CN1088987A - 一种检测细胞的方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测细胞(含病毒)的方法和装
置。待检测样品经过过滤器分离出细胞,然后仍用在
过滤样品时使用的那个过滤器使在细胞检测反应中
使用的成分从细胞中释放并分离出来,测定滤出液中
的释放成分以便指示在原始样品中细胞的存在。本
发明还涉及一种适合用于本发明方法的用品包。
Description
本发明涉及一种检测细胞(含病毒)的方法和装置。本发明还包括一个适用于本发明方法的用品箱。更具有地说,本发明涉及一种检测细胞的方法,在这一方法中,先将待检测的样品过滤以便分离出一些细胞,然后对被过滤器分离的细胞进行处理以便从中释放出在细胞检测反应中使用的成分。
这种细胞的检测可以在很多科学和技术领域内应用,举例来说,这些应用领域包括医学和诊断试验、生物技术和分子生物学分析以及食品和环境分析等。
可以用各种直接和间接的方法检测细胞。一种间接的方法是根据细胞的例如化学、生物学、免疫学或物理学性质测定某些细胞的成分。
在先前的细胞检测中,样品往往必须经过过滤,例如,由于样品的体积过大和细胞的含量过低而使这些方法在检测反应中的灵敏度不够或者是由于在实际测定之前需要在过滤器上清洗细胞。在细胞已经浓缩在过滤器上并且也许已经清洗过之后,对这些细胞进行处理以便从中释放出在细胞反应中所用的成分,在过滤器上测定这些成分(WO专利申请88/08037和欧洲专利101398)。
在这类细胞检测方法中,存在的问题是由一些妨碍测定的杂质所引起的。这些杂质包括例如残余的细胞和细胞碎片和存在于样品中的其它固体颗粒。过滤器本身也可能产生一个干扰背景。此外这个方法是繁复的,损耗很大,特别是在样品中的细胞含量低的情况下。
本发明的目的是改进一种可以可靠地和方便地检测过滤后的细胞的方法和装置。本发明的方法的特征在于,从细胞中释放出的成分仍是采用过滤样品时采用的那个过滤器分离的,然后从滤液中测定该成分以便指示在原始样品中细胞的存在。
通过检测滤液中的细胞成分而不是检测过滤器中的细胞成分,防止了上述的由过滤器引起的杂质和背景干扰。另外,在样品中可能存在的病原体是可以灭活的,因此它们不能进入待分析的滤液。通过用在浓缩样品时使用的那一个过滤器把对检测敏感的和已经从细胞中分离出的成分分离出来,除了使细胞的含量或细胞成分的损失降到最低限度外,还节省了劳动力和材料费用。还可以同时测定从不同类型的细胞中产生的几种成分。
附图示出了一种适于本发明方法的装置。
本发明的方法适用于各种类型的样品,本方法对大体积低细胞含量的样品有特别的效果,虽然本方法用于液体样品具有很大的优越性,但也可能用于其它样品,例如可能首先由液体萃取出的气体。初始状态为固态的样品可以使其溶解或悬浮在液体中,并在检测之前可能经初步过滤或借助其它方式例如离心分离除去了干扰物质。本发明的方法可以用在例如食品和饮料工业,可以在水、气体和空气中完成分析,还可以用于一般的卫生控制和临床样品分析。
使待检测的样品通过一个孔径尺寸根据待分离的细胞尺寸选择的过滤器。在本申请中术语“细胞”还包含病毒,尽管病毒一词其实际含义不是细胞,而是具有穿过细胞能力的感染颗粒。与此相同,细胞成分也表示病毒成分。本发明的方法很适合于检测例如细菌和病毒。对于细菌通常使用孔径为0.2至0.5μm的过滤器;对于真核细胞通常使用比较大孔径尺寸的过滤器;而对于病毒要使用更小孔径尺寸的过滤器-超滤器。在过滤操作中可以采用例如抽吸或压力。
