CN219951035U - 一种在线荧光细胞计数器 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种在线荧光细胞计数器，包括流路单元和光路单元，其中，流路单元包括第一细胞培养容器、第二细胞培养容器、缓冲瓶、染色瓶、多通选择阀、注射泵、换向阀、荧光流通池，第一细胞培养容器、第二细胞培养容器、缓冲瓶、染色瓶通过管路分别与多通选择阀上的不同端口连接，荧光流通池与换向阀连接，荧光流通池上分别设置有流通池入口、流通池出口，荧光流通池靠近流通池出口的一侧安装有可拆卸的筛板，材质为聚丙烯、聚四氟乙烯或不锈钢等生物惰性材料，注射泵上设有缓冲环，其吸取样品或清洗溶剂至荧光流通池内；光路单元包括聚焦透镜、光电池、第一透镜、第二透镜，聚焦透镜上设置有可移动滤光片。
Description
技术领域
本实用新型涉及细胞计数领域，特别是涉及一种在线荧光细胞计数器。
背景技术
细胞计数是生化、制药相关的细胞培养中，最常见的测试需求之一。基于区分培养液中的活细胞与死细胞，并对其分别计数的需求，多种荧光试剂被广泛应用。最常见的荧光染色体系是吖啶橙和溴化乙啶合用双染色。
现有的荧光细胞计数器，动态范围窄，不适合高浓度样品的分析；需要使用特异性荧光标记对样品进行前处理，且一般是手动操作；装置体积大，不适合原位测试。
实用新型内容
为了克服现有技术的不足，本实用新型提供一种在线荧光细胞计数器，可自动进行细胞洗涤、重悬、染色、孵育和动态调整浓缩或稀释倍数的在线采样装置，装置简单小巧可以原位工作的LED荧光检测部分，为细胞培养中宽动态范围(104～108cells/mL)的样本测定提供了便利的解决方案。
为解决上述技术问题，本实用新型提供如下技术方案：一种在线荧光细胞计数器，包括流路单元和光路单元，其中，所述流路单元包括第一细胞培养容器、第二细胞培养容器、缓冲瓶、染色瓶、多通选择阀、注射泵、换向阀、荧光流通池，所述第一细胞培养容器、第二细胞培养容器、缓冲瓶、染色瓶通过管路分别与多通选择阀上的不同端口连接，所述荧光流通池与换向阀连接，所述注射泵上设有缓冲环，其吸取样品或清洗溶剂至荧光流通池内；所述光路单元包括聚焦透镜、光电池、第一透镜、第二透镜，所述聚焦透镜上设置有可移动滤光片，所述第一透镜、第二透镜分别过滤不同的激发光信号；
进一步地，所述荧光流通池上分别设置有流通池入口、流通池出口，所述荧光流通池靠近流通池出口的一侧安装有可拆卸的筛板，对于常见的细胞直径(10-20μm)，所述筛板的孔径5μm，有效厚度0.5-1mm，材质为聚丙烯、聚四氟乙烯或不锈钢等生物惰性材料；
再进一步地，所述管路采用聚醚醚酮、聚四氟乙烯或者不锈钢管，其内径为0.5mm-10mm，外径为1/16英寸-1/2英寸；
再进一步地，所述多通选择阀、换向阀均采用不锈钢、PEEK或者PTFE材质；
再进一步地，所述缓冲瓶中填充有PBS缓冲液，所述染色瓶中填充有吖啶橙-溴化乙啶染色液；
作为本实用新型的一种优选技术方案，所述多通选择阀包括六个带数字编号的端口和一个公共端口，其中端口1做为排废管通往废液容器，端口2连接换向阀的1号端口，端口3连接荧光染色试剂，实例中以AO-EB染色液为例，端口4连接荧光染色试剂，实例中以AO-EB染色液为例，端口5、6连接两个细胞培养容器。
作为本实用新型的一种优选技术方案，所述换向阀有两个不同相位、六个端口，用于切换流通池部分液流的方向，其中端口2连接往荧光检测器流通池入口，端口3连接往荧光检测器流通池出口，端口4做为废液排出口，做为排废管通往废液容器，端口5、6之间用管线相互连接。
作为本实用新型的一种优选技术方案，第一透镜对应的激发光源使用490nm窄带发射波长的发光二极管，置于凸透镜焦点上获得传输方向和流通池垂直的一束平行单色激发光；第二透镜对应的激发光源使用530nm窄带发射波长的发光二极管，置于另一个凸透镜焦点上获得传输方向和流通池垂直的另一束平行单色激发光。
作为本实用新型的一种优选技术方案，当激发光源射入时，在入射光接近90°夹角的方向，设置发射光的检测部分，和激发光垂直方向的发射光，首先经过一个使用电机控制，有两个对应不同波长滤光片位置的可移动滤光片，每个滤光位置安装一个发射光波长的窄带滤光片，其中，滤光片1使用530nm窄带滤光片，带宽20nm(520-540nm允许通过)；滤光片2使用600nm窄带滤光片，带宽20nm(590-610nm允许通过)，在测量活细胞荧光信号时，滤光片1在光路中的工作位置，过滤530nm激发光信号，在测量死细胞荧光信号时，滤光片2在光路中的工作位置，过滤600nm激发光信号。
