FI93742C - Menetelmä ja laite solujen osoittamiseksi - Google Patents

Description

93742

Menetelmä ja laite solujen osoittamiseksi

Keksinnön kohteena on menetelmä ja laite solujen osoittamiseksi. Keksinnön kohteena on edelleen tarvikepak-5 kaus, joka soveltuu käytettäväksi keksinnön mukaisessa menetelmässä. Tarkemmin ilmaistuna keksintö koskee menetelmää solujen osoittamiseksi, jolloin tutkittava näyte suodatetaan solujen erottamiseksi ja suodattimen erottamat solut käsitellään siten, että niistä vapautuvat solujen 10 osoitusreaktiossa käytettävät komponentit.

Solujen osoittaminen liittyy monien tieteen ja tekniikan alojen sovelluksiin. Näitä sovellusaloja ovat mm. kliininen ja diagnostinen tutkimus, biotekniikka ja molekyylibiologia sekä elintarvike- ja ympäristöanalytiikka.

15 Soluja voidaan osoittaa monella tavalla sekä suo raan että epäsuorasti. Eräs epäsuora tapa on määrittää tietyt solukomponentit esim. niiden kemiallisten, biologisten, immunologisten tai fysikaalisten ominaisuuksien perusteella.

20 Ennen solujen osoitusta näyte joudutaan usein suo dattamaan esim. sen takia, että näytetilavuus on niin suuri ja solupitoisuus on niin alhainen, että osoitusreaktiossa käytettävien menetelmien herkkyys ei ole riittävä, tai sen takia, että solut halutaan pestä suodattimena « < 25 ennen varsinaista määritystä. Kun solut on konsentroitu suodattimelle ja mahdollisesti pesty, ne käsitellään siten, että niistä vapautetaan solujen osoitusreaktiossa käytettävät komponentit, jotka määritetään suodattimena (WO-hakemus 88/08037 ja EP-patentti 101 398).

30 Tällaisissa solujen osoitusmenetelmissä ongelmia I; aiheuttavat monet epäpuhtaudet, jotka haittaavat määrityk siä. Epäpuhtaudet ovat mm. jäljellä olevat solut ja solu-pirstaleet sekä muut näytteessä esiintyvät kiinteät hiukkaset. Myös itse suodatin voi aiheuttaa häiritsevän taus-35 tan. Lisäksi menetelmä on työläs ja hävikki saattaa olla 2 93742 suuri varsinkin näytteissä, joiden solutiheys on alhainen.

Keksinnön tavoitteena oli kehittää menetelmä ja laite, joiden avulla suodatetut solut voidaan osoittaa luotettavasti ja kätevästi. Keksinnön mukaiselle menetel-5 mälle on tunnusomaista, että soluista vapautetut komponentit erotetaan soluista saman suodattimen avulla, jota käytetään näytteen suodatukseen, ja suodoksesta määritetään mainitut komponentit solujen läsnäolon osoittamiseksi alkuperäisestä näytteestä.

10 Osoittamalla solukomponentit suodoksesta eikä suo dattimesta, vältetään yllä mainittuja epäpuhtauksia ja suodattimen aiheuttamaa taustaa. Erottamalla soluista vapautuneet, osoituksen kannalta tärkeät solukomponentit samalla suodattimena, jota käytetään näytteen konsentroin-15 tiin, minimoidaan työ- ja materiaalikustannukset sekä hävikit solujen tai niiden komponenttien pitoisuuksissa. Lisäksi on mahdollista yhtaikaa määrittää useampia solukom-ponentteja, jotka voivat olla peräisin useasta eri solu-tyypistä .

20 Keksinnön mukaista menetelmää voidaan soveltaa hy vin erityyppisille näytteille. Menetelmä soveltuu hyvin näytteille, joilla on suuri tilavuus ja alhainen solupi-toisuus. Menetelmää sovelletaan edullisesti nestemäisille näytteille, mutta myös muut näytteet voivat tulla kysymyk-25 seen, kuten kaasu, jota mahdollisesti ensin voidaan uuttaa nesteeseen. Alunperin kiinteät näytteet voidaan liuottaa tai suspensoida nesteeseen ja mahdollisesti esisuodattaa tai poistaa häiritsevät aineet muulla tavalla esim. sent-rifugoimalla ennen osoitusta. Keksinnön mukaista menetel-30 mää voidaan soveltaa esim. elintarvike- ja juomateol-[' lisuudessa, vesi-, kaasu- ja ilmatutkimuksissa sekä hygie nian valvonnassa yleensä.

