JPH04104799A - 水中細菌数の定量測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、例えば半導体製造分野で用いられる半導体洗
浄用超純水、各工程水、回収水、パイロジエンフリー水
等の用水中に含まれる不純物である細菌の菌体数を定量
的に測定する方法に関するものである。

（発明の背景と従来の技術） 従来から種々の分野において、不純物を出来るたけ含ま
ない純水等の水が使用されてぎており、更に、例えは半
導体ウェハーを製作するＬＳＩ生産工場等で代表される
ような半導体製造の分野では、洗浄水等として使用され
る超純水に不純物として細菌（特に生菌）か含まれてい
ると、半導体ウェハーの生産歩留まりに悪影響を与える
ため、その水質は厳しく管理されている。

また、医薬品向けに用いられているパイロジエンフリー
水あるいは食品産業向は用水も、これに含まれる生菌数
の把握が水質管理のために重要である。

上記のように、超純水等の用水の水質管理のための細菌
数測定か従来から行なわれており、この測定法としては
一般に、ＪＩＳ−０５５Ｏｒ超純水中の細菌数試験方法
」に規定される方法が採用されている。このＪＩＳ−０
５５０に規定の試験方法は、寒天培地にサンプル水を展
延し、３５℃で２４時間培養した後、１ｍｆｉ当たりの
コロニー数を計測する方法である。

また別の試験方法として、ＡＳＴＭ−Ｆ２ＯｒＤｅｔｅ
ｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ　ＯＦ　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｎｔａｍｉｎａｎｔ
ｓ　ｉｎ　Ｗａｔｅｒ　Ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｃｅ
ｓｓｉｎｇＥｌｅｃｔｒｏｎ　ａｎｄ　Ｍｉｃｒｏｅｌ
ｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｄｅｖｉｃｅｓ」も知られており、
これは、サンプル水を注射器シリンジにて採取し、これ
を孔径０．４５ｐｍのフィルターか装着されているフィ
ールドモニターに注入して菌体を濾別し、ここに培地液
を注入した後３５℃で２４時間培養し、フィルター上に
生育した菌コロニーをメチレンブルーなどで染色した後
、４０〜１００倍の光学顕微鏡を用いて計測する方法で
ある。

このように、上記超純水等に含まれる菌体数を定量計測
するために従来知られている方法は、肉眼あるいは顕微
鏡による計測を前提として、これらによる計測を可能と
する程度の菌コロニーの成長を必要としたものである。

（発明が解決しようとする課題） ところで、上記のような不純物か極めて少ない超純水等
は、菌の繁殖のために必要な栄養源（電解買、有機物）
がいずれも殆ど存在しなしＡ極貧栄養状態の水であるた
め、一般細菌の生育は難しいのが普通である。従って極
貧栄養状態の水についての上記のような一般細菌の菌数
測定の重要度はむしろそれほど高くないとも言えるが、
しかしこのような環境化でも生育できる種々の細菌類（
貧栄養性細菌）も存在していて、これらの貧栄養性細菌
は、半導体洗浄用超純水、各工程水、回収水、パイロジ
エンフリー水等の純水中で生育できるため、用水を水質
管理して生産性向上等の目的を図るためには、測定対象
として無視できない。そこで、これらの貧栄養性細菌の
生菌数を測定する操作が必要となる。しかしこの貧栄養
性細菌の生菌数を測定する操作を実施するためには末た
解決すべきいくつかの問題がある。例えは貧栄養性細菌
群はその菌学的性質から増殖速度が極めて遅く、肉眼あ
るいは顕微鏡による測定か８来る程度の大きさのコロニ
ー形成のためには、低温（通常２５℃）で長時間（通常
７２〜２４０時間）の培養が必要となるが、便用水の水
質管理操作に数日の培養期間を必要とするということは
、工業的規模での水質管理を行なう場合に強く求められ
る迅速対応の要求が、実質的に放棄されているに等しい
。従ってその菌数測定のための時間短縮は従来から改善
が求められている大きな課題の一つとなっている。

なお、コロニー形成速度（菌増殖速度）を高めるために
は、一般細菌については、培養温度を高くするとか、栄
養源の豊富な培地を用いるとかの方法が知られているが
、これらの方法は、上記のような貧栄養性細菌のコロニ
ー形成速度を増大させる方法として採用できない。

