JPS5991900A - 微生物細胞中のａｔｐの測定方法 - Google Patents

微生物細胞中のａｔｐの測定方法

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JPS5991900A
JPS5991900A JP53065596A JP6559678A JPS5991900A JP S5991900 A JPS5991900 A JP S5991900A JP 53065596 A JP53065596 A JP 53065596A JP 6559678 A JP6559678 A JP 6559678A JP S5991900 A JPS5991900 A JP S5991900A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は界面性剤を利用することによって、種々のタイ
プの生活力のある細胞の数または生理活性を選択的に測
定することに関する。その測定方法は、種々のタイプの
細胞からのヌクレオチドの選択的解放及びその後の化学
光または生物発光によるヌクレオチド０の測定に基礎を
置いている。
生活力のある微生物細胞および体細胞（非微生物細胞）
の測定は医学試験、獣医学、食品衛生学、醗酵産業及び
世情研究において極めて１を要である。
細菌、酵母及び菌類は成長培地中のコロニー計数によっ
て、あるいは顕微鏡、濁度計、屈折計等の如六計測器に
よって測定される。体細胞はコウルターカウンター（Ｃ
ｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｕｎｔｅｒ　）　（コウルター・エ
レクトロニクス社参す）及びレーザーに基礎を置く光学
および螢光装置の如き粒子計数装置によって、またげヌ
クレオチドの如き代謝生成物の量による間接測定によっ
て、あるいは鏡検法によって計数される。これらの方法
は複雑で高価な製筒を必要とするか、あるいは非細胞粒
子または非体細胞の妨害に起因して正確でない。更に、
はとんどの慣用の方法は死んだ細胞と生活力のある細胞
とを区別でき表い。
慣用の方法では、体細胞及び細菌の両タイプの細胞を含
有する試料中の体細胞及び細菌の如き種々のタイプの細
胞を選択的に測定することは困難であるかあるいは時間
のかかるものであった。更に、殊に微生物学における慣
用の方法は、その結果が１日後あるいは数日後にのみ得
られるので、手間どる。臨床試験においては、患者を適
切に治療するために可能なかぎり早く結果を得るべきで
あり、また食品衛生学においては、原料および加工食品
の腐敗を避は得るように、生成物の細菌汚染を可能なか
ぎり迅速に測定するとともＩＬ要である。それ故に、慣
用のコロニー計数及び体細胞計数のための代りの迅速な
方法が求められていた〇アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）
のホタル生物発光測定（米国特許ｆＰ、５，７４５，０
９０号明細書を参照のこと）は、試料中の体細胞及び細
菌細胞の数を測定するための迅速で感度のよい方法であ
る。特定タイプの細胞のＡＴＰ含有含有比較的一定であ
るので、上記の方法においては、ＡＴＰの測定量は細胞
の数に変換され石。同様に、その他の生物部、光測定、
例えば燐光菌生物発光反応はフラビンモノヌクレオチド
（ＦＭＮ　）及び還元形態のニコチンアミンジヌクレオ
チド（ＮＡＤＨ）の助けによって生活力のある細胞の数
を測定するのに用いることができる。
食物及び体液中の、例えば乳汁、尿、血液、中央髄液、
唾液中の細菌の数を測定するために、体細胞中の、例え
ば血球、筋細胞及び上皮細胞中のＡＴＰｌＦＭＮ及びＮ
Ａ［）Ｈを排除しなければ々らない。同様に、体細胞を
正確に測定するためには微生物細胞からのヌクレオチド
の妨害作用を避けかければならない。種々のタイプの細
胞を測定するのに生物発光を利用することは、体細胞及
び微生物細胞のヌクレオチドを別々に測定することを可
能にする適当な試料訓製法がなかったので、制限されて
いた。
体細胞または微生物細胞の選択的測定は科学、医学、衛
生管理及び産業品質管理の多くの分野で必要とされてい
る。これらの分野においては、はとんどの試料は下記の
測定条件に包含される＝（１）　　微生物細胞の存在下
での体細胞のみの測定、（２）試料中の全細胞の測定、 （３）他の細胞の存在下での微生物細胞のみの測定。
本発明はこれらの測定を迅速に、簡巣に且つ正確に達成
することを可能にする。これらの種々の方法を後Ｆの諸
例に示す。
体細胞からＡＴＰを排除するために界面活性剤を用いて
単一細胞を溶解させることは公知の事実であるが（米国
特許第！ｌ　、７４５．０９０号明細書を参照のこと）
、生きている体細胞または微生物細胞中のヌクレオチド
