度が１０
’ＣＦＵ／ｍｌであることを示している。このように期
待する程の高感度にならない原因として、励起光を照射
したままつ／ベリフエロンの蛍光強度を測定しているた
めに菌体自身による励起光の散乱ノイズが太きいととに
よるものと考えられる。
強歴を用いる方法がある。この方法は特開昭５７−１３
２８９９号において明らかにされているように、ウンベ
リフェロン誘導体を蛍光マーカーとする雑菌数の測定で
ある。ウンベリフェロン誘導体はそれ自身は発光性が小
さいものであるが菌体内酵素（エステラーゼ）によって
加水分解されると蛍光性のウンベリフェロンを遊離する
ため、菌数濃度と比例する蛍光強度を測定することによ
って菌数を決定することができる。しかし、この散乱強
度を用いる従来例では１０’ＣＦＵ／ｍｌの大腸菌の増
殖曲線より、増殖が明確に判定できるのは４〜５時間後
である。すなわち、１ｏフＣＰＵ／ａｔと１０’ＣＦＵ
／ｍｌの増殖曲線の上昇は２〜３時間、１０１１ＣＦＵ
／ｍｌでは３〜４時間、１０’ ＣＰＵ／ｍｌでは４〜
５時間であり、このことはこの従来例の検出感度が１０
’ＣＦＵ／ｍｌであることを示している。このように期
待する程の高感度にならない原因として、励起光を照射
したままつ／ベリフエロンの蛍光強度を測定しているた
めに菌体自身による励起光の散乱ノイズが太きいととに
よるものと考えられる。
従って、上記特開昭５７−１３２８９９号で明らかにさ
れた従来例の前記の吸光度広＃＃雰従泉桝と同様に迅速
に微生物の菌数の測定を行うことができないという問題
点がある。
れた従来例の前記の吸光度広＃＃雰従泉桝と同様に迅速
に微生物の菌数の測定を行うことができないという問題
点がある。
上記の従来例と同様のウンベリフェロン誘導体を用いる
従来例として特開昭５７−１４４９９５号に明らかにさ
れているように、蛍光強度測定の直前に菌体その他の固
型物を遠心分離によって除去し、１０３〜１０’ ＣＦ
Ｕ／ｍｌの菌数を測定できるようにした従来例が存在す
る。この従来例では感度がよいために測定に要するスタ
ート菌数に少なくてすむことになる。しかし、遠心分離
操作を必要とする点において微生物の数の迅速な測定と
いう点からは望ましいものとは言えない。
従来例として特開昭５７−１４４９９５号に明らかにさ
れているように、蛍光強度測定の直前に菌体その他の固
型物を遠心分離によって除去し、１０３〜１０’ ＣＦ
Ｕ／ｍｌの菌数を測定できるようにした従来例が存在す
る。この従来例では感度がよいために測定に要するスタ
ート菌数に少なくてすむことになる。しかし、遠心分離
操作を必要とする点において微生物の数の迅速な測定と
いう点からは望ましいものとは言えない。
また、特開昭５８−１７５９８号において明らかにされ
ているように細菌をトルエンなどの消化剤で処理した後
、ウンベリフェロンの蛍光強度を測定する従来例が存在
する。この従来例ではトルエンによって菌体膜が破壊さ
れ耐体内に含まれるエステラーゼが十分につ／ベリフェ
ロン誘導体を加水分解することができるために、１０３
〜１０’ＣＦＵ／ｍｌの菌の測定が可能となっている。
ているように細菌をトルエンなどの消化剤で処理した後
、ウンベリフェロンの蛍光強度を測定する従来例が存在
する。この従来例ではトルエンによって菌体膜が破壊さ
れ耐体内に含まれるエステラーゼが十分につ／ベリフェ
ロン誘導体を加水分解することができるために、１０３
〜１０’ＣＦＵ／ｍｌの菌の測定が可能となっている。
しかし、この従来では菌目体を溶菌してしまうものであ
るために、薬剤感受性試験のように経時的に増殖曲線を
観察する必要のある場合にはそのまま適用できないとい
う問題点がある。
るために、薬剤感受性試験のように経時的に増殖曲線を
観察する必要のある場合にはそのまま適用できないとい
う問題点がある。
さらに、特開昭５８−１１６７ＱＯ号において明らかに
されているようにバーオキシダーデとパラハイドロキシ
フェニルボロピオン酸を用いて１０” 〜１０’ ＣＦ
Ｕ／ｍｌの感度で微生物の菌数の測定を行う酵素蛍光法
が開示されている。しかし、この従来例も遠心分離操作
を必要とするものであるために、迅速に微生物の菌数の
検査を行おうとする測定方法にはそのまま応用できない
という問題点がある。
されているようにバーオキシダーデとパラハイドロキシ
フェニルボロピオン酸を用いて１０” 〜１０’ ＣＦ
Ｕ／ｍｌの感度で微生物の菌数の測定を行う酵素蛍光法
