JPH08502413A

JPH08502413A - 細胞を検出する方法および装置

Info

Publication number: JPH08502413A
Application number: JP6510740A
Authority: JP
Inventors: エリアスハカレート
Original assignee: エリアスハカレート
Priority date: 1992-10-23
Filing date: 1993-10-14
Publication date: 1996-03-19
Also published as: EP0665893B1; WO1994010336A1; GB2286245A; AU5113593A; GB9508202D0; DK0665893T3; DE69332100T2; DE4395461T1; DE69332100D1; ATE220422T1; EP0665893A1; CN1088987A; FI93742C; IL107326A0; FI924834A; FI924834A0; ES2179830T3; FI93742B

Abstract

(57)【要約】本発明はウィルスを包含する、細胞を検出するための方法及び装置に関する。試験されるべきサンプルは濾過されて細胞を分離しそして細胞検出反応において使用される成分が放出されそしてサンプルを濾過するために使用されるフイルターと同じフイルターを用いて細胞から分離されそして元のサンプル中の細胞の存在を示すために濾液から、放出された成分が測定される（調べられる）。本発明はさらに本発明の方法おいて使用するために適当なキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】細胞を検出する方法および装置発明の分野本発明は、ウイルスを包含する、細胞類を検出するための方法および装置に関する。本発明はさらに本発明の方法において使用するのに適当なキットに関する。さらに特定的には、本発明は試験されるべきサンプルを濾過して細胞を分離しそして濾過により分離された細胞を処理して細胞から、細胞検出反応において使用される成分を放出させる、細胞を検出する方法に関する。細胞の検出は多くの科学的分野及び技術分野における適用に関係している。適用のそのような分野は、例えば臨床試験、診断用試験、生物工学および分子生物学的ならびに食品分析および環境分析を包含する。先行技術細胞は直接的および間接的の両方で種々の方法で検出されることが出来る。１つの間接的な方法は、例えば細胞成分の化学的性質、生物学的性質、免疫学的性質または物理的性質について或る種の細胞成分を調べることである。例えばサンプル容量が非常に大きくそして検出反応において使用される方法の感度が十分でない程に低い細胞含有量である理由で又は実際の測定の前にフイルター上で細胞を洗浄することが望ましい理由でしばしばサンプルは細胞検出前に濾過されなければならない。細胞をフイルター上で濃縮しそして場合により洗浄した後に、細胞は細胞検出反応において使用される成分を細胞から放出させるために処理され、前記成分はフイルター上で測定される（調べられる）（ＷＯ特許出願第８８／０８０３７号およびヨーロッパ特許第１０１３９８号）。この種の細胞検出方法において、測定を阻害する多くの不純物により問題が提供される。そのような不純物は例えば残留細胞、細胞断片およびサンプル中に存在する他の固体粒子である。また、フイルターそれ自体が干渉する背景を提供する可能性がある。さらにその方法は、特に低い細胞含有量を有するサンプルを用いて、労力を要しそして損失が大きい。発明の概要本発明の目的は、濾過された細胞が信頼出来る程度に且つ都合良く検出されることが出来る方法および装置を開発することである。本発明の方法は、細胞から放出された成分が、サンプルの濾過のために使用されるフイルターと同じフイルターを用いて細胞から分離されそして元のサンプル中の細胞の存在を示すために前記成分が濾液から測定される（調べられる）ことを特徴とする。フイルターからではなく、濾液から細胞成分の検出により、上記た通りの不純物およびフイルターにより提供される背景が避けられる。さらにサンプル中に存在する可能性がある病原体が不活性化されることが出来そして従って、分析されるべき濾液に病原体は入らない。細胞から放出されそして検出に有意義である細胞成分を、サンプルの濃縮のために使用されるフイルターと同じフイルターを用いて分離することにより、労力費用および材料費用ならびに細胞または細胞成分の含有量における損失が最小にされる。さらに、種々のタイプの細胞から誘導されることが出来る種々の細胞成分を同時に測定する（調べる）ことが可能である。図面の簡単な記載図面は本発明の方法のために適当な装置を描いている。本発明の詳細な記載本発明の方法は広い種々のタイプのサンプルに適用されることが出来る。本方法は大きい容量および低い細胞含有量を有するサンプルに十分に適している。本方法は液体サンプルに有利に適用されるがしかし場合によっては液体で最初に抽出されることが出来るガスのような他のサンプルもまた可能である。初期に固体状態にあるサンプルは液体中に溶解されるかまたは懸濁されてよくそして場合により検出前に、予備濾過されるかあるいは阻害性の物質が他の手段により、例えば遠心分離により除去される。本発明の方法は例えば食品および飲料産業において、水分析、ガス分析および空気分析においてそして一般的な衛生管理においてならびに臨床サンプルにおいて実施されることが出来る。試験されるべきサンプルは分離されるべき細胞の大きさを基準にして孔径が選ばれるフイルター中に通される。ウィルスは実際的な意味の用語で細胞ではなくしかし細胞に浸透する能力のある感染粒体であるけれども、本明細書において用語“細胞”は、ウィルスをまた包含する。同様に細胞成分はまたウィルス成分を意味する。