これは、貧栄養性細菌の培養のために培養温度を高くす
るとか栄養源の豊富な培地を用いる方法を採用しても、
上述した貧栄養性細菌群の菌学的性質から、むしろコロ
ニー形成が阻害される傾向か現われるからであり、この
ことから、上述したＪＩ’Ｓ−０５５Ｏｒ超純水中の細
菌数試験方法」においても、３５℃で２４時間培養を内
容とする「中温、短時間培養法」と併記する形で、２５
℃で５日間培養を行なう「低温、長時間培養法」を規定
している。

以上のように、従来知られている水質管理のための細菌
数測定法によっては、特に貧栄養性細菌の測定か問題と
なる超純水等を対象とした操作の迅速処理、特に工業的
な規模での実施においては極めて強く要求される迅速処
理の実現が不可能であり、従来法に代わる新しい細菌数
測定法の開発が、大きな課題となっていた。

本発明は、以上のような種々の産業分野において求めら
れている要求の実現を図るために鋭意研究を重ねて開発
されたものであり、その目的は、種々の産業分野で用い
られている用水中の細菌の菌数を迅速に測定することか
できる新規な菌数の定量測定法を提供するところにある
。

また本発明の別の目的は、特に、超純水等の貧栄養性細
菌の存在か問題となる用水における細菌数を、従来法と
は比較にならない程の極めて短時間で測定可能とする新
規な菌数の定量測定法を提供するところにある。

本発明の更にまた別の目的は、半導体製品の歩留まり向
上や医薬品の安全性向上、あるいは純水製造装置の正常
運転管理の重要な指標となる用水中の細菌数をいち早く
知ることによって、水質低下の際の不良製品の発生率を
低下させ、早期に純水製造装置の異常に対応でき、製品
歩留まりや安全性の向上に有益で、工業的規模で使用さ
れる用水の水質管理法として極めて重要な新規な菌数の
定量測定法を提供するところにある。

（課題を解決するための手段及び作用）以上のような種
々の目的を実現することができる本発明の水中細菌数の
定量測定法の特徴は、イオン交換処理水、あるいは逆浸
透膜、限外濾過膜、絹畜濾過膜等の膜処理水中に含まれ
る細菌数を以下のａ　％　ｄの工程により定量測定する
方ン去にある。

ａ、核酸に対して親和性を有するシート上に上配水に含
まれる細菌を二次元的に分散して捕捉させる工程 ｂ：シート上に捕捉された細菌の核酸を菌体外部に露出
させる工程 Ｃ：酵素、蛍光物質、放射性物質等の標識物質で標識さ
れた物質を、上記核酸に直接あるいは間接的に結合させ
る工程 ｄ：上記結合によりシート上に固定された標識物質の固
定点数を、標識物質を指標にして計数する工程。

本発明方法は、対象となる検出細菌が、貧栄養性細菌で
あると一般細菌であるとを問うものではなく、検出操作
の迅速化は一般細菌を検出対象とする場合にも有益とな
るが、本発明が最も有益な効果を発揮するのは、従来の
検出方法では工業的規模での迅速検出操作が実質的に不
可能であった、貧栄養性細菌を主たる検出対象とする超
純水等の水質管理を目的とする場合である。すなわち従
来法による場合には実質的に放棄されていたに等しい、
工業的な規模の設備における超純水中の貧栄養性細菌の
定量測定が、本発明方法の採用によって初めて可能とな
ったからである。

本発明方法において細菌を捕捉するために使用されるシ
ートとしては、０４５μｍ以下の孔径を有する濾過膜が
好ましく用いられ、またこの濾過膜は核酸、蛋白質と親
和性の高い材質、例えばニトロセルロース、ニトロセル
ロースとアセテートの混合体、あるいはナイロン及びそ
の麩導体の表面を核酸、蛋白質との親和性の高い状態に
加工したものが好ましい。濾過膜が好ましく用いられる
理由は、例えば測定対象の用水が超純水の場合、生菌は
超純水ＩＩｌ当たり１セル程度しか含まれていないのが
普通であるから、統計的に意味のある程度に菌を検出す
るためには少なくとも２０１程度の超純水に含まれる菌
体をフィルター濾過により捕捉して検出系にかけること
か必要であり、このために２次元的に分散した形で菌体
をシート上に捕捉するのには濾過膜を用いることが都合
よいからである。