が開示されている。しかし、この従来例も遠心分離操作
を必要とするものであるために、迅速に微生物の菌数の
検査を行おうとする測定方法にはそのまま応用できない
という問題点がある。
以上説明したように各種の微生物検査方法が存在するが
、これらの検査方法は特に病院などの臨床検査部門での
薬剤感受性検査のように少ないスタート菌数で微生物の
増殖曲線を迅速に得ようとする分野ではそのまま応用す
ることができない。
、これらの検査方法は特に病院などの臨床検査部門での
薬剤感受性検査のように少ないスタート菌数で微生物の
増殖曲線を迅速に得ようとする分野ではそのまま応用す
ることができない。
すなわち、薬剤感受性試験の迅速化のためには１０’Ｃ
ＦＵ程度の菌数、言いかえれば１０’ＣＦ Ｕ ／ ｍ
ｌ程度のスタート菌数で、測定を開始できるかどうかが
重要なポイントである。そのために１１１０” 〜１０
’ ＣＦＵ／Ｉｎｔの菌を検出できる高感度Ｑ−微生物
検査方法が必要となる０また１遠心分離等の操作を要す
る微生物検査方法では、その遠心分離に要する時間によ
って検査の迅速性が妨げられ、またトルエンなどによっ
て菌体膜を破壊する微生物検査方法では微生物の増殖曲
線が描けないものである。
ＦＵ程度の菌数、言いかえれば１０’ＣＦ Ｕ ／ ｍ
ｌ程度のスタート菌数で、測定を開始できるかどうかが
重要なポイントである。そのために１１１０” 〜１０
’ ＣＦＵ／Ｉｎｔの菌を検出できる高感度Ｑ−微生物
検査方法が必要となる０また１遠心分離等の操作を要す
る微生物検査方法では、その遠心分離に要する時間によ
って検査の迅速性が妨げられ、またトルエンなどによっ
て菌体膜を破壊する微生物検査方法では微生物の増殖曲
線が描けないものである。
本発明の目的は、遠心分離などの複雑な操作を必要とせ
ず、しかも溶菌することなく １０’ＣＦＵ／ｍｌ程度
の微生物の数を測定できる高感度な徴生物鉤罎方法を提
供することにある。
ず、しかも溶菌することなく １０’ＣＦＵ／ｍｌ程度
の微生物の数を測定できる高感度な徴生物鉤罎方法を提
供することにある。
本発明者りは迅速で、精度がよい微生物検査方法につい
て種々の検討を行った結果、微生物を含む検体に励起光
を所定時間照射して、励起光の出力を０にしたときに蛍
光物質の蛍光強度を計ることによって微生物の励起光に
基づく光散乱ノイズを除去して微生物の検査を行えると
いう知見を得るに至った。すなわち、微生物が含まれる
検体に照射される励起光の出力を切った後は、その励起
光の時間に伴う減衰は蛍光の時間に伴う減衰より大きな
ものとなる。従って、励起光の光散乱ノイズが蛍光の強
度を測定するのに悪影響を与えない範囲まで励起光の散
乱ノイズの減衰をまって蛍光強度を測定するものである
。
て種々の検討を行った結果、微生物を含む検体に励起光
を所定時間照射して、励起光の出力を０にしたときに蛍
光物質の蛍光強度を計ることによって微生物の励起光に
基づく光散乱ノイズを除去して微生物の検査を行えると
いう知見を得るに至った。すなわち、微生物が含まれる
検体に照射される励起光の出力を切った後は、その励起
光の時間に伴う減衰は蛍光の時間に伴う減衰より大きな
ものとなる。従って、励起光の光散乱ノイズが蛍光の強
度を測定するのに悪影響を与えない範囲まで励起光の散
乱ノイズの減衰をまって蛍光強度を測定するものである
。
すなわち、本発明は検体中の微生物内の酵素等によって
被蛍光性から発蛍光性に変化する蛍光物質に励起光を照
射して、該励起光の照射によって発生する蛍光の強度を
測定することによシ前記微生物の数を測定する微生物検
査方法において、前記励起光を前記蛍光性となつ７・（
蛍光物質に所定時間、主にパルス状に照射した後、該励
起光の照射を停止し、該励起光の前記微生物による光散
乱ノイズが減衰することをまって蛍光強度を測定するこ
とを特徴とする微生物の検査方法である。
被蛍光性から発蛍光性に変化する蛍光物質に励起光を照
射して、該励起光の照射によって発生する蛍光の強度を
測定することによシ前記微生物の数を測定する微生物検
査方法において、前記励起光を前記蛍光性となつ７・（
蛍光物質に所定時間、主にパルス状に照射した後、該励
起光の照射を停止し、該励起光の前記微生物による光散
乱ノイズが減衰することをまって蛍光強度を測定するこ
とを特徴とする微生物の検査方法である。
上記本発明の構成において、励起光の散乱ノイズの減少
が十分な状態で蛍光強度を計るタイミング、すなわち励