本発明の方法は、例えば細菌およびウィルスの検出に十分適している。細菌に関して、０．２〜０．５μｍの孔径を有するフイルターが一般に使用される。真核細胞（ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌ）に関しては、より大きい孔径が使用されそしてウィルスに関しては、より小さな孔径の−限外フイルター（限外濾過装置）−が使用される。例えば、吸引（ｓｕｃｔｉｏｎ）および圧力が濾過において使用されてよい。濾過は、フイルターが漏斗の底部に配置され、漏斗が吸引びんの開口部上に置かれそして例えば水ポンプを用いて吸引びん中に真空が引き込まれる従来の濾過装置中で行われてもよい。別法として例えば注射器が使用されてもよく、その場合において、サンプルは注射器中に引き入れられ、フイルターが注射器の末端に配置されており、そしてサンプルが圧力でフイルター中に通される。他の濾過用システムも同様に使用されることは当然可能である。ウィルスに関して、サンプルが限外濾過管のフイルター上に配置されそして遠心分離によりフイルター中に通される、限外濾過を行うのが実施可能である。サンプル中の細胞がフイルター上に集められた後に、フイルター中に洗浄用溶液を通すことにより洗浄を行うことがしばしば実施可能である。例えば蒸留水または緩衝液が洗浄溶液として使用されてよい。ここまで得られた濾液は捨てられる。場合による洗浄の後に、細胞は、細胞の検出に有意義な細胞成分を細胞から放出するように処理される。その処理は、化学的にまたは物理的にそして好ましくは細胞またはそれらの組織の大部分がフイルター上に残るようなやり方で行われることが出来る。化学的処理は酵素処理、洗浄剤処理、例えば酸または塩基または或る他の適当な溶媒を用いての抽出、あるいは水または緩衝剤溶液を用いてのフラッシングあるいは例えば浸透圧衝撃であってよい。所望の細胞成分は、例えばアイスプレス（ｉｃｅｐｒｅｓｓ）の手段により、超音波にかけること（ｓｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により、電気穿孔法（エレクトロポーレーション：ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）により、振り混ぜ（ｓｈａｋｉｎｇ）によりあるいは或る他の機械的手段により細胞から分離されることが出来る。細胞表面層が取り出されるのが好ましく、これに関して、場合により、細胞の延長部分および特に細菌鞭毛をまた包含する前記表面層が分離されそして破壊されそしてフラジェリン含有構造物または類似物が測定される（調べられる）。例えば、その延長部分を有する細菌表面層はおだやかな酸処理により取り出される。それにより鞭毛は分離されそしてそれに関してフラジェリン分子に分解される。ウィルスの場合において、検出に有意義である抗原がウィルスから分離されることが出来る。検出に有意義である分離された成分は、サンプルの濾過のために使用されるフイルターと同じフイルター中に通してフラッシュ（ｆｌｕｓｈ）される。濾液は集められそして元のサンプル中の細胞の存在は、細胞成分の化学的、生物学的、物理的または免疫学的性質に基づいて、フイルター中を通過した成分の反応の手段により、フラッシング（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）溶液から検出される。生化学的分析、免疫学的分析および放射化学的分析を包含する、細胞成分を検出する多くの方法がある。検出するために必要な試薬はまたフイルター中に通されるかまたはそれらは濾液中に直接加えられることが出来る。本発明の方法は、細胞を検出するためのそして或る種のタイプの細胞を同定するための両方のための、普遍的方法として使用されることが出来る。もし同定において何ら関係なしに、一般的な細胞の存在が関心の的であるならば、最も実際的方法は、そのＬＰＳまたは構造的部分のような、細胞中に普遍的に存在する成分を規定することである。別法として、本方法は関心の的である或るタイプの細胞または菌株（細胞株）を検出するために使用することが出来、その場合において、関心の的である細胞中にのみ存在する細胞成分が、測定される（調べられる）べき細胞成分として選択される。同じ濾液から幾つかの細胞成分を同時に測定する（調べる）ことは可能であり、そしてこれは有利である。言い換えると、一方の成分が１つのタイプの細胞においてのみ存在しそして他方の成分が他のタイプの細胞においてのみ存在する、等々のような方法で、測定される（調べられる）べき細胞成分を選択することにより同時に幾つかのタイプの細胞が測定される（調べられる）ことが可能である。本発明の方法は、細胞壁蛋白質または細胞膜蛋白質、ＬＰＳ、莢膜多糖、コート蛋白質（例えばＲＳ蛋白質、即ちＳ−層（Ｓ−ｌａｙｅｒ）蛋白質）、鞭毛または細胞の他の延長部分あるいは類似の構造体またはそれらの構造部分、等のような、細胞の表面成分を測定する（調べる）ために非常に良く適している。フイルターを用いて細胞の主要部分から分離した後に、放出された細胞成分は蛋白質測定法または免疫学的測定法のような従来の方法により測定される（調べられる）。原則として、細胞から分離された任意の蛋白質が元のサンプル中の細胞の存在を示すために使用されることが出来る。例えばゲル電気泳動、イムノブロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）分析及びイムノ−ＰＣＲ（ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ）（イムノ−ポリメラーゼ鎖反応（ｉｍｍｕｎｏ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ））技術（Ｓａｎｏ，Ｔ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．