以下本発明方法を、菌体捕捉シートとして濾過膜を用い
る場合を代表例として更に説明する。

上記のようにして、濾過膜等のシート上に２次元的に分
散した形で捕捉された菌体は菌体内に普遍約合まれる核
酸を菌体外部に露出される。この核酸の菌体外部への露
出は、本発明方法の最も特徴的な操作の一つである。す
なわち、超純水等の用水中に含まれることによって該用
水を使用する用途での弊害を招く細菌には種々のものか
あって、特に工業的規模での水質管理においては、検圧
対象を特定種類の細菌に限定することは適当でなく、該
用水に含まれることかある全ての細菌の検出測定を可能
とする求められる。従って本発明方法のＣ工程において
、標識物質と結合した複合物質を指標として細菌の検出
測定を行なう場合には、特定の細菌に特異的に反応する
複合物質を用いることは適当でない。そこで本発明方法
においては、全ての細菌に普遍的に含まれる物質である
核酸を検出源とすると共に、この核酸と結合反応を生ず
る例えは抗核酸抗体等の物質を用いることで、細菌の種
類に特定されることなく、全ての細菌の普遍的な検出を
可能としたのである。

核酸を菌体外部に露出させる方法は特に限定されるもの
ではなく、例えば濾過膜上に捕捉された細菌に苛性ソー
ダや界面活性剤を接触させることによって細菌の細胞膜
を破壊する化学的な方法、あるいは超音波を作用させて
細胞膜を破壊する物理的な方法等が例示されるが、苛性
ソーダによって細菌の細胞膜を破壊する方法によれば、
その他の操作を行なうことなく核酸と濾過膜の親和性に
より核酸が濾過膜上に固定されるので特に好ましい方法
として推奨される。なお、菌体外部に露出された核酸を
濾過膜に強固に結合させるために、加熱、紫外線叩射等
の核酸と濾１Ｍ膜との結合操作を行なうことも好ましい
方法として推奨される。

本発明方法の実施に際しては、特に限定されるものでは
ないが、濾過膜と核酸結合物質が非特異的に結合する可
能性を考慮して、上記工程Ｃとｄの処理の間において、
濾過膜に固定した核酸と結合していない遊離の核酸結合
物質、及び濾過膜に非特異的に結合した核酸結合物質を
除去する洗浄操作を行なうことが好ましい。特に濾過膜
が核酸結合物質と非特異的に結合する関係にある場合に
は、該洗浄操作は重要である。

なお上記濾過膜上に固定した細菌の細胞膜破壊等の操作
、あるいはこれに続いて行なわれることがある核酸と濾
過膜との強固な結合処理のための加熱等の操作に続いて
、濾過膜上の核酸非結合部を、核酸結合物質との非特異
的な結合を阻止するためにブロッキング処理することも
できる。ブロッキング処理は、特に限定されるものでは
ないが、核酸を実質的に含まない蛋白質例えばアルブミ
ンやカゼイン、ゼラチン、スキムミルク等を濾過膜に接
触、吸着させることによって行なうことができる。濾過
膜と核酸結合物質の非特異的な結合が生じない場合には
、この処理を省略できることは言うまでもない。

濾過膜に固定された核酸を検出するために標識物質を結
合させる処理、及び標識物質は、特に限定されることな
く種々の方法、物質を採用できる。例えば標識物質が結
合した複合物質として抗核酸抗体、１木鎖核酸、ＤＮＡ
結合蛋白質、ＤＮＡジャイレース、トポイソネラーゼ等
を用いて免疫反応等の結合反応により核酸との結合を直
接行なわせることができる他、核酸に結合した抗核酸抗
体を媒介としてこれを抗原とする２次抗体に標識物質を
結合したものを結合させる間接的な結合方法を採用する
こともできる。標識物質には酵素、蛍光物質、放射性物
質等の種々のものを用いることができるが、微小な存在
を観察する場合に、基質の発光あるいは蛍光等の呈色反
応等によって検出対象の存在を増幅させることができる
活性をもった酵素は、本発明方法に用いる標識物質とし
て特に好ましいものとして推奨できる。このような酵素
としては例えば、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクト
シダーセ、アルカリフォスファターゼ、ウレアーゼ、グ
ルコースオキシダーゼを例示することかでき、発光基質
としては例えば、８−アニリノナフタレン−１−スルホ
ン酸、ルミノール、フルオしノセイン、アダマンチルジ
オキセタン等、蛍光基質としては４−ヒドロキシフェニ
ル酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、
４−メチルランベリフェリン等を例示することができる
。