Tutkittava näyte lasketaan läpi suodattimesta, jonka huokoskoko on valittu erotettavien solujen koon perus-35 teella. Menetelmä sopii varsin hyvin esim. bakteerien 93742 3 osoittamiseen, jolloin yleensä käytetään 0,2 - 0,5 pm:n huokoskokoa. Eukaryoottisolujen kohdalla käytetään vastaavasti suurempaa huokoskokoa ja virusten kohdalla pienempää. Suodatuksessa voidaan käyttää apuna esim. imua 5 tai painetta.

Suodatus voidaan suorittaa tavanomaisessa suodatus-laitteessa, jossa suodatin asetetaan suppilon pohjalle ja suppilo asetetaan imupullon suuhun ja imupulloon muodostetaan alipaine esim. vesipumpun avulla. Vaihtoehtoisesti 10 voidaan käyttää esim. injektioruiskua, jolloin näyte imetään ruiskuun, ruiskun päähän asetetaan suodatin ja sitten näyte painetaan suodattimen läpi. Tietysti on myös mahdollista käyttää muita suodatusjärjestelmiä.

Kun näytteessä olevat solut on kerätty suodattimel-15 le on usein tarkoituksenmukaista suorittaa pesu laskemalla pesuliuosta läpi suodattimesta. Pesuliuoksena voidaan käyttää esim. tislattua vettä tai puskuria. Tähän asti saadut suodokset hävitetään. Mahdollisen pesun jälkeen solut käsitellään siten, että niistä vapautuvat niiden 20 osoituksen kannalta tärkeät solukomponentit. Käsittely voidaan suorittaa kemiallisesti tai fysikaalisesti ja edullisesti niin, että solut tai pääosa niiden rakenteista jäävät suodattimelle. Kemiallinen käsittely voi olla esim. entsymaattinen käsittely, detergenttikäsittely, uutto ·, 25 esim. hapolla tai emäksellä tai muulla sopivalla liuot timena tai huuhtelu vedellä tai puskuriliuoksella tai osmoottinen shokki. Fysikaalisesti halutut solukomponentit voidaan irrottaa soluista esim. jääpuristimella, sonikoi-malla, elektroporaatiolla, ravistelulla tai muulla mekaa-30 nisella toimenpiteellä.

Edullisesti poistetaan soluista pintakerros, johon tässä yhteydessä voivat sisältyä myös solujen ulokkeet, ja erityisesti irrotetaan ja rikotaan bakteerien flagellat ja määritetään flagelliinia sisältävät tai niitä muistuttavat 35 rakenteet. Esimerkiksi bakteerien pintakerros ulokkeineen 4 93742 k voidaan poistaa miedolla happokäsittelyllä. Tällöin esimerkiksi flagellat irtoavat ja dissosioituvat samanaikaisesti flagelliini-molekyyleiksi.

Osoitusreaktion kannalta tärkeät, irrotetut kompo-5 nentit huuhdellaan läpi samasta suodattimesta, jota käytetään näytteen suodatukseen. Suodos kerätään talteen ja solujen esiintyminen alkuperäisessä näytteessä osoitetaan huuhteluliuoksesta suodattimen läpi tulleiden komponenttien reaktioiden avulla solukomponenttien kemiallisten, 10 biologisten, fysikaalisten tai immunologisten ominaisuuksien perusteella. Solukomponenttien osoitusmenetelmiä on lukuisia sisältäen mm. biokemialliset, immunologiset ja radiokemialliset analyysit. Osoitukseen tarvittavat rea-genssit voidaan myös viedä mainitun suodattimen läpi tai 15 ne voidaan lisätä suoraan suodokseen.

Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää sekä yleismenetelmänä solujen osittamiseen että tietyn solutyypin tunnistamiseen. Jos ollaan kiinnostuneita solujen esiintymisestä yleensä, välittämättä niiden identifikaa-20 tiosta, on tarkoituksenmukaista määrittää joku soluissa yleisesti esiintyvä komponentti, kuten esim. LPS tai sen rakenneosat. Vaihtoehtoisesti menetelmää voidaan käyttää tietyn kiinnostuksen kohteena olevan solutyypin tai -kannan osoittamiseen, jolloin määritettäväksi solukomponen-25 tiksi valitaan sellainen, joka esiintyy vain kiinnostuksen kohteena olevassa solussa. Hyvin spesifiseen määritysmenetelmään päästään käyttämällä immunologisia menetelmiä.