およびＣａｎｔｏｒ，Ｃ．によるＳｃｉｅｎｃｅ２５８（１９９２）第１２０頁〜第１２２頁）がこの目的のために適当である。本発明の方法は、不純なサンプルからのおよび培養液（ｃｕｌｔｕｒｅ）からの両方からのウィルスの検出にまた適用されることが出来る。サンプルは限外フイルター（限外濾過装置）上に置かれ、遠心分離によりサンプルをそのフイルター中に通し、その後にフイルターはフイルター中に残留するウィルスから、抗原のような、検出において使用される成分を分離するために処理される。同時に病原ウィルスが不活性化される利点が達成される。分離された抗原は再遠心分離により同じフイルター中に通されそして抗原は例えばイムノ−ＰＣＲ（ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ）方法により濾液から測定される（調べられる）ことが出来、そして従って非常に小さい抗原濃度が測定される（調べられる）ことが出来る。言い換えると、本発明の方法は抗原の濃縮および精製およびイムノ−ＰＣＲ技術により試験されるべきサンプルの予備処理のために適当である。本発明の範囲は、また上記方法において使用するために適当である装置を含む。本発明の装置は、それが、細胞を分離するように、試験されるべきサンプルを濾過するための手段；細胞検出反応において使用される成分を細胞から放出するために、濾過により分離された細胞を処理するための手段；細胞から、放出された成分を分離するための手段；そして元のサンプル中の細胞の存在を示すために濾液から該成分を測定する（調べる）ための手段、を含むことを特徴とする。細胞を分離するように、試験されるべきサンプルを濾過するための手段は、例えばサンプルおよび場合により洗浄液をフイルターに通過させるために、廃液容器にさらに接続されたフイルターに接続された１個またはそれ以上の容器（ｖｅｓｓｅｌ）そして場合によりポンプ、プレスまたは遠心分離機のような、フイルター中にサンプルを通過させるための手段を含むことが出来る。フイルターの孔径は分離されるべき細胞の大きさを基準にして選ばれる。細胞検出反応において使用される成分を細胞から放出させるために、フイルターにより分離された細胞を処理するための手段は、フイルター中に、細胞成分を放出させる試薬を通過させるための、フイルターに接続された容器（ｖｅｓｓｅｌ）あるいは物理的に細胞を分離するための手段およびフイルター中にフラッシング（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）溶液を通過させるための手段を含むことが出来る。細胞から放出された成分を分離するための手段はサンプルを濾過するために使用されるフイルターと同じフイルター及び場合により同じフイルターの使用を可能にする移動手段のような中間部材からなる。それら手段は前記細胞成分を測定する（調べる）ための前記手段上に前記フイルター中に試薬を通過させるためにフイルターに接続されている容器（ｖｅｓｓｅｌ）をさらに含んでよい。細胞成分を測定する（調べる）ための手段は測定用ステーションを含み、このステーションはアッセイユニット、測定される（調べられる）べき細胞から放出された成分を検出するための、検出ユニット及び電子ユニットを含んでよい。アッセイユニットは、例えば細胞から放出された成分の化学的、生物学的、免疫学的または物理的性質に基づいて、細胞から放出された成分の検出のための、種々の異なるタイプの分析システム、光源、等を含んでよい。検出器ユニットは例えば光測定用手段、放射能測定用手段、等を含んでよい。測定用ステーションは通常生じた信号を受容するための電子ユニットをさらに含む。電子ユニットはデータ処理ユニットおよび制御ユニットに接続されているのが好ましい。測定用ステーションはまた測定用ステーションに走行溶液（ｒｕｎｎｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ）および溶離用溶液を運搬するための容器（ｖｅｓｓｅｌ）に接続されているのが好ましく、その他方の末端は廃液容器に接続されてもよい。幾つかの細胞成分が同時にそれを用いて測定される（調べられる）ことが出来るような測定用ステーションが好ましい。本発明の装置は、通常、使用される試薬、フイルターそれ自体または試験されるべき濾液を所望の部位に運搬することが出来るバルブまたは他の移動手段を含む。本装置は、フイルターに接続されているサンプル採取（ｓａｍｐｌｉｎｇ）用タンク（ｖａｔ）および洗浄用溶液のためのタンク（ｖａｔ）（前記フイルターはさらに廃液容器に接続されている）：抽出用溶液のための第３のタンク（ｖａｔ）が接続されておりそして移動されるフイルターとの接続を有している、他のステーションにフイルターを移動させるための移動手段（前記フイルターはさらに測定用ステーション、データ処理ユニットおよび制御ユニットに接続されている）；そして走行（ｒｕｎｎｉｎｇ）溶液および溶離用溶液のための容器（ｖｅｓｓｅｌ）（これらの容器は測定用ステーションにまた接続されている）、を含むのが好ましい。本発明の装置を用いて本発明の方法は大規模に自動化されることが出来る。本発明は本発明の方法においての本装置の使用にまた関する。好ましくは、本装置は、同じサンプルから同時に幾つかの種類の細胞成分を検出するために使用される。図面は本発明の装置の例を示す。例示された態様は本発明の範囲内だけに可能であるとは限らないことは明らかである。図面は、フイルター１０にバルブ７を介して接続されておりそして廃液容器６にフイルター中を通ってサンプルを通過させるために廃液溶液６にバルブ１４を介して接続されているサンプル採取用タンク（ｓａｍｐｌｉｎｇｖａｔ）１を示す。さらに、他のタンク（ｖａｔ）２はフイルター中に洗浄用液を通過させるためにバルブ８を介してフイルターに接続されている。