本発明方法の工程ｄにおいて、濾過膜上に固定された標
識物質を指標にして細菌数を計数する操作は、標識物質
の性質に応じて選択して採用することができ、例えば発
光点又は蛍光点を計数する場合には、発光または蛍光に
より感光するフィルム（高感度フィルム、Ｘ線フィルム
等）を用いたり、テレビカメラ等の撮像手段を用いるこ
とができる。特に検出測定の自動化のためには、撮像手
段を用いてこれをコンピュータ等を用いて画像処理する
方法が好まし方法として推奨され、また安価に実施でき
る方法としては前者の感光フィルムを用いる方法が推奨
される。

（実施例） 以下に本発明の詳細な説明するが、本発明は以下の実施
例に限定されるものではない。

実施例１ 工業用水をマイクロフロック濾過した後、２床３塔式純
水製造装置および混床式ポリシャーで処理して純水を得
、当該純水を精密濾過、逆浸透膜装置で処理し、次いで
紫外線酸化、混床式カートリッジポリシャー、限外濾過
して得た［純水２０　Ｉｌを孔径０．４５μｍのニトロ
セルロースアセテートフィルター（３７ｍｍφ径）を用
いて濾過し、このフィルターに捕捉された細菌の細胞膜
を破壊するため０．５ＭのＮａＯＨン夜と　１．５Ｍの
ＮａＣ２液の混合液、５ｍ文を接触させた後、ｐＨ７，
２の緩衝液（１，５ＭのＮａＣ９液と　０．５ＭのＴｒ
ｉｓ−）１ｃＮ液と０．ＯＩＭのＮａ２ＥＤＴＡ液の混
液）で中和し、更に核酸と結合する抗核酸抗体がフィル
ターと非特異的に吸着することを防止するために、アル
ブミンの入った以下のブロッキング剤でこのフィルター
をブロッキング処理した。

なおアルブミンの入ったブロッキング剤は４３％アルブ
ミン溶液と３％の界面活性剤（商品名、Ｔｗｅｅｎ２０
　）の混合液と、１３７ｍＭのＮａＣ１液、１．５ｍＭ
のＫＨ２ＰＯ４液、２．７ｍＭの　ＫＣｌ液、８ｍＭの
Ｎａ２ＨＰＯ４液を混合してｐＨ７，４とした混合液（
いわゆるＰＢＳ　ｂｕｆｆｅｒ）とを混合したものであ
る。

次に、マウスを免疫して得た抗核酸抗体にペルオキシダ
ーゼを標識した酵素標識抗核酸抗体をフィルター上に拡
散させて、フィルター上に固定されている核酸と結合反
応させた。

結合反応を行ってから６０分後に、未反応酵素標識抗核
酸抗体及びフィルターに非特異的に吸着している酵素標
識抗核酸抗体を、下記の洗浄液を用いて洗浄除去した。

なお洗浄Ｙ夜は、０５％アルブミン溶７夜と３％の界面
活性剤（商品名、Ｔｗｅｅｎ２０）の混合液と、前記Ｐ
ＢＳ　ｂｕｆｆｅｒとを混合したものである。

次に、フィルターに発光基質（ルミノール。

過酸化水素を主体とした溶液、　１０−’Ｍのルミノー
ルと１０−’ＭのＨ２Ｏ２とエンハンサ−との混合液）
　０．５ａ＋２をまんべんなく接触させて、酵素反応に
より発光させた。

この発光を生じたフィルターを透明な疎水性フィルム（
サラン樹脂）で覆い、その上に高感度フィルムを密着さ
せて発光を感光スポットとして焼き付け、蛍光基点を肉
眼で計数したところ、２１±２個てあった。

また対照として、ＪＩＳ−０５５Ｏｒ超純水中の細菌数
試験方法」の「低温、長時間培養法」に従って、２５℃
で５日間培養を行なった場合の超純水中の生菌数を測定
したところ、１９±４個のコロニーか検出され、本実施
例による計測精度の高いことが確認された。