Samasta suodoksesta on mahdollista määrittää useampia so-lukomponentteja yhtaikaa, mikä on edullista. Toisin sa-30 noen on mahdollista määrittää useampia solutyyppejä yht-aikaa valitsemalla määritettävät solukomponentit siten, että toinen komponentti esiintyy vain toisessa solutyypissä ja toinen vain toisessa jne.

Keskinnön mukainen menetelmä sopii varsin hyvin 35 esimerkiksi solun jonkin pintakomponentin määrittämiseen, 11 93742 5 kuten solunseinän tai solumembraanin proteiinien, LPS:n, kapselipolysakkaridien, vaippaproteiinien (esim. RS-pro-teiinit), flagelloiden tai muiden solujen ulokkeiden tai niitä muistuttavien rakenteiden tai niiden rakenneosien 5 jne. määrittämiseen. Vapautetut solukomponentit määritetään sen jälkeen, kun ne on erotettu solujen pääosisista suodattimen avulla, tavanomaisilla menetelmillä esim. pro-teiinimääritysmenetelmällä tai immunologisella määritysmenetelmällä. Periaatteessa kaikkia soluista irronneita pro-10 teiineja voidaan käyttää solujen läsnäolon osoittamiseen alkuperäisestä näytteestä. Sopivia tähän tarkoitukseen ovat mm. geelielektroforeesi ja immunotäplitys.

Keksinnön piiriin kuuluu lisäksi laite, joka soveltuu käytettäväksi yllä kuvatussa menetelmässä. Keksinnön 15 mukaiselle laitteelle on tunnusomaista, että se käsittää elimet tutkittavan näytteen suodattamiseksi solujen erottamiseksi; välineet suodattimen erottamien solujen käsittelemiseksi siten, että niistä vapautuvat solujen osoitus-reaktiossa käytettävät komponentit; elimet soluista vapau-20 tuneiden komponenttien erottamiseksi soluista ja elimet mainitun komponentin määrittämiseksi suodoksesta solujen läsnäolon osoittamiseksi alkuperäisestä näytteestä.

Elimet tutkittavan näytteen suodattamiseksi solujen erottamiseksi voivat käsittää esim. yhden tai useamman as-. 25 tian, joka on yhteydessä suodattimeen, joka on yhteydessä jätesäiliöön, näytteen ja mahdollisen pesuliuoksen viemiseksi suodattimen läpi sekä mahdollisesti elimen näytteen viemiseksi suodattimen läpi, kuten esim. pumppu tai puristin. Suodattimen huokoskoko valitaan erotettavien solujen 30 koon perusteella.

^ Välineet suodattimen erottamien solujen käsittele miseksi siten, että niistä vapautuvat solujen osoitusreak-tiossa käytettävät komponentit voivat käsittää astian, joka on liitetty suodattimeen solukomponentteja vapautta-35 vien reagenssien viemiseksi suodattimeen tai välineet so- 6 \ 9 3 742 lukomponenttien irrottamiseksi fysikaalisesti sekä välineet huuhteluliuoksen viemiseksi suodattimeen.

Elimet soluista vapautuneiden komponenttien erottamiseksi soluista muodostuvat samasta suodattimesta, jota 5 käytetään näytteen suodatukseen, ja mahdollisesti välikappaleesta, kuten esim. siirtolaitteesta, jonka avulla saman suodattimen käyttö on mahdollista. Lisäksi ne voivat käsittää astiat, jotka ovat yhteydessä suodattimeen reagens-sien viemiseksi mainitun suodattimen läpi elimiin mainitun 10 solukomponentin määrittämiseksi.