本装置はステーション１１および１２にフイルターを移動させるための移動手段１３をさらに含む。タンク（ｖａｔ）３はフイルターに抽出用溶液を供給するためにバルブ９を介してステーション１１に接続されている。ステーション１１でフイルターは、測定用ステーション１８に抽出用溶液を供給するためにバルブ１５を介して測定用ステーション１８に接続されており、そのステーション１８に走行溶液（ｒｕｎｎｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ）を供給するためにフイルター１６を介してタンク（ｖａｔ）４が測定用ステーション１８に接続されている。測定用ステーションは信号の読み取り解明（ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ）および出力のためのデータ処理ユニット１９に接続されている。本装置はまた本装置のバルブおよび他の機械的作動器の操作を制御するためにそして電流を供給するために制御ユニットを含んでいる。さらに、タンク（ｖａｔ）５は再生のために前記測定用ステーションへの溶離用溶液を供給するためにバルブ１７を介して測定用ステーションに接続されている。ステーション１２はフイルター交換ステーションである。上に記載された装置は次のとおりにして使用される：試験されるべきサンプルはサンプル採取タンク（ｓａｍｐｌｉｎｇｖａｔ）１に供給され、そこから圧力によりバルブ７を介してフイルター１０及びバルブ１４を通過して、廃液容器６に通される。フイルター上に残留する細胞はタンク（ｖａｔ）２からバルブ８を通って供給された洗浄用溶液で洗浄される。その後に、フイルターは移動手段１３を用いてステーション１１に移動され、そこでフイルター上に残留する細胞はバルブ９により調節されたタンク（ｖａｔ）３からの溶液で抽出される。（フイルターを移動する代わりに固定（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ）フイルターに抽出用溶液を運び、このフイルターから例えば適当なバルブを介して測定用ステーションに濾液を運ぶことが当然可能である）。抽出液はバルブ１５を介して測定用ステーション１８に送られ、フイルター１６を通って供給されたタンク（ｖａｔ）４からの走行（ｒｕｎｎｉｎｇ）溶液により抽出液は測定用ステーションを通過する。測定用ステーションから誘導された信号はデータ処理ユニット１９により読み取り解明される。データ処理ユニットは読み取り解明した信号を出力しそして測定される（調べられる）べき細胞成分の存在および量を査定する。制御ユニット２０は装置中のバルブ及び他の機械的作動器の操作を制御しそしてシステムに電流を供給する。測定後測定用ステーションは、バルブ１７を介して供給されたタンク（ｖａｔ）５からの溶離用溶液で再生される。ステーション１２で使用済み（ｓｐｅｎｔ）フイルターが新しいフイルターと取り替えられる。本発明は、本方法において使用される手段を含むキットにさらに関係する。本キットは、それが、細胞を分離するために試験されるべきサンプルを濾過するための手段：細胞検出反応において使用される成分を細胞から放出するために、フイルターにより分離された細胞を処理するための手段；細胞から、放出された成分を分離するための手段；および元のサンプル中の細胞の存在を示すかめに濾液から前記成分を測定する（調べる）ための手段を含むことを特徴する。細胞を分離するために、試験されるべきサンプルを濾過するための手段は、濾過するのに適当であるフイルターおよび付属する容器そして場合により必要な洗浄用溶液を含むのが好ましい。細胞を処理するための手段は、細胞検出反応において使用される成分を放出するための手段を含むのが好ましく、そして該成分が細胞から分離される手段はサンプルの濾過のために使用されるフイルターと同じフイルターからなる。濾液から成分を測定する（調べる）ための手段は測定（調査）において使用される試薬を含む。測定（調査）において使用される装置は通常キットに包含されない。本発明のキット中のフイルターは分離されるべき細胞の大きさを基準にして選ばれる。濾過するために適当であるフイルターに接続されるべき容器（ｖｅｓｓｅｌ）は吸引びんに接続された漏斗、注射器または限外濾過チューブであってよい。細胞成分を放出するために使用されるべき試薬は例えば酵素、洗浄剤、酸または塩基溶液あるいは或る他の溶媒、水または緩衝剤であってよい。細胞から放出された成分の検出のために必要とされる試薬は蛋白質測定またはイムノアッセイにおいて使用される試薬のような細胞成分の検出のために従来の反応において必要な任意の試薬であってよい。本発明のキットはサンプル容器、試薬容器、フイルター、検出反応において使用される細胞成分を放出するための試薬および放出された成分を測定する（調ベる）ための試薬を含有するのが好ましい。本発明は以下の非限定例により一層詳細に説明されるだろう。例１：Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓｆｒｉｓｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株ＶＴＴ−Ｅ−８２１６５（Ｈａｋａｌｅｈｔｏ，Ｅ．およびＦｉｎｎｅ，Ｊ．による、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ６７第３０７頁〜第３１２頁（１９９０））を含有する１．５ｍｌの細菌培養液（ｃｕｌｔｕｒｅ）が、２ｍｌ注射器中に引き入れられそして注射器の一端に配置されたフイルター中に圧力で通過させられ、そのフイルター（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＭｉｌｌｅｘＨＡ）は、０．４５μｍの孔径を有した。細胞を蒸留水でフラッシュした。得られた濾液を放棄した。０．０５ＭＨＣｌの約０．