起光の出力を切った後に蛍光強度を計るまでの時間は、
用いられる蛍光物質の性質によって決定される。短寿命
の蛍光線を放出する蛍光物質であるウンベリフェロン誘
導体を用いた場合は蛍光強度の測定のタイミングは極め
て短かい時間すなわちナノ秒単位で決定されるものであ
るのに対し、長寿命の蛍光線を放出する蛍光物質である
エオシン誘導体では測定のタイミングが数ミリ秒単位で
決定される。
が十分な状態で蛍光強度を計るタイミング、すなわち励
起光の出力を切った後に蛍光強度を計るまでの時間は、
用いられる蛍光物質の性質によって決定される。短寿命
の蛍光線を放出する蛍光物質であるウンベリフェロン誘
導体を用いた場合は蛍光強度の測定のタイミングは極め
て短かい時間すなわちナノ秒単位で決定されるものであ
るのに対し、長寿命の蛍光線を放出する蛍光物質である
エオシン誘導体では測定のタイミングが数ミリ秒単位で
決定される。
ナノ秒単位の微生物の検査方法の原理は第５図に示すよ
うにパルス状に検体に照射される励起光（Ａ）を時間Ｔ
１で検体に照射し時間Ｔ２でその照射を終了させる。す
ると微生物菌体による散乱ノイズげ（Ｂ）の曲線のよう
に強度減衰するのに対し、ウンベリフェロン誘導体の蛍
光強度は（Ｃ）のように散乱ノイズの減衰率に比べてゆ
るやかな減衰率で減少する。従って、時間Ｔ３のように
散乱ノイズの減少がほぼ０となる一方で、最も蛍光強度
が高い時間Ｔ３に達した後蛍光強度の測定を行って検体
中の微生物の計数を行うことができる。
うにパルス状に検体に照射される励起光（Ａ）を時間Ｔ
１で検体に照射し時間Ｔ２でその照射を終了させる。す
ると微生物菌体による散乱ノイズげ（Ｂ）の曲線のよう
に強度減衰するのに対し、ウンベリフェロン誘導体の蛍
光強度は（Ｃ）のように散乱ノイズの減衰率に比べてゆ
るやかな減衰率で減少する。従って、時間Ｔ３のように
散乱ノイズの減少がほぼ０となる一方で、最も蛍光強度
が高い時間Ｔ３に達した後蛍光強度の測定を行って検体
中の微生物の計数を行うことができる。
微生物の計数に予め標準試料で検量線を作成することに
よって、測定の結果水められた蛍光強度から微生物の菌
数を測定することができる。この測定方法では時間Ｔ２
から時間Ｔｓ ｔでの時間がナノ秒単位すなわち数ナノ
秒単位であるために、蛍光強度を検出する検出器として
はできるだけ応答性の早い光電子倍増管を用いることが
必要である。
よって、測定の結果水められた蛍光強度から微生物の菌
数を測定することができる。この測定方法では時間Ｔ２
から時間Ｔｓ ｔでの時間がナノ秒単位すなわち数ナノ
秒単位であるために、蛍光強度を検出する検出器として
はできるだけ応答性の早い光電子倍増管を用いることが
必要である。
従って、装置の構成は非常に複雑となシー・般に病院の
臨床検査部門のルーチンの検査にはそのまま適用できな
い。このようなルーチンの検査には次に説明するエオシ
ン誘導体を用いたミリ秒単位での微生物検査方法を用い
ることによって精度良く行うことができる。
臨床検査部門のルーチンの検査にはそのまま適用できな
い。このようなルーチンの検査には次に説明するエオシ
ン誘導体を用いたミリ秒単位での微生物検査方法を用い
ることによって精度良く行うことができる。
ｆｑ）
次にエオシン誘導体を用いた微生物の検査方法の原理は
第１図に示すように時間Ｔ１に検体へ励起光の照射を開
始し、その通常５００ｍ５＋ｅｔＸ後である時間Ｔ２に
その照射を終了させる。すると時間に従って散乱光（Ｂ
）及び蛍光は強度の減衰を始め時間Ｔ２の通常はぼ２７
０μ淵ｉ後に散乱光の強度ＦｉＯとなるが、時間Ｔ３で
蛍光強度（Ｃ）はほぼ十分な強度を保っている。従って
、蛍光強度の最も高い時間Ｔ３で蛍光強度の測定を行え
ば十分に精度良く微生物の計数を行うことができる。こ
のエオシン誘導体を用いた微生物の検査方法では測定の
時間的な単位がミリ秒単位となるために、蛍光の検出器
としては通常使用されるものを用いることができる。そ
して、蛍光強度からの微生物の計数の演算も十分に行う
ことができるために、微生物の係数の検査方法としては
迅速でかつ精度のよいものとなっている。なお、第１図
において、蛍光強度曲線（Ｃ）は全強度曲線から、エオ
シン誘導体を含まない標準試料の散乱強度（Ｂ）を引く
ことによって求められる。
第１図に示すように時間Ｔ１に検体へ励起光の照射を開
始し、その通常５００ｍ５＋ｅｔＸ後である時間Ｔ２に