の濃度を測定するためにあるいは試料中の生活力のある
細胞の数を測定するために、特定の界面活性剤を用いて
種々のタイプの細胞からその細胞壁を通してヌクレオチ
ドを選択的に解放させる方法を開示することが今や可能
となった。
細胞の新陳代謝の研究、生物化学、医学、並びに生きて
いる有機体に関する研究において、ヌクレオチドの濃度
は重要方役割を演じる。公知の２０００種の酵素のほと
んどは基質としてアデノシンリン酸及びその他のヌクレ
オチｒリン酸（ＡＴＰ、ＡＤＰ％ＡＭＰ％ＧＴＰ、ＩＴ
Ｐ等）、７　ラｖンモ）　ヌクレオチド（ＦＭＮ、ＦＭ
ＮＨ２）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｎ
ＡＤ、　ＮＡＤＨ。
ＮＡＤＰＨ）の如きヌクレオチドを働かしている。
今までは、細胞の酵素がヌクレオチド９を破壊したり、
ヌクレオチドが処理によって影＃これたすすることなし
で、ヌクレオチド０を細胞から解放きせることけ困難で
あった。現在性なわれている方法は骨が折れ、費用がか
かｂ１手間どり、不正確であるか、あるいけ再現できる
態様で行危うことが困難である０しげしげその分離方法
は試料を希釈し、ヌクレオチドの分析を妨害する化学試
薬を導入し、あるいけ多数の操作に起因１．て余分の誤
差源を明らかに導入する。慣用の方法は、機械的または
化学的手段による細胞の崩壊、凍結、加熱または化学手
段による酵素の不活性化、及びその後　−の沈澱、液体
クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー有機溶媒
での液体抽出及びその他の方法による試料かちのヌクレ
オチドの分離を包含している。
本発明においては、細胞壁を界面活性剤によって透過性
にすることによってヌクレオチドを単一細胞または細胞
の単一層からその細胞壁を通して解放させる。分子の大
きさが小でいヌクレオチドは界面活性剤での処理の後に
細胞壁を透過できるが、分子の大きさの大きい酵素は細
胞壁を透過せず、それで細胞の内側に残る。このことは
、細胞自体の酵素によってヌクレオチドが破壊すること
なしで、ヌクレオチドが細胞外の液体に解放されること
を可能にする。赤血球は界面活性剤によって崩罰される
が、界面活性剤の添加俵１分以内、好オしくは１５秒以
内に行なうならば、解放されたＡＴＰはまだ正確に測定
できる。その界面活性剤はそれらの比特性、例えばその
化合物のアルキル鎖長、非イオン特性及びイオン特性、
アルコキシル化度（親油性度または親水性度）及び特殊
な基の存在（例えば第四アンモニウム塩）によって選択
され、それでヌクレオチドの解放は柚々のタイプのＭＢ
胞から選択的に行なうことができる。従って、リン酸ア
デノシンの如きヌクレオチドは非イオン系界面活性剤に
よって体細胞（非微生物細胞）から選択的に解放させる
ことができ、一方イオン系界面活性剤は全てのタイプの
細胞からヌクレオチドを解放させるのに用いられる。こ
のヌクレオチドの選択的解放は、オｉ々のタイプの細胞
間で選択的抽出を行なうことができなかった従来法よシ
もオＵ益がろる０本発明のその他の１喪な利益ね１、単
一細胞からのヌクレオチドの解放が早く、１０秒以下で
あることである。その上に、細胞壁を透過性にしてヌク
レオチドを解放させるのに必要な界面活性剤の濃度はわ
ずかに０．０２〜０゜１％であシ、それで試料はヌクレ
オチド用解放剤の添加によって希釈されることはない。
界面活性剤の存在がヌクレオチドの分析を妨曹しないよ
う１ 斤態様で界面活性剤を選択することができる。
Ｂ、測定 アデノシン三燐酸（ＡＴＰ）および７ラビンモノヌクレ
オチド（ＦＭＮ）のようなヌクレオチド類の誂度測定の
公知の方法は生物発光のオＵ用である。生物発光によれ
ば、ヌクレオチドの極度に低い濃度、例えば１０−１５
Ｍ、も測定できる（米国特許第３，７４５，０９０号）
。この高感鼠によシ生きている単−細胞中のＡＴＰなど
のヌクレオチド類の濃度を測定することが可能である。
この解析原理は試料中の細胞の数を測定する点で多数の
用途を有している。この生物発光測定は極めて迅速で敏
感であシ、衛生学、食品工業微生物学、臨床化学、ウィ
ルス学、組織培養、獣医科学および生命科学の全ての分
野における細菌、酵母、力？、および体細胞の魅力ある
迅速測定法を提供する。＼本発明によれば、総ての型の
細胞からのヌクレオチ１９類の迅速で、簡単で、再現性
あ）、かつ完全な分離が可能となる。かくして、本発明
の利用によシ、従来の抽出法を利用してこれまでに到達
２ した以上に迅速で、更に効果的でかつ選択的な、生物発
光測定が可能となった。
−び１ｖユノｒ　の゛　住Ｕ旦例 １、体細胞の測定 生きている体細胞の計数は多くの生物学的流体、例えば
血液試別（赤血球、白血球及び血小板）及び乳汁（乳腺