２ｍｌを次に、他の注射器を用いて同じフイルター中を通過させそしてエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ）管に濾液を集めそしてＮａＯＨで中和した。その後に、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において使用されるのと同じ緩衝液が濾液に加えられそして８％ゲルおよび市販の分子量標準フアーマシァ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてＬａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．によるＮａｔｕｒｅ（ロンドン）２２７第６８０頁〜第６８５頁（１９７０）に記載された通りにして、これについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。若干のサンプルは操作の前に沸騰させた。ゲルは蛋白質染料クマッシーブリリアントブルー（ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅ）（ＣＢＢ）で染色されそして（または）前記菌株（Ｈａｋａｌｅｈｔｏ，Ｅ．およびＦｉｎｎｅ，Ｊ．によるＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ６７第３０７頁〜第３１２頁（１９９０））の細胞で免疫にされたうさぎにおいて生じた抗体を用いてイムノブロット分析（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）が行われた。直接染色においてのそしてイムノブロット分析においてのその両方において、顕著なバンドは約６３ｋＤａで見い出され、これはＰｅｃｔｉｎａｔｕｓｆｒｉｓｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株から由来する約６３ｋＤａの寸法のフラジェリン蛋白質の存在を示す。これはまた、元のサンプル中のＰｅｃｔｉｎａｔｕｓｆｒｉｓｉｎｇｉｅｎｓｉｓの存在の表示である。例２：細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｏｌｙｍｙｘａ（ＡＴＣＣ８４２）を含有するサンプルは例１におけるとおりにして処理されそして１０％ゲルを用いて集められた濾液においてＳＤＳ−ＰＡＧＥが行われ、これは次にＣＢＢで染色された。これらの細菌のコート（ｃｏａｔ）中に存在するＲＳ（整然と構成された（ＲｅｇｕｌａｒｌｙＳｔｒｕｃｔｕｒｅｄ））蛋白質に相当する、１２０〜１３０ｋＤａで顕著なバンドが見られ、前記ＲＳ蛋白質は約１２０−１３０ｋＤａの分子量を有する。例３：細菌Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ１３０４８）を含有するサンプルが例１の通りにして処理された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、８％のゲルを用いて、集められた濾液について行われて、例１に記載されたＰｅｃｔｉｎａｔｕｓ株の６３ｋＤａ蛋白質よりやや下の顕著な蛋白質バンドを得た。精製および次の分析の後、蛋白質バンドはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ株のフラジェリンに相当することが見い出された。例４：例１〜例３に記載された３種の細菌、即ちＰ．ｆｒｉｓｉｎｇｉｅｎｓｉｓＶＴＴ−Ｅ−８２１６５、Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａＡＴＣＣ８４２およびＥ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓＡＴＣＣ１３０４８のすべてを含有するサンプルが例１における通りにして処理されそして８％のゲルを用いて、集められた濾液についたＳＤＳ−ＰＡＧＥが行われた。例１〜例３において得られたバンドの位置で顕著なバンドが得られ、これらは元のサンプルにすべて３種の細菌の存在を示した。例５：細菌Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ１３０４８）の培養液（ｃｕｌｔｕｒｅ）の０．２ｍｌを含有するサンプルの４００ｍｌは、０．４５μｍ孔径および２５ｍｍ直径を有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅＨＡフイルターを用いて濾過された。濾過された培養液を蒸留水または緩衝液で洗浄した。濾液を捨てた。その後に０．０５ＭＨＣｌの２００μｌをフイルターに加えそして濾液をエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ）管に引き入れた。中和の目的のためにＮａＯＨを加えそして最後に吸引を用いて、蒸留水でのフラッシングを行った。その後、１２％ゲルを用いて、例１における通りにして、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ）管に集められたサンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。次の通りにして銀染色をゲルについて行った：ゲルを先ず５０％メタノール中において振り混ぜ、その後に、それは、０．３６％のＮａＯＨ（２１ｍｌ）とアンモニア（１．４ｍｌ）とを混合した溶液に、４ｍｌの蒸留水中の０．８ｇのＡｇＮＯ₃を滴下して加えることにより造られた銀溶液に移された。銀溶液の後に、ゲルを、蒸留水で洗浄しそして１％くえん酸の１．２５ｍｌおよび水溶液（２５０ｍｌ）での３０％ホルムアルデヒドの０．１２５ｍｌを含有する溶液に移した。