与现有技术相比，本实用新型能达到的有益效果是：
本实用新型不使用显微镜光路和/或视觉识别系统，光路构成简单，小型化的装置可以直接连接一个或多个细胞培养容器，进行细胞计数和细胞活率的原位、实时监测，前处理完全自动进行；同时，系统可以自动调整流通池内细胞浓度，解决了当前设备动态范围小的缺点，为细胞培养中宽动态范围(104～108cells/mL)的样本测定提供了便利的解决方案。
附图说明
图1为本实用新型系统流路过滤方向示意图；
图2为本实用新型系统流路反冲示意图；
图3为本实用新型荧光检测示意图；
其中：1、第一细胞培养容器；2、第二细胞培养容器；3、缓冲瓶；4、染色瓶；5、多通选择阀；6、缓冲环；7、注射泵；8、换向阀；9、荧光流通池；10、流通池入口；11、流通池出口；12、筛板；13、聚焦透镜；14、光电池；15、第一透镜；16、第二透镜。
具体实施方式
为了使本实用新型实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本实用新型，但下述实施例仅仅为本实用新型的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本实用新型的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
如图1、图2、图3所示，本实用新型提供一种在线荧光细胞计数器，包括流路单元和光路单元，其中，所述流路单元包括第一细胞培养容器1、第二细胞培养容器2、缓冲瓶3、染色瓶4、多通选择阀5、注射泵7、换向阀8、荧光流通池9，所述第一细胞培养容器1、第二细胞培养容器2、缓冲瓶3、染色瓶4通过管路分别与多通选择阀5上的不同端口连接，所述缓冲瓶3中填充有PBS缓冲液，所述染色瓶4中填充有吖啶橙-溴化乙啶染色液，所述管路采用聚醚醚酮、聚四氟乙烯或者不锈钢管，其内径为0.5mm-10mm，外径为1/16英寸-1/2英寸，所述荧光流通池9与换向阀8连接，荧光流通池9上分别设置有流通池入口10、流通池出口11，荧光流通池9内还安装有PID恒温机构，使得光路部分温度为35-40℃，所述荧光流通池9靠近流通池出口11的一侧安装有可拆卸的筛板12，对于常见的细胞直径(10-20μm)，所述筛板12的孔径5μm，有效厚度0.5-1mm，材质为聚丙烯、聚四氟乙烯或不锈钢等生物惰性材料，所述注射泵7上设有缓冲环6，其吸取样品或清洗溶剂至荧光流通池9内，所述多通选择阀5、换向阀8均采用不锈钢、PEEK或者PTFE材质，所述多通选择阀5包括六个带数字编号的端口和一个公共端口，其中端口1做为排废管通往废液容器，端口2连接换向阀8的1号端口，端口3连接荧光染色试剂，实例中以AO-EB染色液为例，端口4连接荧光染色试剂，实例中以AO-EB染色液为例，端口5、6连接两个细胞培养容器，所述换向阀8有两个不同相位、六个端口，用于切换流通池部分液流的方向，其中端口2连接往荧光检测器流通池入口10，端口3连接往荧光检测器流通池出口11，端口4做为废液排出口，做为排废管通往废液容器，端口5、6之间用管线相互连接；所述光路单元包括聚焦透镜13、光电池14、第一透镜15、第二透镜16，所述聚焦透镜13上设置有可移动滤光片，所述第一透镜15、第二透镜16分别过滤不同的激发光信号，所述第一透镜15对应的激发光源使用490nm窄带发射波长的发光二极管，置于凸透镜焦点上获得传输方向和流通池垂直的一束平行单色激发光；第二透镜16对应的激发光源使用530nm窄带发射波长的发光二极管，置于另一个凸透镜焦点上获得传输方向和流通池垂直的另一束平行单色激发光，当激发光源射入时，在入射光接近90°夹角的方向，设置发射光的检测部分，和激发光垂直方向的发射光，首先经过一个使用电机控制，有两个对应不同波长滤光片位置的可移动滤光片，每个滤光位置安装一个发射光波长的窄带滤光片，其中，滤光片1使用530nm窄带滤光片，带宽20nm(520-540nm允许通过)；滤光片2使用600nm窄带滤光片，带宽20nm(590-610nm允许通过)，在测量活细胞荧光信号时，滤光片1在光路中的工作位置，过滤530nm激发光信号，在测量死细胞荧光信号时，滤光片2在光路中的工作位置，过滤600nm激发光信号，发射光被滤光片过滤掉激发光的杂散光之后，经过凸透镜聚焦到光电池14；