その照射を終了させる。すると時間に従って散乱光（Ｂ
）及び蛍光は強度の減衰を始め時間Ｔ２の通常はぼ２７
０μ淵ｉ後に散乱光の強度ＦｉＯとなるが、時間Ｔ３で
蛍光強度（Ｃ）はほぼ十分な強度を保っている。従って
、蛍光強度の最も高い時間Ｔ３で蛍光強度の測定を行え
ば十分に精度良く微生物の計数を行うことができる。こ
のエオシン誘導体を用いた微生物の検査方法では測定の
時間的な単位がミリ秒単位となるために、蛍光の検出器
としては通常使用されるものを用いることができる。そ
して、蛍光強度からの微生物の計数の演算も十分に行う
ことができるために、微生物の係数の検査方法としては
迅速でかつ精度のよいものとなっている。なお、第１図
において、蛍光強度曲線（Ｃ）は全強度曲線から、エオ
シン誘導体を含まない標準試料の散乱強度（Ｂ）を引く
ことによって求められる。
本発明に用いられる励起光の発生手段としてはパルス放
電管やチョッピング機能を付加したレーザー光源等を使
用することができ、また、シャッタを用いてパルス状の
励起光を照射することもできる。
電管やチョッピング機能を付加したレーザー光源等を使
用することができ、また、シャッタを用いてパルス状の
励起光を照射することもできる。
本発明に用いられるエオシン誘導体にはエオシンジアセ
テー） （Ｅｏｓｉｎｄｉ Ａｃｅｔａｔｅ）、５−イ
ソチオシアナートエオシンジアセテート（５−Ｉｓｏｔ
ｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ＥｏｓｉｎｄｉＡｃｅｔａｔｅ
） 、５−マレイミドエオシンジアセテート（５−Ｍ
ａｌｅｉｍｉｄＥｏｓｉｎ ｄｉ Ａｃｅｔａｔｅ ）
、ｘオシンージーβ−ｄガラクトシド（、［；：ｏｓ
ｉｎｄｉ−β−ｄ−Ｑａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）、エオシ
ン−ジーβ−ｄ−グルコシド（Ｅｏｓｉｎ ｄｉ−β−
ｄ−Ｑｌｕｃｏｓｉｄｅ ）などが有効である。これら
のエオシン誘導体はすべてそれ自身力相ト蛍光性であり
、細菌の酵素によって加水分解され蛍光性となる。しか
も、その蛍光寿命ハミリ秒のオーダである。
テー） （Ｅｏｓｉｎｄｉ Ａｃｅｔａｔｅ）、５−イ
ソチオシアナートエオシンジアセテート（５−Ｉｓｏｔ
ｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ＥｏｓｉｎｄｉＡｃｅｔａｔｅ
） 、５−マレイミドエオシンジアセテート（５−Ｍ
ａｌｅｉｍｉｄＥｏｓｉｎ ｄｉ Ａｃｅｔａｔｅ ）
、ｘオシンージーβ−ｄガラクトシド（、［；：ｏｓ
ｉｎｄｉ−β−ｄ−Ｑａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）、エオシ
ン−ジーβ−ｄ−グルコシド（Ｅｏｓｉｎ ｄｉ−β−
ｄ−Ｑｌｕｃｏｓｉｄｅ ）などが有効である。これら
のエオシン誘導体はすべてそれ自身力相ト蛍光性であり
、細菌の酵素によって加水分解され蛍光性となる。しか
も、その蛍光寿命ハミリ秒のオーダである。
一方ミリ秒のオーダであれば、通常のハロゲンランプな
どの光軸を単純な機械的シャッタで開閉することによっ
てパルス光源の代用とすることが可能となる。
どの光軸を単純な機械的シャッタで開閉することによっ
てパルス光源の代用とすることが可能となる。
通常市販されているシリコン光半導体でもその９０％応
答速度は数μ〜数十μ秒であり、ミリ秒オーダの蛍光寿
命をもつ蛍光の測定には十分な応答速度を有するもので
ある。
答速度は数μ〜数十μ秒であり、ミリ秒オーダの蛍光寿
命をもつ蛍光の測定には十分な応答速度を有するもので
ある。
次に本発明に係る微生物検査方法の実施例について添付
図面に従って詳説する。
図面に従って詳説する。
第２図は、本発明に係る微生物検査方法を実施すること
ができる装置の一実施例を示す構成図である。
ができる装置の一実施例を示す構成図である。
図において、光源ランプ１（沃素タングステンランプ、
３０Ｗ）より発した励起光は集光レンズ２、干渉フィル
タ３、入射側シャッタ４を介して微生物が含まれている
被測定液を保持する透光性の反応容器５に照射される。
３０Ｗ）より発した励起光は集光レンズ２、干渉フィル
タ３、入射側シャッタ４を介して微生物が含まれている
被測定液を保持する透光性の反応容器５に照射される。
反応容器５からの出射光は出射側シャッタ６、干渉フィ