可以用通用的过滤装置完成过滤,其中的过滤器放置在漏斗的底部,漏斗放置在抽吸瓶的开口处,将抽吸瓶例如用一个泵抽成真空。作为一种替换的方案,也可以采用例如注射器,在此情况下样品被抽入注射器中,一个过滤器放置在注射器的端部,样品被加压通过过滤器。当然也可以采用其它的过滤系统。对于病毒,进行超滤是可行的,其中的样品放在超滤管的过滤器上,然后借助离心力使其通过过滤器。
在样品中的细胞已经收集在过滤器上之后,往往可以通过使缓冲洗溶液通过过滤器进行清洗,可以采用例如蒸馏水或缓冲液作为清洗溶液。将目前所获得的滤液排出。在这个可能的清洗过后,对这些细胞进行处理以便从细胞中释放出对细胞检测有显著作用的细胞成分。这个处理可以是化学的或物理的,并最好能使细胞或细胞组织的主要部分留在过滤器上,化学处理可以是例如胺处理、洗净处理、萃取(例如用酸、碱或某些适合的溶剂)或用水或缓冲液冲洗或渗压震扰。所需要的细胞成分可以用物理方法从细胞中分离出来,例如借助于一个冰冻机,借助于声处理、电沉积、摇动或其它一些机械方法。
最好将细胞表面层去掉,就此将该表面层或许还包括的细胞的附属物,具体地说是细菌的鞭毛分离和变碎,然后测定含鞭毛的结构或类似物。例如通过弱酸处理去掉带有附属物的细菌表面层,借此使鞭毛分离并就此粉碎成鞭毛分子。在病毒的情况下,可以从病毒中分离出对检测具有重要意义的抗体。
将对检测具有重要意义的分离成分通过用于过滤样品的同一个过滤器进行冲洗。收集该滤液。借助于已经通过过滤器的那部分成分的反应,根据那些细胞成分的化学的、生物学的、物理的或免疫学性质从冲洗的溶液中检测原来样品的细胞的存在。有很多种检测细胞成分的方法,包括生物化学、免疫学和辐射化学分析法。也可以使检测所必需的试剂通过过滤器,或者将它们直接加到滤液中。
本发明的方法既可以作为通用的检测细胞的方法又可以作为通用的鉴别某一细胞类型的方法。如果只对细胞存在感兴趣而不涉及到鉴别细胞的类型,则最可行的方法是确定在这些细胞中普通存在的成分例如LPS或其组成部分。另外,这个方法可以用于检测某些感兴趣的细胞类型或种系,在这种情况下应选择只存在于那个感兴趣细胞内的细胞成分作为待测定的细胞成分。一种极特殊的方法是利用免疫方法完成的,从同一个滤液中同时可以测定几种细胞成分,这一点是具有优越性的,也就是说可以通过下述选择待测的细胞成分的方法同时测定几种类型细胞,在这种方法中一种成分只存在一种类型细胞内,而另一种成分存在另一种类型细胞内,……等。
本发明的方法非常适合于测定一个细胞的表面成分,例如细胞壁或细胞膜蛋白,LPS,荚膜多糖,膜蛋白(例如RS蛋白,即S层蛋白),细胞的鞭毛或其它的附属物或类似的结构或它们的构成部分等。在由过滤器将释放出的细胞成分从细胞的主要部分分离之后,利用通用的方法(例如蛋白测定法或免疫测定法)对这些释放出的细胞成分进行测定。从原理上讲,从细胞中分离出的任何蛋白质都可以用于指示在原始样品中细胞的存在。例如凝胶电泳,免疫斑点分析和免疫聚合酶链式反应技术(Sano,T.,Smith,C.and Cantor,C.,1992 Science 258 pp.120-122)适合用于这种场合。
本发明的方法既可以检测杂质样品中的病毒,也可检测培养基内的病毒。将样品放在一个超滤器上,通过离心作用使样品通过超滤器;然后处理过滤器,将用在检测中的成分分离出,例如来自留在过滤器上的病毒中的抗体。而这种方法的优点是病原体病毒可以被灭活。通过再次离心分离使分离出的抗原通过同一过滤器,通过例如免疫聚合酶链式反应法测定来自滤液中的抗原,因此可以测定出很低的抗体浓度。换句话说,本发明的方法适合于浓缩和提纯抗原,以及适合于用免疫聚合酶链式反应技术预处理待检测的样品。