该装置包括样品浓缩或稀释、基质移除和PBS清洗、荧光试剂加入和细胞重悬、恒温孵育、过量荧光试剂移除、双波长荧光测定、系统清洗功能等多个步骤，其中
步骤1：样品浓缩或稀释
样品浓缩：系统流路方向切换至过滤方向，先从待测培养容器吸取一定量的培养液(如多通选择阀5切换至端口5对应的培养容器)到缓冲环6，切换至端口1，排废方向推出，以预填充输液管线，如果需要浓缩k倍，吸取体积为流通池体积V·k体积(如流通池体积200μL，浓缩倍数10，则吸取200/10＝2000μL培养液)，之后多通选择阀5切换至端口2，推出V·k体积到流通池，此时多余的培养液会经过过滤筛板12流出流通池，细胞则被过滤筛板12截留，全部推出时，流通池内含有V·k体积培养液中含有的细胞，之后注射泵7连续执行多次从流通池方向吸入-推出V/2的操作(如实例中，流通池体积200μL，注射泵7联系执行10次从流通池吸入/推往流通池100μL液体的操作)，直到流通池内，培养液和过滤筛板12截留的细胞充分混合，此时细胞浓度为原培养液的k倍，浓缩流程完成；
样品稀释：系统流路方向切换至过滤方向，先从待测培养容器吸取一定量的培养液(如多通选择阀5切换至端口6对应的培养容器)到缓冲环6，切换至端口1，排废方向推出，以预填充输液管线；如果需要稀释k倍，则先将多通选择阀5端口切换到放有PBS缓冲液的端口4，吸取足够体积(大于后续的推出体积)的PBS缓冲液到缓冲环6，再将多通选择阀5端口切换到端口6对应的待测培养容器，继续吸取体积为流通池体积V/k体积(如流通池体积200μL，稀释倍数10，则吸取200/10＝20μL培养液)，此时缓冲环6中，最初V/k体积为培养液，剩余部分为充分大体积的PBS缓冲溶液，之后多通选择阀5切换至端口2，推出体积V到流通池，此时流通池将被V/k体积的培养液和V·(1-1/k)体积的PBS缓冲液(如实例中，流通池体积200μL，稀释倍数10，则流通池内实际被注入20μL培养液和180μL PBS缓冲液)，之后多通选择阀5切换至端口1，排废方向推出，清空缓冲环6中剩余PBS缓冲液，之后多通选择阀5切换至端口2，连续执行多次从流通池方向吸入-推出V/2的操作(如实例中，流通池体积200μL，注射泵7联系执行10次从流通池吸入/推往流通池100μL液体的操作)，直到流通池内，培养液和用于稀释的PBS缓冲液充分混合，稀释流程完成，如果不需要进行稀释或者浓缩，此步骤可以忽略，系统直接吸入体积为v的培养液，开始执行下一步骤；
步骤2：基质移除和PBS清洗
系统流路方向保持过滤方向，多通选择阀5端口切换到放有PBS缓冲液的端口4，吸取一定体积的PBS缓冲液到缓冲环6，切换至端口1，排废方向推出，清洗缓冲环6，必要时可执行多次，多通选择阀5端口切换到放有PBS缓冲液的端口4，吸取足够体积满足清洗需求的PBS缓冲液到缓冲环6，再将多通选择阀5端口切换至端口2，推出缓冲环6中的PBS缓冲液，过量的PBS缓冲液，经过过滤筛板12流出流通池，过程中移除了流通池中原有的培养基质，细胞则被过滤筛板12截留，并被过量的PBS缓冲液清洗；
步骤3：荧光试剂加入和细胞重悬
多通选择阀5切换至端口3，吸取适量荧光染色剂(本实例中使用10μL AO-EB染色液)，再将多通选择阀5端口切换至端口2，推出缓冲环6中的荧光染色剂，之后连续执行多次从流通池方向吸入-推出V/2的操作(如实例中，流通池体积200μL，注射泵7联系执行10次从流通池吸入/推往流通池100μL液体的操作)，直到流通池内，荧光染色剂和用于稀释的PBS缓冲液充分混合，同时，切换的流向，会将步骤2中过滤截留在筛板12上的细胞，重新和PBS溶液混合并悬浮于缓冲液中；
步骤4：恒温孵育
流通池在37℃恒温条件下，进行恒温孵育至荧光染色完成；
步骤5：过量荧光试剂移除