炎決定のため■白血球）、において京要である。これは
通常、例えば細胞が小さなオリフィスを通過する時の媒
体の導電性の変化に基く装置のような電気的粒子針数器
によって、直接的な顕微鏡計数によっであるいはヌクレ
オチドの沈降の利用又はヌクレオチドの吸収匹徂１ｊ足
（白血球に対するＤＮＡ−吸光度及びカリフォルニア乳
腺炎試敗）によって達成される。これらの方法は主観的
であシ、高価な装置を必要とし、かつ細胞以外の粒子に
よる固有の誤差を１している。生物発光による生物学的
流体中の体細胞測定は敏感で、迅速でかつ正確である。
非イオン性界面活性剤であるトライトンＸ−１００（米
国インシルパニア、フィラデルフィアのロームアンドハ
ース社の商標名）が体細胞を溶かし、ア２ラーゼと呼ば
れる酵素により非紬菌系ＡＴＰが脱離されることが示唆
されていた（米国特許第５，７４５，０９０号）。
しかしながら、トライトンＸ−１００を、体細胞中の＾
ＴＰ含量を測定するために、ＡＴＰの分離用に使用する
ことは示唆されていなかった。さらに、０．１％温度の
トライトンｘ−１ｏｎは生物発光反応の光生成を約２７
％低下し、かつあるダラム陽性菌からＡＴＰを分離する
。
かくして、体細胞中のＡ丁Ｐ含量を測定するために、特
殊な界面活性剤を、生物発光反応に何等かの押指１１を
与えることなしで、体細胞からＡＴＰを定量的かつ選択
的に分離するために使用する方法を開発することが可能
となった。このような非イオン性界面活性剤は化学式； （ただしＲはアルキル基又は脂肪酸残基であシ、Ｘは２
〜ＳＯの数値を表す）を有するエトキシル化アルキルフ
ェノール類およびオクチルフエノール類ならびに化学式
ニ ー　Ｃ−Ｃ−０−（ＣＨ２ＣＨ２０）ｘＨ（ただしＸは
上記定義通シ）を廟する脂肪酸ポリグリコールエーテル
類のような化学桑品を名む。
微生物系ＡＴＰは、非イオン性界面活性剤が微生物細胞
からＡＴＰを分離しないものとして選はれた等５合には
、測定を妨害しない０体細胞からの八ＴＰのようかヌク
レオチド類の選択的分離は、濃度が試料容積の０．０１
〜２％、好ましくは０．０５〜０．２％の非イオン性界
面活性剤を試料に添加することにより実施される。生物
発光反応を妨害シない、例えばエトキシル化アルコール
ｈおよびフエクール類のような、との製脱範囲の非イオ
ン性界面活性剤によって、ヌクレオチド類が体細胞から
、試料と界面活性剤とを混合した後１０秒以内に、細胞
外液例えは水、緩衝液あるいは塩溶液中に分離される。
酵素の分離を避けた場合、ヌクレオチドは細胞外液中で
かな多安定である。
ヌクレオチド濃度は、界面活性剤添加後即座に６ 又は数分後に測定し得る。しかしながら、アデノシン燐
酸などのいくつかのヌクレオチドは自然酸化作用を受け
るか、試料中の細菌によって破壊されるので、ヌクレオ
チド濃度は、界面活性剤添加後５分以内に測定するのが
好ましい。非イオン性界面活性剤が細胞種を透過するよ
うになった後、小さな分子は濃度勾配に従って、よシ低
い濃度領域に向って移動する。ＡＴＰ及び他の基質は濃
度が細胞内、外で等しくなるまで細胞から拡散し、細胞
の体積が試料全体積の１％未満になった時、ＡＴＰの実
質上完全な分離（〉９９％）が達成される。小さな分子
が分離した後、細胞自体の酵素が細胞内部に残留してい
る基質を利用しはじめる。
測定前に試料を５分間に渡って放置した場合、ＡＴＰの
ような基質の経度は細胞内部では減少しはじめ、細胞か
ら分離された基質は細胞内に逆拡散しはじめる（濃度勾
配に従って）。これによって全濃度は３０分で１０〜４
０％減少する。従って、測定は界面活性剤の適用後５分
以内に行うべきである。細胞濃度を１４万／　ｍｌより
大きくすべきで６ はなく、好ましくは百方細胞／ｄ未満として、体細胞か
らの基質の完全かつ即座の分離を確保すべきである。
【比丘Ｑ旦遣１課にあるノＴＰの測定浩未処理乳汁内の
白匍球中にあるＡＴＰを測定するため、種々のヌクレオ
チド抽出法の効率を比較した。その結果、非イオン性界
面活性剤（エトキシル化フェノール）を利用すると従来
方法と較べて良好な結果が得られた（第１表参照）。従
来方法は、過塩素酸抽出法（０，ＩＮ）および２０ｍＭ
）リス（トリス−ヒドロキシメチル−アミノメタン）　
−２ｍＭＥＤＴＡｌｌ衝液中で１．５〜１０分間沸騰す
る方法である。本発明では、ＡＴＰの解放は完全であり
、エトキシル化アルコールを全試料容積の１％の量で使
用すると、生物発光反応が妨害されなかった。＾ＴＰ＃
度は、発光分析器によシ、ホタルのルシフェリン−ルシ
フェラーゼ試薬の媒介によって測定した。
第１表：　生きている白血球を含有する未処理乳汁の試
料１ｒｎｉ中の、ＡＴＰ及びホタルのルシフェリン−ル
シフェラーゼ反 応によって照射された生物発光性の光 の強舵 （注） ＾：０，１ｕｊのＩＭ過過塩散散用い、０゜１１のＩＭ
にＯＨで中和した。