染色した蛋白質バンドが現れた後に、ゲルを水で洗浄しそして４５％メタノールおよび１％酢酸を含有する溶液に移した。最も顕著な蛋白質バンドが、約２１ｋＤａおよび２９ｋＤａで得られた。また、細胞から分離された他の成分が検出されたがしかしバンドは弱かった。例６：患者のサンプルから得られたピコルナ（Ｐｉｃｏｒｎａ）ウィルスに属するＡＣｏｘｓａｃｋｉｅＢ６ウィルスをサルの腎臓細胞培養液（ｃｕｌｔｕｒｅ）中で培養し、その後に、培養液を数回、凍結且つ解氷させるたとによりウィルスを細胞から放出させた。このウィルス懸濁液の５００μｌを、脱イオン水の５００μｌ中で混合しそして限外濾過管のフイルター（米国、ＦｉｌｔｒｏｎのＭｉｃｒｏｓｅｐ１０Ｋ）上に置きそして４０００〜５０００ｒｐｍで半時間遠心分離した。洗浄は行われなかった。０．０５ＭＨＣｌの１００μｌをフイルターに加えそして３７℃で１時間反応させ、その後上記の通りにして遠心分離を行った。上記の通りに、０．０５ＭＨＣｌの１００μｌをフイルターに加えそして再遠心分離を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを例１における通りにして（１０％ゲルで）濾液について行った。その操作の前にサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で５分間沸騰させた。ゲルを例５における通りにして銀染色により染色するか又は例１の通りにイミノブロット分析を行った。第１抗体としてサル中に生じさせた抗−ＣｏｘｓａｃｋｉｅＢ６抗体（１：５０に希釈）が使用されそしてイムノブロットの、第２抗体としてアルカリ性ホスフアターゼ（デンマークのＤａｋｏ）で標識された１：１００希釈の抗ヒト抗体（ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎａｎｔｉｂｏｄｙ）が使用された。抗ヒト抗体はサル抗体と交差反応された。銀染色ＳＤＳゲルは、沸騰された全ウィルスそれぞれを用いて得られたバンドとは部分的に異なった幾つかのバンドを有した。イミノブロット法において４つのバンドは２５〜３２ｋＤａの範囲においてきわだっていた。文献によればピコルナ（Ｐｉｃｏｒｎａ）ウィルスの最も有意義な構造蛋白質は９〜３５ｋＤａの範囲に通常存在する（１９７８年ロンドンＢａｉｌｌｉｅｒｅＴｉｎｄａｌｌ発行、Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｃ．、ＰｅｒｅｉｒａＨ．Ｇ．およびＷｉｌｄｙ，Ｐ．によるＶｉｒｕｓｅｓｏｆＶｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ）。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年５月１７日【補正内容】れる）ことが出来るような測定用ステーションが好ましい。本発明の装置は、通常、使用される試薬、フイルターそれ自体または試験されるべき濾液を所望の部位に運搬することが出来るバルブまたは他の移動手段を含む。本装置は、フイルターに接続されているサンプル採取（ｓａｍｐｌｉｎｇ）用タンク（ｖａｔ）および洗浄用溶液のためのタンク（ｖａｔ）（前記フイルターはさらに廃液容器に接続されている）；抽出用溶液のための第３のタンク（ｖａｔ）が接続されておりそして移動されるフイルターとの接続を有している、他のステーションにフイルターを移動させるための移動手段（前記フイルターはさらに測定用ステーション、デ一夕処理ユニットおよび制御ユニットに接続されている）；そして走行（ｒｕｎｎｉｎｇ）溶液および溶離用溶液のための容器（ｖｅｓｓｅｌ）（これらの容器は測定用ステーションにまた接続されている）、を含むのが好ましい。本発明の装置を用いて本発明の方法は大規模に自動化されることが出来る。本発明は本発明の方法においての本装置の使用にまた関する。好ましくは、本装置は、同じサンプルから同時に幾つかの種類の細胞成分を検出するために使用される。図面は本発明の装置の例を示す。例示された態様は本発明の範囲内だけに可能であるとは限らないことは明らかである。図面は、フイルター１０にバルブ７を介して接続されておりそして廃液容器６にフイルター中を通ってサンプルを通過させるために廃液溶液６にバルブ１４を介して接続されているサンプル採取用タンク（ｓａｍｐｌｉｎｇｖａｔ）１を示す。さらに、他のタンク（ｖａｔ）２はフイルター中に洗浄用液を通過させるためにバルブ８を介してフイルターに接続されている。本装置はステーション１１および１２にフイルターを移動させるための移動手段１３をさらに含む。タンク（ｖａｔ）３はフイルターに抽出用溶液を供給するためにバルブ９を介してステーション１１に接続されている。ステーション１１でフイルターは、測定用ステーション１８に抽出用溶液を供給するためにバルブ１５を介して測定用ステーション１８に接続されており、そのステーション１８に走行溶液（ｒｕｎｎｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ）を供給するためにバルブ１６を介してタンク（ｖａｔ）４が測定用ステーション１８に接続されている。測定用ステーションは信号の読み取り解明（ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ）および出力のためのデータ処理ユニット１９に接続されている。本装置はまた本装置のバルブおよび他の機械的作動器の操作を制御するためにそして電流を供給するために制御ユニットを含んでいる。さらに、タンク（ｖａｔ）５は再生のために前記測定用ステーションへの溶離用溶液を供給するためにバルブ１７を介して測定用ステーションに接続されている。ステーション１２はフイルター交換ステーションである。