ルタ７、集光レンズ８を介して半導体検知器または光電
子倍増管９で検知される。検知された信号はプレアンプ
１０で増幅された後、Ａ／Ｄ変換器１１でＡ／Ｄ変換が
なされ、そのデータがマイクロコンピュータ１２に記憶
される。マイクロコンピュータ１２では予め記憶された
標準試料の検量線と比較して非測定液中の微生物の係数
を行う。
ルタ７、集光レンズ８を介して半導体検知器または光電
子倍増管９で検知される。検知された信号はプレアンプ
１０で増幅された後、Ａ／Ｄ変換器１１でＡ／Ｄ変換が
なされ、そのデータがマイクロコンピュータ１２に記憶
される。マイクロコンピュータ１２では予め記憶された
標準試料の検量線と比較して非測定液中の微生物の係数
を行う。
上記の微生物検査装置入射側シャッタ４および出射側シ
ャッタ６はそれぞれ第３図（Ａ）、（Ｂ）に示すように
回転式のシャッタとなっている。このシャッタは半円形
状のものであシ入射側シャッタ４と出射側シャッタは第
４図に示すように励起光の入射時に生ずる散乱光ノイズ
を防止するために、入射側シャッタと出射側シャッタの
開閉パターンは５０ＩＯｍｓαを毎に反応となるように
なっている。なお、比較的応答速度の早い検知器を用い
る場合には、出射側シャック６は省略することができる
。Ａ／ＤＩ換のタイミングは入射光（励起光）がシャッ
トされて出射孔がオープンされてから２５０μ灘１〜２
７０μ護・である。このため、検出器の応答遅れによる
散乱光ノイズの成分は完全に除去できることになる。
ャッタ６はそれぞれ第３図（Ａ）、（Ｂ）に示すように
回転式のシャッタとなっている。このシャッタは半円形
状のものであシ入射側シャッタ４と出射側シャッタは第
４図に示すように励起光の入射時に生ずる散乱光ノイズ
を防止するために、入射側シャッタと出射側シャッタの
開閉パターンは５０ＩＯｍｓαを毎に反応となるように
なっている。なお、比較的応答速度の早い検知器を用い
る場合には、出射側シャック６は省略することができる
。Ａ／ＤＩ換のタイミングは入射光（励起光）がシャッ
トされて出射孔がオープンされてから２５０μ灘１〜２
７０μ護・である。このため、検出器の応答遅れによる
散乱光ノイズの成分は完全に除去できることになる。
上記微生物検査装置では反応容器５が各々測定されるべ
き蛍光物質を含む微生物培養液を保持する複数のもので
できており、それらが２秒ピッチで間欠的に光軸を垂直
に横切るように移送される。
き蛍光物質を含む微生物培養液を保持する複数のもので
できており、それらが２秒ピッチで間欠的に光軸を垂直
に横切るように移送される。
そして、各容器について１ｍ淵ｆのサイクルで１０００
回の測定（１秒間）が行われその平均値がマイクロコン
ピュータ１２に記憶される。さらに、各々の容器は２５
〜４０Ｃの適温の空気浴中でインキベートされ、３０分
間隔で光軸位置に達するように循環移送されるようにな
っている。従って、３０分たびの測定値が得られること
によυ微生物の増殖速度が測定できる。よって、本実施
例によって行われる微生物の検査方法は病院等の臨床検
査部門における薬剤感受性試験のように迅速性と高精度
性を有する試験に好ましく用いることができる。
回の測定（１秒間）が行われその平均値がマイクロコン
ピュータ１２に記憶される。さらに、各々の容器は２５
〜４０Ｃの適温の空気浴中でインキベートされ、３０分
間隔で光軸位置に達するように循環移送されるようにな
っている。従って、３０分たびの測定値が得られること
によυ微生物の増殖速度が測定できる。よって、本実施
例によって行われる微生物の検査方法は病院等の臨床検
査部門における薬剤感受性試験のように迅速性と高精度
性を有する試験に好ましく用いることができる。
本実施例での励起光による散乱光と蛍光の強度の減衰の
関係は、基本的に前述の第１図に示したグラフに同じで
ある。なお第１図に示す蛍光強度測定のタイミングすな
わちＴ２〜Ｔ３の時間間隔ｉｔ Ｏ’ ＣＦＵ／ｍ／の
大腸菌を含むＭ ｕ ｌ ｅ ｖ）（ｉｎｔｏｎ培地で
の実測値では２７０μお；である。
関係は、基本的に前述の第１図に示したグラフに同じで
ある。なお第１図に示す蛍光強度測定のタイミングすな
わちＴ２〜Ｔ３の時間間隔ｉｔ Ｏ’ ＣＦＵ／ｍ／の
大腸菌を含むＭ ｕ ｌ ｅ ｖ）（ｉｎｔｏｎ培地で
の実測値では２７０μお；である。
次に具体的な実験例について説明する。
く実−紳例１〉
１０−”ｍｏｔ／ｌのエオシンジアセテートを含有する