本发明的范围还包括一种适合于上述方法的装置。本发明的装置的特征在于,包括:用于过滤待检测样品以便分离细胞的装置,用于处理被过滤器分离的细胞以便从细胞中释放出在细胞检测反应中使用的成分的装置;用于分离从细胞中释放的成分的装置;以及用于检测来自滤液中的那个成分以便指示在原始样品中细胞存在的装置。
用于过滤待检测样品以便分离出细胞的过滤装置可以包括:例如供样品和可能用的清洗液体通过过滤器用的一个或多个容器,该容器同过滤器相连,过滤器又与废物收集器相连;又如使样品通过过滤器的可能用的装置,如泵,压力机或离心机等。过滤器的孔径尺寸根据待分离细胞的尺寸选择。
用于处理由过滤器进行分离的细胞以便从中释放出在细胞检测反应中使用的成分的装置可以包括:一个同该过滤器相连以便使得用于释放细胞成分的试剂通过该过滤器的容器;或者用物理方法分离细胞成分的装置;以及使冲洗溶液通过过滤器的装置。
用于从细胞中分离释放成分的装置包括过滤样品时使用的那个过滤器和可能采用的中间部件例如使过滤器投入使用的传送装置。这个装置还可以包括同该过滤器相连以便使试剂通过该过滤器到达用于测定该细胞成分的该装置上的一些容器。
用于检测细胞成分的装置包括一个测量台,该测量台包括一个测定单元、一个用于检测从待检测细胞中释放出的成分的检测器单元和一个电子单元。测定单元可以包括例如不同类型的分析系统、一个光源等,以便根据成分的化学、生物学、免疫学或物理学性质检测那些从细胞中释放出的成分。检测器单元可以包括例如光测量装置、放射性测量装置等。测量台通常还包括一个用于接收所产生的信号的电子单元。这个电子单元最好同一个数据处理单元和一个控制单元相连接。测量台最好还同一些容器相连以便将工作溶液和洗脱液输送到测量台上,测量台的另一侧可以同一废物容器相连。测量台最好能同时测量几种细胞成分。
本发明的装置通常包括一些阀,其它用于输送所使用的试剂的输送装置,过滤器本身或待检测的滤液可以运送到需要的位置上。
本发明的装置最好包括一取样容器和一个用于装清洗液的容器,这两个容器分别同过滤器相连,该过滤器又同一个废物容器相连接;用于将过滤器运送到另一个台上的传送装置,用于装萃取液的第三个容器同该台相连接,该台有一个同所运送的过滤器相连的接头,该过滤器还同测量台、数据处理单元和控制单元相连;以及一些用于装工作溶液和洗脱液的容器,这些容器也同测量台相连接。
利用本发明的装置,可以使本发明的方法基本上实现了自动化,本发明还涉及这个装置在本发明方法上的应用。这个装置最好用于同时检测来自同一样品中的几种细胞成分。
附图示出本发明装置的一个例子。显然,在本发明的范围内不只有一个这个作为举例的实施方案。
图中示出一个取样容器1,容器1经阀7同时过滤器10相连,以及经过阀14同废物容器6相连以便使样品通过过滤器进入废物容器。此外,另一容器2经过阀8同过滤器相连以便使清洗液通过过滤器。装置还包括用于将过滤器运送到台11和12上的传送装置13。容器3经过阀9同台11相连以便将萃取溶液供给过滤器。在台11中的过滤器经阀15同测量台18相连以便将萃取溶液供给测量台。测量台同数据处理单元19相连以便处理和输出信号。这个装置还包括一个用于控制装置的阀和其它机械促动器操作和提供一个液流的控制单元20。此外,容器5经过阀17同测量台相连以便向该测量台提供洗脱液恢复其测量。台12是一个过滤器交换台。
上述的装置使用方法如下:将待测样品供给取样容器1,利用压力通过阀7使样品从这里通过过滤器10和阀14进入废物容器6。用由容器2通过阀8提供的清洗液清洗过滤器上留下的细胞。然后利用传送装置13将过滤器运送到台11,在此用由阀9调节的来自容器3的溶液萃取留在过滤器上的细胞(当然可以将萃取溶液运送到一个固定的过滤器中,使滤液例如通过一些适合的阀从过滤器输送到测量台,而代替运送过滤器)。通过阀15将萃取物输送到测量台18,利用容器4的通过过滤器16提供的工作溶液使该萃取物通过测量台。利用数据处理单元19处理测量台产生的信号。处理单元输出处理过的信号并评价待测细胞成分的存在和数量。控制单元20控制装置中的阀和其它机械促动器并为系统提供一个液流。在测量之后,测量台由容器5经阀17提供的洗脱液恢复其测量。在台12上,用完的过滤器由一个新的过滤器代替。
