JPS6353447A

JPS6353447A - 微生物の計数法

Info

Publication number: JPS6353447A
Application number: JP19840386A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiro Yamauchi; 山内　芳弘; Sotaro Kishi; 岸　聡太郎; Masao Karube; 征夫軽部
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1986-08-25
Filing date: 1986-08-25
Publication date: 1988-03-07
Also published as: JPH0588417B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）この発明は、種々の液体および気体の試料に含まれてい
る微生物の数を討よ１１する方法に関する。

（従来の技術）飲料水、ビール、清涼飲料水、廃水、空気などに含まれ
ている微生物の数を：ｔ　ｙｌｌ　１１ることは、製品
の品′ｉコ管理上、衛生保健−ヒ、また製造工程管理上
などで必要である。

例えば、出荷される生ビールは、その品質上、製品中に
酵母が残存してはならないとされている。

従って、製造工程において生ビール中から酵母が除去さ
れ、酵母を除去Ｊる７濾過操ｆ’ｌ’Ｅが完全に行なわ
れたかを確認するために、）１品ビール中の酊１」数を
計１１１する品質検査が出前前に１１なわれる。この品
ヱ１検査に必要な５１測箇（印は通常１リツトルあたり
○〜１００個程度と極めて少ない。

このように大量の試料中に非常に少ない数の微生物が含
まれている場合、直接検鏡法によ１〕で酵母を視野内に
捕捉することが困ガなために培養による計数法、１′な
りら、１８養によって酵母数を増して直接検鏡するある
いは培養によって生じたコロニー数を計数することから
なる方法が採られている。

（発明が解決しようとする問題点〉従来の培養による＝１数法で１よ、微生物の培養のため
に通常２／１〜４８時間という長い培養時間を要し、し
かし操作も煩雑である。このために、培養による計数法
を製造工程のモニタリングに使用することができず、ま
た、製品の出荷判定に使用するとその結果がでるまで長
時間製品出荷を待たなければならないという問題点があ
る。

他方、微生物、細胞Ｓを短時間で計数する方法として、
フローリイトメーターを利用ザる方法、Ｖなわら、蛍光
色素で処理された細胞等を含む試料を、細い流路を持つ
水晶製）１コーヂＡ・ンネル内に流し、レーＩアー光を
レンズによってフローチャンネルの試Ｆ′４．流上に焦
点を合せ、細胞等から放出された蛍光、散乱光を検知し
て計数する方法がある。しかしながら、この方法では１
リットル程度以上の大容量の試料を分析しようとづ゛る
と長時間を要し、ビールなどの発泡性の高い試料をこの
方法に供することが困ｎである。

この発明は上記の背型にもとずきなされたものであり、
その目的とするところは、水、ビール、清涼飲料水、空
気などの流体試料に：８薄に含む細胞、酵母、バクテリ
アなどの微生物を迅速に目数する方法を提供することで
ある。

（問題点を解決するための手段）本発明者は、培養によらない計数法を種々検討した結果
、試料をメンブランフィルタ−でン濾過し、ン戸別した
微生物を蛍光染料で染色し、これに光を照射すれば微生
物が蛍光を発し、その数を１１側できることに注目し、
更に検討して、照用光としてレーザー光を用いしかしレ
ーザー光のスポット径を絞ってフィルター面を走査すれ
ば、この発明の目的達成に有効であることを見い出しこ
の発ＩＵＪを完成するに到った。

すなわち、この発明による微生物の計数法は、微生物を
含有する流体試料をメンブランフィルタ−で涌過してそ
のフィルターに該微生物を捕捉し、メンブランフィルタ
−上の微生物を蛍光染料で処理して選択的に染色し、微
生物を捕捉したままのメンブランフィルタ−面を、好ま
しくは計数ずべき微生物の寸法と実質的に同程度のビー
ム径のレー十アー光で走査して微生物から蛍光を放出さ
せ、例えば、その蛍光を光電子僧侶管で選択的に受光し
て該蛍光を検知し、その検知信号から微生物の数を４１
数することからなるものである。