、Ｍ’ｕｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ培地中に大腸菌ＮＩＨＪ
−ＪＣ２を各々ｌＸｌ０” （Ａ）、ｌＸｌ０”（Ｂ
）、ｌＸｌ０’ （Ｃ）、ｌＸｌ０’ （Ｄ）、ｌ
Ｘ１０’ （Ｅ）ＣＰＵ／ｍｔとなるように各々接種
した。そして（Ａ）〜（Ｅ）の各々について前述の第２
図に示す装置による微生物測定方法を用いて蛍光強度を
測定した。次に上記大腸菌が接（１されたＭ’ｕｌｅｙ
−１（ｉｎｔｏｎ培地を３７１ｒで１時間反応させた。
、Ｍ’ｕｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ培地中に大腸菌ＮＩＨＪ
−ＪＣ２を各々ｌＸｌ０” （Ａ）、ｌＸｌ０”（Ｂ
）、ｌＸｌ０’ （Ｃ）、ｌＸｌ０’ （Ｄ）、ｌ
Ｘ１０’ （Ｅ）ＣＰＵ／ｍｔとなるように各々接種
した。そして（Ａ）〜（Ｅ）の各々について前述の第２
図に示す装置による微生物測定方法を用いて蛍光強度を
測定した。次に上記大腸菌が接（１されたＭ’ｕｌｅｙ
−１（ｉｎｔｏｎ培地を３７１ｒで１時間反応させた。
この反応の精米大腸菌の増殖の性質によれば、測定時の
菌数は接種時の菌数のは理１０倍となっていることが知
られている。次に測定時の蛍光強度を、接種時の蛍光強
度測定と同様に行った。
菌数は接種時の菌数のは理１０倍となっていることが知
られている。次に測定時の蛍光強度を、接種時の蛍光強
度測定と同様に行った。
これらの１連の操作を各（Ａ）〜（Ｅ）に５回ついて行
い接種時の蛍光強度と１時間後の蛍光強度の相対強度を
各濃度毎に求めその平均を計算した。
い接種時の蛍光強度と１時間後の蛍光強度の相対強度を
各濃度毎に求めその平均を計算した。
その結果を第６図に示す。第６図に示すように、接種時
の菌数が１０ＢＣＦＵ／ｍＪであってもその計数を行う
ことができるものである。
の菌数が１０ＢＣＦＵ／ｍＪであってもその計数を行う
ことができるものである。
く実験例２〉
滅菌した牛乳およびこれに１０３ＣＦＵ／ｍ７１！の濃
度になるように、実験例１と同じ大腸菌種を接種したも
の５０ｍ／！を、上記のエオシンジアセテート含有培地
７５０ｍ１と混合後３７１？で１時間培養を行った。そ
して、各々の蛍光強度を１０重測定した。結果を第１表
に示す。
度になるように、実験例１と同じ大腸菌種を接種したも
の５０ｍ／！を、上記のエオシンジアセテート含有培地
７５０ｍ１と混合後３７１？で１時間培養を行った。そ
して、各々の蛍光強度を１０重測定した。結果を第１表
に示す。
表１ 牛乳中の大腸菌測定結果
すなわち牛乳のような濁った食品中の１×１０ｓＣＦＵ
／Ｆｆｆ７！の大腸菌を有意に定量することが可能であ
る。
／Ｆｆｆ７！の大腸菌を有意に定量することが可能であ
る。
〈実麓例３〉
実験例１のエオシンジアセテートのＭ’ｕｌｅｒ−Ｈｉ
ｎｔｏｎ、培地にピリドンカルボン酸系抗菌剤のＮａ１
ｉｄｉｃ Ａｃ１ｄ （Ｎ Ａ ）を各々０．６２５
．１．２５゜２．５０μｇ／ｍｅを添加した感受性測定
用培地に上述の大腸菌種を１×１０３ＣＦＵ／ｍｌとな
るように接種した。そして、かかる培地を３７１？で培
養しながら第２図で示す微生物の測定方法と従来の技術
で説明した普通の吸光度法（６００μｍでの吸光度）の
両方の測定を行った。その結果を第７図に示す。第７図
にお１／−１て、吸光度法による測定結果は（Ａ）に示
すものであシ、本発明に係る微生物検査方法によるもの
Ｈ（Ｂ）に示すものである。グラフは横軸の時間の経過
に伴う、接種時と１時間後の測定結果の相対強度縦軸の
変動を示している。
ｎｔｏｎ、培地にピリドンカルボン酸系抗菌剤のＮａ１
ｉｄｉｃ Ａｃ１ｄ （Ｎ Ａ ）を各々０．６２５
．１．２５゜２．５０μｇ／ｍｅを添加した感受性測定
用培地に上述の大腸菌種を１×１０３ＣＦＵ／ｍｌとな
るように接種した。そして、かかる培地を３７１？で培
養しながら第２図で示す微生物の測定方法と従来の技術
で説明した普通の吸光度法（６００μｍでの吸光度）の
両方の測定を行った。その結果を第７図に示す。第７図
にお１／−１て、吸光度法による測定結果は（Ａ）に示
すものであシ、本発明に係る微生物検査方法によるもの
Ｈ（Ｂ）に示すものである。グラフは横軸の時間の経過
に伴う、接種時と１時間後の測定結果の相対強度縦軸の
変動を示している。
第７図によれば、従来の吸光度法では７〜８時（］７）