Elimet solukomponentin määrittämiseksi käsittävät mittausaseman, joka voi käsittää osoitusyksikön, detekto-riyksikön ja elektroniikkayksikön määritettävän soluista vapautuneen komponentin havaitsemiseksi. Osoitusyksikkö 15 voi käsittää esim. erityyppisiä analyysijärjestelmiä, va lolähteen jne. soluista vapeutettujen komponenttien osoittamiseksi niiden kemiallisten, biologisten, immunologisten tai fysikaalisten ominaisuuksien perusteella. Detektoriyk-sikkö voi käsittää mm. valonmittauslaitteita, radioaktii-20 visuuden mittauslaitteita jne. Mittausasemaan sisältyy yleensä vielä elektroniikkayksikkö saadun signaalin vastaanottamiseksi. Elektroniikkayksikkö on edullisesti kytketty tietojenkäsittely-yksikköön ja ohjausyksikköön. Mittausasema on edullisesti myös yhteydessä astioihin määri-' 25 tyksessä käytettävien ajoliuosten ja eluointiliuosten vie miseksi mittausasemaan, joka toisesta päästä voi olla yhteydessä jätesäiliöön. Edullisesti mittausasema on sellainen, että sen avulla voidaan määrittää useampi solukom-ponentti yhtaikaa.

30 Keksinnön mukaiseen laitteeseen sisältyy yleensä :* venttiilit tai muut siirtoelimet, joiden avulla käytetyt reagenssit, itse suodatin tai tutkittava suodos voidaan ohjata haluttuun kohtaan.

Edullisesti laite käsittää näytteensyöttösammion ja 35 pesuliuossammion, jotka ovat yhteydessä suodattimeen, joka on yhteydessä jätesäiliöön; siirtolaitteen suodattimen • 7 9 o 7 42 siirtämiseksi toiseen asemaan, johon on liitetty kolmas sammio uuttoliuosta varten ja joka on yhteydessä siirrettyyn suodattimeen, joka vuorostaan on yhteydessä mittausasemaan, tietojenkäsittely-yksikköön ja ohjausyksikköön; 5 sekä astiat ajoliuosta varten ja eluointiliuosta varten, jotka myös on kytketty mittausasemaan.

Keksinnön mukaisen laitteen avulla keksinnön mukaista menetelmää voidaan pitkälti automatisoida. Keksinnön kohteena on myös laitteen käyttö keksinnön mukaisessa 10 menetelmässä. Edullisesti laitetta käytetään useamman so-lukomponentin osoittamiseen yhtaikaa samasta näytteestä.

Kuviossa esitetään esimerkki keksinnön mukaisesta laitteesta. On selvää, ettei esitetty toteutusmuoto ole ainoa mahdollinen keksinnön piiriin kuuluva.

15 Kuvio esittää näytteen syöttösammion 1, joka vent tiilin 7 kautta on yhteydessä suodattimeen 10 ja venttiilin 14 kautta jätesäiliöön 6 näytteen viemiseksi suodattimen läpi jätesäiliöön. Suodattimeen on edelleen venttiilin 8 kautta liitetty toinen sammio 2 pesuliuoksen viemiseksi 20 suodattimen läpi. Laitteeseen kuuluu edelleen siirtolaite 13 suodattimen siirtämiseksi asemaan 11 ja 12. Asemaan 11 on venttiilin 9 kautta liitetty sammio 3 uuttoliuoksen viemiseksi suodattimeen. Asemassa 11 oleva suodatin on venttiilin 15 kautta kytketty mittausasemaan 18 uutto-·, 25 liuoksen viemiseksi mittausasemaan, johon venttiilin 16 kautta on liitetty sammio 4 ajoliuoksen viemiseksi siihen. Mittausasema on kytketty tietojenkäsittelyyksikköön 19 signaalin tulkintaa ja tulostusta varten. Laitteeseen kuuluu myös ohjausyksikkö 20 laitteen venttiilien ja mui-30 den mekaanisten toimilaitteiden toiminnan ohjaamiseksi ja virran syöttämiseksi. Mittausasemaan on edelleen venttiilin 17 kautta liitetty sammio 5 eluointiliuoksen viemiseksi mittausasemaan regenerointia varten. Asema 12 on suodattimen vaihtoasema.