上に記載された装置は次のとおりにして使用される：試験されるべきサンプルはサンプル採取タンク（ｓａｍｐｌｉｎｇｖａｔ）１に供給され、そこから圧力によりバルブ７を介してフイルター１０及びバルブ１４を通過して、廃液容器６に通される。フイルター上に残留する細胞はタンク（ｖａｔ）２からバルブ８を通って供給された洗浄用溶液で洗浄される。その後に、フイルターは移動手段１３を用いてステーション１１に移動され、そこでフイルター上に残留する細胞はバルブ９により調節されたタンク（ｖａｔ）３からの溶液で抽出される。（フイルターを移動する代わりに固定（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ）フイルターに抽出用溶液を運び、このフイルターから例えば適当なバルブを介して測定用ステーションに濾液を運ぶことが当然可能である）。抽出液はバルブ１５を介して測定用ステーション１８に送られ、バルブ１６を通って供給されたタンク（ｖａｔ）４からの走行（ｒｕｎｎｉｎｇ）溶液により抽出液は測定用ステーションを通過する。測定用ステーションから誘導された信号はデータ処理ユニット１９により読み取り解明される。データ処理ユニットは読み取り解明した信号を出力しそして測定される（調べられる）べき細胞成分の存在および量を査定する。制御ユニット２０は装置中のバルブ及び他の機械的作動器の操作を制御しそしてシステムに電流を供給する。測定後測定用ステーションは、バルブ１７を介して供給されたタンク（ｖａｔ）５からの溶離用溶液で再生される。ステーション１２で使用済み（ｓｐｅｎｔ）フイルターが新しいフイルターと取り替えられる。本発明は、本方法において使用される手段を含むキットにさらに関係する。本【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１１月７日【補正内容】請求の範囲１．ａ）細胞を分離するように、試験されるべきサンプルを濾過し、ｂ）細胞検出反応に使用される表面成分を細胞から放出させるために、フイルター上の細胞を処理し、ｃ）サンプルの濾過ために使用されるフイルターと同じフイルターを用いて、細胞から放出された表面成分を細胞から分離し、そしてｄ）元のサンプル中の細胞の存在を示すために濾液から前記表面成分を測定する（調べる）、ことを含む、細胞を検出する方法。２．細菌の検出に適用される、請求項１に記載の方法。３．細菌の鞭毛が分離され且つ破壊されそしてフラジェリン−含有構造物または類似の構造物が測定される（調べられる）、請求項２に記載の方法。４．細菌のＲＳ−蛋白質が測定される（調べられる）、請求項２に記載の方法。５．細菌の延長部分（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、コート（ｃｏａｔ）または細胞壁に存在する表面成分が測定される（調べられる）、請求項１に記載の方法。６．放出された細胞表面成分がイムノアッセイにより測定される（調べられる）、請求項１に記載の方法。７．同じサンプル中の幾つかのタイプの細胞の存在を検出するために、幾つかの細胞表面成分が同時に濾液から測定される（調べられる）、請求項１に記載の方法。８．イムノ−ＰＣＲ法により測定される（調べられる）べき抗原が細胞表面から放出される、請求項１に記載の方法。９．ａ）ウィルスが分離されるように、試験されるべきサンプルを濾過し、ｂ）ウィルス検出反応に使用される成分をウィルスから放出させるために、フイルター上のウィルスを処理し、ｃ）サンプルを濾過するために使用されるフイルターと同じフイルターを用いて、ウィルスから放出された成分を、ウィルスから分離し、そしてｄ）元のサンプル中のウィルスの存在を示すために、濾液から前記成分を測定する（調べる）、ことを含む、ウィルスを検出する方法。１０．ａ）細胞を分離するように、試験されるべきサンプルを濾過するための手段、ｂ）細胞検出反応において使用される表面成分を細胞から放出させるために、フイルターにより分離された細胞を処理するための手段、ｃ）細胞から、放出された表面成分を分離するための手段（この手段はサンプルを濾過するために使用されるフイルターと同じフイルターからなる）、およびｄ）元のサンプル中の細胞の存在を示すために、濾液から前記表面成分を測定する（調べる）ための手段、を含む装置の、細胞の検出のために請求項１の方法における使用。１１．装置が、幾つかの種類の細胞表面成分を同時に測定する（調べる）ために用いられる、請求項１０に記載の使用。１２．ａ）細胞を分離するように、試験されるべきサンプルを濾過するための手段、ｂ）細胞検出反応に使用される表面成分を細胞から放出するために、フイルターにより分離された細胞を処理するための手段、ｃ）細胞から、放出された表面成分を分離するための手段（この手段はサンプルを濾過するために使用されるフイルターと同じフイルターからなる）、およびｄ）元のサンプル中の細胞の存在を示すために濾液らか前記表面成分を測定する（調べる）ための手段、を含むキットの、細胞の検出のために請求項１の記載の方法においての使用。１３．サンプル容器、試薬容器、フイルター、細胞表面成分を放出させるための試薬および放出された表面成分を測定する（調べる）ための試薬を含有する、キットを用いることを包含する請求項１２に記載の使用。１４．ａ）ウィルスを分離するように、試験されるべきサンプルを濾過するための手段、ｂ）ウィルス検出反応において使用される細胞表面成分をウィルスから放出するために、フイルターにより分離されたウィルスを処理するための手段、ｃ）ウィルスから、放出された表面成分を分離するための手段（この手段はサンプルを濾過するために使用されるフイルターと同じフイルターからなる）、およびｄ）サンプル中のウィルスの存在を示すために濾液から前記表面成分を測定する（調べる）ための手段、を含む装置の、ウィルスの検出のために請求項９の方法においての使用。１５．ａ）ウィルスを分離するように、試験されるべきサンプルを濾過するための手段。