間位Ｍ’ＩＣが２．５０μｇ／ｍｌであると判定できる
のに対して、本発明に係る微生物検査方法では１〜２時
間で同様の結果を得ることができる。また、分裂速度の
遅い細菌では従来の吸光度法を用いた測定では１晩以上
の純培養を必要とするに対して、本発明に係る微生物検
査方法では、例え分裂速度の遅い細菌であっても迅速に
微生物の検査を行うことができる。
のに対して、本発明に係る微生物検査方法では１〜２時
間で同様の結果を得ることができる。また、分裂速度の
遅い細菌では従来の吸光度法を用いた測定では１晩以上
の純培養を必要とするに対して、本発明に係る微生物検
査方法では、例え分裂速度の遅い細菌であっても迅速に
微生物の検査を行うことができる。
従って、第２図に用いた微生物検査方法を応用すれば１
０３ＣＦＵ／ｍＪのスタート菌数で、その細菌の数の測
定を行うことができるため、釣菌のための培養を完全に
省略することができる。よって、病院の臨床部門におけ
る薬剤感受性結果の報告が約１日分早くなり臨床上着し
い有効性を有する。
０３ＣＦＵ／ｍＪのスタート菌数で、その細菌の数の測
定を行うことができるため、釣菌のための培養を完全に
省略することができる。よって、病院の臨床部門におけ
る薬剤感受性結果の報告が約１日分早くなり臨床上着し
い有効性を有する。
また、尿のスクリーニング検査等に応用すれば約１時間
で陽性尿（１０’ ＣＦＵ／ｍ１以上）で、擬陽性（１
０３〜１０４ＣＦＵ／ｍｌ）、陰性（（１０’ ＣＦＵ
／ｍｌ以下）の判定が容易に行うことができる。
で陽性尿（１０’ ＣＦＵ／ｍ１以上）で、擬陽性（１
０３〜１０４ＣＦＵ／ｍｌ）、陰性（（１０’ ＣＦＵ
／ｍｌ以下）の判定が容易に行うことができる。
以上説明したように本発明に係る微生物検査方法によれ
ば、微生物数に比例した蛍光強度を、微生物体による励
起光の散乱ノイズの妨害を除去して測定することができ
る。従って、微生物の数の測定を迅速かつ精度よく行う
ことができる。
ば、微生物数に比例した蛍光強度を、微生物体による励
起光の散乱ノイズの妨害を除去して測定することができ
る。従って、微生物の数の測定を迅速かつ精度よく行う
ことができる。
第１図は本発明に係る微生物検査方法の原理を示す図、
第２図は本発明に係る微生物検査方法を実施するだめの
装置の構成図、第３図は第２図に示された検査装置のシ
ャッタを示す図、第４図は第３図のシャッタの開閉パタ
ーンを示すグラフ、第５図は短寿命の蛍光を発生する蛍
光物質を用いて微生物検査方法を行った場合の原理を示
すグラフ、第６図は細菌濃度と蛍光相対強度を示すグラ
フ、第７図（Ａ）は時間と吸光度における測定強度を示
すグラフ、第７図（Ｂ）は時間と蛍光相対強度を示すグ
ラフである。 １・・・光源ランプ、２・・・集光レンズ、３・・・緩
衝フィルタ、４・・・入射側シャッタ、５・・・反応容
器、６・・・出射側シャッタ、７・・・緩衝フィルタ、
８・・・集光レンズ、９・・・光電子倍増管、１０・・
・プレアンプ、１１・・・Ａ／Ｄ変ｍ器、１２・・・マ
イクロコンピュータ。
第２図は本発明に係る微生物検査方法を実施するだめの
装置の構成図、第３図は第２図に示された検査装置のシ
ャッタを示す図、第４図は第３図のシャッタの開閉パタ
ーンを示すグラフ、第５図は短寿命の蛍光を発生する蛍
光物質を用いて微生物検査方法を行った場合の原理を示
すグラフ、第６図は細菌濃度と蛍光相対強度を示すグラ
フ、第７図（Ａ）は時間と吸光度における測定強度を示
すグラフ、第７図（Ｂ）は時間と蛍光相対強度を示すグ
ラフである。 １・・・光源ランプ、２・・・集光レンズ、３・・・緩
衝フィルタ、４・・・入射側シャッタ、５・・・反応容
器、６・・・出射側シャッタ、７・・・緩衝フィルタ、
８・・・集光レンズ、９・・・光電子倍増管、１０・・
・プレアンプ、１１・・・Ａ／Ｄ変ｍ器、１２・・・マ
イクロコンピュータ。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、検体中の微生物によつて非発蛍光性から発蛍光性に
変化する蛍光物質に励起光を照射し、該励起光の照射に
よつて発生する蛍光の強度を測定することにより前記微
生物の数を測定する微生物検査方法において、前記励起
光を前記蛍光性の蛍光物質に所定時間照射した後、該励
起光の照射を停止し該励起光の前記微生物による散乱光
の強度が減衰した後に前記蛍光の強度を測定することを
特徴とする微生物検査方法。 ２、特許請求の範囲第Ｌ項記載の発明において、上記蛍