以下、この発明をより訂細に説明づ−る。

この発明の５１数法にＪ３い（、まず微生物を含有する
流体試１１’ｌをメンブランフィルタ−でγ濾過してメ
ンブランフィルタ−に該微生１力を捕捉づる。

この発明において用いられる流体試Ｒは、微生物を含む
液体よｔこ（よ気体（・あって、例えば、飲料水、廃水
、河川水、発酵酒、清涼飲料水、病院や精密ｒＪ１品製
造Ｔ場のクリーンルームの空気、処理水などがある。試
料に含よれる微生物が非常に少１−．い場合もしくは微
生物が過多である場合、必要に応じて試料を濃縮らしく
は箱釈してもよい。このメンブランフィルタ−は、計数
を目的とする微生物の寸法よりも小さい孔径を有するも
のである。

メンブランフィルタ−の材質、司法などは種々のものの
なかから適宜選択づ−ることができるが、そのようなも
のとしてポリカーボネート、ポリエチレン、アセチルセ
ルロースなどがある。フィルターによる試料のｉ濾過は
、外からの微生物の混入を防止づ−るように実施され、
この操作によってフィルターの孔径より小さい微生物、
その他の固形物、半流動物などがメンブランフィルタ−
上にｔｌｌｉ　１足される。例えば、平均刈払１０μｍ
の酵母を含む６３３ｍ１の生ビールを、孔径０．４５μ
ｍのポリカーボネート膜（直径４７Ｍ）で約１５分間吸
引）濾過して酵母をフィルター上に浦１足することがで
きる。

この発明においてメンブランフィルタ上の微生物が蛍光
染ねで処理されて選択的に染色される。

これは、フィルター上に捕捉した微生物を容易に選択検
出υ′るｌこめである。蛍光染料の処理は、メンブラン
フィルタ−上の微生物を失なわ＜ｒいように、フィルタ
ーへの蛍光染１３＋による浸漬、噴震、塗布などによっ
て行なう。この発明にＪ５いて用いることのできる蛍光
染料は、微生物を選択的に染色・標識するものであり、
そのようなものとして具体的には、ＤＮＡ結合性蛍光色
素、蛋白Ｓ１結合性蛍光色素などの蛍光？ｉ識試薬があ
り、例えば、プロビデイウム・イオダイド（ＰＩ）、フ
ルオレセインイソチオシアニン（Ｆ［ＴＣ）、テトラメ
チルローダミンイソヂオシ７ニン（ＲＩＴＣ）などがあ
る。これらは、標識対象の微生物の神類、レーザー光の
波長に応じて適宜選択づることが望ましい。試料が生ビ
ールである場合、ビール中の蛋白質がフィルター上に残
留すること、ＷＩＩ母以外の無償質の夾雑物もフィルタ
ー上に残留して紫外励起で自家蛍光を発すること、退色
の早い蛍光色素では後の計測の際に不都合であること等
の理由から、この発明の好ましい蛍光染料として、プロ
ビデイウム・イオダイドｃｐｒ＞、アクリジンオレンジ
、エチジウムブロマイドなどがある。通常、蛍光染料の
処理によってメンブランフィルタ−上の微生物が死滅し
、実質的に１００％の細胞が染色される。染色後、余分
の蛍光染料を除去し、洗浄、乾燥、フィルターをホルダ
ー、例えば２枚のガラス板で挟み込む固定などのＩｎ埋
をづる。

この発明にＪ３いて、微生物の計数は、微生物が固定さ
れたメンブランフィルタ−の表面をシー１Ｆ−光で走査
してこの微生物から蛍光を放ｑ１さｕｌこの放射された
蛍光を検知して行なう。この発明において用いられるレ
ーザー光は、蛍光染料が励起する波長などに応じて適宜
選択すべきであるが、そのようなものどして、アルゴン
レーボー、クリプトンレープ−１炭酸ガスレーザー、ガ
ラスレーナー、その他、液体レーザー、半導体レーザー
むどがある。レーザー光の照ｍは、この発明において、
全面照射もしくは広範囲魚介１ではなく、ビーム径を絞
ったシーチア−光でメンプランノイルター表面上を走査
して行なわれる。レーザー光のビーム径は、好ましくは
、計数しようとする微生物の寸法と実質的に同程度の大
きさである。より具体的には、ビーム径は微生物の平均
寸法のｉ　ｏｏ。