ｂ）ウィルス検出反応において使用されるウィルス表面成分をウィルスから放出するために、フイルターにより分離されたウィルスを処理するための手段、ｃ）ウィルスから、放出された表面成分を分離するための手段（この手段はサンプルを濾過するために使用されるフイルターと同じフイルターからなる）、およびｄ）サンプル中のウィルスの存在を示すために、濾液から前記表面成分を測定する（調べる）ための手段、を含むキットの、ウィルスの検出のために請求項９の方法においての使用。１６．サンプルからの細胞またはウィルスを分離するために、サンプルおよび場合により洗浄用溶液をフイルターに通過させるための、廃液容器（６）にさらに接続されているフイルター（１０）に接続されている１つまたはそれ以上の容器（１、２）、他のステーション（１１）にフイルター（１０）を移動させるための任意の移動手段（１３）、フイルターより分離された細胞またはウィルスから表面成分を放出させる試薬を該フイルターに送るために、フイルター（１０）に接続されている容器（３）、サンプルを濾過するために使用されるフイルターと同じフイルター（１０）からなる、前記細胞またはウイルスから、放出された表面成分を分離するための手段、および測定用ステーション（１８）に、放出された表面成分の検出反応に使用する試薬を送るための任意の容器（４、５）、元のサンプル中の細胞またはウィルスの存在を示すために、放出された成分を測定する（調べる）ための測定用ステーション（１８）、を含む、請求項１又は９において記載された方法において使用するための装置。１７．サンプルから細胞およびウィルスを分離させるためにそして細胞またはウィルスから表面成分を放出する試薬をフイルターに送るために、該フイルター中にサンプルおよび試薬を通過させるように、濾過するために適当なフイルターおよび付属する容器、任意の洗浄液、および細胞またはウィルスから表面成分を放出させるための試薬、サンプルを濾過するために使用されるフイルターと同じフイルターからなる、放出された表面成分を分離するための手段、および放出された表面成分を測定する（調べる）ための試薬および容器、を含む、請求項１または９に記載の方法において使用するために適当なキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ）細胞を分離するように、試験されるべきサンプルを濾過し、ｂ）細胞検出反応に使用される成分を細胞から放出させるために、フイルターにより分離された細胞を処理し、ｃ）サンプルの濾過ために使用されるフイルターと同じフイルターを用いて、細胞から放出された成分を細胞から分離し、そしてｄ）元のサンプル中の細胞の存在を示すために濾液から前記成分を測定する（調べる）、ことを含む、細胞を検出する方法。２．細菌の検出に適用される、請求項１に記載の方法。３．細胞の表面成分が測定される（調べられる）、請求項１に記載の方法。４．細菌の鞭毛が分離され且つ破壊されそしてフラジェリン−含有構造物または類似の構造物が測定される（調べられる）、請求項３に記載の方法。５．細菌のＲＳ−蛋白質が測定される（調べられる）、請求項３に記載の方法。６．細菌の延長部分（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、コート（ｃｏａｔ）または細胞壁に存在する成分が測定される（調べられる）、請求項１に記載の方法。７．放出された細胞成分がイムノアッセイにより測定される（調べられる）、請求項１に記載の方法。８．同じサンプル中の幾つかのタイプの細胞の存在を検出するために、幾つかの細胞成分が同時に濾液から測定される（調べられる）、請求項１に記載の方法。９．イムノ−ＰＣＲ法により測定される（調べられる）べき抗原が細胞から放出される、請求項１に記載の方法。１０．ａ）ウィルスが分離されるように、試験されるべきサンプルを濾過し、ｂ）ウィルス検出反応に使用される成分をウィルスから放出させるために、フイルターにより分離されたウィルスを処理し、ｃ）サンプルを濾過するために使用されるフイルターと同じフイルターを用いて、ウィルスから放出された成分を、ウィルスから分離し、そしてｄ）元のサンプル中のウィルスの存在を示すために、濾液から前記成分を測定する（調べる）、ことを含む、ウィルスを検出する方法。１１．ａ）細胞を分離するように、試験されるべきサンプルを濾過するための手段、ｂ）細胞検出反応において使用される成分を細胞から放出させるために、フイルターにより分離された細胞を処理するための手段、ｃ）細胞から、放出された成分を分離するための手段、およびｄ）元のサンプル中の細胞の存在を示すために、濾液から前記成分を測定する（調べる）ための手段、を含む、細胞の検出のために適当な装置。１２．細胞から放出された成分を分離するための手段が、サンプルを濾過するために使用されるフイルターと同じフイルターからなる、請求項１１に記載の方法。１３．請求項１に記載された方法において、請求項１１に記載された装置を使用する方法。１４．装置が、幾つかの種類の細胞成分を同時に測定する（調べる）ために用いられる、請求項１３に記載された方法。１５．ａ）細胞を分離するように、試験されるべきサンプルを濾過するための手段、ｂ）細胞検出反応に使用される成分を細胞から放出するために、フイルターにより分離された細胞を処理するための手段、ｃ）細胞から、放出された成分を分離するための手段、およびｄ）元のサンプル中の細胞の存在を示すために濾液らか前記成分を測定する（調べる）ための手段、を含む、請求項１に記載された方法において使用するために適当なキット。１６．細胞から、放出された成分を分離するための手段がサンプルを濾過するために使用されるフイルターと同じフイルターからなる、請求項１５に記載のキット。１７．サンプル容器、試薬容器、フイルター、細胞成分を放出させるための試薬および放出された成分を測定する（調べる）ための試薬を含有する、請求項１６に記載のキット。