また本実施例の方法による計数に要した時間は１２時間
であり、培養に５日間を要した従来法に比べて、その測
定が極めて迅速であることが確認できた。

実施例２ 工業用水をマイクロフロック濾過した後、２床３塔式純
水製造装置および温床式ポリシャーて処理して得た純水
１　ｒｎｌを、孔径０２２μｍのナイロンフィルター（
３７ｍ＋ｎφ径）を用いて濾過し、このフィルターに捕
捉された細菌の細胞膜を破壊するため０．５ＭのＮａ０
ｔＩ液と　１．５ＭのＮａＣ１液の混合液５ＩｎＲを接
触させた後、実施例１て用いたと同しｐＨ７，２の緩衝
液で中和し、更に核酸と結合するＤＮＡ結合蛋白質がフ
ィルターと非特異的に吸着することを防止するために、
以下のゼラチンの入ったブロッキング剤でこのフィルタ
ーをブロッキング処理した。

なおゼラチンの入ったブロッキング剤は、３％のゼラチ
ン溶液と前記ＰＢＳ　ｂｕｆｆｅｒとを混合したもので
ある。

次に、β−Ｄ−ガラクトシダーゼで酵素標識されたＤＮ
Ａ結合蛋白Ｘ（大腸菌より油田精製したもの）を含む液
をフィルター上に拡散させて、フィルター上に固定され
ている核酸と結合反応させた。結合反応を行ってから　
１２０分後に、未反応ＤＮＡ結合蛋白質及びフィルター
に非特異的に吸着しているＤＮＡ結合蛋白質を、実施例
１て用いたと同し洗浄液を用いて洗浄除去した。

次に、フィルターに蛍光基質（４−メチルランへりフェ
リンを主体とするｍＱ＆　：　０．３ｍＭの４−メチル
ランへりフェリルβ−Ｄ−ガラクトシド）　０．５ｍＭ
をまんへんなく接触させて、酵素反応により蛍光を出さ
せた。

この蛍光を、実施例１と同様にして感光フィルム上に感
光させて焼き付け、蛍光基点を肉眼で計数したところ、
１５０±５個であった。

対照として、実施例１と同様にＪＩＳ−０５５Ｏｒ超純
水中の細菌数試験方法」の「低温、長時間培養法」に従
い、同し純水を２５℃で５日間培養を行なフた場合の生
菌数を測定したところ、１５５±４個のコロニーが検出
され、本実施例による計測精度の高いことが確認された
。

また本実施例の方法による計数に要した時間は２４時間
であった。

実施例３ 実施例１で用いたと同じ超純水２０１を、孔径０，２２
μｍのニトロセルロースアセテートフィルター（３７＋
ｎｍφ径）を用いて濾過し、このフィルターに捕捉され
た細菌の細胞膜を破壊するため０．５ＭのＮａＯＨ液と
　１．５ＭのＮａＣ１液の混合液５ｍｌを接触させた後
、実施例１で用いたと同じｐＨ７，２の緩衝液で中和し
、更に核酸と結合する１木鎮核酸がフィルターと非特異
的に吸着することを防止するために、実施例１で用いた
と同じアルブミンの入ったブロッキング剤でこのフィル
ターをブロッキング処理した。

次に、超純水中に生育する細菌が共通に有する核酸配列
と相補的な１木鎖核酸に、酵素Ｗ４識としてアルカリ性
フォスファターゼを標識した複合物質を含む液をフィル
ター上に拡散させて、フィルター上に固定されている核
酸と結合反応させた。

結合反応を行ってから６０分後に、未反応酵素標識１木
鎖核酸及びフィルターに非特異的に吸着している酵素標
識１木鎖核酸を、実施例１で用いたと同じ洗浄液を用い
て洗浄除去した。

次に、フィルターに発光基質（アダマンチルジオキセタ
ン類を主体とする溶液：３−Ａｄａｍａｎｔａｎｅ−４
−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ
）ｐｎｅｎｙｌ　１．２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ液とエン
ハンサ−（０，７５Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−
プロパツール）液との混合液）　０．５ｍｌをまんべん
なく接触させて、酵素反応により発光させた。