Ｂ：　　９ｄの沸＄０．０２Ｍ）リス−〇、００２Ｍ　
　ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７，４）を用いた。
Ｃ：　１−の０　、２９６’エトキシル化アルコールを
用いた。
Ａ、Ｂ％Ｃそれぞれの場合に０．１−のアリコートの３
つの試別について測定した。
血液細胞からＡＴＰを抽出する種々の方法に関する研を
［ターカンネン、ビー、アール・トリーシュおよびエイ
チ・グレイリング（Ｔａｒｋｋａｎｅｎ。
Ｐ、、　Ｒ，Ｄｒｌｅｓｃｈ　ａｎｄ　Ｈ，Ｇｒｅｌｌ
ｌｎｇ　）　　によるｌ酵素による細胞内ＡＴＰおよび
細胞外ＡＴＰの迅速微量測定法ならびにその臨床化学的
施用１、アナリテイシエ　シミー（Ａｎａｌｙｔｌｓｅ
ｈ　Ｃｈｅｍｌｅ　）、２９０（２）：１８０，１９７
Ｂ］において、非イオン性界面活性剤［ＮＲ８すなわち
体細胞用ヌクレオチド解放試薬、ここでＮＲ３はルーマ
ック　システムズ　エージ−、バーゼル（Ｌｕｍａｃ　
ＳｙｓｔｅｍｓＡＧ＋　Ｂａ５ａｌ　）の登録商標〕の
場合を、沸騰トリス法およびエタノールＥＤＴＡ（０，
１Ｍ）９：１混合物法と比較した。ＮＲ８によるＡＴＰ
の抽出は迅速かつ定量的（９６，８〜１０２．２％）で
あシ、従来方法と充分相互関係のあるＡＴＰ値を与えた
（ｒ＝０．９２〜０．９３）。ＮＲ３の場合は、より簡
便であり、よシ迅速であシ、そして再塑件があった。
非イオン性界面活性剤を利用する際の一つの大きな利点
け、それら活性剤のあるものは生物発光性の接触性酵素
、すなわちルシフェラーゼ、の酵素的活性を妨害するこ
とがないので、それら非イオン性界面活性剤を生物発光
試薬といっしょに混合し得ることである。従って、細胞
からＡＴＰを解放するために要する必要な薬剤（非イオ
ン性界面活性剤）および生物発光性の照射反応を生せし
めるために要する必要な薬剤（−試薬中にルシフェラー
ゼ、基質、酵素活性剤と安定化剤、Ｍｇ塩および緩衝液
の全てを含む）を全て絹み合わせることが可能となる。
本発明においては、試料調製および測定は極めて簡単で
あシ、容易に自動制御しうる。手動器械の場合、試料を
ピ４ットで取ること、その試料を光度計内に置くこと、
試薬を分配することおよび相対光の示度を得ることを含
めて３０秒より少ない時間で、体細胞を測定すると　９ とができる。
０ 主に微生物細胞、例えば活性化スラッジおよび微生物培
養菌、分有する試料の場合、非微生物細胞≠為らＡＴＰ
’ｊｉ予め離脱せしめることなく測定することができる
。細菌の細胞壁は重合体、すなわちいわゆるペグチドグ
リカン、を有しており、この重合体は細胞壁を外部の化
学的および物理的妨害に対して非常に抵抗性にする。従
って、微生物細胞壁を透過性にすることは、体細胞壁の
場合よりもずっと難しい。本発明によれば、細菌の細胞
壁が、ヌクレオチドのような比較的小さい分子寸法を有
する物質に対１．透過性に々るような方法でその細胞壁
に作用することが可能となる。この透透性は、細菌を非
イオン性界面活性剤で処理することによって得られ、そ
の際の最良のタイプの活性剤は、第４アンモニウム塩お
よび１２個の炭素原子の鎖長を有する脂肪酸（但し、４
〜２２個の炭素原子の鎖長を有するものを使用すること
ができる）含有しているものである。
界面活性剤として次の一般式を有するエトキシル化アミ
ン、エトキシル化ジアミン、脂肪酸のポリエチレングリ
コールエステルおよびエトキシル化アルコールを使うこ
とができる。
１ ＲＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２０）ｘＨ （上式中、Ｒは８〜１８個の炭素原子を有する脂肪酸か
ら誘導した脂肪アルキル基であり、×、Ｖおよび２は酸
化エチレン基の数であり、２〜５０である）。
ま友、次の一般式を有するエトキシル化アミンの第４塩
を使用することができる。
３ （上式中、８％Ｒ１およびＲ２はアルキル、エトキシル
化アルコール、アルキルアリール、エトキシル化アミン
、アルキルアリールアルキル、エトキシアルキルまたけ
オキシアルキル基であり、Ｒｓはメチルオたけエチル基
であり、Ｘは２〜１５でありそしてｙはハロダン、スル
フェート、スルフイツトｔたはホスフェートでありうる
。）界面活性剤はまた、フッ素化炭化水素またはハイア
ミン（ｈｙａｍｌｎｅ　）クロライドであることもでき
る。
陽イオン性エトキシル化アミンもｔｅ微生物細胞からヌ
クレオチドを解放するので、第４アンモニウム塩は必ず
しも必要ではない。しかしながら。
１２個の炭素の鎖長を有するエトキシル化アミンの第４
アンモニウム塩は、より速く作用し、マを緩衝液、ｐＨ
および微生物試料中で恐らく出会う他の薬剤によってそ
れほど影響を受けない。５〜９５蟹の陽イオン性エトキ
シル化アミンと５〜９５πのポリオキシエチル化アミン