本发明还涉及一个由在这个方法中所用的用品组成的用品包,这个用品包的特征在于其包括:用于过滤待测样品以便分离细胞的用品;用于处理被过滤分离的细胞以便从中释放在检测反应中所用的成分的用品;用于从细胞中分离所释放的成分的用品,以及用于测定来自滤液中的那个成分以便指示原始样品中的细胞的存在的用品。
用于过滤待测样品以便分离细胞的用品最好包括过滤器和相应的适合于过滤的容器以及可能用的必要的清洗溶液。用于处理细胞的用品最好包括用于释放在细胞检测反应中的成分的试剂和一个用于使成分同细胞分离的装置,该装置由过滤样品时使用那个过滤器组成。用于测定滤液中成分的用品包括在检测中使用的试剂:在测定中使用的装置通常不包括在用品包内。
本发明的用品包中的过滤器根据待分离细胞的尺寸选择。同适合于过滤的过滤器相连的容器可以是一些同一个吸入瓶相连的漏斗、注射器或超过滤器;用于释放细胞成分的待用试剂可以是例如酶、洗涤剂、酸或碱溶液或一些其它溶剂、水或缓冲液。为检测从细胞中释放出的成分所必需的试剂可以是在常规的检测细胞成分的反应中所需的任何试剂,例如在蛋白质测定或免疫测定中所用的试剂。
本发明的用品包最好包括样品容器和试剂容器、过滤器、用于释放在检测反应中所用细胞成分的试剂和用于测定这些释放成分的试剂。
下面通过非限定的例子更详细地说明本发明。
例1
将1.5毫升含Pectinatus frisingiensis菌株VTT-E-82165(Hakalehto,E.and Finne,J.,1990,FEMS Microbiology Letters 67,PP.307-312)的细菌培养基抽入到2毫升的注射器中,然后压力使其通过位于注射器端部的过滤器,过滤器的孔径尺寸为0.45μm(Millipore Millex HA)。用蒸馏水冲洗这些细胞。弃掉所获得的滤液。用另一个注射器使约0.2ml,0.05M的HCL通过同一过滤器,将溶液收集在Eppendorff管中并用NaOH中和。
然后将在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中所用的样品缓冲液加入到该滤液中,按照在Laemmli,U.K.1970,Hature(London)227,PP.680-685,中所描述的方法利用8%的凝胶和商业分子量标准品,(药剂(pharmacia))完成这些滤液的SDS-PAGE。其中一些样品在进行SDS-PAGE之前经过沸腾。用蛋白质染料考马斯亮蓝(CBB)使这些凝胶染色和/或利用在由该细菌菌株(Hakalehto,E.and Finne,J.,1990,FEMS Microbiology Letters 67,PP.307-312)免疫过的兔中产生的抗体完成免疫斑点。在直接染色和免疫斑点分析二者中都在约63KDa分子量位置处出现一条明显的区带,这表明了由Pectinatus frisingiensis菌株中衍生出约63KDa大小的鞭毛蛋白。这还表明Pectinatus frisingiensis菌株在原始样品中是存在的。
例2
将含有细菌多粘芽胞杆菌(ATCC 842)的样品按照例1的方法处理,利用10%的凝胶完成所收集的滤液的SDS-PAGE,接着用CBB使凝胶染色。可以在120-130KDa分子量位置处看到一条明显的区带,其对应于这些细菌膜上所存在的RS(规则结构)蛋白质,该RS蛋白质的分子量约120-130KDa。