35 Kuvattua laitetta käytetään seuraavasti; Tutkittava 93742 näyte syötetään syöttösammioon 1, josta se paineella viedään venttiilin 7 kautta suodattimen 10 ja venttiilin 14 läpi jätesäiliöön 6. Suodattimelle jääneet solut pestään venttiilin 8 kautta syötettävällä pesuliuoksella sammiosta 5 2. Tämän jälkeen suodatin siirretään siirtolaitteen 13 avulla asemaan 11, jossa suodattimelle jääneet solut uutetaan sammion 3 liuoksella venttiilin 9 säätelemänä. (Suodattimen siirtämisen sijasta on tietysti mahdollista ohjata uuttoliuos paikallaan olevaan suodattimeen, josta suo-10 dos ohjataan mittausasemaan esim. tarkoituksen mukaisten venttiilien kautta.) Uutos ajetaan venttiilin 15 kautta mittausasemaan 18, jonka läpi se viedään sammion 4 ajo-liuoksella, joka syötetään venttiilin 16 kautta. Mittausasemasta saatu signaali tulkitaan tietojenkäsittelyyksikön 15 19 avulla. Tietojenkäsittely-yksikkö tulostaa tulkitseman sa signaalin ja arvioi määritettävien solukomponenttien läsnäolon ja määrän. Ohjausyksikkö 20 ohjaa laitteiston venttiilien ja muiden mekaanisten toimilaitteiden toimintaa sekä syöttää virtaa järjestelmälle. Mittauksen jälkeen 20 mittausasema regeneroidaan sammion 5 eluointiliuoksella, joka syötetään venttiilin 17 kautta. Asemassa 12 korvataan käytetty suodatin uudella.

Keksintö koskee edelleen tarvikepakkausta, joka käsittää menetelmässä käytettävät välineet. Tarvikepak-25 kaukselle on tunnusomaista, että se käsittää välineet tutkittavan näytteen suodattamiseksi solujen erottamiseksi; välineet suodattimen erottamien solujen käsittelemiseksi siten, että niistä vapautuvat solujen osoitusreaktiossa käytettävät komponentit; välineet soluista vapautuneiden 30 komponenttien erottamiseksi soluista ja välineet mainitun komponentin määrittämiseksi suodoksesta solujen läsnäolon osoittamiseksi alkuperäisestä näytteestä.

Välineet tutkittavan näytteen suodattamiseksi solujen erottamiseksi käsittävät edullisesti suodattimet ja 35 niihin liitettävät, suodatukseen sopivat astiat sekä mah- 93742 9 dollisesti tarvittavat pesuliuokset. Välineet solujen käsittelemiseksi käsittävät edullisesti reagenssit solujen osoitusreaktiossa käytettävien komponenttien vapauttamiseksi, ja välineet, joilla komponentit erotetaan soluista 5 muodostuvat samasta suodattimesta, jota käytetään näytteen suodatukseen. Välineet komponentin määrittämiseksi suodok-sesta käsittävät määrityksessä käytetyt reagenssit. Määrityksessä käytetyt laitteet eivät yleensä sisälly tarvike-pakkaukseen.

10 Keksinnön mukaisen tarvikepakkauksen suodattimet valitaan erotettavien solujen koon perusteella. Suodatti-meen liitettävät, suodatukseen sopivat astiat voivat olla imupulloon liitettäviä suppiloita tai injektioruiskuja. Solukomponenttien vapauttamiseen käytettävä reagenssi voi 15 olla esim. entsyymi-, detergentti-, happo- tai emäsliuos tai muu liuotin, vesi tai puskuri. Soluista vapautettujen komponenttien osoitukseen tarvittavat reagenssit voivat olla mitkä tahansa tavanomaisessa solukomponettien osoitusreaktiossa tarvittavat reagenssit, kuten esim. proteii-20 nimäärityksessä tai immunoanalyysissä käytettävät reagenssit.

Keksinnön mukainen tarvikepakkaus sisältää edullisesti näyte- ja reagenssiastiat, suodattimet, reagenssit osoitusreaktiossa käytettävien solukomponenttien vapautta-25 miseksi sekä reagenssit vapautettujen komponenttien määrittämiseksi.

Keksintöä valaistaan tarkemmin seuraavien esimerkkien avulla.

Esimerkki 1 30 1,5 ml:n bakteeriviljelmät, jotka sisälsivät .. Pectinatus frisingiensis-kantaa VTT-E-82165 (Hakalehto, E.

ja Finne, J, 1990, FEMS Microbiology Letters 67, 307-312) imettiin 2 ml:n injektioruiskuun ja puristettiin ruiskun päähän asetetun suodattimen läpi, jonka huokoskoko oli 35 0,45 pm (Millipore Millex HA). Solut huuhdeltiin tislatul- 93742 10 k la vedellä. Saadut suodokset hävitettiin. Saman suodattimen läpi vietiin sitten toisen ruiskun avulla noin 0,2 ml 0,05 M HC1 ja suodos kerättiin talteen Eppendorff-putkeen ja neutraloitiin NaOHclla.