光物質がウンベリフエロン誘導体またはエオシン誘導体
であることを特徴とする微生物検査方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26350784A JPS61140843A (ja) | 1984-12-13 | 1984-12-13 | 微生物検査方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26350784A JPS61140843A (ja) | 1984-12-13 | 1984-12-13 | 微生物検査方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61140843A true JPS61140843A (ja) | 1986-06-27 |
Family
ID=17390485
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26350784A Pending JPS61140843A (ja) | 1984-12-13 | 1984-12-13 | 微生物検査方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61140843A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006091445A (ja) * | 2004-09-24 | 2006-04-06 | Yokogawa Electric Corp | レーザ共焦点顕微鏡システム |
| JP2008508526A (ja) * | 2004-07-29 | 2008-03-21 | イーストマン ケミカル カンパニー | 蛍光に基づく装置を用いた微生物の検出 |
| JP2010501867A (ja) * | 2006-09-01 | 2010-01-21 | エルヴェーオー ゲーエムベーハー | 水中の生存植物プランクトン細胞を検知するための方法及び装置 |
| JP2019078668A (ja) * | 2017-10-25 | 2019-05-23 | 株式会社トヨタプロダクションエンジニアリング | 応力発光測定システム、応力発光測定方法及び応力発光測定プログラム |
-
1984
- 1984-12-13 JP JP26350784A patent/JPS61140843A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008508526A (ja) * | 2004-07-29 | 2008-03-21 | イーストマン ケミカル カンパニー | 蛍光に基づく装置を用いた微生物の検出 |
| US8535937B2 (en) | 2004-07-29 | 2013-09-17 | Neogen Corporation | Detection of microorganisms with a fluorescence-based device |
| US9207180B2 (en) | 2004-07-29 | 2015-12-08 | Neogen Corporation | Detection of microorganisms with a fluorescence-based device |
| JP2006091445A (ja) * | 2004-09-24 | 2006-04-06 | Yokogawa Electric Corp | レーザ共焦点顕微鏡システム |
| JP4662123B2 (ja) * | 2004-09-24 | 2011-03-30 | 横河電機株式会社 | レーザ共焦点顕微鏡システム |
| JP2010501867A (ja) * | 2006-09-01 | 2010-01-21 | エルヴェーオー ゲーエムベーハー | 水中の生存植物プランクトン細胞を検知するための方法及び装置 |
| JP2019078668A (ja) * | 2017-10-25 | 2019-05-23 | 株式会社トヨタプロダクションエンジニアリング | 応力発光測定システム、応力発光測定方法及び応力発光測定プログラム |
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