例3
将含有细菌产气肠杆菌(ATCC 13048)的样品按照例1的方法处理,用8%的凝胶完成所收集的滤液的SDS-PAGE分析,而获得一条稍低于例1所述的Pectinatus菌株的63KDa蛋白质的明显区带。在经纯化和依次分析后发现这个蛋白质区带相应于肠杆菌属菌株的鞭毛蛋白。
例4
将含有上述例1-3中的三种细菌(即:P.frisingiensis VTT-E-82165,多粘芽胞杆菌ATCC 842和产气肠杆菌ATCC13048)的样品按例1的方法处理,用8%的凝胶完成所收集的滤液的SDS-PAGE。在例1-3所获得的区带的位置获得了一些明显的区带,这些区带指示出在原始样品中存在所有这三种细菌。
例5
将含0.2ml的细菌产气肠杆菌(ATCC 13048)培养基的400ml样品利用一个孔径尺寸为0.45μm和直径为25mm的Millipore HA过滤器过滤。用蒸馏水或缓冲液清洗该过滤的培养基。将该滤液弃掉,然后将200μl,0.05M的HCl加到该过滤器上,再将滤液抽入到Eppendorff管中。加入NaOH进行中和,采用吸入法用蒸馏水完成最后的清洗,然后按照例1的方法和用12%的凝胶进行收集在Eppendorff管中的样品的SDS-PAGE。
按照下述方法在凝胶上进行银染色:先将凝胶在50%的甲醇中摇动,然后将其转移到一种把4ml蒸馏水中的0.8gAgNO3逐滴加入到已混有0.36%的NaOH(21ml)和氨(1.4ml)的溶液中制备的银溶液中。将凝胶从混溶液中拿出之后用蒸馏水清洗并将其转移到含有1.25ml1%的柠檬酸和0.125ml30%的甲醛水溶液的溶液中(250ml)。染色的蛋白质区带出现以后,用水清洗凝胶并将其移入含有45%的甲醇和1%的醋酸溶液中。在约21KDa和29KDa分子量位置处获得最明显的蛋白质区带。再对从细胞中分离出的其它成分进行检测,但是区带较弱一些。
例6
将一种从一个病人样品中获得的属于微小RNA病毒类的柯萨奇B6病毒在一猴子的肾细胞培养基上培养,然后通过冷冻和解冻培养基几次使病毒从细胞中释放出来。将500μl这种病毒的悬浮液在500μl的去离子水中混合并铺在一个超过滤管的过滤器(Microsep lok,Filtron,USA)上,再离心分离半小时(4000-5000转/分钟)。不进行任何清洗。将100μl,0.05M的HCI加入到过滤器上并允许在37℃下反应1小时,然后按上述方法完成离心分离。将100μl,0.05M的HaOH加到该过滤器上,然后按上述方法再进行离心分离。按照例1的方法(在10%的凝胶中)进行滤液的SDS-PAGE。在进行SDS-PAGE之前,样品先在SDS-PAGE样品缓冲液中沸腾5分钟。按照例5中的银染色法对凝胶进行染色,或按照例1的方法进行免疫斑点分析。将一种在猴子身上产生的抗柯萨奇B6抗体(按1∶50稀释)用作免疫斑点的第一抗体,将按1∶1000稀释的用碱性磷酸酶(DaKo,Denmark)标记的抗人类抗体用作免疫斑点的第二抗体。抗人类抗体同猴子的抗体发生交差反应。
银染色的凝胶具有几条区带,这些区带与用沸腾进的全病毒所获得的对应区带在局部上有些不同。在免疫斑点方法中,四条区带在25-32KDa范围内最明显。根据文献报导,微小DNA病毒类的最明显的结构蛋白通常在9-35KDa范围内(Andrews,C.,Pereira,H.G.and Wildy,P.,1978.Viruses of Vertebrates.Bailliere Tindall,London).