多通选择阀5端口切换到放有PBS缓冲液的端口4，吸取一定体积的PBS缓冲液到缓冲环6，切换至端口1，排废方向推出，清洗缓冲环6，必要时可执行多次，多通选择阀5端口切换到放有PBS缓冲液的端口4，吸取足够体积满足清洗需求的PBS缓冲液到缓冲环6，再将多通选择阀5端口切换至端口2，推出缓冲环6中的PBS缓冲液，过量的PBS缓冲液，经过过滤筛板12流出流通池，过程中移除了流通池中未反应的荧光染色剂，细胞则被过滤筛板12截留，之后连续执行多次从流通池方向吸入-推出V/2的操作(如流通池体积200μL，注射泵7联系执行10次从流通池吸入/推往流通池100μL液体的操作)，切换的流向，会将过滤截留在筛板12上的细胞，重新和PBS溶液混合并悬浮于缓冲液中；
步骤6：双波长荧光测定
荧光检测器首先开启光源1，在活细胞染色的荧光试剂激发波长下，对流通池中，已经重悬在PBS缓冲液中，被荧光试剂染色的细胞进行激发，滤光片切换到通道1，过滤掉发射光之外，其他波长的光信号，此时光电池14读出的信号，对应流通池内活细胞的计数，以AO-EB体系为例，激发使用490nm发光二极管，发射信号被530nm窄带滤光片过滤，光电池14读取530nm荧光信号强度，计算流通池内细胞计数；荧光检测器之后开启光源2，在死细胞染色的荧光试剂激发波长下，对流通池中，已经重悬在PBS缓冲液中，被荧光试剂染色的细胞进行激发，滤光片切换到通道2，过滤掉发射光之外，其他波长的光信号，此时光电池14读出的信号，对应流通池内死细胞的计数，以AO-EB体系为例，激发使用530nm发光二极管，发射信号被600nm窄带滤光片过滤，光电池14读取600nm荧光信号强度，计算流通池内细胞计数；
在该步骤中，装置计数原理如下：
对稀溶液，荧光强度符合下列关系式：
为激发光强度；
α为荧光物质的吸收系数，定义为每1cm路径中1mol/L荧光物质的吸光值；
β为荧光物质的光子吸收率，定义为吸收的光子数与发射的光子数之比，最大值为1；吸收率定义为发射和吸收的光子数量；
T为入射激发光的样品厚度；
样品中荧光试剂的浓度表示为C，荧光强度和浓度在不超过线性范围的浓度内成正比例；
对一个给定的光源和流通池，测量某一种确定的荧光物质浓度时，α、β、T均为定值，因此有简单关系，/>
对一个体系(如car-t细胞培养液)，首先使用外部计数方式(如荧光镜检)对一个中等浓度试样进行标定，获得计数为Cstd(如标定值为2.5x106cells/mL计数)，再取一部分试样，将其中细胞全部灭活，则可以分别得到计数为2.5x106cells/mL的活细胞和死细胞培养液标样；将上述活细胞和死细胞样品分别注入系统，经过测试流程后，分别得到2.5x106cells/mL的活细胞和死细胞各自荧光通道的荧光信号强度和/>以上标定对同一类别细胞仅需要标定一次，标定值就可以长期使用；
对实际试样测量，如果样品稀释/富集倍率(Dilution factor)为Fd，则
根据实际试样活细胞和死细胞荧光通道发射光强度Φem-L和Φem-D，活细胞浓度和死细胞浓度分别为：
活细胞浓度
死细胞浓度
细胞活率为100％·CL/(CL+CD)
动态计数调整功能：
对稀溶液，荧光强度符合下列关系式：
细胞计数如果过大，发射光可能不再和浓度成线性关系；
细胞计数如果过小，发射光强度则过弱，不利于荧光检测器的检测；
本实例中，对多数细胞，最优的定量区间为0.1-5x106cells/mL
对超出这个范围的样品，系统使用动态计数调整算法进行在线稀释或富集，动态调整算法由两部分规则构成；
规则1：计数信号范围
如果池内细胞计数的测量超过了0.1-5x106cells/mL范围，则系统将自动补做一个样品，根据前值额外进行富集或者稀释；
如：2.5x106cells/mL标样的响应强度为Φem-L，待测样本5倍稀释后，得到的强度为/>此时池内细胞计数的测量值为2.5x106cells/mL x 3＝7.5x106cells/mL，超过了0.1-5x106cells/mL范围，则系统将自动补做一个样品，将稀释倍数调节为20倍，以保证池内的细胞计数，在0.1-5x106cells/mL的最优线性范围内；
规则2：增长倍率
对常见培养体系的监测，系统可写入细胞培养的预期增殖速度，当系统以一定时间间隔采样进行细胞计数的动态监测时，可以根据上一个采样点测量到的细胞计数，与上一个点的采样间隔时间，以及增殖速度，计算本次采样的细胞计数预期值，根据预期值，系统自动采用最适的浓缩或者稀释倍率，将流通池内细胞计数控制在荧光检测器性能最优的1-2x106cells/mL；
对一般样品，系统可以进行10倍浓缩到50倍稀释，细胞计数的线性范围，从0.1-5x106cells/mL，扩展到104～108cells/mL；