の第４塩との混合物は、生物発光系で使うルシフェラー
ゼ酵素全妨害すなわち不活性化することなしで、細胞か
らヌクレオチドを迅速に解放するために使うことができ
る。
ホタルのルシフェリン−ルシフェラーゼ試薬ヲ使用する
発光照射反応の速叶は、１２個の炭素原子の鎖長を有す
るエトキシル化アミンと１２個の炭素原子の鎖長を有す
るエトキシル化アミンの第４塩との間の比率を費えるこ
とによって変化せしめることができる。エトキシル化ア
ミン単独の場合のＡＴＰの解放および生物発光反応は遅
い。エトキシル化アミンの第４塩とエトキシル化アミン
との混合物を使用すると、混合物中の２つの界面活性剤
の比率に応じて、解放は適度に遅いか、適度に速い（第
１図参照）。エトキシル化アミンの第４［の量が多けｎ
ば多いほど、解放すなわち酵素運動および照射反応、は
速くなる。７０％の工４ トキシル化アミンと３０％のエトキシル化アミンの第４
塩との混合物は、適度の反応速＋ｆを与え、１０秒連続
で測定した場合、界面活性剤混合物を有しない水中の＾
ＴＰ濃罪と較べてホタルの生物発光反応における相対光
示度の１．２〜２．０倍の示度を与えた。この混合物が
酵素の親１水性部位に恐らく影響を与えるルシフェラー
ゼ酵窒のターンオーバー率（ｔｕｒｎｏｖｅｒ　ｒａｔ
ｅ　）を増加するものと思わｎる。エトキシル化アミン
の第４塩が５０腎より多＋Ａ２合、ルシフェラーゼ酵素
の活性が低下するのであろう。従って、エトキシル化ア
ミンに比例して第４塩の割合を評節しなければならない
。
試料（例えば純粋な細菌培地あるいは混合細菌培地）が
細菌のみあるいは他の細胞よす１０００倍以上の細菌を
含んでいる場合には１ａ菌ヌクレオチドの測定はイオン
性界面活性剤（例えばエトキシ化アはン類、好ましくは
その一部が第４級アンそニウム塩であるもの）ｅｏ、０
１〜２％、好ましくに０．０５〜０．２％の量で単に添
加し、こｎと上記試料と全混合して、ヌクレオチドを細
ｉ壁を通して解放させることによって行なわれる。
次いで該試料は、ヌクレオチド、例えばＡＴＰの濃聞を
ホタルの生物発光反応を用いて測定する几め、計測器中
に置かｎる。該試料中の反応により作られた光線強度は
、第２表に示すＸうに、試料中のＡＴＰの端間、即ち生
活力のある細菌の数に直接関連がある。
第　　　２　　　表 ０．１腎の連間の、エトキシル化アミンと第四級エトキ
シル化アミンとの混合物によって、種々の数の細菌細胞
から解放されたＡＴＰにより作られた相対的光強囲。細
菌は０．５ｍ／の生理ＮａＣ１溶液（０，９π）に懸濁
され、かつホタル生物発光法で測定。
７ 試料の０．１％（容量）濃■での、エトキシル化アミン
とエトキシル化アミンの第４級塩との７０＝５０の比ボ
の混合物の抽出効果を、第１表の場合と同様にトリス（
０，０２Ｍ）−Ｅ［）ＴＡ（０，００２Ｍ）、ｐＨ７，
７５沸騰法及び過塩素酸抽出法と比較しｔ０三つの再現
試験の結果を以下に示す。
エトキシル化アミンとその第４級塩との混合物による酵
母細胞及び菌類細胞からのＡＴＰの解放は、細菌からの
ＡＴＰの解放より遅い。
細菌については、１５秒以下で解放が完結する。
一方、菌類及び酵母の細胞については、定量的解放が３
０〜６０秒で起る。定量的解放のためには、細胞量は試
料全量の１％を越えるべきではない。
解放は、試薬が細胞壁を通して小さな分子を解放するが
微生物細胞を破裂しないので、微生物の大きい（１１１
１ｍ３以上）凝集塊（ｆｌｏｒｋｕｌａｔｅｓ　）及び
組織の厚い部分では完全ではない。
３、　多数の体細胞の存在下に於ける微生物細胞の既定 ＡＴＰあるいはＦＭＮの如きヌクレオチドを測定する場
合であって、細菌試料が非微生物細胞を含んでいるとき
には、非細菌細胞のヌクレオチドは細菌ヌクレオチドを
測る前に排除すべきである。
初期のホタル生物発光法に於て＃−ｉ、これは非細菌細
胞を非イオン性界面活性剤であるトライトンＸ７１００
．によシ溶解し、かつ非細菌系＾ＴＰを破壊するために
核試料に、アビラーゼのようなＡＴＰ−アーゼ酵素を添
加することによシなされ８ ていた。その後、細菌系ＡＴＰは、ＡＴＰを抽出し、そ
して沸騰トリス−ＥＤＴ＾緩衝液、有機溶剤、塩基、酸
、及び他の普通の方法で、アビラーゼを不活性化するこ
とにより測定された。（米国特許第５．７４５，０９０
号） 上述の方法は幾つかの欠点を有している。すなわち、ト
ライトンｘ−１００は非細菌細胞の総てのタイプのもの
からＡＴＰを定量的に抽出することができない。更に、
トライトンＸ−１００はグラム陽性細菌からＡＴＰを解
放し、またそれは生物発光反応を低下させる。かくて、
上述の方法上。
体液及び食品中にある細菌の測定に不正確さをもたらす
。また、アビラーゼを不活性化させ、かつ細菌細胞から
ＡＴＰを解放させるために、該試料を沸騰トリス−ＥＤ