Claims (17)
1、一种检测细胞的方法,包括:
a)过滤待检测的样品,以便分离出这些细胞;
b)处理被过滤器分离出的这些细胞以便使其释放出在细胞检测反应中所用的成分;
c)利用那个过滤样品使用过的过滤器将细胞中释放的成分同细胞分离开来;以及
d)测定滤液中的该成分以便指示在原始样品中细胞的存在。
2、如权利要求1所述的方法,其特征在于,该方法用于检测细菌。
3、如权利要求1所述的方法,其特征在于,对细胞的表面成分进行测定。
4、如权利要求3所述的方法,其特征在于,使细菌的鞭毛分离并弄碎,然后测定含鞭毛的结构或类似的结构。
5、如权利要求3所述的方法,其特征在于,测定细菌的RS蛋白。
6、如权利要求1所述的方法,其特征在于,测定存在细菌的附属物,膜或细胞壁内的成分。
7、如权利要求1所述的方法,其特征在于,用免疫测定方法测定细胞释放的成分。
8、如权利要求1所述的方法,其特征在于,测定滤液中的几种细胞的成分,以便同时检测在同一样品中存在的几种类型细胞。
9、如权利要求1所述的方法,其特征在于,将由免疫PCR方法测定的抗体是从细胞中释放的。
10、一种检测病毒的方法,包括:
a)过滤待检测样品以便分离出病毒;
b)处理被过滤器分离出的病毒,以便使其释放用在病毒检测反应中的成分;
c)仍用过滤样品时采用过的过滤器使从病毒中释放出的成分同病毒分离开;
d)测定滤液中的那些成分以便指示在原始样品中病毒的存在;
11、一种适合检测细胞的装置,包括:
a)用于过滤待测试样品以便分离出细胞的装置;
b)用于处理被过滤器分离出细胞以便从中释放出在细胞检测反应中使用的成分的装置。
c)用于使释放出的成分同细胞分离的装置;以及
d)用于测滤液中的所述成分以便指示在原始样品中细胞存在的装置。
12、如权利要求11所述的装置,其特征在于,用于使释放成分同细胞分离出的装置仍由过滤样品时采用的那个过滤器组成。
13、一种在权利要求1的方法中使用权利要求11所述装置的方法。
14、一种如权利要求13所述的方法,其特征在于,该装置用于同时测定几种细胞成分。
15、一种在权利要求1所述方法中使用的用品包,包括:
a)用于过滤待测试样品以便分离出细胞的用品;
b)用于处理被过滤器分离出的细胞以便从中释放出在细胞检测反应中使用的成分的用品;
c)用于使从细胞中释放成分分离出的用品;
d)用于测定滤液中的那个成分以便指示在原始样品中存在细胞的用品。
16、如权利要求15所述的用品包,其特征在于,用于分离从细胞中释放出的成分的装置仍由在过滤样品时使用的那个过滤器组成。
17、如权利要求16所述的用品包,其特征在于,包括样品和试剂容器、过滤器、用于从细胞中释放成分的试剂和测定释放成分的试剂。
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