步骤7：系统清洗
系统流路方向切换至反冲方向，多通选择阀5端口切换到放有PBS缓冲液的端口4，吸取足够体积满足清洗需求的PBS缓冲液到缓冲环6，再将多通选择阀5端口切换至端口2，推出缓冲环6中的PBS缓冲液，PBS反冲过滤筛板12和流通池，将池内所有液体和细胞从废液口排出，彻底清洗系统；
本实用新型不使用显微镜光路和/或视觉识别系统，光路构成简单，小型化的装置可以直接连接一个或多个细胞培养容器，进行细胞计数和细胞活率的原位、实时监测，前处理完全自动进行；同时，系统可以自动调整流通池内细胞浓度，解决了当前设备动态范围小的缺点，为细胞培养中宽动态范围(104～108cells/mL)的样本测定提供了便利的解决方案。
尽管已经示出和描述了本实用新型的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本实用新型的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本实用新型的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种在线荧光细胞计数器，其特征在于：包括流路单元和光路单元，其中:
所述流路单元包括第一细胞培养容器(1)、第二细胞培养容器(2)、缓冲瓶(3)、染色瓶(4)、多通选择阀(5)、注射泵(7)、换向阀(8)、荧光流通池(9)，所述第一细胞培养容器(1)、第二细胞培养容器(2)、缓冲瓶(3)、染色瓶(4)通过管路分别与多通选择阀(5)上的不同端口连接，所述荧光流通池(9)与换向阀(8)连接，所述注射泵(7)上设有缓冲环(6)，其吸取样品或清洗溶剂至荧光流通池(9)内；
所述光路单元包括聚焦透镜(13)、光电池(14)、第一透镜(15)、第二透镜(16)，所述聚焦透镜(13)上设置有可移动滤光片，所述第一透镜(15)、第二透镜(16)分别过滤不同的激发光信号。
2.根据权利要求1所述的一种在线荧光细胞计数器，其特征在于：所述荧光流通池(9)上分别设置有流通池入口(10)、流通池出口(11)，所述荧光流通池(9)靠近流通池出口(11)的一侧安装有可拆卸的筛板(12)。
3.根据权利要求1所述的一种在线荧光细胞计数器，其特征在于：所述管路采用聚醚醚酮、聚四氟乙烯或者不锈钢管，其内径为0.5mm-10mm，外径为1/16英寸-1/2英寸。
4.根据权利要求1所述的一种在线荧光细胞计数器，其特征在于：所述多通选择阀(5)、换向阀(8)均采用不锈钢、PEEK或者PTFE材质。
5.根据权利要求1所述的一种在线荧光细胞计数器，其特征在于：所述缓冲瓶(3)中填充有PBS缓冲液，所述染色瓶(4)中填充有吖啶橙-溴化乙啶染色液。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202321189653.XU CN219951035U (zh) | 2023-05-17 | 2023-05-17 | 一种在线荧光细胞计数器 |
Applications Claiming Priority (1)
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| CN219951035U true CN219951035U (zh) | 2023-11-03 |
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Family Applications (1)
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| CN202321189653.XU Active CN219951035U (zh) | 2023-05-17 | 2023-05-17 | 一种在线荧光细胞计数器 |
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2023
- 2023-05-17 CN CN202321189653.XU patent/CN219951035U/zh active Active
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