ＴＡ緩衝液で処理すると、該試料は極めて希釈され、そ
れで該方法の感度は低下する。Ｊ（米国特許第５，７４
５，０９０号）細菌試料から非細菌系＾ＴＰを排除する
４つの改良法が本発明に関連する。
第１の方法は次のようなものである。ＡＴＰのような非
細菌系ヌクレオチドが、細菌細胞壁の透過性に影響を与
えないような非イオン性界面活性剤あるいけ他の界面活
性剤により解放され、かつ試料の５０μｌ〜１００ｔｎ
１１好ましくは５０〜１　＃　ＯＯＯμｍ、が、０．１
〜２μｍ好ましくは０．２〜０．４５μｍの孔を有する
膜濾過器により濾過される。非細菌系＾ＴＰは濾過器を
通り、排除される。一方、損われていない細菌は濾過器
上に残される。該濾過器は、次いで緩衝液、生理食塩水
あるいは蒸留水ですすぎ、そして透明な測定用がラスび
んの中に置き、それからエトキシル化アミンと第４級エ
トキシル化アミンとの混合物のような、イオン性界面活
性剤を０．０５〜２％の濃度で添加して細菌系ＡＴＰを
解放させ、かつ引き続いてホタル生物発光反応で測定さ
れる。この方法に於ては、操作は単純かつ早い。しかも
塩類、着色物質酵素抑制剤等の如き、非細菌系ＡＴＰ以
外の妨害性物質が除かれる。更に、試料は希釈されず、
むしろ濃縮され、かくて分析感度は高められる。また平
たい底の測定がラスびん、及び該１ ガラスびんの内径より小さい直径を有する濾過器を用い
ると、濾過膜は該がラスびんの底部に置くことができ、
その結果濾過器は、液体試料と光検知器との間の光をさ
えぎらない。
第２法は次の通りである。
試料０．１〜１００−１好ましくは０．５〜１０−を、
フィルター表面に薄い液体膜が残る迄、０．１〜０．４
５μｍの膜濾過器で濾過する。濾過器は乾燥すると細菌
にひずみを起させそのＡＴＰを通常以下の水準に減少さ
せるので乾燥してはならない。非イオン界面活性剤例え
ばエトキシル化フェノールの０．０１〜１％、好ましく
は０．１〜０．２％の溶液をフィルターに０．０１〜１
０ｍ１、好ましくは０．１〜０．５−加える。１０〜６
０秒後その液体を濾過して空にするが、濾過器を乾燥さ
せない。濾過器を０．１〜１０−の滅菌水、生理食塩水
又は適当な緩衝液で１〜３回すすいで、全ての非細菌系
Ａｖｐｆ：濾過器、細胞断片ちるいけ濾過器支持具の壁
から除去するが、すすぎ液を濾過する間、濾過器を乾燥
させてはならな２ い。すすぎ終った後、濾過器をイオン性界面活性剤、好
ましくは９５：５〜５：９５．好ましくは７０：３０の
比のエトキシル化アミンとエトキシ化アミンの第４級ア
ンモニウム塩との混合物の０．０１〜１％、好ましくは
０．０５〜０．２％溶液０．０５〜１０−１好ましくは
０．１〜１ｄで覆う。エトキシル化アミンは炭素数１２
の主鎖のものが好ましい。この試薬を濾過器上で細菌細
胞に１０〜３０秒間作用させ細菌細胞から放出されたＡ
ＴＰ含有液を試験管又は直接測定用クヴエット中に濾過
する。濾過器及び濾過器支持具を０．０５〜１０−１好
ましくは０．１〜０．５−の蒸留水で、ＡＴＰを含有す
るイオン性界面活性剤の溶液と同じ容器中に濾過する。
かくて測定用試料が出来上る。
非細菌系ヌクレオチドを除去するもう一つの方法は遠心
分離である。体細胞のヌクレオチドを非イオン性界面活
性剤１例えばエトキシル化フエ、、！−ルによって解放
させ、細菌を３０００〜２０．０００ｆで１〜２０分間
遠心分離することによって沈殿させる。解放された非細
菌系ヌクレオチドを有する上澄水をすて、細菌を少量の
水、塩水又は緩衝液で再懸濁させ、細菌系ヌクレオチド
を、全容積の０．０５〜２％の濃度の非イオン性界面活
性剤２例えばエトキシル化アミンを添加して解放させる
。その直後に、細菌系ヌクレオチドの濃度を生物発光法
により測定出来る。高い空試験値（非細菌系ＡＴＰ）は
、水、緩衝液または塩溶液で更に洗浄し、次いで遠心分
離し、その後イオン性界面活性剤の添加及び細菌系ヌク
レオチドの測定を行なうことにより低下させることが出
来る。
第３の方法は、不動態形のアビラーゼのようなＡＴＰア
ーゼを応用する。その方法は次の通りである。
体細胞及び微生物細胞の両方を含有する０、０５〜１０
−１好ましくは０．１〜１−の試料または７゛・濾過器
膜を、ホタルの生物発光反応を妨害しない０．０１〜２
％、好ましくは０．０５〜０．２にの非イオン性界面活
性剤１例えばエトキシル化フエノール０．０５〜１０−
１好ましくけ０．１〜１−で処理する。この処理によっ
てＡＴＰが数秒で体細胞から解放きれる。不動態化した
＾ＴＰアーゼ０．１〜１０単位、好ましくけ１〜５単位
をがラスビーズ、プラスチック棒、ｉＩ！、維素又は他
の繊維類、金属ビーズ、ラテックス又は他の高分子ビー
ズの形で加えるか、あるいはアビラーゼを試験管壁で不
動態化出来る。試料を２０〜５７℃の温度で、攪拌し又
は橿拌せずに、０．５〜３０分好ましくけ１〜１０分間