5 Tämän jälkeen suodoksiin lisättiin SDS-polyakryy- liamidigeelielektroforeesissa (SDS-PAGE) käytettävää näy-tepuskuria ja niille suoritettiin SDS-PAGE, kuten julkaisussa Laemmli, U.K., 1970, Nature (London) 227, 680-685 on kuvattu, käyttäen 8-%:ista geeliä ja kaupallisia molekyy-10 lipainostandardeja (Pharmacia). Osa näytteistä keitettiin ennen ajoa. Geelit värjättiin proteiinivärillä Coomassie Brilliant Blue (CBB) ja/tai tehtiin immunotäplitys käyttäen mainitun bakteerikannan soluilla immunisoidusta kanista saatua vasta-ainetta (Hakalehto, E. ja Finne, J., 15 1990, FEMS Microbiology Letters 67, 307-312). Sekä suora- värjäyksessä että immunotäplityksessä havaittiin selvä vyöhyke noin 63 kDa:n kohdalla, mikä osoitti Pectinatus frisingiensis-kannasta peräisin olevan noin 63 kDa:n kokoisen flagelliiniproteiinin läsnäolon. Tämä vuorostaan 20 osoittaa Pectinatus frisingiensis-kannan läsnäolon alkuperäisessä näytteessä.

Esimerkki 2 Näyte, joka sisälsi Bacillus polymyxa-bakteeria (ATCC 842) käsiteltiin kuten esimerkissä 1 ja kerätystä 25 suodoksesta ajettiin SDS-PAGE käyttäen 10-%:ista geeliä, joka sitten värjättiin CBBtllä. 120-130 kDa:n kohdalla nähtiin voimakas vyöhyke, joka vastasi näiden bakteerien vaipassa esiintyvää RS-proteiinia ("Regularly Structured Protein"), jonka molekyylipaino on noin 120-130 kDa.

30 Esimerkki 3 . Enterobacter aerogenes-bakteeria (ATCC 13048) si sältävä näyte käsiteltiin kuten esimerkissä 1. Talteenote-tulle suodokselle suoritettiin SDS-PAGE-analyysi 8-%:isel-la geelillä, jolloin saatiin vahva proteiinivyöhyke hie-35 man esimerkissä 1 kuvatun Pectinatus-kannan 63 kDa:n proteiinin alapuolelle. Puhdistuksen ja sekvenssianalyysin 93742 11 jälkeen todettiin, että proteiinivyöhyke vastaa Enterobac-ter-kannan flagelliinia.

Esimerkki 4 Näyte, joka sisälsi kaikki kolme esimerkeissä 1-3 5 mainitut bakteerit eli P. frisingiensis VTT-E-82165, B. polymyxa ATCC 842 ja E. aerogenes ATCC 13048 käsiteltiin kuten esimerkissä 1 ja kerätystä suodoksesta ajettiin SDS-PAGE käyttäen 8-%:ista geeliä. Saatiin selvät vyöhykkeet esimerkeissä 1-3 saatujen vyöhykkeiden kohdalla, mikä 10 osoitti kaikkien kolmen bakteerin läsnäolon alkuperäisessä näytteessä.

Esimerkki 5 400 ml näytettä, joka sisälsi 0,2 ml E. aerogenes-bakteerin (ATCC 13048) viljelmää suodatettiin käyttäen 15 suodattimena Millipore HA-suodatinta, jonka huokoskoko oli 0,45 pm ja halkaisija 25 mm. Suodatettu viljelmä pestiin tislatulla vedellä tai puskurilla. Suodokset hävitettiin. Tämän jälkeen suodattimelle lisättiin 200 μΐ 0,05 M HC1 ja suodos imettiin Eppendorff-putkeen. Neutralointitarkoituk-20 seen lisättiin NaOH ja lopuksi huuhdeltiin tislatulla vedellä imua käyttäen. Tämän jälkeen Eppendorff-putkeen kerätylle näytteelle suoritettiin SDS-PAGE, kuten esimerkissä 1, käyttäen 12-%:ista geeliä.