この発光を、実施例１と同様に感光フィルム上に感光さ
せて焼き付け、蛍光基点を肉眼で計数したところ、１８
±１個であった。

また対照として、実施例１と同様に、ＪＩＳ−０５５Ｏ
ｒ超純水中の細菌数試験方法」の「低温、長時間培養法
」に従って２５℃で５日間培養を行なった場合の超純水
中の生菌数を測定したところ、２０±２個のコロニーが
検出され、本実施例による計測精度の高いことが確認さ
れた。

また本実施例の方法による計数に要した時間は１２時間
であった。

（発明の効果） 本発明の方法によれば、従来方法に比へて用水中の菌件
数極めてを迅速に測定することができるという効果かあ
る。

また特に、超純水等の貧栄養性細菌の存在か問題となる
用水においては、従来法とは比較にならない程の極めて
短時間でその細菌数を測定できるので、半導体製品の歩
留まり向上や医薬品の安全性向上、あるいは純水製造装
置の正常運転管理の重要な指標となる用水中の細菌数を
いち早く知ることによって、水質低下の際の不良製品の
発生率を低下させたり、早期に純水製造装置の異常に対
応できるため、製品歩留まりや安全性の向上に有益で、
工業的規模で使用される用水の水質管理法として極めて
優れている。

「＝− 他４名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、イオン交換処理水、あるいは逆浸透膜、限外濾過膜
   、精密濾過膜等の膜処理水中に含まれる細菌数を以下の
   ａ〜ｄの工程により定量測定する方法 ａ：核酸に対して親和性を有するシート上に上記細菌を
   二次元的に分散して捕捉させる 工程 ｂ：該シート上に捕捉された細菌の核酸を菌体外部に露
   出させる工程 ｃ：酵素、蛍光物質、放射性物質等の標識物質で標識さ
   れた核酸結合物質を、上記核酸 に結合させる工程 ｄ：上記結合によりシート上に固定された標識物質の固
   定点数を、上記標識物質を指標 にして計数する工程。 ２、細菌を二次元的に分散して捕捉するシートが、０．
   ４５μｍ以下の孔径を有する濾過膜であることを特徴と
   する請求項１に記載の方 法。 ３、細菌を捕捉する濾過膜が、ニトロセルロース系繊維
   か、又はナイロン及びその誘導体の繊維からなることを
   特徴とする請求項２に記載の方法。 ４、標識物質が酵素であり、かつ標識物質の固定点数を
   計数する工程が、光学的に検出可能な性質を有する基質
   を濾過膜にかける操作を含むことを特徴とする請求項１
   乃至３のいずれかに記載の方法。 ５、基質が、酵素反応により発光又は蛍光を生ずる物質
   であることを特徴とする請求項４に記載の方法。 ６、工程ｃとｄの間に、核酸と結合していない核酸結合
   物質、及びシートに対し非特異的に結合した核酸結合物
   質を除去する操作を行なうことを特徴とする請求項１乃
   至５のいずれかに記載の方法。 ７、工程ｂとｃの間に、菌体外部に露出された核酸をシ
   ートに強固に結合させるために、加熱、紫外線照射等の
   核酸とシートとの結合操作を行なうことを特徴とする請
   求項１乃至６のいずれかに記載の方法。 ８、核酸とシートとの結合操作に続いて、シート上の核
   酸非結合部に、核酸結合物質の非特異的な結合を阻止す
   るためのブロッキング処理をすることを特徴とする請求
   項７に記載の方法。 ９、核酸結合物質が、抗核酸抗体であることを特徴とす
   る請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。 １０、核酸結合物質が、１本鎖の核酸であることを特徴
   とする請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。 １１、核酸結合物質が、ＤＮＡ結合蛋白質、ＤＮＡジャ
   イレース、トポイソネラーゼ等の核酸認識蛋白質である
   ことを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の方
   法。 １２、標識物質のシート上の固定点数を標識物質を指標
   にして計数する工程ｄにおいて、シート上の発光又は蛍
   光によって感光するフィルムを用いることを特徴とする
   請求項１乃至１１のいずれかに記載の方法。 １３、標識物質のシート上の固定点数を標識物質を指標
   にして計数する工程ｄにおいて、シート上の発光点数又
   は蛍光点数を検出する撮像手段を用いることを特徴とす
   る請求項１乃至１１のいずれかに記載の方法。