培養し、アビラーゼにより体細胞系ＡＴＰを破壊させる
。培養後、０．０１〜１０−１好ましくは０．０５〜１
ｆｎｔの試料を０．０１〜１％、好ましくは０．０５〜
０．２腎のイオン性界面活性剤、例えばエトキシル化ア
ミン及び好１しくけエトキシ化アミンと第４級アミン塩
を有するエトキシル化アミンとの５＝９５〜９５　：５
．好寸しくは７０：３０の比の混合物０　、１〜１０　
ｍｌ　、好ましくＦｉｏ、０５〜１−で処理する。これ
により微生物系ＡＴＰが数秒で解放され、細胞数が細菌
については１０８　／−以下。
酵母及び菌類については１０　／−以下の場合に、細菌
からは１０〜１５秒で、酵母及び菌類からは２０〜６０
秒で定量的に解放される。この微生物系ＡＴＰの濃度は
ホタルの生物発光試薬により測定出来る。ＡＴＰの濃度
は公知種についての細胞当りのＡＴＰの測定値、即ち文
献（Ｄ’Ｅｕ５ｔａｃｈｌｏ　。
Ａ、Ｊ、＋　Ｄ、Ｒ，Ｊｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｇ、Ｊ
、　Ｌｅｖｌｎ、　Ｒａｐｉｄａｓｓａｙ　　ｏｆ　　
ｂａｃｔｅｒｌａ　　ｐｏｐｕｌａｔｌｏｎｓ、　　日
ａｃｔｅｒｌｏｌ。
Ｐｒｏｃ、　２１　：　２３−ｔ　１９６８．及びＴｈ
０ｒｅ＊＾、、Ｓ。
Ａｎｓｅｈｎ、Ａ、　　Ｌｕｎｄｌｎ　　ａｎｄ　　Ｓ
、　　Ｂａｒｇｍａｎ、　　Ｄｅｔｅｃｔｌｏｎｏｆ　
ｂａｃｔｅｒｌｎｒｌａ　ｂｙ　Ｉｕｃｌｆｅａｓｅ　
ａｓｓａｙ　ｏｆ　ａｄｅｎｏｓｌｎｅｔｒｌｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ、　Ｊ、　ＣｌＩｎ、　Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌ
、　１　：　１−８゜１９７９及び米国特許第３，７４
５．０９０号）に報告されているように、細菌の未知の
混合集団については細胞当りの０．５〜２フエムトグラ
ム（０、４Ｘ　１０−１５　　）　、醸造酵母について
は細胞当り１３０〜１７０フエムトグラムを使用して細
菌の細胞数に換算される。
この最ｇの便法は既存のサンプルチャンサー（ｓａｍｐ
ｌｅ　ｃｈａｎｃｅｒ　）　　と分配装置を用いて容易
に自５ 勧化出来る。
アビラーゼ酵素の使用については上記の文献及び米国特
許第３，７４５，０９０号に報告されているが、これを
不動態形態のものに以前に応用したということは知られ
ていない。不動態化したアビラーゼを使用すると、加熱
又は化学的手段によるアビラーゼの不活性化を必要とせ
ず、細菌からＡＴＰを解放させるのに、イオン性活性剤
、例えばエトキシル化アミンの使用を不能にする。この
方法は連続法及び個別試料チューブ法の何れについても
容易に自動化出来る。不動態化したアビラーゼは緩衝液
で洗条して＋４℃で緩衝液中に貯蔵すれば繰返し数週間
にわたって使用出来る。
一般説明 本明細書に開テしたような１本発明の方法は。
生化学分析のために、特にホタルのルミフェリン−ルシ
フェラーゼ系によるＡＴＰの生物発光分析のために、Ａ
ＴＰのような買クレオチドを抽出する慣用の方法と比べ
て時間の節約をもたらす。さらに、ＡＴＰの測定は体細
胞または微生物細胞に３６ 対し選択的に行なうことができる。試料の調製は迅速で
、効果的で、かつ再現可能であり、界面活性剤ｉｊルシ
フェリンールシフェラーゼ生物発光反応を妨害しないよ
うに、或いはＡＴＰのようなヌクレオチドの安定性に影
響を与えないように選ぶことができる。
本発明の原理、好ましい態様および操作形式は明細書中
に記載されている。本明細書に記載の界面活性剤の例、
操作形式および適用分野は開示された特定の形式に限定
されると解釈されてはならない、というのはこれらは限
定的例ではなくて、例示的なものと見なされるべきであ
るからである。
【図面の簡単な説明】
第１図は細菌の試料にイオン性界面活性剤を加えた後の
時間の関数としての光信号を示す。数字は試料中食濃度
０．１ににおけるエトキシル化アミンおよび第４級エト
キシル化アミンの百分率をそれぞれ示す。両者ともに１
２個の炭素原子鎖長を有していた。八は界面活性剤の添
加時間、Ｂはホタル試薬の添加時間を示す。 手続補正書（方式） １．事件の表示　＋１／−４和ｊ３年　特　許　願　　
第　ｔｓｓ９ｔ　　　号２、発明の名称　　　生活力の
ある体ａｍおよび微生物細胞の選択的測定法 ３、補正をする者 事件との関係　　　出願人 喚冒−氏名　　セッポ　コルノナン 外１名 ４、代理人 住　所　　１１ｆｌｊｆｉｌ下代川＋ｉ（九）内３　丁
目３　Ｗ　Ｉ　ＩＪ　Ｃ１１ｊｆｆＡ　代ｉ’ｚ　２＋
１−８７４１１１＋）５、補正命令の日付　　　自　発 ６、補正の対象　臀亨＝千亨！ 明細書 ７、補正の内容　　別紙の通り 特許庁長官　　若　杉　和　夫　　殿 １、事件の表示　　昭和５３年特許願第６５５９６号２