Geelille tehtiin hopeavärjäys seuraavasti: Ensin 25 geeliä ravisteltiin 50 % metanolissa, minkä jälkeen se siirrettiin hopealiuokseen, joka oli valmistettu lisäämällä tipoittain 0,8 g AgN03 4 ml:ssa tislattua vettä liuokseen, johon oli sekoitettu 0,36 % NaOH:ia (21 ml) ja ammoniakkia (1,4 ml). Hopealiuoksen jälkeen geeli pestiin 30 tislatulla vedellä ja siirrettiin sitten liuokseen, jossa oli 1,25 ml 1 % sitruunahappoa ja 0,125 ml 30 % formaldehydiä vesiliuoksessa (250 ml). Värjäytyneiden proteiini-vyöhykkeiden ilmaannuttua näkyviin geeli pestiin vedellä ja siirrettiin 45 % metanolia ja 1 % etikkahappoa sisältä-35 vään liuokseen. Voimakkaimmat proteiinivyöhykkeet saatiin noin 21 ja 29 kDa:n kohdalle. Myös muita soluista irronneita komponentteja havaittiin, mutta heikoimpina vyöhykkeinä .

Claims (10)

95742

1. Menetelmä solujen osoittamiseksi, jolloin tutkittava näyte suodatetaan solujen erottamiseksi, suodos 5 hävitetään ja suodattimen erottamat solut käsitellään siten, että niistä vapautuvat solujen osoitusreaktiossa käytettävät komponentit rikkomatta solujen keskeisiä rakenteita, tunnettu siitä, että soluista vapautetut pintakomponentit erotetaan soluista saman suodattimen 10 avulla, jota käytetään näytteen suodatukseen, ja tästä suodoksesta määritetään mainitut pintakomponentit solujen läsnäolon osoittamiseksi alkuperäisestä näytteestä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmää sovelletaan bak- 15 teerien osoittamiseen.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että irrotetaan ja rikotaan bakteerien flagellat ja määritetään flagelliinia sisältävät tai niitä muistuttavat rakenteet.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen me netelmä, tunnettu siitä, että vapautetut solun pintkomponentit määritetään immunologisella määritysmenetelmällä.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen me- ·· 25 netelmä, tunnettu siitä, että suodoksesta määritetään useampi solun pintakomponentti yhtaikaa useamman solutyypin läsnäolon osoittamiseksi samasta näytteestä.

6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritetään bakteerien RS- 30 proteiini.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukaiseen menetelmään soveltuva laite solujen osoittamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää yhden tai useamman astian (1,2), joka on yhteydessä 35 suodattimeen (10), joka on yhteydessä jätesäiliöön (6), « 93742 näytteen ja mahdollisen pesuliuoksen viemiseksi suodattimen läpi solujen erottamiseksi näyteestä ja suodoksen hävittämiseksi ; mahdollisesti siirtolaitteen (13), jolla suodatin 5 (10) siirretään toiseen asemaan (11); astian (3), joka on liitetty suodattimeen (10) rea-genssien, jotka vapauttavat suodattimen erottamien solujen pintakomponentit rikkomatta solujen keskeisiä rakenteita, viemiseksi suodattimeen; 10 näytteen suodatukseen käytettävästä samasta suodat timesta (10) muodostuvan elimen soluista vapautuneiden komponenttien erottamiseksi soluista, ja mahdollisesti astiat (4,5) pintakomponenttien osoitusreaktiossa tarvittavien reagenssien viemiseksi mittausasemaan (18); 15 mittausaseman (18) soluista vapautuneiden pintakom ponenttien määrittämiseksi solujen läsnäolon osoittamiseksi alkuperäisestä näytteestä.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukaisen laitteen käyttö patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen käyttö, tun nettu siitä, että laitetta käytetään useamman solun pintakomponentin määrittämiseen yhtaikaa.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukaiseen menetelmään soveltuva tarvikepakkaus, tunnettu siitä, että se 25 käsittää t suodattimet ja niihin liitettävät suodatukseen sopivat astiat näytteen ja reagenssien viemiseksi suodattimen läpi solujen erottamiseksi näyteestä, suodoksen hävittämiseksi sekä reagenssien, jotka vapauttavat suodattimen 30 erottamien solujen pintakomponentit rikkomatta solujen keskeisiä rakenteita, viemiseksi suodattimeen; mahdolliset pesuliuokset, sekä reagenssit solujen pintakomponenttien vapauttamiseksi rikkomatta solujen keskeisiä rakenteita; 93742 näytteen suodatukseen käytettävästä samasta suodattimesta muodostuvan välineen soluista vapautuneiden komponenttien erottamiseksi soluista; ja vapautuneiden pintakomponenttien osoituksessa tar-5 vittavat reagenssit ja astiat. 93742