倍〜１／１０００倍、より好ましくは１００倍〜１／１
００倍、最も好ましく１は５倍〜１１５倍の大きさであ
る。走査速度は適宜変更することが望ましい。また、レ
ーザー光の強度等の照射パラメータも各々の条件に応じ
て適宜選択することができる。

レーザー光の照射により放射される蛍光は検知され、そ
の検知信号から微生物の数が計測される。

この発明の好ましい態様として、蛍光の検知１．ｔ、バ
ックグラウンド／〕いらの散乱光を例えばカットフィル
ターで１断し、蛍光を光電子増信管で選択的に受光して
行なう。この態様では、パルスなどの電気信号に変換さ
れた検知ｆ１号が記録ｔ１のグラフに記録され、グラフ
に示されたパルスの数を攻λて微生物を計数することが
できると共に、その検知信号をＡ／Ｄ変換器を介してマ
イクロコンビコータのインターフ【−スに送出し必要な
データ処理をコンピュータで行なつ′Ｃ黴生物の計数を
実施してもよい。

（作　用）上述のような構成を有するこの発明は、以下のように作
用する。

メンブランフィルタ−上に捕捉された微生物を蛍光染料
で選択染色する。この発明の特徴の一つは１．この染色
処理されたフィルターをレーザー光で走査照射して蛍光
を検知することである。この発明において用いられる、
位相のそろった一直線に進み広がりのないレーザー光は
、高エネルギーの光であると共に、単一波長の光である
ので、微小の蛍光で検出可能であり、しかも散乱光ど蛍
光との分前が容易である。従って、広いメンブランフィ
ルタ−による散乱光から微小な微生物による蛍光を検出
することをレーザー光の利用によって可能にする。メン
ブランフィルタ−上の広い面積を一様にレーザー光で照
（ト）すると、メンブランフィルタ−自身が発するバッ
クグラウンドの蛍光もあるので、高い信、０　（Ｓ　）
とノイズ＜Ｎ）との比、寸なわら高いＳ／Ｎ比を４ｊ’
ｌることができない。この発明においてシー１１−光の
照射は、ビーム径を絞ったレーザー光の走査によって行
なう。この走査照射中に、レーザー光ビームが微生物を
照射しているとぎ、微生物からのみ強い蛍光が発生し、
バックグラウンドから蛍光が発生せず微生物の蛍光に混
入しない。他方、レーザー光のビームが微生物から外れ
たどき、バックグラウンドから弱い蛍光が発生するだけ
である。従って、走査照射によって得られた分析結果は
、微生物の存在する箇所で強い蛍光を検知し、逆に微生
物が存在しない箇所で弱い蛍光のみを検知する。

（実施例）この発明を、図面を参照しつつ具体的な例によって説明
する。

調製例孔径０．４５μｍのポリカーボネート製メンブランフィ
ルタ−（直径４７Ｍ）を備えたｉ濾過装置で、外部から
微生物が混入しないように、１〜１００個の酵母（直径
１Ｑ　／ｌｒｎ　）が実験のために添加された６３３ｍ
１の生ビールを吸引６１過し、約１５分で完了した。

メンブランフィルタ−上に捕捉された微生物を染色する
ために、プロピディウムイオダイド（ＰＩ）の蛍光石′
ｔｊ、（Ｐ　ｌ　１〜５■／ρ−４，５％エタノール）
に上記のメンブランフィルタ−を１〜５分間浸漬した。

次いで、蛍光溶液からフィルターを引き出し、余分の液
を吸引ン濾過して除去した。

このフィルターを２枚のガラスに挟み、サンプルを調製
した。

装置例この発明の方法に使用することのできる装置例の概要図
を第１図に示す。

この装置は、アルゴンイオンレーザ−をＭ　ＤＪするレ
ーザー光源１ど、試料で必るメンブランフィルタ−４を
載置する試料用ＸＹテーブル５ど、レーザー光源１から
テーブル５へのレーザー光路中に設けられたスキャニン
グミラ−２および集光レンズ３と、試料からの蛍光を検
知する受光用光電子増倍管９と、光電子増倍管の前面に
設９ノられたカットフィルター７および集光レンズ８と
、ＸＹテーブル５を駆動するＸＹテーブル駆動装置６と
、光電子増倍管が検知した信号を記録する記録計１１と
、上記の各要素と接続し計数を制御する制御部１０とか
らなる。