、発明の名称　　生活力のある体細胞および微生物細胞
の選択的測定法 ３、補正をする者 事件との関係　　出願人 氏　名　　　セッポ　コルメナン ５、補正命令の日付　　昭和５３年８月２９日６、補正
の対象　　　　国籍証明書　　全図面内、御指令に係る
明細書につきましては、昭和５３年８月２３日付手続補
正書（方式）にて提出済でありますので、よろしく御審
査願います。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）　　界面活性剤の助けによって細胞壁を通して代
    謝産物を解放させ、その代謝産物の濃度をホタルまたは
    燐光萌の生物発光のような発光系によって測定すること
    により、体細胞または微生物細胞中のＡＴＰのような代
    謝産物を選択的に測定する方法。 （２１０，０２〜０．５チの濃度の、エトキシル化ノニ
    ルフェノールおよびエトキシル化オクチルフェノールの
    ようなエトキシル化アルキルフェノールを包含する（た
    だしこれらに限定されない）非イオン系界面活性剤によ
    って体細胞および非微生物細胞からのＡＴＰの解放を選
    択的に達成し、そのＡＴＰの濃度を光度計中でホタルノ
    ルジフェリン−ルシフェラーゼ試薬−ｔ’　測定−する
    特許請求の範囲第（１）項記載の方法。 ＋３１０．０２〜０．５チの濃度の、エトキシル化アミ
    ン、およびエトキシル化アミンと鎖中に１２個の炭素原
    子を有するエトキシル化７２ンの４ｖｌＩアンモニウム
    塩との混合物を含む（ただしこれに限定されない）イオ
    ン性界面活性剤によって非微生物細胞の不存在で微生物
    細胞からＡＴＰの解放を達成し、ＡＴＰの濃度をホタル
    のルシフェリン−ルシフェラーゼ試薬で測定する特許請
    求の範囲第（１）項記載の方法。 （４）　　非微生物細胞の存在で、 ａ、０．０２〜０．５係の濃度の、エトキシル化アルキ
    ルフェノールのような非イオン性界面活性剤で試料を処
    理して非微生物系ＡＴＰを選択的に解放し、 ｂ、不動態状の馬鈴薯アビラーゼのようなＡＴＰアーゼ
    酵素の１〜５単位を試料に加え、ｃ、　２０〜３７℃で
    １〜１０分間にわたり試料を培養してその間にアぎラー
    ゼにより非微生物系ＡＴＰを加水分解させ、 ｄ、試料から、あるいは既知小量の試料を取り出すこと
    によって試料から不動態状のアビラ−ゼをのぞき、 ｅ、ＡＴＰｆの測定をホタルのルシフェリン−ルシフェ
    ラーゼ試薬で光度計中でなすこと、によって微生物細胞
    からＡＴＰの解放を達成する特許請求の範囲第（１）項
    記載の方法。 （５）　　非微生物細胞の存在で、 ａ、０．０２〜０．５チの濃度の、エトキシル化ノニル
    フェノールおよびエトキシル化オクチルフェノールのよ
    うなエトキシル化アルキルフェノールのごとき非イオン
    性界面活性剤で試料を処理して非微生物系ＡＴＰを選択
    的に解放し、 ｂ、　１０〜６０秒の待ち時間の後に試料を濾過して、
    解放された非微生物系ＡＴＰを除去し、Ｃ１試料および
    濾過装置を滅菌水、舒衝液または嬉水で洗浄して非細菌
    系ＡＴＰの痕跡をのぞき、 ｄ＋、測定用クヴエットの底部に濾過膜を置き、０．０
    ２〜０．５チの濃度の、エトキシル化アミン、およびエ
    トキシル化アミンと１２個ノ炭素原子鎖を有するエトキ
    シル化アミンの４級塩との混合物のような非イオン性界
    面活性剤を加えて、微生物細胞からＡＴＰを解放するか
    、 ｄ２．別法として、０．０２〜０．５チの濃度の、エト
    キシル化アミン、およびエトキシル化アミンと１２個の
    炭素原子鎖を有するエトキシル化アミンの４級塩との混
    合物のような非イオン性界面活性剤で非微生物系ＡＴＰ
    を洗浄したのちに濾過膜をおおって微生物系ＡＴＰを解
    放し、１０〜６０秒の待ち時間の後で濾過器上の溶液を
    測定用クヴエット、マたはクヴエツ）ＫビベツＦで入れ
    ることのできる他の容器の中に濾過し、しかる後に、 ｅ、　　ｄ＋　　またはｄ２　　にしたがって処理した
    試料を、つぎにＡＴＰの濃度について光度計中でホタル
    のルシフエリンールシフェラーゼ試薬で測定する、微生
    物細胞からＡＴＰの解放を達成する特許請求の範囲第（
    １）項記載の方法。
JP53065596A 1977-05-31 1978-05-31 微生物細胞中のａｔｐの測定方法 Granted JPS5991900A (ja)

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