次いでこの装置の動作を説明づ゛る。まず、ＸＹテーブ
ル５の上に試料のメンブランフィルタ−４を（δく。次
いで、レーザー光源１から照射されたレーザー光は、集
光レンズ３で試ｒ１フィルター４上に一定のビーム径℃
・集光される。レーザー光は、スキャニングミラ−２で
一定の周波数でＸ方向に振られるので、試料表面がＸ方
向へ走査される。

メンブランフィルタ−のうら特定の蛍光′１！艮の光の
みを、カットフィル’ｊ−７Ｊづよび集光レンズ８を通
しで光電子増倍管９で受光し、この光の強度を電気（１
号に変換づ−る。一方、Ｙｈ向へは、ＸＹテーブル駆動
装置６でＸＹテーブル５を機械的に送り、メンブランフ
ィルタ−４を移動させ、上記のＸ方向と同様に走査して
、メンブランフィルタ−全面を走査・受光づる。

制御部１０では、上記の各要素の動作、すなわら、ＸＹ
テーブル５の位置決め制御、スキャニングミラーの制御
、光源の制御、および光電子増倍管９からの信号を処理
して記録計１１にデータを送出する制御を行なう。

応用例調製例で得た試料を、装ご例の装置を用いて微生物の計
数を行なった。その結果の一部であるメンブランフィル
タ−からの典型的出力波形を第２図に示す。この図から
判かるように、バックグラウンド（Ｎ）に対しＳ／Ｎ比
の高いパルス状の検知信号（Ｓ）が得られた。また、計
数時間は短時間（約１０分以内）であった。なお、レー
ザー光として出力１０ｍＷのアルゴンレーザーを用い、
このビーム径は１０１．１ｍであった。

（発明の効果）この発明によって次の効果を奏づる。

（ａ）　　従来法のように２４〜４８時間を要する１８
養によらないので、１０分間以内の短時間で、微生物を
計数ザることができ、工程のモニタリング、製品の品で
１管理の検査を大幅に短縮することができる。

（ｂ）　　高いＳ／Ｎ比の測定を行なうことができるの
で、精度の高い微生物の計数を行なうことができ、また
、データ処理および自動化が容易となる。

（Ｃ）　　純水中の微生物の検出等のように微生物濃度
が低いために、従来は１ｇ養法にたよらざるを得なかっ
た分野でも応用が期待でき、さらに、固体レベルでの細
胞の解析等の試験研究の目的にも応用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の方法に用いることのでさる装置間の
概要図、第２図は微生物の５１数の出力波形を示す線図
である。１・・・レーザー光源、２・・・ミラー、３・・・集光
レンズ、４・・・試料、５・・・ＸＹテーブル、６・・
・×Ｙテーブル駆動装防、７・・・カットフィルター、
８・・・集光レンズ、９・・・光電子増イ８管、１０・
・・υ制御部、１１・・・記録計。

Claims

【特許請求の範囲】１、微生物を含有する流体試料をメンブランフィルター
でろ過してメンブランフィルターに該微生物を捕捉し、
メンブランフィルター上の微生物を蛍光染料で処理して
選択的に染色し、該微生物を固定したメンブランフィル
ター面をレーザー光で走査して微生物から蛍光を放出さ
せ、該蛍光を検知し、該検知信号から微生物を計数する
ことからなる微生物の計数法。２、放出された蛍光の検知が、光電子増倍管で選択的に
蛍光を受光して行なう特許請求の範囲第１項記載の計数
法。３、走査するレーザー光のビーム径が、計数すべき微生
物の寸法と実質的に同程度である、特許請求の範囲第１
項または第２項記載の計数法。